نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات کردستان، ایران
2 استادیار میکروب شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات کردستان، ایران
3 دانشجوی دکتری تخصصی ژنتیک مولکولی، مرکز تحقیقات سل و عفونی کودکان، دانشگاه علوم پزشکی اراک، ایران
4 استادیار باکتری شناسی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، ایران
5 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات کردستان، ایران
6 دانشجوی دکتری تخصصی پزشکی مولکولی، مرکز تحقیقات پزشکی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: In this study, some molecular methods were designed for rapid detection of resistance to kanamycin and amikacin.
Materials and methods: Among 120 clinical isolates of mycobacterium tuberculosis, 70 strains were selected for evaluation of possible mutations. A PCR-RFLP method was designed for detection of wild type (using enzyme ajii) and mutant from (BstFNI enzyme) of the isolates. Furthermore, allele specific method (as PCR) was designed for detection mutations in codons 1401 and 1402 gene rrs. Some selected isolates were sequenced.
Results: In PCR-RFLP method, among the 70 strains examined by BstFNI enzyme, could detect 17 mutant strains among 24 phenotypicaly resistant and 44 non-mutant isolates from 46 susceptible isolates. The sensitivity of this method was %70.83 and specificity was %95.65 on the other hand, 12 mutant from 20 resistant strains and 29 non-mutant strains from 32 susceptible strains were detected by AjiI enzyme. The sensitivity and specificity of this method was 60 and %90.62, respectively. In MAS PCR, 3 mutants from 6 resistant strains and 12 non-mutants from 17 resistant strains were detected. The sensitivity of this method was 50 and specificity was 70.58. Results of sequencing method confirmed the results of molecular methods.
Discussion and conclusion: PCR-RFLP method by BstFNI enzyme was the best method for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis resistant to second-line injectable drugs and was recommended for routine use.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
سلیکبیماریعفونیبا ماهیتمزمنو بسیار مسریاستکهدر بیشتر موارد ناشیاز مایکوباکتریوم توبرکلوزیساست.شایعترین محل درگیری آن ریه است، اما در یک سوم موارد سایر اعضا را نیز درگیر میکند (1). این بیماری شایعترین بیماری کشنده به علت یک میکروب در تمام جهان است و یک سوم جمعیت جهان آلوده به این میکروب هستند. در هر سال نزدیک به 9 میلیون نفر مبتلا به سل میشوند. 5 تا 10 درصد کسانی که به میکروب سل آلوده اند مبتلا به این بیماری میشوند (3) و در هر سال نزدیک به 2 میلیون مرگ ناشی از این بیماری رخ میدهد (2).
پس از سال 1980 افزایش شدیدی در سویههای مقاوم به درمان در تمامی جهان مشاهده شد. مقاومت به یک دارو از سالها قبل شناخته شده بود ولی با افزایش شدید مقاومتها متاسفانه تعداد زیادی از این مقاومتها به شکل مقاومت چند دارویی (حداقل مقاومت به دو داروی خط اولی بیماری سل یعنی ریفامپینو ایزونیازید) مشاهده شده است. میزان بروز سل مقاوم به چند دارو به سرعت در حال افزایش است و بروز تخمینی آن در کل جهان 460000 مورد در سال 2005 گزارش شده است. این میزان در بسیاری از کشورهای درحال توسعه به علت کمبود امکانات آزمایشگاهی و تشخیصی مناسب کمتر از میزان واقعیت تخمین زده میشود. در سال ۲۰۱۰ میزان بروز کل موارد سل در ایران، ۲۰ مورد به ازای یکصد هزار نفر جمعیت ثبت و گزارش شده است. همسایگی ایران با دو کشور افغانستان و پاکستان که در زمره ۲۲ کشور مطرح دنیا در زمینه سل هستند و همچنین عراق و کشورهای تازه استقلال یافته (با شیوع بالای سل مقاوم به چند دارو) ضرورت توجه بیشتر ما را به این بیماری متذکر میکند (3).
موضوع مهم در مورد بیماری سل چگونگی کنترل و پیشگیری از آن است (4 و 5). در حال حاضر گسترش سویههای با مقاومت گسترده و ظهور سویههای مقاوم به تمام داروها مشکلات اساسی در کنترل جهانی سل ایجاد کرده است. استفاده مناسب از داروهای ضد سل، برای درمان موثر سل مقاوم به چند دارو و پیشگیری از ایجاد سل با مقاومت گسترده ضروری است (6).
سل با مقاومت گسترده، یک نوع کمابیش نادری از سل مقاوم به چند دارو است که تقریبا مقاوم به تمام داروهای استفاده شده در درمان سل از جمله دو داروی خط اول درمان و داروهای خط دوم مانند فلوروکینولونها و حد اقل یکی از سه داروی تزریقی کانامایسین، آمیکاسین و کاپرئومایسین است(7). در درمان این نوع از سل، آنتی بیوتیکهای خط دوم درمان مانند آمینوگلیکوزیدها (کانامایسین و آمیکاسین) یا آنتی بیوتیکهای پپتیدی (کاپرئومایسین) استفاده میشوند (8).
آنتی بیوتیکهای خط دوم درمان باکتریسیدال بوده و از طریق تداخل با این جایگاههای ریبوزوم، اثر خود را اعمال و از سنتز پروتئین ممانعت مینمایند (5). درواقع کانامایسین و آمیکاسین به جز S rDNA16 از زیر واحد s30 متصل شده و با اتصالبهاینزیرواحدسبب اشتباهخواندنرمزهایژنتیکیمیشوند؛ بنابراین باعثافزایشسطوحپروتئینهاییباتاخوردگی اشتباهدرسلولودرنهایتمرگسلولمیشود (9، 10 و 13). مکانیسم فعالیت کاپرئومایسین در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به طور کامل مشخص نیست اما به نظر میرسد که از طریق تداخل در ترجمه و ممانعت از سنتز فنیل آلانین در ریبوزومهای باکتریایی اثر خود را اعمال میکند (11).
سویههای مقاوم به یک یا بیش از یک داروی تزریقی شامل موتاسیونهایی در نزدیکی انتهای ′3 ژن rrs (S rDNA16) شامل نواحی نوکلئوتیدی A1401G،C1402t ،G1484t است (12، 16 و 17).
روشهای موجود برای تشخیص سریع این داروها بیشتر مبتنی بر تعیین ترادف کدونهای اصلی مرتبط با مقاومت هستند. به تازگی کیتهای تجاری دراین رابطه به بازار ارائه شدند که با توجه به هزینه بری بالا،.مقبولیت عام در آزمایشگاههای مرکزی پیدا نکردند.
دراین تحقیق، سه روش مختلف مولکولی
In – House برای تشخیص جهشها درکدونهای 1401 و 1402 ژن rrs طراحی شده و با روش تعیین توالی مقایسه شده اند.
مواد و روشها
این مطالعه از نوع توصیفی تحلیلی بوده و در مرکز تحقیقات سل و عفونی دانشگاه علوم پزشکی اراک انجام گرفته است.
سویهها
صد و بیست سویه خلط مثبت و کشت مثبت با الگوهای مقاومت متنوع و سابقه شکست در درمان انتخاب شدند. از این میان تعداد 52 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس که به روش استاندارد طلایی کشت (proportion) مقاومت به سه داروی تزریقی کانامایسین، آمیکاسین و کاپرئومایسین در آنها تعیین شده بود، استفاده شدند.
استخراج DNA
تعدادی از کلونیهای رشد کرده مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون برداشته و در 270 میکرو لیتر بافر TAE-1X محتوی 07/0 گرم، chelex100 حل شد. سپس به شدت ورتکس شده و در 95 درجه سانتیگراد به مدت 45 دقیقه حرارت دهی انجام شد. دوباره ورتکس کرده و به مدت 10 دقیقه در دور 14000 سانتریفوژ شد. سپس، با دقت DNA موجود در فاز رویی جدا شده و دو بار دیگر سانتریفوژ تکرار میشود. در نهایت، سوپرناتانت محتوی DNA در فریزر نگه داری شد.
روشهای مولکولی مورد استفاده
در این تحقیق، برای تعیین جهش در کدونهای 1401 و 1402 ژن rrs روشهای مولکولی زیر طراحی و استفاده شدند:
نتایج فنوتیپی به عنوان استاندارد طلایی مقاومت و روش تعیین توالی به عنوان استاندارد طلایی روشهای مولکولی استفاده شدند. در روش آلل اسپسیفیک از پرایمرهای اختصاصی برای تعیین حالت وحشی 1401 و 1402 استفاده شد. در روشPCR-RFLP ازآنزیم ajii برای تعیین سویههای تیپ وحشی و از آنزیم BstfNIبرای شناسایی سویههای موتانت استفاده به عمل آمد.
طراحی پرایمر
با توجه به جدید بودن روشهای مولکولی مورد استفاده، پرایمرهای مورد نیاز طراحی شدند. بدین منظور پرایمرها با توجه به نوکلئوتیدهای هدف به گونه ای طراحی شدند که قادر به شناسایی هر نوع موتاسیون باشند. علاوه بر این، نکات اصلی در طراحی پرایمر شامل موارد زیر در نظر گرفته شده و با کاهش و افزایش نوکلئوتیدها بهترین ترادفها انتخاب شدند: طول پرایمر، درصد GC بین 60 تا 45، دلتا G پرایمر، جلوگیری از تشکیل ساختارهای سنجاق سری، ممانعت از انتهای چسبان، افزایش درصد C یا A در انتهای 3 پرایمر، افزایش درصد A و T در 3، پرهیز از (5')...GATC(3') و نیز (5')AC...GT(3') در 3، تشابه درصد GC درF و R، انتخاب دمای ذوب بین 65 تا 70 درجه سانتیگراد و تشابه آن در هر دو پرایمر و در نهایت انتخاب دمای Annealing بر اساس دمای ذوب.
جدول 1- پرایمرهای مورد استفاده برای روشهای مختلف مولکولی
|
روش |
پرایمرها |
توالی (به شکل '3-'5) |
∆G |
GCدرصد |
وزن مولکولی گرم/ مول |
نقطه ذوب درجه سانتیگراد |
طول |
محصول ( زوج باز) |
|
روش PCR-RFLPو تعیین توالی |
F-rrs |
TCTCATGTTGCCAGCACGTAATG |
39/0 تا 37/1+ |
8/47 |
6/7014 |
8/47 |
22 |
422 |
|
R-rrs |
GAGGTGATCCAGCCGCAC |
07/0 تا 88/0- |
7/66 |
6/5509 |
8/58 |
|||
|
آلل 1401 |
f1401 |
GCCTTGTACACACCGCCCGTCA |
65/0 تا 25/1 |
6/36 |
3/6616 |
2/64 |
22 |
151 |
|
fm1401 |
GCCTTGTACACACCGCCCGTCG |
3/0- تا 65/0 |
2/68 |
3/6632 |
65 |
22 |
151 |
|
|
R-rrs |
GAGGTGATCCAGCCGCAC |
07/0- تا 88/0- |
7/66 |
6/5509 |
8/58 |
|||
|
آلل 1402 |
fm1402 |
GCCTTGTACACACCGCCCGTCAT |
65/0 تا 25/1 |
9/60 |
6/6920 |
9/63 |
23 |
151 |
|
R-rrs |
GAGGTGATCCAGCCGCAC |
07/0- تا 88/0- |
7/66 |
6/5509 |
8/58 |
انجام PCR-RFLP
به منظور بررسی وجود موتاسیون در ژن rrs، پرایمرهای اختصاصی F-rrsوR- rrs(جدول 1) بدین منظور طراحی شده و برای تکثیر یک قطعه bp422 استفاده شدند.
برنامه واکنش PCR به شکل زیر انجام شد. دناتوراسیون اولیه: 94 درجه سانتیگراد برای 3 دقیقه، 40 سیکل به شکل 94 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، 56 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد برای 30 ثانیه و دمای پایانی 72 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه محصولات PCR در ژل آگاروز یک درصد الکتروفورز شدند و برای اندازه گیری باندها از نشانگر مولکولی مناسب استفاده شد.
ترکیب مخلوط PCR شامل 2 میکرولیتر بافر، 5/. میکرولیتر MgCl2، 5/2 میکرولیتر جفت پرایمرهای اختصاصی، یک میکرولیتر مخلوط دزوکسی نوکلئوتیدهای چهارگانه، 6/0 میکرولیتر آنزیم Taq پلیمراز و مقداری آب مقطر استریل در حجم نهایی 25 میکرولیتر بود.
برای تعیین جهشها درکدونهای 1401، 1402 ژن rrs، محصول PCR برای انجام برش آنزیمی به دو روش استفاده شد:
(الف) آنزیم BstFNI
آنزیم BstFNI دارای سایت برش، (5-CG"CG-3) است. باندهای مورد انتظار با کمک نرم افزار Genetix برای فراگمنت مورد نظر این آنزیم تعیین شدند. همان گونه که در شکل 1 مشاهده میشود، قطعات حاصل از برش محصول PCR، با کمک آنزیم BstFNI، در نمونههای غیر موتان 273 و 150 و در نمونههای موتان 130و143و150 هستند (شکل 1). محصولاتحاصلاز برش،با الکتروفورز روی ژل پلیآکریل آمید 8 درصد و رنگآمیزی نیترات نقره قابل مشاهده بودند.
برای انجام واکنش هضم، مخلوط 4 میکرولیتر محصول PCR، 2 میکرولیتر بافر، 1 واحد از آنزیم BstFNI و 13 میکرولیتر آب مقطر تهیه و در دستگاه ترموسایکلر ابتدا به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و سپس به مدت 20 دقیقه در دمای 65 درجه (برای غیرفعال شدن آنزیم) قرار داده شد.
شکل 1- برش قطعه bp422را توسط آنزیم BstFNI نشان میدهد . قطعه bp 422 طی هضم با این آنزیم در سویههای موتان قطعه 130، 143 و 150 را تولید و در سویههای فاقد موتاسیون قطعات 150 و 273 را تولید میکند
(ب) برش با کمک آنزیم Ajii
آنزیم ajii دارای سایت برش (5-CAC"TCG-3) بوده و باندهای حاصل از برش در شکل2قابل مشاهده هستند. قطعات حاصل از برش محصول PCR موجود توسط آنزیم ajii در نمونههای غیر موتان bp 292 و bp 131 و در نمونههای موتان bp 422 است. ترکیب مخلوط واکنش، شبیه ترکیب به آنزیم BstFNI مربوط بود. محصولاتحاصلاز برشبا الکتروفورز روی ژل پلیآکریل آمید 8 درصد و رنگآمیزی نیترات نقره بررسی شدند.
شکل 2- برش قطعه bp 422 را توسط آنزیم ajii نشان میدهد. قطعه bp 422 طی هضم با این آنزیم در سویههای موتان قطعه bp 422 را تولید و در سویههای فاقد موتاسیون قطعاتbp131 و bp 292 را تولید میکند.
روش آلل اسپسیفیک
برای روش آلل اسپسیفیک، 3 گروه پرایمرهای اختصاصی طراحی شد. پرایمرهایی که به شکل فوروارد انتخاب شدند شامل F-1401، F- 1401M و F- 1402M بودند. استفاده آنها با پرایمر R، برای حالت وحشی باند داخلی 157 را ایجاد نمود که درانجام آزمایشها از آنها استفاده شد.
برای تعیین جهشها درکدونهای 1401، 1402 ژن rrs برنامه pcr و مخلوط واکنش شبیه برنامه و ترکیب روش PCR-RFLP بود.
پرایمرهای داخلی استفاده شده با پرایمر R، ایجاد باند داخلی 151 میکنند که در نهایت قطعات تکثیر شده روی ژل آگاروز یک درصد با GelRed الکتروفورز شد. در مقابل نور UV حاصل از ترانس لومیناتور، بررسی شدند.
شکل 3- نمایی ازطراحی پرایمرهای داخلی ژن rrs برای روش آلل اسپسیفیک با استفاده از نرم افزار mega
تعیین توالی ژن
برای ارزیابی روش تعیین موتاسیون با سایر روشهای مولکولی، از تعیین توالی، به عنوان استاندارد طلایی استفاده شد. در این روش، قطعه مورد نظر محتوی کدونهای موتان، با انجام PCR با پرایمرهای اختصاصی (ارائه شده در بند PCR-RFLP) تکثیر شد. محصول PCR، قطعهbp422 بود که پس از تخلیص برای تعیین توالی با دستگاه AppliedBiosystem به شرکت انگلستان فرستاده شد.
نتایج
نتایج PCR
انجام PCR ژن rrs روی تمامی نمونههای مورد مطالعه، باند bp 422 را ارائه نمود که نشان دهنده انتخاب صحیح پرایمرها و تعیین برنامه مناسب آمپلی فیکاسیون بود.
نتایج RFLP-PCR
(الف) برش با کمک آنزیم ajii
در این روش محصول برش آنزیمی به کمک RFLP-PCR همان گونه که با نرم افزار Genetix پیشبینی شده بود، برای سویههای موتان باندbp422 و برای سویههای غیر موتان باندهای bp 131 و bp292 را ایجاد نمود.
از 120 سویه کلینیکی جدا شده از بیماران خلط مثبت و کشت مثبت، 52 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با الگوی مقاومت متنوع برای بررسی با آنزیم ajii انتخاب شدند. که از این میان 20 سویه از نظر فنوتیپی مقاوم (4 نمونه MDR، 16 نمونه (XDR و 32 سویه از نظر فنوتیپی حساس (23 نمونه کاملا حساس و 8 نمونهMDR و یک نمونهتک مقاومتی) به سه داروی تزریقی مذکور بوده اند.
نتیجه هضم قطعه bp 422 حاصل از PCR ژن rrs، در نمونههای مختلف متفاوت بوده والگوهای متنوعی را نشان میدهد. نتایج این یافتهها در شکل 4 نشان داده شده است.
شکل 4- الگوهای RFLP ژن rrs پس از برش توسط آنزیم ajii در نمونههای غیر موتان قطعات حاصل از برش محصول PCR با آنزیمajii، bp 131 وbp292 و در نمونههای موتان باند bp422مورد انتظار است. در شکل یاد شده نمونههای 2، 3 و4 حساس بوده که دارای باندهای 131 و 292 هستند و نمونههای 5 و6مقاوم فنوتیپی بوده که برای آنها باند 422 قابل انتظار است.
آنزیم ajii به کمک روش PCR-RFLPقادر به تشخیص 12 سویه موتان از میان20 سویه مقاوم فنوتیپی شد. همچنین از میان 32 سویه حساس فنوتیپی،29سویه غیر موتان توسط این آنزیم تشخیص داده شدند. حساسیت این روش 60 و ویژگی آن 62/90 درصد بوده است.
(ب) برش با کمک آنزیم BstFNI
نتیجه هضم قطعه bp 422 توسط آنزیم BstFNI در نمونههای موتان و غیر موتان الگوهای متفاوتی را برای نمونههای مختلف نشان داد. تمامی سویههای غیر موتان باند bp 273 و bp 150و سویههای موتان باند 130 و 143 و 150 را نشان میدهند (شکل 5).
شکل 5- الگوهای RFLPژن rrs پس از برش توسط آنزیم bstfni، در نمونههای غیر موتان باندهای، 273 و150 و در نمونههای موتان باندهای 130 و 143 و 150 قابل مشاهده هستند. در شکل یاد شده نمونههای 3 و 2 حساس بوده که دارای باندهای 150 و 273 هستند. نمونه 4 مقاوم فنوتیپی بوده که برای آنها باندهای 130 و 143 و 150 قابل انتظار است.
از 70 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس که برای بررسی با آنزیم BstFNI انتخاب شدند، 24 سویه از نظر فنوتیپی مقاومو 46 سویه از نظر فنوتیپی حساس به سه داروی تزریقی مذکور بوده اند.
آنزیم BstFNI به کمک روش PCR-RFLPقادر به تشخیص 17 سویه موتان از میان 24 سویه مقاوم فنوتیپی شد. این آنزیم از میان 46 سویه حساس فنوتیپی، 44 سویه غیر موتان را تشخیص نمود. به عبارت بهتر، حساسیت این روش 83/70 و ویژگی آن 65/95 درصد بود.
روش آلل اسپسیفیک
23 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس برای بررسی با روش آلل اسپسیفیک انتخاب شدند، که از این میان 6 سویه مقاوم فنوتیپی شامل: 2 نمونه MDR، 4 نمونه XDR و17 سویه حساس فنوتیپی (12سویه کاملا حساس و 3 نمونه MDR و یک نمونه تک مقاومتی) بودهاند.
با استفاده از روش آلل اسپسیفیک 3 سویه موتان از میان 6 سویه مقاوم فنوتیپی تشخیص داده شدند. همچنین، با کمک این روش 12 سویه غیر متان از میان 17 سویه حساس فنوتیپیتشخیص داده شدند حساسیت این روش50 و ویژگی آن 58/70 درصد بوده است. نتایج تعیین ترادف، اثبات کننده صحت نتایج روشهای مولکولی مورد استفاده بود.
نتایج تعیین توالی
برای ارزیابی صحت نتایج PCR-RFLP، از روش تعیین توالی بهعنوان استاندارد طلایی بخش مولکولی استفاده شد. انطباق کامل (100 درصد) نتایج تعیین توالی با PCR-RFLP نشانگر دقت روش مورد استفاده از دیدگاه مولکولی بود. تعیین توالی در ژن rrs، در سویههای انتخاب شده به شکل تصادفی، انطباق کامل نتایج PCR-RFLP را با سکونس نشان داد و وجود جهش در کدونهای 1401,1402 این ژن را در تعدادی از سویههای مورد مطالعه اثبات نمود.
بحث
در این تحقیق، 4 روش مولکولی برای سویههایی که فنوتیپی به روش proportion تعیین شدند اجرا و مقایسه شد. این روشها به گونه ای انتخاب شدند که در استفاده عادی دارای کمترین هزینه بری بوده و در عین حال از سرعت عمل و دقت مناسبی برخوردار باشند.
مقاومتهایچندداروییبه علتکمبودامکاناتآزمایشگاهیوتشخیصیمناسبوعدم درمانصحیحدرکشورهایدرحالتوسعه،کهبالاترین میزانآلودگیراداراند،روبهافزایشاست. به علت گسترش روز افزون سل مقاوم به دارو و با توجه به متد درمانی سل، فراهم نمودن روشهایی برای تشخیص سریع حساسیت یا مقاومت سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به دارو امری ضروری به نظر میرسد.
اصولا روش PCR-RFLP بر مبنای شناسایی اختصاصی یک توالی خاص در ژنوم توسط آنزیمهای مورد استفاده است. در این تحقیق، از دو نوع آنزیم استفاده شد. آنزیم ajii برای تعیین سویههای حساس (ترادف وحشی) و آنزیم bstfni برای تعیین حالت موتان (ترادف موتان که در سویههای مقاوم یافت میشود) با کمک نرم افزار Genetix انتخاب و شرایط واکنش طراحی شدند.
روش آلل اسپسیفیک به گونه ای طراحی شد که تنها قادر به شناسایی ترادف حساس (غیر موتان) باشد. به این ترتیب سویههای حساس تشکیل باند داخلی داده اما سویههای مقاوم قادر به تشکیل باند نیستند. این روشهای مولکولی با روش تعییین توالی به عنوان استاندارد طلایی بخش مولکولی و نیز نتایج فنوتیپی بهعنوان استاندارد طلایی مقاومت مقایسه شدند. نتایج این تحقیق، کارا بودن هر دو روش PCR-RFLP و امکان پذیر بودن استفاده از آنها در روشهای روتین آزمایشگاهی را نشان داد.
در مطالعه حاضر، آنزیم BstFNI از میان 46 سویه حساس 44 سویه فاقد موتاسیون را تشخیص داد. حساسیت این روش 83/70 و ویژگی آن 65/95 درصد بود.به عبارت بهتر، چنانچه در استفاده روتین، با کمک این روش اگر نمونه ای حساس تشخیص داده شود، میتوان گفت که بیمار به دارو حساس است.
در این تحقیق، از دیدگاه مقاومت به داروهای تزریقی (آمیکاسین، کانامایسین و کاپرئومایسین) تنوع سویههای مورد استفاده درخور توجه بود. به این شکل که تمامی سویههای مقاوم به این داروها، بیشتر دارای مقاومت دارویی به سایر داروهای خط اول و دوم درمان به سل بودند.
از این میان دو سویه 665Xو 15T از نظر فنوتیپی مقاوم به کانامایسین ولی حساس به آمیکاسین بودند. ویژگی این سویهها در الگوی ژنتیکی مقاومت دارویی آنها بود. در این نمونهها فقدان موتاسیون در کدون 1401 و 1402 ژن rrs با روش PCR-RFLP اثبات شد و تعیین ترادف ژن این سویهها نیز نبود موتاسیون را اثبات نمود. این مسئله با مطالعات تسوکامورا[2] مطابقت دارد (10).
علاوه بر این، همین دانشمند بیان میدارد که سویههای جدا شده از بیمارانی که با کانامایسین تحت درمان بوده اند به عنوان سویههای مقاوم به کانامایسین و کاپرئومایسین و حساس به ویومایسین تعیین شدند. مقاومت این سویهها به کاپرئومایسین با سطح متفاوتی از مقاومت به کانامایسین همراه بوده است. سویههایی که سطح پایینی از مقاومت به کانامایسین را دارند حساس به کاپرئومایسین بودند (فنوتیپی). این سویهها (کانامایسین مقاوم و کاپرئومایسین حساس) فاقد هرگونه جهش در ژن rrs بوده و سویههای مقاوم به کانامایسین و کاپرئومایسین دارای جهش در کدون 1401 و یا 1484 بودند (10).
سویه 116x از نظر فنوتیپی مقاوم به آمیکاسین و کانامایسین و حساس به کاپرئومایسین بوده که رخداد موتاسیون در ژنrrs با روش PCR-RFLPدر این سویه به اثبات رسید. سویه 554x از نظر فنوتیپی مقاوم به سه داروی تزریقی هستند. بررسی آن با آنزیم ajii عدم موتاسیون و با آنزیم bstfni وجود موتاسیون در آن را به اثبات رساند.
سویههای مقاوم به داروهای تزریقی در این تحقیق، دارای الگوهای متنوع مقاومت دارویی بودند. برای مثال سویههای کاملا حساس مانند 3n و 6n، سویه تک مقاومتی به استرپتومایسین مانند 9n، سویههای MDR مقاوم به کل داروهای خط اول مانند5T ، 1T، 2T، سویههای مقاوم به کل داروهای خط اول و دوم درمان که غیر XDR بوده مانند 27n، سویههای مقاوم به اکثر داروها 111x و 146x، سویههای حساس به داروهای تزریقی نیز دارای تنوعی از تمام حساس
(pansensitive)، سویههای MDR حساس به آمیکاسین و کانامایسین و سویههای دارای مقاومت به سایر داروها ولی حساس به داروهای تزریقی.در جدول شماره2 تنوع مقاومت به دارو در نمونههای مورد مطالعه ارائه شده است.
در این مطالعه، سویههایی با مقاومت متنوع به آنتی بیوتیک استفاده شدند. برای مثال، سویههایی با مقاومت تک دارویی مثل 9n که مقاوم به استرپتومایسین بودند. 2 دارویی، (18n,24n)که مقاوم به استرپتومایسین و ایزونیازید بوده تا نمونههای دارای مقاومت چندگانه به 5 6 ، 7 و 8 دارو (1t، 3t، 26x، 12x، 99x) و داروهایی که به کل داروهای خط اول و دوم درمان مقاومند، مانند . (2n,5n)
پریسا طهماسبی و همکاران97سویه مایکوکتریوم توبرکلوزیس را با استفاده از روشPCR-RFLP ارزیابی کردند که از این بین 7 مورد مقاوم به آمیکاسین بوده و 90 مورد حساس به این دارو بودند. این محققین از پرایمرهای rrs1539 وrrs1096 و آنزیمهای اندونوکلئاز DdeI، TaiIاستفاده کرده اند (13 و 17).
در مطالعه حاضر، پرایمرهای مورد نیاز با استفاده از نرم افزارهای Mega، Blastو Oligoو آنزیمهای Ajii و Bstfni برای تعیین جهش در کدونهای 1401 و 1402 ژن rrs توسط نرم افزارGenetix، طراحی شدند.
آنزیم ajii هر دو کدون 1401 و 1402 را بررسی نموده و برای حالت وحشی طراحی شده است. درحالیکه آنزیم Bstfni صرفا حالت موتان کدون 1401 را شناسایی میکند. این مسئله بر اساس نتایج سایر محققین بوده که اکثر سویههای موتان بیشتر درکدون 1401 موتاسیون نشان میدهند. بنابراین، با هدف تسهیل روش، سرعت عمل و کاهش خطای پرسنل، روی این کدون تمرکز شد. هم پوشانی نتایج این دو آنزیم، باعث کاهش خطای آزمایش میشود.
|
a1401g |
شکل 6- با استفاده از نرم افزار Genetix سایتهای برش آنزیمBtrI)AjiI) که برای برش حالت wild (وحشی) و آنزیمACCII)BstFNI(که برای برش حالت موتان طراحی شده اند نشان داده شده است. BstUI دارای سایت برش CG^CG)) است و رخداد موتاسیون در 1401 را بررسی میکند که با آنزیم(ACCII)BstFNIکه برای برش حالت موتان در این تحقیق طراحی شده است، انطباق دارد.
آنزیمهای انتخاب شده با توجه به اینکه تیپ دو هستند (آنزیمهای تیپ دو دقیقا در ترادف انتخاب شده برش را انجام میدهند) بر آنزیمهای تیپ برتری دارند.
در مطالعه طهماسبی، فراوانیجهشهایمربوطبهمقاومتبه آمیکاسیندرکدون 1401 ژن rrs را بیشترازسایرکدونها اثبات نمود. همچنیندر25 نمونه (3/80 درصد) مقاوم به آمیکاسینودرتمامنمونههایحساسبهدارو جهشیمشاهدهنشد. وی اشاره کرده است که در کدونهای1402 و1484 در نمونههایمقاومجهشی دیده نشد که این با نتایج این تحقیق مطابقت دارد (13).
باتوجه به اختصاصی بودن جایگاههای برش پالیندروم 6 نوکلئوتیدی آنزیم AjiI میتوان گفت که تغییر نوکلئوتیدی در هرکدام از نوکلئوتیدهای 1401 و 1402 به تغییر این سایت اختصاصی برای آنزیم مذکور منجر شده و در نتیجه به طور همزمان میتوان هر دو نوع موتاسیون را تشخیص داد و ضرورتی به تفکیک رخداد موتاسیون در کدونهای 1401 و 1402 نیست. بنابراین، آنزیم AjiIکه هر دو کدون 1401 و 1402 را بررسی میکند، برای استفاده عملیاتی میتواند کارا باشد. سوزوکی[3] و سیرگل[4]، نشان دادند که رخداد موتاسیون در هریک از کدونهای 1401 و 1402 ژن rrs باعث مقاومت به داروهای تزریقی میشود (15 و 19). در این مطالعه جهش در1402 درهیچ یک از نمونهها یافت نشد که با نتایج طهماسبی و سوزوکی،مطابقت دارد (13 و 17).
همانطور که در جدول 2 مشاهده میشود، حساسیت و ویژگی به دست آمده از آنزیم bstfni بهتر از آنزیم ajii است. بخصوص ویژگی 65/95 درصد آنزیم bstfni کمک زیادی به حذف موارد منفی کاذب در تشخیص مقاومت آنتی بیوتیکی مینماید.
جدول 2- مقایسه حساسیت و ویژگی آنزیم ajii و Bstfni
|
آنزیم |
تعداد سویههای مقاوم فنوتیپی |
تعداد سویههای مقاوم ژنوتیپی با آنزیم |
حساسیت (درصد) |
ویژگی (درصد) |
|
BstFNI |
24 |
17 |
65/95 |
83/70 |
|
AjiI |
20 |
12 |
62/90 |
60 |
بررسی ترادف نوکلئوتیدی ژن rrsدر سویههای کلینیکی مورد مطالعه به کمک نرم افزار Mega4 نشان داد که در برخی از سویههای مقاوم، جابجایی نوکلوتید گوانین به جای نوکلوتید آدنین در موقعیت 1401 و نوکلئوتید تیمین به جای نوکلئوتید سیتوزین در جایگاه 1402 دیده میشود . نوکلئوتید 1402 تمایل به اتصال به 1484 دارد و جهش در آن سبب عدم اتصال 1402 و 1484 با پیوند هیدروزنی میشود (12). بر اساس مطالعه موس و همکاران و سوزوکی، بررسی توالیهای نوکلئوتیدی مشابه در سایر باکتریها مشخص کرد که جهش در کدون 1402 نقش کلیدی در ایجاد مقاومت در سویههای مقاوم به کانامایسین ایفا میکند. بنابراین، تبدیلc در موقعیت 1402 و g در موقعیت 1484 باعث تضعیف پیوند هیدروژنی میشود (17 و 18).
مولکول rrnaS16 که همراه با پروتئینهای s در تشکیل زیر واحد کوچک ریبوزوم باکتریایی شرکت میکند و یکی از اجزای اصلی تشکیل دهنده این ساختار ماکرومولکولی است، در اصل تک رشته ای بوده و ساختارهای ثانویه ای که تشکیل میدهد در اثر اتصالات هیدروژنی نوکلئوتیدهای مختلف c,a=t gΞ است. بنابراین، در صورتی که در جایگاههای Turn و Loop های تشکیل دهنده ساختار ثانویه این مولکول تغییر ایجاد شود، این مولکول قادر به ایجاد پیوند با پروتئینهای s نبوده و در نتیجه در ساختار زیر واحد کوچک ریبوزوم ایجاد اختلال میشود. و به عدم کارایی مولکول منجر میشود (شکل 7).
ساختار ریبو نوکلئوتیدی پروتئینهای ریبورزوم متشکل از زیرواحدهای کوچک و بزرگ است و تشکیل زیرواحدهای کوچک این ساختار ماکرومولکولی، مولکولهای rrnaS16 و پروتئینهای کوچک(small protein)نقش دارند که با اینترکشنهایی که با هم میدهند ساختار سه بعدی و فضایی خاصی برای جایگاههای p و a و اتصال mrnaدر موقعیت مناسب و ایجاد ساختار نخستین 30s و در نهایت اتصال به زیرواحد بزرگ ریبوزوم و تشکیل یک ریبونوکلئوتید پروتئین کامل به منظور آغاز فعالیت ترجمه را فراهم میکنند.
مطالب یاد شده بیانگر اهمیت وجود میان کنشهایی بینmrna های ریبوزومی و زیرواحدهای پروتئینی ریبوزوم است.
در ایجاد این میان کنشها قطعات ساختار ثانویه rrna و ساختار سه بعدی پروتئینها نقش دارند. تغییر نوکلئوتیدی در 1401به تضعیف پیوندهای هیدروفوب – هیدروفوب بین ساختار پورینی باز موجود در موقعیت 1401 منجر شده و ریشه آمینواسیدهایی با زنجیره جانبی هیدروفوب خواهد شد و در نهایت تشکیل ساختار ریبونوکلئوپروتئینی را به مخاطره میاندازد.
تغییر نوکلئوتیدی در 1484 یا 1402میتواند به تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین g و c منجر شود و تشکیل ساختار را به نوعی به مخاطره اندازد.
شکل 7- طرح شماتیک ساختار ثانویه rrna S16 در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و محل کدون 1401. همانگونه که مشاهده میشود، هر گونه موتاسیون در نوکلئوتیدهای این کدون باعث تغییر ساختار فضایی مولکول و غیر فعال شدن آن میشود.
در تحقیق حاضر، روشهای مولکولی ساده و کاربردی برای اجرا به شکل روتین استفاده به عمل آمد. همان گونه که در جدول3 مشاهده میشود، سایر محققین بیشتر از روشهای کشت و تعیین توالی برای تشخیص مقاومت استفاده کرده اند که زمانبر بوده و هزینه آزمایش را افزایش میدهد.
جدول 3- مطالعات انجام شده در سالهای گذشته
|
مطالعات انجام شده |
تعداد نمونه مقاوم(فنوتیپی) |
روش ** |
ژنوتیپی* |
درصد انطباق |
حساسیت ( درصد) |
ویژگی ( درصد) |
|
(19) |
26 |
mAs-pcr |
24 |
30/92 |
3/92 |
2/99 |
|
DNA sequencing |
23 |
46/88 |
8/95 |
8/98 |
||
|
(13) |
181 |
DNA sequencing |
162 |
50/89 |
- |
- |
|
(20) |
150 |
DNA sequencing |
106 |
66/70 |
- |
- |
|
(22) |
136 |
کشت و mAs-pcr |
32 |
5/23 |
5/54 |
100 |
|
(23) |
48 |
DNA sequencing |
37 |
77 |
2/79 |
100 |
|
(21) |
26 |
DNA sequencing |
7 |
92/26 |
- |
- |
|
(12) |
78 |
DNA sequencing |
69 |
46/88 |
9/85 تا2/94 |
100 |
|
(18) |
16 |
DNA sequencing |
11 |
75/68 |
_ |
5/87 |
|
(17) |
43 |
|
29 |
44/67 |
100 |
44/67 |
** روش مولکولی مورد استفاده برای تعیین موتاسیون در کدونهای مرتبط با مقاومت
* تعداد نمونههایی که با روش مولکولی، مقاومت آنها اثبات شده است.
ویرالوادوای[v] در سال 2012، به منظور تعیین عامل مقاومت به داروهای خط اول و دوم درمان سل، موتاسیون درکدونهای (KatG315، rpoB531، GyrA94، rrs1401) را در 450 سویه، با استفاده از روشهای کشت و mAs-pcr و تعیین توالی بررسی کرد. بررسی نمونهها برای وجود موتاسیون در کدون 1401 ژن rrs با استفاده از روشmAs-pcr، حساسیت و ویژگی به ترتیب برابر3/92 و 2/99 درصدبود. تعیین توالی سویههای دارای موتاسیون، به ترتیب حساسیت و ویژگی 8/95 و8/98 درصد را نشان داد (19).
اونسوسگال[vi]، در سال 2010، 288 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را با استفاده از روش کشت و mAs-pcr از نظر مقاومت به داروهای خط دوم درمان سل بررسی کرده اند.آنها در این مطالعه حساسیت روش خود را 5/54 و ویژگی آن را 100 درصد مشخص کرده اند (22). درصد انطباق فنوتیپی با ژنوتیپی در روش آلل اسپسیفیک مورد استفاده در تحقیق حاضر، با نتایج این دانشمند مطابقت داشت.
سیرگل در سال 2011، 310 نمونه را از نظر موتاسیون در کدون 1401 با استفاده از روش تعیین توالی بررسی کرد که از این بین، 181 نمونه (58 درصد) دارای موتاسیون بوده و از 129 نمونه دیگر،42 درصد فاقد موتاسیون و6 درصد موتان گزارش شدند. با روشکشت 181 نمونه مقاوم ژنوتیپی، فقط 162 نمونه،از نظر فنوتیپی به آنتی بیوتیکهای کانامایسین و کاپرئومایسین مقاومت نشان دادند (14).
کانچانآجبانی[vii] در سال 2011، 150 سویه XDR-TB را برای تعیین کدونهای عامل موتاسیون در ژنهای rpoB، inhA، katG، gyrA، gyrB، rrsتعیین توالی کرد .که مشخص شد که 71 درصد از سویههای مورد بررسی دارای موتاسیون در کدون 1401 ژن rrsبودند.در این بررسی 106 نمونه (71 درصد) دارای موتاسیوندر کدون 1401 ژن rrs و 42 سویه دارای موتاسیون در کدون1484 و 13 نمونه دارای موتاسیون در کدون 1484 ژن rrs و کدون 205 ژن tlyAبودند و3نمونه هم دارای موتاسیون در ژن tlyA به تنهایی بودند (20).
A1401G، برای تشخیص مقاومت به کانامایسین و آمیکاسین 100 درصد اختصاصی بوده، در حالیکه برای تشخیص حساسیت این عدد 9/85 و 2/94 درصد است (20). نتایج کار این محققین با نتایج تحقیق حاضر در خصوص 1401 مشابهت دارد.
جاووپردیگاوو[viii] و همکاران، درسال 2005، 26 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را از نظر موتاسیون در ژنهای rrs، tlyAوgyrAارزیابی کردند. تحلیل موتاسیونی این ژنها نشان داد که 25 سویه، حداقل جهش را در یکی از ژنهای مورد نظر نشان دادند و فقط 3 سویه به طور همزمان در دو ژن جهش را نشان دادند (21).
سوزوکی[ix] در سال 1998، 71 سویه حساس و 43 سویه مقاوم فنوتیپی را با استفاده از روش PCR-RFLP و تعیین توالی ارزیابی کرد. پس از تعیین توالی این سویهها، از 43 سویه مقاوم فنوتیپی 14 سویه (61/32 درصد) حساس ژنوتیپی و 29 سویه دارای موتاسیون تشخیص داده شد. 26 سویه (5/60 درصد) در 1401، یک سویه (3/2 درصد) در 1402 و 2 سویه (7/4 درصد) در 1484 دارای موتاسیون بودند. در این مطالعه،اشاره شده است که موتاسیون در کدنهای 1402 و 1484 نیز (علاوه بر 1401) باعث مقاومت به کانامایسین در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس میشود. در سویههایی که از نظر فنوتیپی مقاوم به کانامایسین بودند، وجود موتاسیون در ژن rrs در 67 درصد از سویههای مورد مطالعه یافت شد (17).
سیلکفیورییگل[x] سال 2009، برای بررسی 26 سویه مقاوم به افلوکساسین و 48 سویه مقاوم به کاپرئومایسین و آمیکاسین و 10 سویه (5 سویه مقاوم به آمیکاسین و 5 سویه مقاوم به کاپرئو مایسین) از نظر موتاسیون در ژنهای (tlyA، rrs، gyrA، gyrB) از روش تعیین توالی استفاده کرده است (49 سویه حساس به افلوکساسین و 39 سویه حساس کاپرئومایسین و آمیکاسین هم به عنوان شاهد در نظر گرفته شدند).34 سویه از 48 سویه مقاوم به کاپرئومایسین و آمیکاسین دارای موتاسیون در کدون 1401 ژن rrs بودند. در یکی از سویههای مقاوم به کاپرئومایسین جهش در کدون 1402 مشاهده شد. 10 سویه هم فاقد هر گونه جهش در ژنهای tlyA و rrs بودند، که 5 سویه مربوط به سویههایی که تنها به آمیکاسین مقاوم بودند مشاهده شد. 3 سویه هم دارای جهش در ژن tlyA بودند. در بررسی 39 سویه حساس به این دو دارو هیچ جهشی در ژنهای tlyA، rrsمشاهده نشد. حساسیت و ویژگی روش آنها برای تشخیص مقاومت به داروهای تزریقی خط دوم 2/79 و ویژگی آن 100 درصد بوده است. در پایان، اشاره داشتند که بیشترین جهش در ژن rrs، به نوکلئوتید 1401 اطلاق شده است (23).
با توجه به نتایج محققین یاد شده و نیز طهماسبی (13) نتایج تحقیق حاضر با بررسیهای این محققین در خصوص ارتباط مقاومت فنوتیپی بیشتر به موتاسیون در 1401 مطابقت دارد (13).
در مطالعه آلانگادن[xi] و همکاران در سال 1998، بیان شده است که موتاسیون در کدون 1401 ژن rrs باعث سطح بالایی از مقاومت به کانامایسین وآمیکاسین در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را سبب میشود. در این مطالعه جابجایی a به g در 13 سویه مورد مطالعه مشاهده شد که نیمی از این تعداد مقاوم به کاپرئومایسین نیز بودند (16).
همان گونه که از جدول 3 قابل استنباط است، انطباق کاملی بین نتایج روشهای مولکولی سریع با نتایج آنتی بیوگرام به روش کشت وجود ندارد. این مسئله حتی هنگام استفاده از تعیین توالی نیز مشاهده میشود. بنابراینحضور مقاومت بدون تغییرات در ژن rrs نشان دهنده این است که اصولا روشهای مولکولی درصد انطباق کاملی با روشهای فنوتیپی ندارند که این مسئله به علت دخالت احتمالی مکانیسمهای دیگراز جمله مقاومت ذاتی مایکوباکتریوم مرتبط با دیواره و یا ژنهای دیگر (غیر از ژن rrs) است (19).
نتیجه گیری
نتایجاینتحقیق بر مبنای مقایسه سه روش مولکولی و نیز تعیین توالی نشانمیدهد که روش PCR-RFLP طراحی شده با آنزیم BstFNI، برای اجرا در تشخیص روتین مقاومت میتواند به عنوان یک روش سریع و روتین در تشخیص مقاومت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به داروهای تزریقی خط دوم درمان سل در آزمایشگاههای تشخیص طبی استفاده شود .
تشخیص سریع و در دسترس سویههای مقاوم باکتری، درمان به موقع بیماران مبتلا، جلوگیری از افزایش هزینه بیماران مسلول،کمک به حذف سریعتر یک عامل انتشار بیماری به دنبال تشخیص به موقع یک بیماری مقاوم به دارو و درمان آن که از دیدگاه اپیدیمیولوژیک بسیار حائز اهمیت میباشد، از نتایج این تحقیق به شمار میرود.
تشکر و قدردانی
اینپژوهشبخشیازطرحتحقیقاتیمصوب دانشگاهعلومپزشکیاراکاست.بنابراین،بدینوسیلهاز معاونتپژوهشیدانشگاهعلومپزشکیاراکتشکرو قدردانیمیشود. همچنینازمرکز تحقیقاتسل و عفونی کودکاندانشگاهعلومپزشکیاراکبه علتپشتیبانیتجهیزاتو امکاناتو ازکلیههمکارانیکهمارادراینپژوهشیارینمودهاندصمیمانهتشکرو قدردانیمیشود.
)