نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، پژوهشکدۀ زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

2 دانشیار، پژوهشکدۀ زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

3 استادیار میکروبیولوژی، بخش زیست‌فناوری میکروبی، دانشکدۀ زیست‌شناسی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران

4 استادیار، پژوهشکدۀ زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ‌‌ایران

5 دانشیار، گروه صنایع شیمیایی آلی و دارویی، پژوهشکدۀ فناوری‌های شیمیایی، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران

10.22108/bjm.2020.120139.1240

چکیده

مقدمه: اینوکوتیس لویس، قارچی پلی‌پور از خانوادۀ هایمنوکتاسه است. اعضای این خانواده ویژگی‌های دارویی شناخته‌شده‌ای دارند و به‌تازگی، آثار ضددیابتی و ضدکلسترولی گونۀ اینوکوتیس لویس نیز گزارش شده‌اند. هدف مطالعۀ حاضر، بررسی ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی و ضدباکتریایی عصاره‌های اندام بارده قارچ یادشده است.
مواد و روش‏‏ها: پس‌از نمونه‌برداری و شناسایی قارچ، عصاره‌گیری از اندام بارده با کمک حلال‌های متانول، اتانول و آب انجام شد. بررسی اثر آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها به روش DPPH و بررسی اثر ضدباکتریایی آنها روی تعدادی باکتری گرم مثبت و گرم منفی به روش رقیق‌سازی در چاهک انجام شد. تجزیه‌وتحلیل ترکیبات فنلی و فلاوونوئیدی عصاره‌ها به روش‌های اسپکتروفوتومتری و HPLC انجام شد.
نتایج: نتایج نشان دادند عصارۀ متانولی اینوکوتیس لویس دارای بیشترین اثر آنتی‌اکسیدان با IC50 برابر با 555 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر است؛ همچنین عصاره‌های اتانولی و متانولی این قارچ اثر ضدباکتریایی مشابه و قوی‌تری نسبت به عصارۀ آبی داشتند. باکتری استرپتوکوکوس موتانس نسبت به سایر باکتری‌ها حساسیت بیشتری به این دو عصاره با مقادیر MIC و MBC به‌ترتیب برابر با 5/12 و 25 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر داشت. میزان فنل کل و فلاونوئید کل عصارۀ متانولی بیشتر از سایر عصاره‌ها و به‌ترتیب برابر با 15/34 میلی‌گرم گالیک‌اسید و 4/5 میلی‌گرم کوئرستین در هر گرم پودر خشک عصاره بود. ترکیبات آسکوربیک‌اسید، کاتچین، رزورسینول،کافئیک‌اسید و وانیلیک‌اسید در نتایج آزمون HPLC تشخیص داده شدند.
بحث و نتیجه‏گیری: بررسی حاضر برای نخستین‌بار وجود ویژگی‌های ضدباکتریایی و آنتی‌اکسیدانی را در قارچ اینوکوتیس لویس نشان داد و نتایج آن می‌توانند در مطالعه‌های آتی در زمینۀ طراحی منابع جدید آنتی‌بیوتیکی و آنتی‌اکسیدانی با استفاده از قارچ‌های بومی مدنظر قرار گیرند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigating Antibacterial and Antioxidant Activity of Inocutis levis Extracts and Evaluating its Phenolic Compounds

نویسندگان [English]

  • Samaneh Chaharmiri dokhaharani 1
  • Masoomeh Ghobad-Nejhad 2
  • Hamid Moghimi 3
  • Abbas Farazmand 4
  • Hossein Rahmani 5

1 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran

2 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran

3 Department of Microbial Biotechnology, School of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran

4 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran

5 Department of Chemical Technologies, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran

چکیده [English]

Introduction: Inocutis levis is a polypore basidiomycete from the Hymenochaetaceae family. Members of this family have well-known medicinal properties. Recently, anti-diabetic and anti-hypercholesterolemic effects of I. levis have been reported. This study aimed to evaluate antibacterial activities and antioxidant properties of the extracts of I. levis.
Materials and methods: After the sampling and fungus identification, the methanolic, ethanolic, and aqueous extracts of the dried fruiting bodies of I. levis were prepared. The antioxidant activities were determined by DPPH method, and antibacterial activities by microdilution method against some gram-positive and gram-negative bacteria. Furthermore, the identification and quantification of phenolic and flavonoid compounds of the extracts were investigated by spectrophotometers and HPLC.
Results: The results showed that the methanolic extract had the highest DPPH scavenging activity, with an IC50 value of 555 µg/ml. The ethanolic and methanolic extracts showed the same antibacterial effects, and Streptococcus mutansATCC35665 was more sensitive than other bacteria, with the MIC and MBC values of 12.5 and 25 mg/ml, respectively. Total phenolic (34.15mg gallic acid) and total flavonoid contents (5.4mg quercetin) per 1 gram dry methanolic extract were higher than other extracts. Furthermore, in the HPLC analysis, ascorbic acid, resorcinol, caffeic acid, catechin and, vanillic acid were determined.
Discussion and conclusion: This is the first study presenting the antibacterial and antioxidant properties of I. levis. The results can be considered for future studies in the design of new antibiotics and antioxidant compounds from natural resources applying native fungi.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Inocutis levis
  • Antibacterial
  • Antioxidant
  • Polypore Fungus

مقدمه

قارچ‌های ماکرومیست پیشینه‌ای طولانی در مصارف دارویی به‌ویژه در کشورهای آسیایی و اروپایی دارند (1) و دارای ترکیبات زیست‌فعال متنوعی نظیر ترکیبات فنلی، پلی‌ساکاریدها، پروتئین‌ها، لیپیدها، پلی‌کتیدها، ترپنوئیدها، آلکالوئیدها و مواد دیگرند (2). تاکنون گزارش‌های متعددی دربارۀ قارچ‌های ماکرومیست منتشر شده‌اند که در آنها به فعالیت‌های این قارچ‌ها ازجمله پلی‌پورها نظیر فعالیت‌های ضدمیکروبی، ضدسرطانی، ضدالتهابی، آنتی‌اکسیدانی، بهبوددهندگی مشکلات قلب و عروق، دیابت، آلزایمر و تقویت سیستم ‌ایمنی اشاره شده است (2 و 3).

بیماری‌های عفونی یکی از تهدیدهای اصلی برای سلامت انسان به شمار می‌آیند و تلاش‌های بسیاری برای شناخت عوامل ایجادکننده، درمان و کنترل آنها انجام شده‌اند. امروزه، مقاومت دارویی چندگانۀ میکروب‌ها مشکل بزرگی برای سلامت عمومی به شمار می‌آید (4)؛ زیرا بسیاری از گونه‌های باکتریایی در برابر رده‌های مختلف آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم شده‌اند (5). پژوهش در زمینۀ کشف ترکیبات ضدباکتریایی جدید و کارآمد از منابع مختلف زیستی همواره مدنظر بوده است. قارچ‌ها از مهم‌ترین و متنوع‌ترین منابع طبیعی آنتی‌بیوتیک‌ها (6) و منبع طبیعی آنتی‌‌اکسیدان‌های قوی ازجمله توکوفرول‌ها، کاروتنوئیدها، آسکوربیک‌اسید، بنزوئیک‌اسید، گالیک‌اسید، کاتچین و کافئیک‌اسید هستند (7).

آنتی‌اکسیدان‌های مصنوعی و طبیعی به کاهش آسیب اکسیداتیو ناشی از گونه‌های اکسیژن فعال[1] (ROS) در بدن انسان کمک می‌کنند (8). غلظت‌های زیاد ROS سبب آسیب گسترده به بافت و سلول‌ها طی عفونت‌ها، بیماری‌های قلبی و عروقی، پیری، آلزایمر، دیابت، جهش و سرطان می‌شوند (9). آنتی‌اکسیدان‌های مصنوعی مانند بوتیلات هیدروکسیل آنیزول[2] ممکن است سبب بروز آثار سمی یا سرطان شوند (10)؛ بنابراین، یافتن آنتی‌اکسیدان‌های جدید و مؤثرتر با منشأ طبیعی نظیر متابولیت‌های قارچی اهمیت ویژه‌ای دارد (11). هدف مطالعۀ حاضر، بررسی اثر ضدباکتریایی و آنتی‌اکسیدانی قارچ اینوکوتیس لویس[3]و ارزیابی ترکیبات فنلی در عصاره‌های مختلف آن است.

اینوکوتیس لویس، قارچ پلی‌پور بازیدیومیست از راستۀ هایمنوکتالز[4] و خانوادۀ هایمنوکتاسه[5] است که اندام بارده آن به رنگ قهوه‌ای مایل به زرد روی تنۀ درختان زنده رشد می‌کند (12). در پژوهش‌های اخیر نشان داده شده است این قارچ دارای ویژگی‌های ضدهیپرتری‌گلیسیریدمی (13) و آثار هیپوگلیسمیک و تنظیم انسولین در دیابت نوع دو است (14). در مطالعۀ حاضر، ویژگی‌های ضدباکتریایی و آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های اتانولی، متانولی و آبی قارچ اینوکوتیس لویس و ترکیبات فنلی آن برای نخستین‌بار بررسی شد.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‌های قارچی طی سال 1396 از تهران جمع‌آوری و با معرف‌های شیمیایی آبی‌کتان و پتاس و به کمک میکروسکوپ نوری و با مراجعه به منابع معتبر قارچ‌شناسی (12) با عنوان اینوکوتیس لویس شناسایی شدند. قطعه‌هایی از نمونه‌های استفاده‌شده در عصاره‌گیری با شماره‌های دسترسی ICH494F و ICH495F در هرباریوم سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران با نمایۀ بین‌المللی ICH نگهداری می‌شوند.

عصاره‌گیری:به‌منظور عصاره‌‌‌گیری، ابتدا سطوح بیرونی بازیدیوکارپ قارچ با هیپوکلریت‌سدیم 5 درصد شستشو شد و پس‌از شستشوی سطح آن با آب مقطر استریل، قارچ کاملاً خشک شد. عمل پودرکردن با دستگاه آسیاب برقی انجام شد. عصاره‌گیری با حلال‌های اتانول، متانول و آب مقطر استریل به روش خیساندن همراه با حمام فراصوتی (اولتراسونیک PARSONIC 15s) انجام شد؛ به‌این‌ترتیب که مخلوط 30 گرم پودر قارچ در 300 میلی‌لیتر حلال تهیه و ابتدا به‌مدت یک ساعت در دستگاه حمام امواج فراصوتی با فرکانس 28 کیلوهرتز و در دمای محیط گذاشته شد و سپس عصاره‌گیری به‌مدت 72 ساعت در دمای اتاق و به کمک شیکر (GFL3005) با سرعت 200 دوردردقیقه انجام شد. عصارۀ حاصل با کاغذ صافی واتمن شمارۀ 4 صاف و دوباره این روش به‌مدت 24 ساعت روی پودر قارچ باقیمانده از عصاره‌گیری پیش انجام شد. عصارۀ نهایی صاف‌شده در دمای 40 درجۀ سانتی‌گراد با دستگاه روتاری (LabTech EV311) خشک و حلال آن کاملاً تبخیر شد. بازده تولید عصاره‌ها از رابطۀ زیر به دست آمد:

( )

بررسی محتوای فنل کل عصاره‌ها: محتوای فنل کل عصاره‌های هیدروالکلی و آبی قارچ به روش رنگ‌سنجی فولین سیوکالتیو بر حسب گالیک‌اسید اندازه‌گیری شد (15)؛ ابتدا محلول استاندارد با غلظت‌های مختلف بر حسب میکروگرم‌برمیلی‌لیتر از گالیک‌‌اسید در محلول متانول تهیه شد، سپس 100 میکرولیتر از هریک به لولۀ آزمایش منتقل و به آنها 5/2 میلی‌لیتر از محلول (1:10) واکنشگر فولین سیوکالتیو اضافه شد و پس‌از 3 تا 8 دقیقه، 2 میلی‌لیتر از محلول کربنات‌سدیم 5/7 درصد به آنها اضافه شد. لوله‌ها به‌مدت 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه نگهداری شدند و سپس میزان جذب آنها با دستگاه اسپکتروفتومتر (T80+UV/VIS Spectrometer-PG Instruments Ltd) در طول موج 765 نانومتر اندازه‌گیری و منحنی استاندارد آنها تهیه شد. به‌منظور تعیین فنل کل عصاره‌های آبی، اتانولی و متانولی، غلظت 2000 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر از هر‌کدام از آنها تهیه و در ادامه، میزان آن بر اساس روش فولین سیوکالتو اندازه‌گیری شد. حلال متانول خالص برای شاهد استفاده شد (16). بر اساس میزان جذب خوانده‌شده، مقدار فنل کل با استفاده از رابطۀ خط منحنی کالیبراسیون گالیک‌اسید بر حسب میلی‌گرم گالیک‌اسید در وزن پودر خشک (گرم) عصاره و پودر خشک قارچ به دست آمد.

بررسی محتوای فلاونوئید کل عصاره‌ها: محتوای فلاونوئید عصارۀ قارچ به روش رنگ‌سنجی آلومینیوم‌کلرید اندازه‌گیری شد؛ به‌این‌ترتیب که 1000 میکرولیتر نمونه از هر سه عصارۀ محلول در متانول با غلظت 2000 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر و 1000 میکرولیتر از محلول 2 درصد AlCl3.6H2O در لولۀ آزمایش ریخته شد. نمونه‌ها به‌مدت یک ساعت در دمای محیط نگهداری شدند و سپس جذب آنها در طول موج 435 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (T80+UV/VIS Spectrometer-PG Instruments Ltd) اندازه‌گیری شد. کوئرستین برای استاندارد ترکیب فلاونوئید در غلظت‌های مختلف بر حسب میکروگرم‌برمیلی‌لیتر استفاده و منحنی استاندارد از آنها تهیه شد؛ سپس محتوای فلاونوئید کل عصاره‌ها با استفاده از رابطۀ خط منحنی استاندارد بر حسب میلی‌گرم کوئرستین در گرم وزن پودر خشک عصاره و قارچ به دست آمد (17-19).

بررسی اثر آنتی‌اکسیدان: توانایی عصاره‌های متانولی، اتانولی و آبی قارچ اینوکوتیس لویس در مهار رادیکال آزاد 2 و 2- دی‌فنیل 1-11پیکریل هیدرازیل[6] بررسی شد؛ به این منظور، محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف 312، 625، 1250، 2500 و 5000 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر از عصاره‌های متانولی، اتانولی و آبی در حلال متانول آماده شدند. 100 میکرولیتر از محلول متانولی 2 و 2- دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل (DPPH) به 100 میکرولیتر عصارۀ درون پلیت 96 خانه‌ای افزوده و مخلوط حاصل کاملاً همگن شد. پلیت آزمایش به‌مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار گرفت و سپس میزان جذب در طول موج 517 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (BioTek-Epoch) سنجیده شد. مقدار200 میکرولیتر DPPH بدون عصاره برای شاهد منفی و آسکوربیک‌اسید برای شاهد مثبت استفاده شد (20). فاکتور IC50 برای مقایسۀ فعالیت ضدرادیکالی عصاره‌ها به کار رفت.

بررسی اثر ضدباکتریایی: به‌منظور آزمون ضدباکتریایی از 6 گونۀ مرجع باکتری شامل باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس[7]ATCC25923، باسیلوس سوبتیلیس[8]ATCC6633 و استرپتوکوکوس موتانس[9]ATCC35665) و باکتری‌های گرم منفی (سودوموناس آئروژینوزا[10]ATCC 9027، اسینتوباکتر بومانی[11]BAA-747 و اشریشیا کلی[12]ATCC8739) استفاده شد. باکتری‌ها از بانک میکروبی انستیتو پاستور ایران و آزمایشگاه زیست‌فناوری محیطی دانشگاه تهران تهیه شدند. روش رقیق‌سازی در چاهک (میکرودایلوشن) برای تعیین میزان MIC (حداقل غلظت مهارکنندگی) و MBC (حداقل غلظت کشندگی) عصاره‌های اتانولی، متانولی و آبی قارچ استفاده شد (1)؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا 100 میکرولیتر محیط‌کشت مولرهینتون‌براث در تمام چاهک‌های پلیت 96 خانه‌ای ریخته شد، سپس 100 میکرولیتر عصاره به نخستین چاهک یک ردیف تلقیح شد و سری رقت از غلظت‌های 19/0 تا 100 میلی‌گرم‌درمیلی‌لیتر در چاهک‌ها تهیه شد؛ سپس 100 میکرولیتر از غلظت‌های 001/0 تا 5 میلی‌گرم‌درمیلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک کانامایسین (ترکیب ضدباکتری استاندارد) به یک ردیف از چاهک‌ها اضافه و از دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) 5 درصد برای شاهد حلال پودر عصاره‌ها استفاده شد؛ درنهایت، 10 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری رقیق‌شده معادل نیم مک فارلند به چاهک‌ها تلقیح شد. یک ردیف محیط‌کشت مولرهینتون‌براث همراه با 10 میکرولیتر باکتری برای شاهد مثبت رشد باکتری و محیط‌کشت مولرهینتون بدون باکتری برای شاهد منفی رشد باکتری استفاده شد. پس‌از 24 ساعت انکوباسیون، میزان MIC (حداقل غلظت مهارکنندگی) در چاهک‌هایی تعیین شد که بدون کدورت رشد باکتریایی بودند؛ همچنین کمترین غلظت کشندۀ باکتری (MBC) از کشت دوبارۀ 20 میکرولیتر سوسپانسیون موجود در چاهک‌ها (یا همان رقت‌های عصارۀ بدون کدورت رشد باکتری) روی مولرهینتون‌آگار به‌مدت 24 ساعت در 35 درجۀ سانتی‌گراد تعیین شد؛ سپس کمترین غلظتی که باکتری هیچ رشدی در آن نداشت، میزان MBC گزارش شد.

.بررسی کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد (HPLC): روش کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد (HPLC) برای جداسازی آسکوربیک‌اسید و ترکیبات فنلی موجود در قارچ اینوکوتیس لویس استفاده شد. نُه ترکیب استاندارد شامل آسکوربیک‌اسید، سالیسیلیک‌اسید، وانیلیک‌اسید، کوئرستین، پاراکوماریک‌اسید، رزورسینول، کاتچین، کافئیک‌اسید و سیرینجیک‌اسید استفاده و استانداردها در غلظت 1 میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر متانول حل شدند؛ همچنین از 1/0 گرم پودر خشک عصارۀ متانولی قارچ در 10 میلی‌لیتر متانول استفاده شد. آزمایش HPLC با استفاده از دستگاه KNAUER مدل well chrom مجهز به دتکتور (ردیاب) UV visible k2600 و برنامۀ EZchrom در سه طول موج 370، 280، 254 نانومتر به روش شویشی ایزوکراتیک انجام شد. این روش در شرایط شدت جریان 8/0 میلی‌لیتر‌بر‌دقیقه با استفاده از ستون Perfectsil Target ODS-3 (5µm) مجهز به گارد[13] و حجم تزریق 10 میکرولیتر انجام شد (21) تزریق برای هرکدام از ترکیبات استاندارد به‌طور مجزا در طول موج 280 نانومتر انجام شد. فاز متحرک شامل حلال A (آب حاوی 5/0 درصد استیک‌اسید) و حلال B ( استونیتریل) بود؛ برنامۀ حلال‌ها در جدول 1 آورده شده است.

 

جدول 1- برنامۀ درصدهای فاز متحرک و زمان روش ایزوکراتیک برای HPLC

درصدحلال**B

درصدحلالA*

زمان(دقیقه)

20

80

00/0

20

80

10

70

30

30

85

15

32

85

15

58

20

80

59

20

80

60

*حلال A (آب حاوی 5/0 درصد استیک‌اسید)، **حلال B (استونیتریل)

 

تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند. داده‌ها به روش آنالیز واریانس یک‌طرفه تجزیه‌و‌تحلیل آماری شدند و مقدار P کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته شد. تمام داده‌ها به شکل SD±mean گزارش شدند.

 

نتایج

میزان استخراج پودر خشک عصاره‌های به‌دست‌آمده از حلال‌های متانول، اتانول و آب به‌ترتیب برابر با 3/1، 07/1، 01/1 گرم و بازده استخراج عصاره‌های متانولی برابر 3/4 درصد، اتانولی برابر 5/3 درصد و آبی برابر 4/3 درصد بود.

میزان فنل کل موجود در عصاره‌ها:مقدار فنل موجود در هر عصاره بر اساس رابطۀ خط منحنی استاندارد گالیک‌اسید به‌شکل (y = 0.002x + 0.014, R² = 0.998) محاسبه شد (جدول 2). محتوای فنل کل در 1 گرم عصاره‌های متانولی، اتانولی و آبی به‌ترتیب برابر با 15/34، 5/17 و 5/14 میلی‌گرم گالیک‌اسید در 1 گرم پودر خشک عصاره بود. نتایج نشان دادند مقدار فنل استخراج‌شده با متانول بیشتر از دو حلال دیگر است (05/0.(P<

میزان فلاونوئید کل در عصاره‌ها:محتوای فلاونوئید کل موجود در عصاره‌ها با رابطۀ خط استاندارد کوئرستین (y= 0.0526x+0.028, R2=0.9993) محاسبه شد (جدول 3). محتوای فلاونوئید کل عصاره‌های متانولی، اتانولی و آبی قارچ به‌ترتیب برابر با 4/5، 85/4 و 5/3 میلی‌گرم کوئرستین در 1 گرم پودر خشک عصاره بود. محتوای فلاونوئید عصاره‌ها تفاوت معناداری (05/0 (P<با یکدیگر داشتند؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان به عصارۀ متانولی و کمترین میزان به عصارۀ آبی مربوط بود.


جدول 2- میزان فنل کل استخراج‌شده از قارچ اینوکوتیس لویس درحلال‌های اتانول، متانول و آب و جذب آنها در765 نانومتر (n:3) بر حسب میلی‌‌‌گرم گالیک‌اسید در گرم پودر خشک عصاره (05/0P<)

عصاره آبی

عصاره اتانولی

عصاره متانولی

غلظت عصاره‌ها

(میکرو‌گرم ‌برمیلی‌لیتر)

میزان گالیک‌اسید به‌دست‌آمده از منحنی کالیبراسیون (میلی‌گرم‌‌برمیلی‌لیتر)

جذب

میزان گالیک‌اسید به‌دست‌آمده از منحنی کالیبراسیون (میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر)

جذب

میزان گالیک‌اسید به‌دست‌آمده از منحنی کالیبراسیون (میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر)

جذب

 

0285/0± 001/0

071/0±002/0

035/0±002/0

084/0± 004/0

0683/0± 003/0

151/0±007/0

2000

25/14

5/17

15/34

میزان فنل کل در یک گرم عصارۀ قارچ  (میلی‌گرم ‌برگرم)

 

جدول 3- محتوای فلاونوئید کل و میزان جذب در 435 نانومتر در عصاره‌های متانولی، اتانولی و آبی قارچ اینوکوتیس لویس (n:3) بر حسب میلی‌گرم کوئرستین در گرم پودر خشک عصاره (05/0>P)

عصاره آبی

عصاره اتانولی

عصاره متانولی

غلظت (میکرو‌گرم ‌برمیلی‌لیتر)

میزان فلاونوئید به‌دست‌آمده از منحنی استاندارد (میلی‌گرم‌‌برمیلی‌لیتر)

جذب

میزان فلاونوئید به‌دست‌آمده از منحنی استاندارد (میلی‌گرم‌‌برمیلی‌لیتر)

جذب

میزان فلاونوئید به‌دست‌آمده از منحنی استاندارد (میلی‌گرم‌‌برمیلی‌لیتر)

جذب

007/0±0003/0

426/0±002/0

0097/0 ± 0001/0

534/0±007/0

0108/0± 001/0

558/0± 010/0

2000

5/3

85/4

4/5

میزان فلاونوئید کل در 1 گرم عصارۀ قارچ (میلی‌گرم ‌برگرم)

 


اثر آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها: ظرفیت آنتی‌اکسیدانی عصارۀ قارچ به روش حذف رادیکال‌های آزاد DPPH ارزیابی شد. در این روش، درصد مهار DPPH در غلظت‌های مختلف آسکوربیک‌اسید (شاهد مثبت) و عصاره‌ها به دست آمد. IC50 آسکوربیک‌اسید برابر با 94/4 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر بود. درصد مهار و IC50 عصاره‌ها در بازۀ غلظت‌های 5/312 تا 5000 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر در جدول 4 دیده می‌شود.

اثر ضدباکتریایی عصارهها: نتایج بررسی اثر ضدباکتریایی به روش رقیق‌سازی در چاهک (پلیت 96 خانه‌ای) در جدول 5 ارائه شده‌اند؛ میزان MIC و MBC عصاره‌های متانولی و اتانولی در این روش تقریباً برابر بود. عصاره‌های متانولی و اتانولی با غلظت 50 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر خاصیت مهارکنندگی بر باکتری سودوموناس آئروژینوزا داشتند؛ ولی در غلظت‌های بیشتر، اثر کشندگی روی این باکتری نداشتند. باکتری اشریشیا کلی با MIC برابر 25 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر و MBC برابر 50 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر بیشترین حساسیت را بین باکتری‌های گرم منفی نسبت به عصاره‌های متانولی و اتانولی داشت؛ هر سه باکتری گرم منفی به عصارۀ آبی این قارچ مقاوم بودند. اثر عصاره‌های متانولی و اتانولی بر باکتری‌های گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتیلیس مشابه یکدیگر و MIC آنها برابر 25 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر و MBC آنها برابر 50 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر بود. استرپتوکوکوس موتانس با MIC برابر 5/12 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر و MBC برابر 25 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر حساس‌تر از سایر باکتری‌ها نسبت به عصاره‌های متانولی و اتانولی بود.


 

جدول 4- میزان جذب در 517 نانومتر، درصد مهار DPPH و IC50 (برحسب میکروگرم‌برمیلی‌لیتر) عصاره‌‌های اینوکوتیس لویس

عصارۀ آبی

عصارۀ اتانولی

عصارۀ متانولی

غلظت عصاره بر حسب

میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر

درصدمهار DPPH

جذب

درصدمهار DPPH

جذب

درصدمهار DPPH

جذب

84/62

01/0±327/0

56/84

009/0±136/0

91/90

01/0±080/0

5000

47/43

02/0±498/0

95/79

01/0±203/0

03/86

01/0±123/0

2500

09/36

02/0±563/0

71/54

01/0±399/0

00/74

04/0±229/0

1250

09/30

02/0±608/0

4/45

01/0±498/0

88/57

02/0±371/0

625

47/22

01/0±679/0

07/35

03/0±572/0

42/46

01/0±472/0

5/312

25/3311

1003

555

IC50(µg/ml)

 

جدول 5- میزان MIC و MBC عصاره‌های قارچ اینوکوتیس لویس بر باکتری‌ها (بر حسب میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر)؛ علامت-: بدون اثر ضدباکتری

عصاره

باکتری

عصارۀ اتانولی

عصارۀ متانولی

عصارۀ آبی

کانامایسین

DMSO(5%)DW

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

MIC

MBC

-

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

50

-

50

-

-

-

625/0

25/1

-

Acinetobacter baumanniBAA747

50

100

50

100

-

-

01/0

03/0

-

Escherichia coli ATCC8739

25

50

25

50

-

-

004/0

009/0

-

Staphylococcus aureus ATCC25923

25

50

25

50

100

-

07/0

156/0

-

Bacillus subtilis ATCC6633

25

50

25

50

100

-

001/0

002/0

-

Streptococcus mutansATCC35665

5/12

25

5/12

25

100

-

03/0

07/0

-

 


نتایج بررسی کروماتوگرافی HPLC:باتوجه‌به اینکه مقادیر پلی‌فنل و فلاونوئید در عصارۀمتانولی بیشتر بود، عصارۀ متانولی برای تجزیه‌وتحلیل در آزمون HPLC استفاده شد.آزمون HPLC به روش ایزوکراتیک در سه طول موج به‌طور هم‌زمان انجام شد. طول موج‌های استفاده‌شده و زمان بازداری[14] آسکوربیک‌اسید، سالیسیلیک‌اسید، وانیلیک‌اسید، کوئرستین، پاراکوماریک‌اسید، رزورسینول، کاتچین، کافئیک‌اسید و سیرینجیک‌اسید که استاندارد در پژوهش حاضر بودند، در شکل 1 و جدول 6 گزارش شده‌اند.

 

 

شکل 1- نمودار HPLC ترکیبات استاندارد بر اساس ترتیب آنهادر سه طول موج 280، 254، 370 به روش ایزوکراتیک (زمان بازداری دقیق آنها در جدول 6 گزارش شده است). A: آسکوربیک اسید، B: کاتچین، C: کافئیک‌اسید، D: رزورسینول، E: سیرینیجیک‌اسید، F: وانیلیک‌اسید، G: پاراکوماریک‌اسید، H: سالیسیلیک‌اسید،  I: کوئرستین

 

جدول 6- استانداردهای استفاده‌شده در HPLC در پژوهش حاضر

طول موج(نانومتر)

زمان بازداری (دقیقه)

ترکیب استاندارد

280

27/3

Ascorbic acid

280

55/4

Catechin

280

18/5

Caffeic acid

280

83/5

Resorcinol

280

16/6

Syringic acid

280

05/8

Vanillic acid

280

38/10

P-coumaric acid

280

33/16

Salicylic acid

280

56/21

Quercetin

 

ترکیباتی که در طول موج و زمان بازداری مشابه با ترکیبات استاندارد در نمودار عصارۀ قارچ به دست آمدند، در شکل 2، الف و ب و جدول 7 مشخص شده‌اند. نتایج نشان دادند از میان نُه استاندارد بررسی‌شده، پنج ترکیب آسکوربیک‌اسید، کاتچین، رزورسینول، کافئیک‌اسید و وانیلیک‌اسید در عصارۀ متانولی این قارچ وجود داشتند.

 

 

 

 

 

شکل 2- الف. نمودار HPLC قارچ اینوکوتیس لویس بر اساس زمان بازداری. A: آسکوربیک‌اسید، B: کاتچین، C: کافئیک‌اسید، D: رزورسینول، F: وانیلیک‌اسید (سه طول موج 254، 280 و 370 نانومتر، روش ایزوکراتیک). ب. بزرگ‌نمایی پیک‌های نمودار HPLC شکل الف به‌طور تفکیک‌شده

 

جدول 7- ترکیبات شناسایی‌‌شده در عصارۀ متانولی اینوکوتیس لویس

طول موج(نانومتر)

زمان بازداری(دقیقه)

ترکیبات شناسایی شده

280

38/3

Ascorbic acid

280

41/4

Catechin

280

13/5

Caffeic acid

280

63/5

Resorcinol

280

06/8

Vanillic acid

 

بحث

طبق گزارش‌های سازمان بهداشت جهانی (WHO)، مقاومت باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها ممکن است به‌زودی به بحران بهداشت عمومی تبدیل شود. امروزه، اثربخشی آنتی‌بیوتیک‌های موجود در بازار به‌طور چشمگیری کاهش یافته و توسعۀ داروهای جدید برای درمان باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌ها به‌سرعت درحال پیشرفت است (22). در سال‌های اخیر، منابع دارویی طبیعی بسیاری استفاده شده‌اند و در این میان، قارچ‌ها با تنوع زیستی و تنوع متابولیتی زیادی که دارند می‌توانند به‌شکل منابع جدید ضدباکتریایی جایگزین شوند (2 و 23). در پژوهش حاضر برای نخستین‌بار، آثار ضدباکتریایی قارچ بازیدیومیستی اینوکوتیس لویس از خانوادۀ قارچ‌های ماکرومیستی هایمنوکتاسه بررسی شد؛ اعضای این خانواده آثار دارویی شناخته‌شده‌ای دارند (3) و آثار ضد‌باکتری و آنتی‌اکسیدانی از اعضای گونه‌های متعدد این خانواده به‌ویژه فلینوس و اینونوتوس گزارش شده است. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند از میان باکتری‌های بررسی‌‌شده، باکتری سودوموناس آئروژینوزا ATCC 9027 بیشترین مقاومت را نسبت به عصاره‌های قارچ اینوکوتیس لویس دارد و هیچ‌کدام از عصاره‌ها خاصیت MBC نسبت به این باکتری از خود نشان نمی‌دهند و صرفاً عصاره‌های متانولی و اتانولی در غلظت 50 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر MIC نسبت به این باکتری از خود نشان می‌دهند. در مطالعۀ حاضر، باکتری‌های گرم مثبت در برابر عصاره‌ها حساسیت بیشتری نسبت به باکتری‌های گرم منفی نشان دادند. در مطالعۀ سوای[xv] و همکاران نیز فعالیت ضدباکتریایی قارچ‌های بازیدیومیست مختلف نشان داد باکتری‌های گرم مثبت نسبت به عصاره‌های قارچ‌ها حساس‌تر از باکتری‌های گرم منفی‌اند (24) که با نتایج مطالعۀ حاضر مطابقت دارد. باکتری‌های گرم منفی دارای غشای خارجی حاوی لیپوپلی‌ساکاریدند که آنها را نسبت به برخی از ترکیبات ضدباکتریایی مقاوم می‌کند؛ این مطلب حساسیت بیشتر باکتری‌های گرم مثبت در مقایسه با انواع گرم منفی را نسبت به عصارۀ قارچ توجیه می‌کند (25–27)؛ همچنین در پژوهش حاضر، عصارۀ آبی اینوکوتیس لویس تنها باعث مهار رشد (MIC) باکتری‌های گرم مثبت شد، ولی خاصیت کشندگی (MBC) روی آنها نداشت.

در پژوهش گلاموکلیجا[xvi] و همکاران، خاصیت ضدباکتری عصاره‌های اتانولی و آبی اینونوتوس اوبلیگوس[xvii] روی چهار باکتری گرم مثبت و چهار باکتری گرم منفی بررسی شد و MIC و MBC آنها در عصارۀ اتانولی بین 5/1 تا 6 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر و در عصارۀ آبی 75/0 تا 3 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر بود که درمقایسه با مطالعۀ حاضر نشان می‌دهد اثر ضدباکتریایی عصاره‌های مشابه اینونوتوس اوبلیگوس قوی‌تر از اینوکوتیس لویس است (28). خاصیت ضدباکتری عصارۀ متانولی فلینوس ریموسوس[xviii] روی سویه‌های باکتری‌های بیماری‌زا ازجمله سودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتیلیس در پژوهش شینا[xix] و همکاران گزارش شده است (29). هور[xx] و همکاران اثر ضدباکتری عصارۀ متانولی فلینوس لینتئوس[xxi] را با MIC برابر 500 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر روی استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین گزارش کرده‌اند (30). در مطالعه‌ای دیگر، بلسار[xxii] و همکاران خاصیت ضدباکتری قارچ‌های پلی‌پور فلینوس سویتنیا[xxiii] و فلینوس مریلیی[xxiv] را با میزان MIC برابر 71/0 تا 42/1 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر روی باکتری اسینتوباکتربومانی گزارش کرده‌اند (31). در پژوهش ندلکوسکا[xxv] و همکاران، اثر ضدباکتری عصارۀ متانولی فلینوس ایگنیاریوس[xxvi] بر باکتری‌های سودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتیلیس با MICهای به‌ترتیب 10، 5، 5، 5/2 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر گزارش شده است؛ در مطالعۀ آنها مانند پژوهش حاضر، اثر ضد‌باکتری عصارۀ متانولی بر باکتری‌های گرم مثبت بیشتر از باکتری‌های گرم منفی بود (32)، ولی میزان MIC و MBC عصاره‌های قارچ‌های یادشده با نمونۀ آزمایش‌شده در پژوهش حاضر تفاوت داشت که از تفاوت در نوع و مقدار متابولیت‌های موجود در هر گونه ناشی می‌شود.

آنتی‌اکسیدان‌ها توانایی حذف یا کاهش رادیکال‌های آزاد را دارند و مانع بیماری‌های دژنراتیو می‌شوند. روش رنگ‌‌سنجی (DPPH)، روش ساده‌ای برای تعیین فعالیت آنتی‌اکسیدانی ترکیبات مختلف است (33). در بررسی حاضر، خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های مختلف قارچ اینوکوتیس لویس بررسی شد. نتایج نشان دادند عصاره‌های متانولی و اتانولی خاصیت آنتی‌اکسیدانی قوی‌تری نسبت به عصارۀ آبی دارند و آزمون آماری نیز این نتایج را تأیید کرد؛ همچنین IC50 عصاره‌های متانولی، اتانولی و آبی به‌ترتیب برابر با 555، 1003و 25/3311 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر بود. در پژوهش دبناث[xxvii] و همکاران خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های مختلف اینونوتوس اوبلیگوس گزارش شد و خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها رابطۀ مستقیمی با غلظت آنها داشت (34). در مطالعه‌ای دیگر، جانگ[xxviii] و لی[xxix] خاصیت آنتی‌اکسیدانی پلی‌فنل‌هایی نظیر هیسپیدین، هیفولومین بی[xxx]، کافئیک‌اسید و دیگر ترکیبات فنلی موجود در قارچ‌های اینونوتوس زرانتیکوس[xxxi] و فلینوس لینتئوس را گزارش کرده‌اند (35–37) که در آزمون HPLC مطالعۀ حاضر، ترکیب کافئیک‌اسید در عصارۀ متانولی تشخیص داده شد؛ در پژوهش دیگری نیز خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصارۀ متانولی و پلی‌فنل‌های اینونوبلین[xxxii] و فلیگریدین[xxxiii]جدا‌شده از قارچ اینونوتوس اوبلیگوس گزارش شده است (38). دای[xxxiv] و همکاران در سال 2010، خاصیت آنتی‌اکسیدانی هیسپیدین موجود در گونه‌های فلینوس را گزارش کرده‌اند (39). اگرچه نتایج پژوهش‌های یادشده با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارند، تفاوت‌هایی در مقدار IC50 آنها وجود دارند که به نظر می‌رسد از تفاوت در نوع متابولیت‌های هر قارچ و روش عصاره‌گیری ناشی می‌شوند.

پژوهش آبوگری[xxxv] در سال 2013 نشان داد روش استخراج، نوع حلال و نوع گونۀ قارچ بر میزان استخراج متابولیت‌های ثانویه اثر می‌گذارد و مقدار فنل و فلاونوئید کل در عصاره‌ها باتوجه‌به حلال‌‌های مختلف و گونه‌های قارچ‌های مختلف تفاوت زیادی دارد؛ برای نمونه در برخی مطالعه‌ها، میزان فنل کل عصارۀ متانولی یک قارچ بیشتر است و در قارچ دیگر، میزان فنل کل عصارۀ اتانولی در مقایسه با دیگر عصاره‌ها بیشتر است و این تفاوت‌ها نشان می‌دهند استخراج متابولیت‌های قارچ‌ها دستورعمل‌های متفاوتی دارد که به نوع قارچ، گروه و جنس آن نیز بستگی دارد و به پژوهش‌های بیشتر در این زمینه نیاز است (40). در مطالعۀ حاضر، مقدار فنل و فلاونوئید کل در عصارۀ متانولی در غلظت‌های مختلف بیشتر از دو عصارۀ دیگر بود و اختلاف میان آنها معنادار بود؛ همچنین ارتباط مستقیمی بین میزان فنل و فلاونوئید با میزان اثر آنتی‌اکسیدانی و ضدباکتریایی عصاره‌ها وجود داشت که این نسبت در مطالعه‌های دیگر نیز نشان داده شده است (41)؛ باوجوداین، محتوای کل ترکیبات فنلی به‌تنهایی معیار دقیق و ثابتی برای اثبات قدرت آنتی‌اکسیدانی و ضد‌باکتریایی یک نمونه نیست، بلکه ماهیت، نوع و میزان ترکیبات منفرد فنلی نمونه شاخص قدرت آنتی‌اکسیدانی و ضد‌باکتریایی آن به شمار می‌آیند. در پژوهش حاضر، روش کروماتوگرافی HPLC استفاده و باتوجه‌به استانداردهای انتخابی، حضور تعدادی از ترکیبات فنلی و آسکوربیک‌اسید در عصارۀ متانولی این قارچ بررسی شد.

ترکیباتی که در آزمون HPLC عصارۀ متانولی قارچ اینوکوتیس لویس در پژوهش حاضر تشخیص داده شدند، عبارتند از: آسکوربیک‌اسید، کاتچین، رزورسینول، وانیلیک‌اسید وکافئیک‌اسید. ویژگی ضدباکتریایی و آنتی‌اکسیدانی کافئیک‌اسید،کاتچین، رزورسینول (42–45) و آسکوربیک‌اسید (46 و 47) در پژوهش‌های مختلف بررسی و گزارش شده است. در مطالعۀ نوواکا[xxxvi] در سال 2015 و آلوس[xxxvii] در سال 2013، ویژگی‌های ضدباکتریایی فنل کل و چند ترکیب فنلی مانند وانیلیک‌اسید و مشتقات سینامیک‌اسید (فرولیک‌اسید، کومارین، و کافئیک‌‌اسید) شناسایی‌شده در چند قارچ ماکرومیست روی باکتری‌های گرم مثبت و منفی گزارش شده‌اند (1 و 48)؛ بنابراین، ویژگی ضدباکتریایی قارچ اینوکوتیس لویس را می‌توان تا حدی به ترکیبات فنلی آن نسبت داد، اما پژوهش‌های بیشتری در این زمینه لازم است.

پژوهش‌های چندانی در زمینۀ ویژگی‌های ترکیبات زیست‌فعال قارچ‌های خانوادۀ هایمنوکتاسه در ایران انجام نشده‌اند. احسانی‌فرد[xxxviii] و همکاران پتانسیل کنترل هیپرتری‌گلیسیریدمی و نیز تنظیم انسولین را با استفاده از عصارۀ آبی قارچ اینوکوتیس لویس گزارش کرده‌اند (13 و 14)؛ به‌طوری‌که تیمار موش‌ها با عصارۀ آبی این قارچ سبب کاهش سطوح تری‌گلیسیرید در سرم خون و سطح آنزیم کبدی AST و کاهش نفوذ لکوسیت‌ها در بافت کبد می‌شود (13)؛ ازاین‌رو، به نظر می‌رسد انجام پژوهش‌های بیشتر در زمینۀ ویژگی‌های دارویی این قارچ ضروری است.

 

نتیجه‌گیری

نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند قارچ اینوکوتیس لویس عملکرد آنتی‌اکسیدانی و ضدباکتریایی دارد و دارای ترکیبات فنلی و آسکوربیک‌اسید است. عصاره‌های متانولی و اتانولی اثر ضدباکتریایی و آنتی‌کسیدانی قوی‌تری نسبت به عصارۀ آبی دارند و مقدار ترکیبات فنلی و فلاونوئید کل آنها نسبت به عصارۀ آبی بیشتر است. ویژگی ضدباکتریایی اینوکوتیس لویس را تا حدی می‌توان به میزان ترکیبات فنلی آن نسبت داد. ترکیبات ضدباکتریایی موجود در قارچ‌ها پتانسیل ارزشمندی برای کاربرد به‌شکل آنتی‌بیوتیک‌های جدید در درمان عفونت‌ها دارند؛ همچنین می‌توان از آنها به‌شکل آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی استفاده کرد. بدیهی است به‌منظور طراحی آنتی‌بیوتیک‌ها وآنتی‌اکسیدان‌ها از گونه‌های مختلف ازجمله اینوکوتیس لویس باید سایر متابولیت‌های قارچ استخراج و بررسی‌های فارماکولوژیک به‌ویژه آزمون‌های سمیت سلولی و سازوکار‌های تعاملی انجام شوند.

 

سپاسگزاری

مطالعۀ حاضر بخشی از پایان‌نامۀ دورۀ دکتری نویسندۀ اول مصوب در سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران است. نویسندگان از همکاری مسئولان محترم آزمایشگاه‌ها و افرادی که ما را در انجام پژوهش حاضر یاری کردند، سپاسگزاری می‌کنند. پژوهش حاضر باکمک مالی شمارۀ 8243/98 ستادتوسعۀ زیست‌فناوری معاونت علمی و فناوری ریاست جمهوری انجام شده است.

(1)              Nowacka N., Nowak R., Drozd M., Olech M., Los R., Malm A. Antibacterial, antiradical potential and phenolic compounds of thirty-one polish mushrooms. Plos One 2015; 10(10): 1-13.
(2)              De Silva DD., Rapior S., Sudarman E., Stadler M., Xu J., Alias SA., Hyde KD. Bioactive metabolites from macrofungi: ethnopharmacology, biological activities and chemistry. Fungal Diversity 2013; 62(1): 1-40.
(3)              Zjawiony JK. Biologically active compounds from Aphyllophorales (Polypore) fungi. Journal of Natural Products 2004; 67(2): 300-310.
(4)              Yamaç M., Bilgili F. Antimicrobial activities of fruit bodies and/or mycelial cultures of some mushroom isolates. Pharmaceutical Biology 2006; 44(9): 660-667.
(5)              Svahn KS., Go U., El-seedi H., Bohlin L., Joakim DG., Chryssanthou E. Antimicrobial activity of filamentous fungi isolated from highly antibiotic- contaminated river sediment. Infection Ecology and Epidemiology 2012; 1: 6-11.
(6)              Alves MJ., Ferreira ICFR., Dias J., Teixeira V., Martins A. A review on antifungal activity of mushroom extracts and isolated compounds. Current Topics in Medicinal Chemistry 2012; 78: 1707-1718.
(7)              Kim MY., Seguin P., Ahn JK, Kim JJ., Chun SC., Kim EH., Seo SH., Kang EY., Kim SL., Park YJ., Ro HM. Phenolic compound concentration and antioxidant activities of edible and medicinal mushrooms from Korea. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2008; 56(16): 7265-7270.
(8)              Sánchez C. Reactive oxygen species and antioxidant properties from mushrooms. Synthetic and Systems Biotechnology 2017; 2(1): 13-22.
(9)              Di Meo S., Reed TT., Venditti P., Victor VM. Role of ROS and RNS sources in physiological and pathological conditions. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016; Special Issue: 1-44.
(10)          Leslie SW., Gad SC., Acosta D. Cytotoxicity of butylated hydroxytoluene and butylated hydroxyanisole in cultured heart cells. Toxicology 1978; 10: 281-289.
(11)          Ferreira IC., Barros L., Abreu R. Antioxidants in wild mushrooms. Current Medicinal Chemistry 2009; 16(12): 1543-1560.
(12)          Ghobad-Nejhad M., Kotiranta H. The genus Inonotus sensu lato in Iran, with keys to Inocutis and Mensularia worldwide. Annales Botanici Fennici 2008; 45(6): 465-476.
(13)          Ehsanifard Z., Mir Mohammadrezaei F., Ghobad-Nejhad M., Safarzadeh A. Effect of aqueous extract of Inocutis levis on liver histopathology and hypertriglyceridemia in high sucrose fed Wistar rats. Journal of Medicinal Plants 2019; 70: 181-187.
 
(14)          Ehsanifard Z., Mir-Mohammadrezaei F., Safarzadeh A., Ghobad-Nejhad M. Aqueous extract of Inocutis levis improves insulin resistance and glucose tolerance in high sucrose-fed Wistar rats., Journal of Herbmed Pharmacology 2017; 6(4): 160-164.
(15)          Singleton VL., Orthofer R., Lamuela-Raventós RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods in Enzymology 1999; 299: 152-178.
(16)          Mitrović T., Stamenković S., Cvetković V., Tošić S., Stanković M., Radojević I., Stefanović O., Čomić L., Đačić D., Ćurčić M., Marković S. Antioxidant, antimicrobial and antiproliferative activities of five lichen species. International Journal of Molecular Sciences 2011; 12(8): 5428-5448.
(17)          Stankovic MS. Total phenolic content, flavonoid concentration and antioxidant activity of Marrubium peregrinum L. extracts. Kragujevac Journal of Science 2011; 33: 63-72.
(18)          Matejić JS., Džamić AM., Mihajlov-Krstev TM., Randelović VN., Krivošej ZD., Marin PD. Total phenolic and flavonoid content, antioxidant and antimicrobial activity of extracts from Tordylium maximum. Journal of Applied Pharmaceutical Science 2013; 3(1): 55-59.
(19)          Wang X., Sankarapandian K., Cheng Y., Woo SO., Kwon HW., Perumalsamy H., Ahn YJ. Relationship between total phenolic contents and biological properties of propolis from 20 different regions in South Korea. BMC Complementary and Alternative Medicine 2016: 2016; 16(65): 1-12.
(20)          Shimada K., Fujikawa K., Yahara K., Nakamura T. Antioxidative  properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1992; 40(6): 945-948.
(21)          Mradu G., Saumyakanti S., Sohini M., Arup M. HPLC profiles of standard phenolic compounds present in medicinal plants. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research 2012; 4(3): 162-167.
(22)          Tacconelli E., Carrara E., Savoldi A., Harbarth S., Mendelson M., Monnet DL., Pulcini C., Kahlmeter G., Kluytmans J., Carmeli Y., Ouellette M. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. The Lancet Infectious Diseases 2018; 18(3): 318-327.
(23)          Wasser SP. Medicinal mushroom science: history, current status, future trends, and unsolved problems. International Journal of Medicinal Mushrooms 2010; 12(1): 1-16.
(24)          Suay I., Arenal F., Asensio FJ., Basilio A., Cabello MA., Díez MT., García JB., Del Val AG., Gorrochategui J., Hernández P., Peláez F. Screening of basidiomycetes for antimicrobial activities. Antonie van Leeuwenhoek 2000; 78(2): 129-140.
(25)          Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiological Reviews 1985; 49(1): 1-32.
(26)          Scherrer R., Gerhardt P. Molecular sieving by the Bacillus megaterium cell wall and protoplast. Journal of Bacteriology 1971; 107(3): 718-735.
(27)          Negi PS., Jayaprakasha GK. Antioxidant and antibacterial activities of Punicagranatum peel extracts. Journal of Food Science 2003; 68(4): 1473-1477.
(28)          Glamočlija J., Ćirić A., Nikolić M., Fernandes Â., Barros L., Calhelha RC., Ferreira IC., Soković M., Van Griensven LJ. Chemical characterization and biological activity of Chaga (Inonotus obliquus), a medicinal “mushroom”. Journal of Ethnopharmacology 2015; 162: 323-332.
(29)          Sheena N., Ajith TA., Mathew A., Janardhanan KK. Antibacterial activity of three macrofungi, Ganodermalucidum, Navesporusfloccosa and Phellinus rimosus occurring in South India. Pharmaceutical Biology 2003; 41(8): 564-567.
(30)          Hur JM., Yang CH., Han SH., Lee SH., You YO., Park JC., Kim KJ. Antibacterial effect of Phellinus linteus against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia 2004; 75(6): 603-605.
(31)          Belsare MH., Bapat GS., Ranadive KR., Vaidya JG., Deokule SS. No TiIn-vitro susceptibility testing of some Phellinus species against Acinetobacter baumannii from Maharashtra Indiatle. Journal of Medicinal Plants Research 2010; 4(13): 1335-1338.
(32)          Walsh FM., Amyes SG. Microbiology and drug resistance mechanisms of fully resistant pathogens. Current Opinion in Microbiology 2004; 7(5): 439-444.
(33)          Dulay RMR., Miranda LA., Malasaga JS., Kalaw SP., Reyes RG., Hou CT. Antioxidant and antibacterial activities of acetonitrile and hexane extracts of Lentinus tigrinus and Pleurotus djamour. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 2017; 9: 141-144.
(34)          Debnath T., Park S., Kim D., Jo J., Lim B. Anti-oxidant and anti-inflammatory activities of inonotus obliquus and germinated brown rice extracts. Molecules. 2013; 18(8): 9293-9304.
(35)          Jung JY., Lee IK., Seok SJ., Lee HJ., Kim YH., Yun BS. Antioxidant polyphenols from the mycelial culture of the medicinal fungi Inonotusxeranticus and Phellinus linteus. Journal of Applied Microbiology 2008; 104(6): 1824-1832.
(36)          Lee IK., Seok SJ., Kim WK., Yun BS. Hispidin derivatives from the mushroom Inonotus xeranticus and their antioxidant activity. Journal of Natural Products 2006; 69(2): 299-301.
(37)          Park I-H., Chung S-K., Lee K-B., Yoo Y-C., Kim S-K., Kim G-S., et al. An antioxidant hispidin from the mycelial cultures of Phellinus linteus.Archives of Pharmacal Research 2004; 27(6): 615-618.
(38)          Lee IK., Kim YS., Jang YW., Jung JY., Yun BS. New antioxidant polyphenols from the medicinal mushroom Inonotus obliquus. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2007; 17(24): 6678-6681.
(39)          Dai Y-C., Zhou L-W., Cui B-K., Chen Y-Q., Decock C. current advances in Phellinus sensu lato: medicinal species, functions, metabolites and mechanisms. Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 87(5): 1587-1593.
(40)          Abugri DA., McElhenney WH. Extraction of total phenolic and flavonoids from edible wild and cultivated medicinal mushrooms as affected by different solvents. Journal of Natural Product and Plant Resources 2013; 3(3): 37-42.
(41)          Chang HY., Ho YL., Sheu MJ., Lin YH., Tseng MC., Wu SH., Huang GJ., Chang YS. Antioxidant and free radical scavenging activities of Phellinus merrillii extracts. Botanical Studies 2007; 48(4): 407-417.
(42)          Jiang RW., Lau KM., Hon PM., Mak TC., Woo KS., Fung KP. Chemistry and biological activities of caffeic acid derivatives from salvia miltiorrhiza. Current Medicinal Chemistry 2005; 12(2): 237-246.
(43)          Magnani C., Isaac VL., Correa MA., Salgado HR. Caffeic acid: A review of its potential use in medications and cosmetics, analytical methods. Royal Society of Chemistry 2014; 6: 3203-3210.
(44)          Alvarado IE., Navarro D., Record E., Asther M., Asther M., Lesage-Meessen L. Fungal biotransformation of p-coumaric acid into caffeic acid by Pycnoporus cinnabarinus: An alternative for producing a strong natural antioxidant. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2003; 19(2): 157-160.
(45)          Veluri R., Weir TL., Bais HP., Stermitz FR., Vivanco JM. Phytotoxic and antimicrobial activities of catechin derivatives. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2004; 52: 1077-1082.
(46)          Cort, M. W. Antioxidant properties of ascorbic acid in foods. Ascorbic Acid: Chemistry, Metabolism, and Uses 1982; 31-45.
(47)          Verghese RJ., Ramya SR., Kanungo R. In vitro antibacterial activity of vitamin C and in combination with ciprofloxacin against uropathogenic Escherichia coli. Journal of Clinical and Diagnostic Research 2017; 11(12): 1-5.
Alves MJ., Ferreira ICFR., Froufe HJC., Abreu RMV., Martins A., Pintado M. Antimicrobial activity of phenolic compounds identified in wild mushrooms, SAR analysis and docking studies. Journal of Applied Microbiology 2013; 115(2): 346-357.