نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد شیمی و حاصلخیزی خاک، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
2 دانشیار شیمی و حاصل خیزی خاک، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
3 استادیار خاک شناسی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Biosurfactants are unique amphipathic molecules with extensive application in removing organic and metal contaminants. The purpose of this study was to investigate production of biosurfactant and determine optimal conditions to produce biosurfactant by Bacillus pumilus 1529 and Bacillus subtilis WPI.
Materials and methods: In this study, effect of carbon source, temperature and incubation time on biosurfactant production was evaluated. Hemolytic activity, emulsification activity, oil spreading, drop collapse, cell hydrophobicity and measurement of surface tension were used to detect biosurfactant production. Then, according to the results, the optimal conditions for biosurfactant production by and Bacillus subtilis WPI was determined.
Results: In this study, both bacteria were able to produce biosurfactant at an acceptable level. Glucose, kerosene, sugarcane molasses and phenanthrene used as a sole carbon source and energy for the mentioned bacteria. Bacillus subtilis WPI produced maximum biosurfactant in the medium containing kerosene and reduced surface tension of the medium to 33.1 mN/m after 156 hours of the cultivation at 37°C. Also, the highest surface tension reduction by Bacillus pumilus 1529 occurred in the medium containing sugarcane molasses and reduce the surface tension of culture medium after 156 hours at 37°C from 50.4 to 28.83 mN/m.
Discussion and conclusion: Bacillus pumilus 1529 and Bacillus subtilis WPI had high potential in production of biosurfactant and degradation of petroleum hydrocarbons and Phenanthrene. Therefore, it could be said that these bacteria had a great potential for applications in bioremediation and other environmental process.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
سورفکتانت یکی از مواد شیمیایی است که بیشتر در زندگی روزمره استفاده میشود. از آغاز قرن بیستم تولید طیف گستردهای از سورفکتانتهای مصنوعی از منابع نفتی بهشدت افزایشیافته است اما استفاده از بیوسورفکتانتهای طبیعی مانند صابون (نمک اسید چرب)، لسیتین (فسفولیپید) و یا ساپونین (گلیکولیپید) در صنعت و منازل قدمت بیشتری دارد. سورفکتانت شامل یک بخش آبگریز و یک بخش آبدوست است. از سورفکتانتها در صنعت بهعنوان ماده هماور[1]، مرطوبکننده، عامل کفساز، امولسیون کننده و روان کننده استفاده میشود. توانایی کاهش کشش سطحی یکی از ویژگیهای مهم سورفکتانت است (1). امروزه بیوسورفکتانتها با استفاده از مواد زائد حاصل از فرآیندهای مختلف، بهعنوان منبع کربن تولید میشود. مصرف مواد ارزان قیمت تجدیدپذیر طبیعی، پسماندهای کشاورزی و یا پسابهای صنعتی و شهری بهعنوان سوبستراهای جایگزین، علاوه بر کمک به عدم تجمع این مواد در طبیعت به تولید مادهای با ارزش نیز کمک میکند (2).
آلودگی خاک به نفت یکی از مشکلات شایع زیستمحیطی است. روشهای پاکسازی خاک از نفت دشوار بوده و یا به لحاظ اقتصادی امکانپذیر نیست. یکی از اقتصادیترین روشهای زیست پالایی استفاده از میکروارگانیسمهاست که باعث سادهسازی و یا تخریب کامل ساختار مولکولی آلایندههای زیستمحیطی میشود (1، 3 و 4).
دسترسی زیستی آلایندههای نفتی در محیط زیست به علت ﺣﻼﻟﻴﺖ ناچیز این ترکیبات بسیار کم است،
از اینرو موجب تخریب محیطزیست و سلامت انسانها میشوند. بنابراین، بیوسورفکتانتﻫﺎ میتوانند بهعنوان ﻋﺎﻣﻞ ﻣﺤﺮک برای اﻓﺰاﻳﺶ ﺗﺠﺰﻳﻪ زﻳﺴﺘﻲ اﻳﻦ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت مؤثر باشند. بیوسورفکتانت با کاهش کشش سطح و بینسطحی، افزایش سطح ترکیبات نامحلول به افزایش تحرک و فراهمی زیستی هیدروکربنها منجر میشود. در نتیجه، بیوسورفکتانت به افزایش تجزیه زیستی و حذف هیدروکربنها منجر میشود. علاوه بر این، بیوسورفکتانت از طریق افزایش حلالیت و امولسیون نیز باعث افزایش تجزیه زیستی هیدروکربنهای نفتی میشود (5 و 6).
جمعی از پژوهشگران آثار رامنولیپید تولیدشده توسط Pseudomonas aeruginosaدر آبگریزی سطح سلول و تجزیه زیستی فنانترن توسط دو باکتری گرمادوست Bacillus subtilis وPseudomonas aeruginosaو ترکیبی از هر دو سویه را بررسی کردند. در غیاب رامنولیپید ترکیب دو سویه 2/82 درصد از فنانترن را در کمتر از 30 روز حذف کرد. در حالی که افزودن رامنولیپید جذب فنانترن را بهواسطه سورفکتانت افزایش داد (7). کالو و همکاران[2] در اسپانیا با استفاده از باکتری Bacillus pumilus تجزیه نفتالین و تولید بیوسورفکتانت را مطالعه کردند. پس از جداسازی سویههای باکتری، آن را در حضور 1/0 درصد (وزنی) نفت خام و نفتالین در شرایط هوازی رشد دادند. نتایج نشان داد که این باکتری ظرفیت امولسیونکنندگی نفت خام را داراست و ازاینرو میتوان برای حذف هیدروکربنهای نفتی به روش زیستی از آن استفاده کرد (8).
بر این اساس، پژوهش حاضر بهمنظور بررسی توانایی تولید بیوسورفکتانت و انتخاب بهترین منبع کربن برای تولید بیوسورفکتانت انجام شد.
مواد و روشها.
تهیه باکتری: باکتری Bacillus pumilus 1529 بهشکل لیوفیلیزه از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران و باکتری Bacillus subtilis WPI از کلکسیون میکروبی گروه خاکشناسی دانشگاه شهید چمران اهواز تهیه و بر روی پلیتهای حاوی محیط کشت آگار مغذی[3] کشت شد. باکتری Bacillus pumilus 1529 از مناطق آلوده به هیدروکربنهای نفتی و باکتری Bacillus subtilis WPIاز پساب کارخانجات کاغذسازی استان خوزستان (9) جداسازی شده بودند.
شرایط کشت و تولید بیوسورفکتانت: برای تولید بیوسورفکتانت از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت مایع مغذی[4] (چگالی نوری[5]= 1) استفاده شد. به این شکل که پنج درصد از کشت شبانه باکتری به ارلنهای حاوی محیط کشت نمک معدنی[6] (جدول 1) با اسیدیته 2/7 و منابع مختلف کربن، شامل: 2/1 درصد (وزنی/ حجمی) گلوکز، پنج درصد (وزنی/ حجمی) ملاس، دو درصد (وزنی/ حجمی) نفت سفید و 100 میلیگرم بر لیتر فنانترن تلقیح شد. همچنین، به تمامی محیط کشتها 1/0 درصد (وزنی/ حجمی) آمونیوم سولفات بهعنوان منبع نیتروژن اضافه شد. نمونهها در دو درجه حرارت 30 و 37 درجه سلسیوس و با سرعت دورانی 180 دور در دقیقه[7] در دو دوره زمانی 48 و 156 ساعته نگهداری شدند. پس از ﮔﺬﺷﺖ دوره گرماگذاری، ﻣﺤﻠﻮل ﺑﺎﻗﯿﻤﺎﻧﺪه ﺑﻪ ﻣﺪت 15 دﻗﯿﻘﻪ ﺑﺎ دور 8500 ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ شد ﺗﺎ سلولها و ذرات ﻣﻌﻠﻖ از آن ﺣﺬف ﺷﻮد (2). مایع رویی بهدستآمده برای تولید ﺑﯿﻮﺳﻮرﻓﮑﺘﺎﻧﺖ بررسی شد.
جدول 1- ترکیبات محیط کشت نمک معدنی (10)
|
ترکیبات |
مقدار |
|
پتاسیم دی هیدروژن فسفات |
2 گرم |
|
آمونیوم نیترات |
1/0 گرم |
|
منیزیم سولفات |
1/0 گرم |
|
سدیم کلرید |
1/0 گرم |
|
سولفات آهن 7 آبه |
1/0 گرم |
|
دی سدیم هیدروژن فسفات |
4/2 گرم |
|
کلسیم کلرید 2 آبه |
013/0 گرم |
|
سولفات روی 7 آبه |
4/1 گرم |
|
سولفات منگنز 7 آبه |
2/1 گرم |
|
سولفات مس 5 آبه |
25/0 گرم |
|
آب مقطر |
1000 میلیلیتر |
غربالگری بیوسورفکتانت
آزمایش همولیز خون: بهمنظور تعیین توانایی تولید بیوسورفکتانت ابتدا فعالیت همولیتیکی باکتریها بررسی شد. بدین منظور تک کلونیهای حاصل اﺯ ﻛﺸﺖ ۲۴ ﺳﺎﻋﺘﻪ دو باکتری، ﺑﺮ ﺭﻭﻱ پلیتهای حاوی ﺁﮔﺎﺭ خوندار[8] (ﺩﺍﺭﺍﻱ ۵ ﺩﺭﺻﺪ (حجمی/ حجمی) ﺧﻮﻥ ﮔﻮﺳﻔﻨﺪ)، کشت شد و ﺑﻪ ﻣﺪﺕ ۴۸ ﺳﺎﻋﺖ ﺩﺭ گرمخانه در دمای ۳۷ ﺩﺭﺟﻪ سلسیوس ﻗﺮﺍﺭ ﺩﺍﺩﻩ شد. فعالیت همولیتیک با حضور منطقه شفاف اطراف کلونیهای باکتریایی شناسایی میشود (11).
آزمون پراکنش نفت[9]: در این آزمون، 30 میلیلیتر آب ﻣﻘﻄﺮ درون یک ﭘﻠﯿﺖ رﯾﺨﺘﻪ، 20 میکرولیتر ﻧﻔﺖ ﺧﺎم ﺑﻪ ﻣﺮﮐﺰ ﭘﻠﯿﺖ اﺿﺎﻓﻪ و در ﭘﺎﯾﺎن، 10 میکرو لیتر از ﻫﺮ ﻧﻤﻮﻧﻪ حاصل از ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ ﺑﺮ ﻻﯾﻪ ﻧﻔﺘﯽ ایجادشده رﯾﺨﺘﻪ شد. چنانچه محلول رویی حاصل از سانتریفوژ حاوی بیوسورفکتانت باشد، قادر خواهد بود ﻻﯾﻪ ﻧﻔﺘﯽ را ﮐﻨﺎر ﺑﺰﻧﺪ و در ﺳﻄﺢ آب ناحیه شفافی ایجاد کند (12).
فروپاشی روغن[10]: در این مرحله10 میکرولیتر از ﻣﺤﻠﻮل روﻳﻲ حاصل از ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ ﺑﻪ درون ﻫﺮ ﭼﺎﻫﻚ ﭘﻠﻴﺖ الایزا ﺣﺎوی 100 میکرولیتر ﭘﺎراﻓﻴﻦ اﺿﺎﻓﻪ ﮔﺮدﻳﺪ. در اﻳﻦ آزﻣﺎﻳﺶ از سورفکتانت ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ تویین 20 بهعنوان ﺷﺎﻫﺪ ﻣﺜﺒﺖ و از ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ نمک معدنی همراه با منبع کربن بهعنوان ﺷﺎﻫﺪ ﻣﻨﻔﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. در ﺻﻮرت ﺗﺸﻜﻴﻞ ﻗﻄﺮه ﻛﺮوی در ﺳﻄﺢ ﭘﺎراﻓﻴﻦ اﻣﺘﻴﺎز ﻣﻨﻔﻲ ﺑﻪ ﭼﺎﻫﻚ و در صورتیکه ﻗﻄﺮه اضافهشده ﺑﻪ ﺗﻪ ﭼﺎﻫﻚ ﻣﻨﺘﻘﻞ شود یا از حالت کروی خارج شود اﻣﺘﻴﺎز ﻣﺜﺒﺖ میگیرد. ﻧﺘﺎﻳﺞ در زمانهای 1، 30 و 60 دﻗﻴﻘﻪ ﻳﺎدداﺷﺖ ﺷﺪ (13).
فعالیت امولسیون کنندگی[11]: ﺑﺮای اﻧﺠﺎم اﯾﻦ آزمون، دو میلیلیتر از ﻫﺮ ﻧﻤﻮﻧﻪ حاصل از ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ، درون لولههای آزﻣﺎﯾﺶ ﺟﺪاﮔﺎﻧﻪ رﯾﺨﺘﻪ و دو میلیلیتر ﻧﻔﺖ ﺳﻔﯿﺪ ﻧﯿﺰ ﺑﻪ ﻫﺮﮐﺪام اﺿﺎﻓﻪ شد. ﺳﭙﺲ، هر نمونه ﺑﻪ ﻣﺪت دو دﻗﯿﻘﻪ ﺗﺤﺖ ورﺗﮑﺲ ﺷﺪﯾﺪ ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺖ، پس از آن نمونهها ﺑﻪ ﻣﺪت 24 ﺳﺎﻋﺖ در ﻣﺤﯿﻂ بهشکل ﺳﺎﮐﻦ ﻗﺮار گرفتند. پس از گذشت این زمان، ارتفاع امولسیون ﺑﺎﻗﯿﻤﺎﻧﺪه درون ﻫﺮ لولهآزمایش اندازهگیری ﺷﺪ و ﻧﺴﺒﺖ ارتفاع این امولسیون به ارتفاع کل مایع درون لوله آزمایش، به عنوان شاخص امولسیفیکاسیون برای هر نمونه گزارش شد (12).
آبگریزی سطح سلول: این روش از روشهای غیرمستقیم برای غربالگری تولید ﺑﯿﻮﺳﻮرﻓﮑﺘﺎﻧﺖ ریز موجودات است. با وجود این، برای شناسایی سریع سویههای تولیدکننده ﺑﯿﻮﺳﻮرﻓﮑﺘﺎﻧﺖ میتوان از این روش استفاده کرد (14 و 15). این روش به میزان چسبندگی سلول به هیدروکربنهای مختلف مایع بستگی دارد. برای اندازهگیری این فاکتور، از کشت باکتری در منابع مختلف کربن استفاده شد. سلولهای باکتریایی در 7000 دور در دقیقه به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ شده و دو بار در محلول بافر فسفات منیزیم اوره (ترکیبات (گرم در لیتر): دی پتاسیم هیدروژن فسفات: 7/19، پتاسیم دی هیدروژن فسفات: 26/7، اوره: 8/1، سولفات منیزیم 7 آبه: 2/0) شسته شد. سپس، به حالت سوسپانسیون درآمده تا چگالی نوری اولیه (A0) به یک برسد. چگالی نوری در 600 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Apel (PD- 303 UV) خوانده شد. پس از آن 500 میکرولیتر هگزادکان به پنج میلیلیتر از سوسپانسیون سلولی اضافه و به مدت دو دقیقه با دور بالا ورتکس شد. پس از 10 دقیقه، چگالی نوری فاز آبی اندازهگیری شد (A1). میزان آبگریزی از معادله (1) محاسبه شد (16). این آزمایش در سه تکرار انجام شد.
معادله (1): درصد آبگریزی
اندازهگیری کشش سطحی: بهمنظور اندازهگیری کشش سطحی پنج میلیلیتر از مایع بهدستآمده از سانتریفوژ نمونهها به لوله آزمایشی که در حمام آب در درجه حرارت ثابت 28 درجه سلسیوس قرار داشت اضافه شد. کشش سطحی با اندازهگیری ارتفاع صعود مایع در لوله موئین و با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد. در ﻫﺮ ﻣﻮرد ﺑﺮای اﻃﻤﯿﻨﺎن از درستی ﻧﺘﺎﯾﺞ، اندازهگیری ﮐﺸﺶ ﺳﻄﺤﯽ سه ﻣﺮﺗﺒﻪ انجام شد (17).
معادله (2):
=r شعاع لوله مویین (سانتیمتر)، =h ارتفاع صعود مایع (سانتیمتر)، = چگالی (گرم بر میلیلیتر)،
=g نیروی ثقل (980 سانتی متر بر مجذور ثانیه)،
= کشش سطحی (میلینیوتن بر متر[12]) است.
رﺳﻢ ﻣﻨﺤﻨﯽ رﺷﺪ باکتری: بهمنظور رسم منحنی رشد، باکتری در ارلنهای 250 میلیمتری حاوی 100 میلیلیتر محیط نمک معدنی همراه با منابع مختلف کربن (ملاس نیشکر، گلوکز، نفت سفید و فنانترن) در 3 تکرار کشت داده شد. ارلنها در شیکر انکوباتور در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور 150 (دور در دقیقه) بهمنظور هوادهی، گرماگذاری شد. چگالی ﻧﻮری باکتریها در زمانهای صفر، 12، 36، 60، 84، 108، 132 و 156 ساعت ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از دﺳﺘﮕﺎه اﺳﭙﮑﺘﺮوﻓﺘﻮﻣﺘﺮ در طولموج 600 ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ خوانده ﺷﺪ.
نتایج.
آزمایش همولیز خون: در این روش، 48 ساعت پس از کشت باکتریها در پلیتهای حاوی آگار خوندار هالهای از نوع بتا در اطراف کلونی باکتری
Bacillus pumilus 1529 مشاهده شد (شکل 1). قطر هاله ایجادشده پس از دو روز گرماگذاری به دو سانتیمتر رسید. نتیجه فعالیت همولیتیکی باکتری
Bacillus subtilis WPI منفی بود و هیچ هالهای در اطراف کلونیهای این باکتری ایجاد نشد.
شکل 1- فعالیت همولیتیکی باکتری Bacillus pumilus 1529
آزمون پراکنش نفت: در این روش، نفت اضافهشده در سطح آب مقطر لایهای به قطر 10 سانتیمتر تشکیل داد که با افزودن محلول حاصل از سانتریفوژ هر دو باکتری در منابع مختلف کربن بهشکل جداگانه، ناحیه شفافی در سطح لایه نفتی ایجاد شد. این پدیده نشاندهنده حضور ترکیبات دوگانه دوست بیوسورفکتانت در محیط کشت باکتری
Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI در چهار منبع کربن است؛ اما با توجه به ایجاد نواحی شفاف با قطر بیشتر در برخی از نمونهها مشخص شد فعالیت بیوسورفکتانت تولیدشده در برخی منابع کربن بیشتر است (جدول 2).
فروپاشی روغن: مشاهدات نشان داد شاهد منفی (آب مقطر) در لایه پارافینی موجود در چاهک پلیت سقوط نکرده و مانند یک مهره در سطح پارافین قرار گرفت. درحالیکه شاهد مثبت (تویین 20 درصد) در مدتزمان یک دقیقه فروریخت و به ته چاهک منتقل شد. این حالت بهطور مشابه، برای محلولهای حاوی متابولیتهای هر دو باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPIدر هر چهار منبع کربن مشاهده شد. از سوی دیگر در نمونههای شاهد حاوی منابع کربن هیچگونه سقوط و یا تغییر حالت در سطح پارافین مایع مشاهده نشد. نتایج این آزمون در جدول 2 آورده شده است.
فعالیت امولسیون کنندگی: آزمون (EI24) برای تمامی نمونهها انجام شد. امولسیونهای ایجاد شده بهوسیله باکتریBacillus pumilus 1529در دو منبع کربن ملاس و گلوکز به ترتیب با 1± 2/42 و
9/1± 7/33 درصد پایدارتر از سایر منابع کربن به نظر میرسیدند. نتایج نشان داد باکتری
Bacillus subtilis WPIتوانایی تشکیل امولسیون پایدار را ندارد و امولسیونهای تشکیلشده بهوسیله این باکتری چند ساعت پس از تشکیل از بین رفتند (جدول 2).
جدول 2- نتایج تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI
|
48 ساعت، |
156 ساعت، |
48 ساعت، 30 درجه سانتیگراد |
156 ساعت، 30 درجه سانتیگراد |
زمان و دمای آزمایش باکتری منبع کربن |
||||||
|
B. 1529 |
B. subtilis |
B. 1529 |
B. subtilis |
B. 1529 |
B. subtilis |
B. 1529 |
B. subtilis |
شاهد |
||
|
++ |
+ |
++ |
+ |
++ |
+ |
++ |
+ |
- |
گلوکز |
پراکنش نفت* |
|
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
- |
نفت سفید |
|
|
++ |
++ |
+++ |
++ |
+ |
++ |
+++ |
++ |
- |
ملاس |
|
|
++ |
+ |
++ |
++ |
+ |
+ |
++ |
++ |
- |
فنانترن |
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
گلوکز |
فروپاشی نفت** |
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
نفت سفید |
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
ملاس |
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
فنانترن |
|
|
2/0± 11 |
2/1± 8/3 |
9/1± 7/33 |
1/2± 6/5 |
6/2± 1/7 |
1/1± 8/5 |
9/1± 19 |
8/0± 6/3 |
0 |
گلوکز |
EI24(درصد) |
|
6/0± 5/5 |
2/1± 4/4 |
2/1± 1/9 |
8/1± 10 |
7/0± 4/4 |
1/2± 6/4 |
4/0± 11 |
9/1± 8/5 |
0 |
نفت سفید |
|
|
5/0± 18 |
5/2± 5/10 |
1± 2/42 |
3/2± 12 |
1± 13 |
7/1± 3/9 |
1/1± 1/20 |
3/2± 2/10 |
0 |
ملاس |
|
|
9/1± 7/5 |
1± 6/4 |
6/0± 13 |
7/1± 11/11 |
6/0± 5 |
3/2± 1/7 |
7/0± 4/9 |
5/1± 7/13 |
0 |
فنانترن |
|
*+ نواحی با قطر کمتر از 1 سانتیمتر، ++ نواحی با قطر 3-1 سانتیمتر، +++ نواحی با قطر بیشتر از 3 سانتیمتر،
** + نواحی فروریخته با قطر کمتر از 6/0 سانتیمتر، ++ نواحی فروریخته با قطر 1-7/0 سانتیمتر، +++ نواحی فروریخته با قطر بیشتر از 1/0 سانتیمتر
جدول 3- اثر منبع کربن بر آبگریزی Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI پس از 156 ساعت
|
درصد آبگریزی |
باکتری |
|||
|
گلوکز |
ملاس |
نفت سفید |
فنانترن |
|
|
1/3±2/31 |
2/1±5/60 |
8/1±3/68 |
8/0±7/55 |
Bacillus pumilus 1529 |
|
6/1±9/16 |
9/0±4/38 |
1/2±3/51 |
6/1±3/21 |
Bacillus subtilis WPI |
آبگریزی سطح سلول: برای بررسی بیشتر تأثیر منبع کربن استفاده شده، آبگریزی سطح سلول هر دو باکتری اندازه گیری شد. نتایج این آزمون نشان داد آبگریزی سطح سلول با توجه به نوع منبع کربن موجود در محیط کشت تغییر میکند. در هر دو باکتری بالاترین میزان آبگریزی مربوط به منبع کربن نفت و کمترین آبگریزی مربوط به گلوکز است (جدول 3).
.اثر منبع کربن بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت: تأثیر منابع کربن مختلف در تولید بیوسورفکتانت نشان داد هر دو سویه قادر به کاهش قابلقبول کشش سطحی در چهار منبع کربن هستند. همانطور که در جدول 4 در میان منابع کربن مورداستفاده بیشترین کاهش کشش سطحی و در نتیجه، تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری
Bacillus subtilis WPIمنبع کربن نفت سفید ایجاد شد و این باکتری توانست کشش سطحی را تا 3/0± 1/33 (میلینیوتن بر متر) کاهش دهد. پس از منبع کربن نفت سفید، بیشترین کاهش کشش سطحی بهوسیله باکتری Bacillus subtilis WPIدر محیط کشت حاوی فنانترن و گلوکز به ترتیب با کشش سطحی 1/0± 31/32 (میلینیوتن بر متر) و 5/0± 81/35 (میلینیوتن بر متر) ایجاد شد. همچنین، بیشترین کاهش کشش سطحی بهوسیله باکتریBacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس نیشکر رخ داد. کشش سطحی نمونه شاهد بدون باکتری حاوی ملاس معادل 5/1± 4/50 (میلینیوتن بر متر) بود که این سویه توانست پس از 156 ساعت کشش سطحی محلول را تا 83/22 (میلینیوتن بر متر) کاهش دهد. پس از ملاس بیشترین کاهش کشش سطحی در محیط حاوی نفت سفید و فنانترن ایجاد شد. همانطور که در شکل 2 مشاهده میشود در بین چهار منبع کربن استفاده شده، باکتری
Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی گلوکز رشد بیشتری نسبت به سایر منابع کربن دارد. همچنین، باکتری Bacillus subtilis WPIبالاترین رشد را در بین منابع کربن در محیط حاوی ملاس نیشکر نشان داد.
. اثر دمای گرماگذاری بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت: نتایج این بررسی نشان داد رشد باکتریها در دمای 37 درجه سلسیوس بسیار بیشتر و سریعتر از دمای 30 درجه سلسیوس بوده و با افزایش دما کاهش کشش سطحی نیز افزایشیافته است. رشد باکتری در چهار منبع کربن در دمای 37 درجه سلسیوس در شکل 2 آورده شده است. افزایش دما از 30 درجه سلسیوس به 37 درجه سلسیوس به کاهش کشش سطحی در تمامی منابع کربن منجر شد که میتوان گفت افزایش دما به افزایش میزان تولید بیوسورفکتانت منجر شد (شکل 3). بیشترین میزان کاهش کشش سطحی در اثر افزایش دما در دوره زمانی 156 ساعته توسط باکتری Bacillus subtilis WPIو در منبع نفت سفید ایجاد شد.
جدول 4-کشش سطحی باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI
|
باکتری |
زمان و دمای گرماگذاری |
کشش سطحی (میلینیوتن بر متر) |
|||
|
فنانترن |
ملاس نیشکر |
نفت سفید |
گلوکز |
||
|
Bacillus pumilus 1529 |
48 ساعت- 37 درجه سانتیگراد |
9/0± 51/38 |
1/2± 36/34 |
1/2± 65/42 |
8/1± 13/40 |
|
156 ساعت- 37 درجه سانتیگراد |
1/1± 83/22 |
9/0± 87/29 |
4/1± 07/36 |
5/1 ± 07/38 |
|
|
48 ساعت- 30 درجه سانتیگراد |
7/1± 61/46 |
5/1± 74/39 |
8/1± 29/48 |
8/2± 26/49 |
|
|
156 ساعت- 30 درجه سانتیگراد |
3/1± 28/33 |
8/2± 91/28 |
3/2± 43/40 |
8/2± 02/47 |
|
|
Bacillus subtilis WPI |
48 ساعت- 37 درجه سانتیگراد |
5/0± 81/35 |
7/0± 41/49 |
5/0± 6/36 |
3/0± 09/47 |
|
156 ساعت- 37 درجه سانتی گراد |
1/0± 96/37 |
4/0± 23/41 |
3/0± 1/33 |
1/0± 32/39 |
|
|
48 ساعت- 30 درجه سانتی گراد |
8/0± 75/36 |
3/0± 82/47 |
4/0± 65/33 |
2/0± 89/45 |
|
|
156 ساعت- 30 درجه سانتی گراد |
2/0± 58/37 |
2/0± 32/46 |
1/0± 31/32 |
3/0± 08/45 |
|
|
شاهد (بدون تلقیح باکتری) |
|
3/1± 6/56 |
5/1± 4/50 |
8/0± 6/63 |
7/1±12/56 |
شکل 2- نمودار تغییرات رشد در منابع مختلف کربن در دمایºC37
. الف) باکتری Bacillus pumilus 1529، ب) باکتریBacillus subtilis WPI
. اثر زمان گرماگذاری بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت: بهمنظور بررسی اثر زمان بر تولید بیوسورفکتانت، آزمایشها در دو زمان 48 و 156 ساعت انجام شد. همانطور که در شکل 2 نشان دادهشده است بیشترین میزان رشد در هر دو باکتری بیشتر بین 36 تا 60 ساعت رخ داده است. رشد باکتریها در این زمان در فاز نمایی قرار دارد و پس از آن رشد هر دو باکتری کاهشیافته و به تدریج وارد فاز سکون میشود. بیشترین میزان کاهش کشش سطحی محیط نیز پس از 156 ساعت که رشد در فاز سکون قرار دارد، مشاهده شد. بهطوریکه کشش سطحی در هر دو باکتری در دوره زمانی 156 ساعت 5 تا 14 (میلینیوتن بر متر) نسبت به دوره 48 ساعته کاهش نشان داده است (شکل 3).
شکل 3- تغییرات کشش سطحی در دو دورهی زمانی 48 و 156ساعت در چهار منبع کربن در دمای 37 درجه سلسیوس.
الف) باکتری Bacillus pumilus 1529 ، ب) باکتری Bacillus subtilis WPI
بحث و نتیجهگیری.
در سالهای اخیر با توجه به کاربردهای فراوان بیوسورفکتانت در صنایع مختلف، تولید بیوسورفکتانت در پژوهشهای فراوانی بررسی شده است. پژوهشگران از روشهای مختلفی برای بهبود تولید بیوسورفکتانت استفاده کردهاند که از میان این روشها بهینهسازی تولید بیوسورفکتانت ارزانتر و آسانتر از سایر روشهاست.
در پژوهش حاضر، قابلیت تولید ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺘﻲ بهوسیله دو ﺑﺎﻛﺘﺮی Bacillus pumilus 1529 و
Bacillus subtilis WPIدر دو دوره زﻣﺎﻧﻲ (48 و 156 ساعت) و ﺗﻮاﻧﺎﻳﻲ ﻣﺼﺮف گلوکز، ملاس نیشکر، نفت سفید و فنانترن بهعنوان ﺗﻨﻬﺎ ﻣﻨﺒﻊ ﻛﺮﺑﻦ و اﻧﺮژی در دو دمای متفاوت ﺷﻨﺎﺳﺎﻳﻲ ﺷﺪ.
در ﭘﮋوﻫﺶ ﺣﺎﺿﺮ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻫﻤﻮﻟﻴﺘﻴﻚ باکتریها بهعنوان نخستین ﺷﺎﻫﺪ ﻛﻴﻔﻲ ﺑﺮای ﺗﻮﻟﻴﺪ بیوسورفکتانت در ﻧﻈﺮ ﮔﺮﻓﺘﻪ ﺷﺪ. مانرات و ﻫﻤﻜﺎران[xiii] ﻧﻴﺰ از اﻳﻦ روش ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ ﺗﻮﺳﻂ باکتریهای جداسازی شده ﺧﻮد اﺳﺘﻔﺎده ﻛﺮدﻧﺪ (13). ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻫﻤﻮﻟﻴﺘﻴﻚ بیوسورفکتانتها، نخستین ﺑﺎر ﺗﻮﺳﻂ برن هایمر و اویقاد[xiv] در ﺳﺎل 1970 ﺑﺮای ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ تولیدشده ﺗﻮﺳﻂ Bacillus subtilisﮔﺰارش ﺷﺪ (18). مصطفی پور و احمدی[xv] با استفاده از گونهای از باکتری Bacillus cereus دارای فعالیت همولیتیکی کشش سطحی محیط حاوی نفت خام را به کمتر از 40 میلینیوتن بر متر کاهش دادند (19). اﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ﻧﺒﻮدن اﻳﻦ روش، ازجمله محدودیتهای آن ﻣﺤﺴﻮب میشود، زﻳﺮا ﻣﻤﻜﻦ اﺳﺖ ﻫﺎﻟﻪ ﺷﻔﺎف اﻃﺮاف ﻛﻠﻮﻧﻲ درنتیجه ﺣﻀﻮر آنزیمهای ﻟﻴﺘﻴﻚ تولیدشده ﺗﻮﺳﻂ باکتری به وجود آﻣﺪه ﺑﺎﺷﺪ. همچنان که در ﻧﺘﺎﻳﺞ اﻳﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ باکتری Bacillus subtilis WPIﻫﻤﻮﻟﻴﺰ منفی ﺑﻮده، اما توانایی تولید بیوسورفکتانت آن در غربالگری اولیه مثبت ارزیابی شد. ﻋﺪم ﻫﻤﻮﻟﻴﺰ سلولهای ﻗﺮﻣﺰ ﺧﻮن ﻧﻴﺰ میتواند ﻧﺎﺷﻲ از ﻣﺤﺪودﻳﺖ انتشار ﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ در ﻣﺤﻴﻂ ﺣﺎوی آﮔﺎر ﺑﺎﺷﺪ. به همین منظور در ادامه، ﺗﻮاﻧﺎﻳﻲ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ ﺗﻮﺳﻂ این دو باکتری ﺑﺎ روش دقیقتر و ﻛﻤﻲ بررسی شد. نتایج آزمون فروپاشی روغن و پراکنش نفت در مورد هر دو باکتری مثبت بود و مؤید تولید بیوسورفکتانت است. نتایج حاصل نشان داد بیشترین میزان پراکنش و فروپاشی در دمای 37 درجه سلسیوس و پس از 156 ساعت گرماگذاری حاصل میشود. روش پراکنش نفت و فروپاشی روغن روش سریع و آسان برای تشخیص بیوسورفکتانت است که بدون نیاز به تجهیزات و تنها با حجم کوچکی از نمونه انجام میشود. این روش نسبت به مقادیر کم بیوسورفکتانت نیز واکنش نشان میدهد. یوسف و همکاران[xvi] گزارش دادند که پراکنش نفت روش قابلاعتمادی برای تشخیص بیوسورفکتانت تولیدشده بهوسیله ریز موجودات است (20).
نتایج بهدستآمده در این مطالعه نشان میدهد، بیشترین شاخص امولسیونی در باکتری
Bacillus pumilus 1529 و در دو منبع کربن ملاس و گلوکز ایجادشده است. فعالیت امولسیونی باکتری Bacillus subtilis WPI در هر چهار منبع کربن پایین بود که با نتایج برخی از پژوهشهای قبلی هم سو است (2، 21 و 22). باقری و همکاران[xvii] با بررسی ارتباط بین فعالیت امولسیونکنندگی و کشش سطحی 16 سویه باکتریایی اعلام داشتند تشابهی بین روند دادههای حاصل از کشش سطحی و شاخص امولسیونکنندگی وجود ندارد. از طرفی در این پژوهش مشاهده شد میزان امولسیونکنندگی نمونهها در هگزان نرمال و نفت خام کاملاً متفاوت است و میزان امولسیونکنندگی به ماده امولسیون شونده نیز بستگی دارد (2). برای اطمینان بیشتر از تولید بیوسورفکتانت و تعیین شرایط بهینه برای تولید آن کشش سطحی نمونهها نیز اندازهگیری شد.
در پژوهش حاضر، پتانسیل باکتری
Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPIبرای استفاده از گلوکز، ملاس نیشکر، نفت سفید و فنانترن بهعنوان تنها منبع کربن و انرژی از طریق اندازهگیری رشد و تولید بیوسورفکتانت بررسی شد. کمیت و کیفیت تولید بیوسورفکتانت تولیدشده توسط میکروارگانیسمها تحت تأثیر ماهیت منبع کربن است (23). پسماندهای حاصل از صنایع و کشاورزی پتانسیل بالایی برای تولید بیوسورفکتانت دارند. در این مطالعه، باکتری Bacillus subtilis WPIبیشترین کاهش کشش سطحی را در محیط حاوی نفت سفید نشان داد و توانست به میزان 5/30 (میلینیوتن بر متر) کشش سطحی محیط را نسبت به نمونه شاهد کاهش دهد. الایه و همکاران[xviii] با بررسی فعالیت بیوسورفکتانتی در سویههای تجزیهکننده هیدروکربن دریافتند تولید بیوسورفکتانت در باکتریای از گونه Pseudomonas در محیط کشت حاوی نفت سفید بسیار بیشتر از محیط حاوی گلوکز بهعنوان تنها منبع کربن و انرژی است (24). بیشترین کاهش کشش سطحی و درنتیجه تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس نیشکر رخ داد. ماکار و همکاران[xix] توسط دو سویه Bacillus و با استفاده از منبع کربن ملاس در شرایط ترموفیلیک بیوسورفکتانت لیپوپپتیدی تولید کردند. استفاده از ملاس توسط دو گونه از باکتری Bacillus Subtilis برای تولید بیوسورفکتانت و رشد در دمای 45 درجه سلسیوس به تولید بیوسورفکتانت و کاهش کشش سطحی محیط کشت تا 29 و 31 دین بر سانتیمتر[xx] منجر شد (25). نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد هر دو باکتری توانایی رشد و استفاده از چهار منبع کربن (گلوکز، ملاس، نفت سفید و فنانترن) را دارا هستند. رشد بالای باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی گلوکز و باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس احتمالاً به علت سهولت دسترسی ملاس و گلوکز به علت حلالیت بیشتر و میزان بالای قند موجود در ملاس و قابلیت استفاده آن توسط باکتری نسبت به نفت و فنانترن بوده است. استفاده از ملاس بهعنوان منبع کربن ارزانقیمت برای تولید بیوسورفکتانت در پژوهشهای پیشین نیز بر کارایی و کاهش قابلتوجه کشش سطحی تأکید دارد (25- 28). تولوا و همکاران[xxi] توانستند با استفاده از سویه Pseudomonas putida 21 BN بیوسورفکتانت رامنولیپید تولید کنند. تولید بیوسورفکتانت بر بستر محلول مانند گلوکز و بسترهای کم محلول مانند هگزادکان بهعنوان تنها منبع کربن انجام شد (29).
بررسی اثر دما بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت نشان داد کشش سطحی در محیط کشت هر دو باکتری در دمای 37 درجه سلسیوس کاهش بیشتری مییابد. درواقع تولید بیوسورفکتانت کاملاً به دمای گرماگذاری وابسته است. باقری و همکاران نشان دادند با افزایش دما گرماگذاری میزان بیوسورفکتانت تولیدی توسط سویه Pseudomonas aeruginosaافزایش مییابد (2).
بررسی اثر زمان بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت توسط دو باکتری نشان داد بیشترین میزان تولید بیوسورفکتانت پس از 156 ساعت از دوره گرماگذاری حاصل میشود و اینطور به نظر میرسد ﻛﻪ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ ﺗﻮﻟﻴﺪی ﺗﻮﺳﻂ اﻳﻦ دو باکتری ﺟﺰو ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎی ثانویه ﺑﺎﻛﺘﺮی است. ایلوری و همکاران[xxii] گزارش دادند بیشترین میزان رشد و تولید بیوسورفکتانت گلیکولیپیدی توسط گونه
Aeromonasدر محیط کشت حاوی نفت پس از 8 روز ایجاد شد (30). تولید بیوسورفکتانت در فاز سکون و استراحت در گونههای Pseudomonas،
Candida apicolaوRhodococcus erythropolis گزارششده است (31- 35).
بررسی آبگریزی سطح سلول باکتریها در مطالعه حاضر نشان داد بیشترین میزان آبگریزی سطح سلول توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 در دو منبع کربن ملاس و نفت سفید مشاهده شد. نتایج این آزمون نشان داد باکتری Bacillus pumilus 1529 آبگریزی بیشتری نسبت به باکتری Bacillus subtilis WPI در هر چهار منبع کربن دارد. آبگریزی بالای هر دو باکتری در دو منبع نفت و ملاس نتایج حاصل از کشش سطحی را تائید کرده و مؤید تولید بیوسورفکتانت است. بالا بودن آبگریزی سلول به باکتری اجازه میدهد تا بهطور مستقیم با قطره نفت یا هیدروکربنهای جامد تماس پیدا کنند (36). به گفته ژانگ و میلر[xxiii]، جاذبه متقابل بین بیوسورفکتانت و سلولهای میکروبی میتواند به افزایش آبگریزی سلول منجر شود، در نتیجه سلولها تماس بهتری با بستر آبگریز داشته و در نهایت، تجزیه زیستی بالاتری به دست میآید (37).
در پژوهش حاضر پتانسیل تولید بیوسورفکتانت دو باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPIبا چندین روشبررسی شد. هر دو سویه با وجود درصد فعالیت امولسیونی کم در دو یا سه آزمون دیگر نتایج مثبت نشان دادند. هر دو باکتری قادر به رشد در چهار منبع کربن (گلوکز، ملاس نیشکر، نفت سفید و فنانترن) بوده و کشش سطحی را به میزان قابل قبولی کاهش دادند. نتایج حاصل از آبگریزی سطح سلول تا حدودی نتایج حاصل از کشش سطحی و تولید بیوسورفکتانت را تائید کرد. بررسی اثر زمان و دما نشان داد بیشترین کاهش کشش سطحی در هر دو باکتری در دمای 37 درجه سلسیوس و پس از 156 ساعت از زمان گرماگذاری حاصل میشود. به علت کاهش قابلتوجه کشش سطحی در محیط حاوی نفت و فنانترن توسط این دو باکتری میتوان برای پالایش مکانهای آلوده به هیدروکربنهای نفتی از این سویهها استفاده شود. با وجود این، برای اطمینان از میزان تجزیه هیدروکربنهای نفتی و رسیدن به شرایط بهینه رشد نیاز به انجام پژوهشهای بیشتری است. همچنین به علت دشواری در تشخیص تولید بیوسورفکتانت مختلف با استفاده از یک روش پیشنهاد میشود از روشهای مختلف برای شناسایی سویههای تولیدکننده بیوسورفکتانت استفاده شود.
[1]- FlocculationAgent
[2]- Calvo et al.
[3]- Nutrient Agar
[4]- Nutrient Broth
[5]- Optical Density
[6]- Mineral Salt Medium
[7]- rpm
[8]- Blood Agar plate
[9]- Oil spreading
[10]- Drop Collapse
[11]- EI24
[12]- mN/m
[xiii]- Maneerat et al.
[xiv]- Bernheimer and Avigad
[xv]- Mostafapour Rami and Ahmady-Asbchin
[xvi]- Youssef et al.
[xvii]- Bagheri et al.
[xviii]- Ellaiah et al.
[xix]- Makkar et al.
[xx]- dyne/cm
[xxi]- Tuleva et al.
[xxii]- Ilori et al.
[xxiii]- Zhang and Miller
)