مطالعه جمعیت میکروبی موجود در هاضم‌ بی‌هوازی زباله‌های جامد شهری اصفهان با استفاده از تکنیک توالی‌یابی نسل جدید

مقدمه

زباله‌های جامد شهری (MSW[1]) شامل موادی‌اند که در مناطق شهری دور ریخته می‌شوند؛ مانند زباله‌های خانگی و گاهی زباله‌های تجاری که توسط شهرداری‌ها جمع‌آوری و دفع می‌شوند (1). دسترسی به انرژی و مدیریت پسماند از چالش‌های بزرگ کشورهای درحال توسعه است. تقاضای انرژی به‌دلیل رشد جمعیت از عرضه پیشی گرفته است؛ در حالی که منابع متداول مانند نفت و گاز درحال کاهش هستند و انتشار گازهای گلخانه‌ای را تشدید می‌کنند. درنتیجه، تمرکز بسیاری از تحقیقات بر یافتن انرژی‌های تجدیدپذیر مانند خورشیدی و بادی به‌عنوان جایگزین‌های سبز افزایش یافته است؛ با این حال، این منابع به‌دلیل وابستگی به شرایط آب‌وهوایی قادر به پاسخگویی کامل به نیاز روزافزون انرژی نیستند (2).

هضم بی‌هوازی به‌دلیل ظرفیت چشمگیر خود در تولید متان به‌عنوان یک فناوری برجسته شناخته شده است. در این فرایند، متابولیت‌های متعدد و ارزشمندی تولید می‌شوند؛ با این حال، تحقیقات اخیر نشان داده‌اند میکروبیوم‌های فعال در این فرایند دارای مقاومت و انعطاف‌پذیری درخور توجهی هستند. همین ویژگی‌ها چالش‌هایی در جهت دستکاری این میکروبیوم‌ها به‌منظور تمرکز بر تولید یک متابولیت خاص ایجاد کرده‌اند؛ ازاین‌رو، دستیابی به درک عمیق‌تر قابلیت تنظیم و کنترل میکروبیوم‌های بی‌هوازی می‌تواند زمینه‌ای مهم برای پیشرفت صنایع زیست‌محور فراهم کند (3).

میکروارگانیسم‌ها نقش کلیدی در تجزیه و تبدیل ترکیبات آلی و آلاینده‌ها در بیوراکتورهایی دارند که به‌منظور تصفیه انواع مختلف زباله طراحی شده‌اند. این موجودات در جوامعی بسیار پیچیده سازمان‌دهی شده‌اند و اساس عملکرد تصفیه‌خانه‌های فاضلاب و محل‌های دفن زباله جامد را تشکیل می‌دهند. تحلیل دقیق این جوامع میکروبی و طبقه‌بندی آنها با استفاده از داده‌های فیلوژنتیکی، کاربردهای متعددی در نظارت بر واکنش‌های سیستم به تغییرات پارامترهای عملیاتی، همچنین توسعه و بهینه‌سازی شرایط مطلوب برای بیوراکتورها دارد (4). شناسایی میکروارگانیسم‌ها در سامانه‌های هضم بی‌هوازی تا پیش از این عمدتاً از طریق ساخت کتابخانه‌های کلون مبتنی بر ژن16SrRNA  و توالی‌یابی سنگر[2] انجام می‌پذیرفت (5). با وجود این، در روش‌های سنتی تعیین توالی DNA، هر نمونه باید به‌طور جداگانه بررسی شود. این روش برای نمونه‌های محیطی، به‌خصوص برای تحقیقات در مقیاس بزرگ، کارایی لازم را ندارد. نمونه‌های محیطی معمولاً ترکیبی از DNA متعلق به تعداد زیادی از میکروارگانیسم‌ها را شامل می‌شوند. استخراج و تحلیل توالی‌های DNA از تعداد زیادی میکروارگانیسم مختلف در یک نمونه محیطی مستلزم توانایی خواندن داده‌های DNA به‌صورت موازی و در سطوح مختلف است. این ویژگی برجسته فناوری‌های تعیین توالی نسل جدید ([3]NGS) محسوب می‌شود (6).

 با ظهور روش‌های پیشرفته توالی‌یابی نسل جدید، تحولی عظیم رخ داده است که به پژوهشگران در حوزه بوم‌شناسی میکروبی امکان می‌دهد حجم بی‌سابقه‌ای از داده‌های فیلوژنتیکی را در زمانی کوتاه و با هزینه‌ای مقرون‌به‌صرفه تولید کنند (4). متاژنومیکس از ژن 16SrRNA بهره می‌گیرد که به‌طور معمول برای شناسایی و طبقه‌بندی باکتری‌ها به کار می‌رود. این ژن کوچک (حدود 1500 جفت‌باز) به‌طور گسترده در میان موجودات پروکاریوتی نظیر باکتری‌ها و آرکی‌ها یافت می‌شود. در روش‌های متداول توالی‌یابی، DNA با استفاده از آغازگرهایی تکثیر می‌شود که با نواحی حفاظت‌شدة ژن 16SrRNA تطابق دارند. آمپلیکون‌های تولیدشده، دست‌کم یک ناحیه بسیار متغیر را شامل می‌شوند که می‌توانند برای توالی‌یابی و طبقه‌بندی باکتری‌ها استفاده شوند. این فرایند، امکان طبقه‌بندی خوانش‌ها را در سطوح مختلف نظیر سلسله، شاخه، رده، راسته، خانواده، جنس و در مواردی گونه فراهم می‌آورد. این طبقه‌بندی براساس مقایسه و تطبیق توالی‌های کوتاه به‌دست‌آمده از خوانش‌ها با یک پایگاه داده مرجع 16S صورت می‌گیرد. نتیجه این تجزیه و تحلیل شامل تعداد کل خوشه‌های طبقه‌بندی‌شده برای هر نمونه در سطوح مختلف طبقه‌بندی است (6).

توالی‌یابی متاژنومیک شاتگان[4] به‌عنوان رویکردی پیشرفته‌تر، امکان توالی‌یابی مستقیمDNA  استخراج‌شده را فراهم می‌کند که در نتیجه آن، اطلاعات دقیق‌تری درخصوص هویت میکروبی، عملکردهای متابولیسمی و سایر داده‌های زیستی مرتبط، نظیر ژن‌های نوظهور در دسترس قرار می‌گیرد. افزون بر این ویژگی‌ها، پیشرفت‌هایی نظیر کاهش هزینه‌های اجرایی و افزایش عمق توالی‌یابی منجر به گسترش کاربرد متاژنومیک در مطالعه جوامع پیچیده میکروبی نظیر نمونه‌های محیطی شامل آب دریا، خاک‌ها، روده انسان و منابع آب شیرین شده است؛ این امر به تحلیل با وضوح بالاتر از چنین محیط‌هایی کمک شایانی کرده است (5).

آرکی‌های متان‌زا به‌عنوان اصلی‌ترین میکروارگانیسم‌های تولید متان شناخته می‌شوند؛ اما نقش باکتری‌ها در فرایند هضم بی‌هوازی نیز بسیار حیاتی است؛ زیرا آنها مرحله مقدماتی این فرایند را بر عهده دارند. باکتری‌ها وظیفه تجزیه پلیمرهای پیچیده به مونومرها و سپس تبدیل این مونومرها به ترکیباتی نظیر هیدروژن، استات و دی‌اکسید کربن را دارند؛ این ترکیبات به‌عنوان مواد اولیه مورد نیاز برای فعالیت آرکی‌های متان‌زا محسوب می‌شوند (7).

طرح ساخت دستگاه هاضم بی‌هوازی برای تولید بیوگاز از زباله‌های جامد شهری در اصفهان، نخستین‌بار در ایران در کارخانه تولید و فرآوری کمپوست این شهر و در مقیاس پایلوت اجرا شد. این دستگاه به شکل یک مکعب مستطیل افقی ۲ متری طراحی شده و دارای چهار همزن عرضی است. حجم کل آن 75/0 متر مکعب و حجم مفید کاری 65/0 متر مکعب بود (شکل 1). به‌صورت روزانه، ۲۰ کیلوگرم بخش آلی زباله‌های جامد شهری به داخل رآکتور تزریق می‌شد. لجن خروجی از این هاضم که دارای رطوبت تقریباً ۸۰ درصد بود، به‌عنوان نمونه‌ای از کمپوست بی‌هوازی بررسی شد.

با وجود پیشرفت‌های قابل‌توجه در شناخت جوامع میکروبی هاضم‌های بی‌هوازی در سطح جهانی، تاکنون مطالعه‌ای انجام نشده است که با استفاده از NGS به بررسی ساختار و عملکرد جامعه میکروبی یک هاضم بی‌هوازی فعال در زمینه پردازش زباله شهری در ایران بپردازد. این خلأ داده‌ای، به‌ویژه دربارة اولین هاضم بی‌هوازی پایلوت موفق کشور که در کارخانه کمپوست اصفهان احداث شده است، یک شکاف علمی مهم به شمار می‌رود. دستیابی به درک دقیق از این جامعه میکروبی منحصربه‌فرد، به‌ویژه شناسایی و تحلیل عملکرد گروه‌های کلیدی مانند باکتری‌های سینتروفیک و آرکی‌های متانوژن، برای فهم بهتر مکانیسم‌های تأثیرگذار بر کارایی این سیستم نوآورانه و همچنین بهینه‌سازی عملکرد آن در شرایط محلی اهمیت ویژه‌ای دارد.

بر این اساس، هدف اصلی این پژوهش استفاده از روش توالی‌یابی نسل جدید ناحیه 16S rRNA برای ایجاد اولین نقشه جامع از ترکیب جامعه باکتریایی و آرکئایی در این هاضم در اصفهان است. علاوه بر این، مطالعه قصد دارد گروه‌های میکروبی عملکردی کلیدی (به‌ویژه سینتروف‌ها و متانوژن‌ها) را شناسایی کند که نقش محوری در زنجیره تجزیه بی‌هوازی و تولید متان دارند. این مطالعه، به‌عنوان نخستین گزارش علمی از اکولوژی میکروبی یک هاضم بی‌هوازی عملیاتی در ایران، نه‌تنها این خلأ علمی را پوشش می‌دهد، بلکه با ارائه داده‌های پایه معتبر و متناسب با شرایط بومی، زمینه‌ای مناسب برای ارزیابی سلامت سیستم، مقایسه‌های آینده با فناوری‌ها یا مناطق دیگر و نیز تدوین راهبردهای عملی با هدف بهبود پایدار راندمان تولید بیوگاز از زباله شهری در کشور فراهم می‌آورد.

شکل 1: پایلوت هاضم بی‌هوازی بخش آلی زباله‌های جامد شهر اصفهان، مستقر در کارخانه پردازش پسماند اصفهان

Figure 1: The pilot anaerobic digester of the organic fraction of solid waste in Isfahan, located at the Isfahan Waste Processing Plant.

مواد و روش‌ها

نمونه‌گیری از دستگاه هاضم بی‌هوازی و داده‌های عملکردی

در این مطالعه، یک نمونه مرکب از خروجی راکتور جریان پیستونی (PFR[5]) در مقیاس پایلوت کارخانه مدیریت پسماند شهری در اصفهان جمع‌آوری شد. نمونه‌برداری در یک مقطع زمانی از دوره عملیاتی پایدار راکتور (زمانی که پارامترهای خروجی مانند تولید بیوگاز و pH در حالت ثابت و بدون نوسان شدید بودند) انجام گرفت. هدف از نمونه‌برداری، ثبت تصویری از جامعه میکروبی در یک نقطه مشخص از فرایند پایدار بود. بلافاصله پس از جمع‌آوری، نمونه در ظروف استریل و بدون هوا قرار داده شد و در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه، منتقل و در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد تا زمان انجام آنالیزهای مولکولی نگهداری شد.

همزمان با انجام نمونه‌برداری میکروبی، داده‌های مربوط به عملکرد هاضم از سیستم پایش عملیاتی کارخانه جمع‌آوری شد. اطلاعات جمع‌آوری‌شده شامل پارامترهای فیزیکوشیمیایی ازجمله pH، کل جامدات (TS)، جامدات فرار VS[6]))، اسیدهای چرب فرار (VFA[7]) و قلیاییت کل بود. همچنین حجم و ترکیب بیوگاز، به‌ویژه درصد متان موجود در آن، به‌عنوان بخشی از فرایند پایش روتین کارخانه و طبق پروتکل‌های استاندارد داخلی اندازه‌گیری شد.

 استخراج DNA

استخراج DNA ژنومی با به کارگیری یک روش اصلاح‌شده مبتنی بر استخراج فنل-کلروفرم انجام گرفت (8). ابتدا 1 گرم از نمونه لجن حاصل از خروجی هاضم بی‌هوازی در 5 میلی‌لیتر بافر PBS به حالت سوسپانسیون درآمد و به مدت 10 دقیقه در دمای جوش قرار گرفت. سپس، 200 میکرولیتر از محلول رویی جدا شد و به آن 300 میکرولیتر بافر استخراج همراه با 20 میکرولیتر آنزیم پروتئیناز K افزوده شد. این مخلوط به مدت 20 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. در ادامه، از محلول فنل:کلروفرم: ایزوآمیل الکل (با نسبت ۲۵:۲۴:۱) به نمونه اضافه شد و مخلوط حاصل تحت سانتریفیوژ با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه قرار گرفت. پس از جداسازی مایع رویی، ایزوپروپانول 70 درصد به آن افزوده شد و به مدت 20 دقیقه در دمای منفی 20 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. سپس نمونه به مدت 30 دقیقه در سرعت 12000 دور سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل با اتانول 70 درصد شست‌وشو داده شد و پس از خشک‌شدن در دمای محیط، بافر TE به آن اضافه شد. درنهایت، جذب در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر اندازه‌گیری شد. DNA استخراج‌شده برای بررسی نواحی متغیر ژن 16S rRNA (V3-V4) به شرکت Novogene (چین) ارسال شد. تمامی مراحل آماده‌سازی کتابخانه و توالی‌یابی مطابق با پروتکل استاندارد این شرکت انجام پذیرفت. خلاصه‌ای از پروتکل استاندارد اجراشده توسط این شرکت در ادامه آمده است:

تولید آمپلیکون: ناحیه‌های متغیر ژن‌های 16S rRNA برای شناسایی باکتری‌ها و آرکی‌ها با استفاده از آغازگرهای اختصاصی بارکددار 16S V4: 515F-806R تکثیر شدند (جدول 1). واکنش PCR در یک مخلوط واکنشی شامل ۱۵ میکرولیتر High-Fidelity Phusion® از شرکت New England Biolabs، غلظتی بین ۰٫۲ تا ۲ میکرومولار از هر آغازگر و تقریباً ۱۰ نانوگرم DNA الگو انجام گرفت. در مرحله بعد، محصولات PCR با اندازه مناسب ازطریق الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۲ درصد، شناسایی و برای آزمایش‌های بعدی انتخاب شدند.

جدول ۱: پرایمرهای استفاده‌شده برای تکثیر ناحیه V4 ژن 16S rRNAدر این مطالعه

Table 1: Primers used for amplification of the V4 region of the 16S rRNA gene in this study

خالص‌سازی و ساخت کتابخانه: خالص‌سازی این محصولات با استفاده از کیت استخراج ژل Qiagen) مدل Qiagen Gel Extraction Kit، ساخت کشور آلمان) انجام شد. در مرحله بعد، کتابخانه‌های تعیین توالی با بهره‌گیری از کیت ساخت کتابخانه PCR TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit  (شرکت Illumina، ایالات متحده) و مطابق با دستورالعمل سازنده، ساخته و برچسب‌های شاخص به هر نمونه اختصاص داده شدند. کیفیت و اندازه کتابخانه‌های ساخته‌شده با دو دستگاه Qubit® 2.0 Fluorometer  (شرکت (Thermo Scientific  و Agilent Bioanalyzer 2100 system مورد ارزیابی کمی و کیفی قرار گرفت؛ درنهایت، توالی‌یابی روی پلتفرم Illumina NovaSeq با تولید خوانش‌های جفتی به طول ۲۵۰ جفت‌باز انجام شد.

توالی‌یابی DNA متاژنومیکس:

ژن‌های 16S rRNA با استفاده از آغازگر اختصاصی GTGCCAGCMGCCGCGGTAA,GGACTACHVGGGTWTCTAAT 16SV4:، CCTAYGGGRBGCASCAG,GGACTACNNGGGTATCTAAT 16SV34: و GTGCCAGCMGCCGCGGTAA,CCGTCAATTCCTTTGAGTTT 16SV45: و AACMGGATTAGATACCCKG,ACGTCATCCCCACCTTCC 16Sv57: تکثیر شدند. برای انجام واکنش‌های PCR، ترکیب شامل 15 میکرولیتر از Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix محصول شرکت (New England Biolabs)، 2/0 میکرومولار آغازگرهای فوروارد و ریورس و حدود 10 نانوگرم DNA الگو استفاده شد. مراحل حرارتی به این شکل اجرا شد: دناتوراسیون اولیه در دمای 98 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، سپس 30 چرخه دناتوراسیون در دمای 98 درجه به مدت 10 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 50 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، طویل‌شدن در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و درنهایت یک مرحله طویل‌شدن نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه.

کمیت و کیفیت محصولات PCR با استفاده از تکنیک خالص‌سازی توسط مهره‌های مغناطیسی بررسی شدند. نمونه‌ها براساس غلظت محصولات PCR و با نسبت‌های چگالی مشابه با یکدیگر ترکیب شدند. پس از پایان مرحله اختلاط، محصولات PCR، شناسایی و باندهای هدف به‌طور دقیق استخراج شدند.

تجزیه و تحلیل داده‌ها: پردازش اولیه و تحلیل بیوانفورماتیکی اطلاعات خام حاصل از توالی‌یابی، با استفاده از پروتکل استاندارد تدوین‌شده توسط شرکت نواژن انجام گرفته است. این فرایند شامل چندین مرحله اصلی و کلیدی است که به‌طور خلاصه می‌توان آنها را به شرح زیر بیان کرد:

پردازش اولیه و کنترل کیفیت داده‌ها: خوانش‌های جفت‌شده خام ابتدا به کمک بارکدهای یکتا به نمونه‌های مربوطه تخصیص یافتند. سپس اجزای اضافی مانند توالی‌های بارکد، آغازگرها و آداپتورها با استفاده از نرم‌افزار Cutadapt حذف شدند. برای تولید توالی‌های با کیفیت‌تر، خوانش‌های جفت‌شده هر قطعه DNA به کمک نرم‌افزار FLASH، ادغام و تگ‌های خام ایجاد شد.

فیلتراسیون کیفیت و حذف توالی‌های کایمریک: پس از کنترل کیفی دقیق، توالی‌های مبهم، بسیار کوتاه (کمتر از ۲۰۰ جفت‌باز) یا کم‌کیفیت از تگ‌های خام حذف شدند. همچنین، توالی‌های کایمریک حاصل از فرایند PCR با مقایسه تگ‌ها با پایگاه داده مرجع SILVA) نسخه ۱۳۸) و بهره‌گیری از الگوریتم UCHIME شناسایی و حذف شدند. نتیجه این مرحله، مجموعه‌ای از تگ‌های مؤثر و با کیفیت بود.

خوشه‌بندی توالی‌ها و تعریف OTUها: تحلیل تگ‌های مؤثر با استفاده از نرم‌افزار UPARSE) نسخه ۷.۰.۱۰۰۱) انجام شد. توالی‌هایی که دارای شباهت حداقل ۹۷ درصد بودند، در قالب یک واحد طبقه‌بندی عملیاتی (OTU) گروه‌بندی شدند و برای هر OTU یک توالی نماینده انتخاب شد.

شناسایی هویت تاکسونومیک: برای تعیین هویت هر OTU، توالی‌های نماینده با پایگاه داده مرجع SILVA)  مرتبط با باکتری‌ها و آرکی‌ها) توسط الگوریتم RDP Classifier مقایسه شدند؛ درنهایت، تخصیص تاکسونومیک تا سطح گونه انجام گرفت.

نرمال‌سازی و تحلیل داده‌ها: ماتریس فراوانی OTUها براساس کوچک‌ترین تعداد توالی نمونه‌ها برای جبران اختلاف در عمق توالی‌یابی نرمال‌سازی شد. این ماتریس تبدیل‌شده مبنای محاسبات و تحلیل‌هایی همچون شاخص‌های تنوع آلفا (شامل شانون، شاو۱ و (Simpson، بررسی تنوع بتا (براساس فاصله‌های (Weighted/Unweighted Unifrac، انجام آنالیزهای آماری و تهیه نمودارها قرار گرفت. تمامی تحلیل‌ها با نرم‌افزار QIIME) نسخه ۱.۹.۱) و بسته‌های آماری در R اجرا شدند.

بیانیه دسترسی به داده‌ها: مجموعه داده‌های پشتیبان یافته‌های این مطالعه در Sequence Read Archive (SRA) مرکز ملی اطلاعات زیست‌فناوری (NCBI) ذخیره شده‌اند و ازطریق شناسه پروژه (BioProject) شماره PRJNA1131470 قابل دسترسی هستند. شناسه‌های دسترسی سطح نمونه شامل SAMN42286091 (BioSample) و SRX25199245 (SRA Experiment) هستند.

 نتایج

ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی زباله ورودی و لجن خروجی

زباله‌های جامد شهری که طی سال‌های 1401 تا 1403 به کارخانه پردازش پسماند وارد شده‌اند، براساس آنالیزهای دوره‌ای منظم، شامل 58/72 درصد ماده آلی بوده‌اند. مقدار اسیدیته بخش آلی زباله خوراک ورودی هاضم و لجن خروجی به‌ترتیب برابر با 85/5 و 27/9 اندازه‌گیری شده است. همچنین، مقادیر کربن آلی کل (TOC[8]) به‌ترتیب 8/39 و 6/28 درصد گزارش شده‌اند. نسبت کربن به نیتروژن (C/N) نیز به‌ترتیب 86/21 و 22/12 به دست آمده است.

 عملکرد هاضم بی‌هوازی

pH سیستم در محدوده خنثی و مطلوب هضم بی‌هوازی (9-۷) حفظ شده بود. رطوبت لجن خروجی ۷۸ درصد و نسبت جامدات فرار VS)) به کل جامدات (TS) معادل ۶۵ درصد بود که نشان‌دهندة تجزیه مؤثر مواد آلی است. غلظت کل اسیدهای چرب فرار (VFA) mg/L 3500 و قلیاییت کل mg/L 19000 اندازه‌گیری شد که نشان‌دهندة تعادل مناسب بین فرایندهای اسیدسازی و متانوژنز است. تولید ویژه متان در این سیستم ۵۰۸ متر مکعب به‌ازای هر تن جامدات فرار ورودی با میانگین غلظت متان در بیوگاز ۵۵ درصد بود که حاکی از کارایی مناسب فرایند در شرایط عملیاتی موجود است.

 ساختار و ترکیب جامعه میکروبی هاضم بی‌هوازی

نتایج تحلیل مولکولی مبتنی بر داده‌های NGS نشان دادند ترکیب تاکسونومیکی باکتری‌های موجود در هاضم بی‌هوازی عمدتاً تحت سلطه دو شاخه Bacteroidota و Firmicutes قرار داشت که درمجموع 2/75 درصد از کل جامعه میکروبی را شامل می‌شدند (مطابق با شکل 2). شاخه Bacteroidota با 44748 خوانش (معادل 7/44 درصد) فراوان‌ترین گروه بود و پس از آن Firmicutes با 30453 خوانش (5/30 درصد) در جایگاه دوم قرار داشت. گروه سوم، پروتئوباکتریا، با 8968 خوانش (9 درصد) مشخص شد؛ در حالی که سایر شاخه‌ها هرکدام سهمی زیر 6 درصد از جامعه میکروبی نمونه داشتند.

Cloacimonadota با 5583 خوانش (6/5 درصد) و Patescibacteria با 5565 مطالعه (6/5 درصد) به‌عنوان شاخه‌های فرعی برجسته شناسایی شدند و پس از آن Actinobacteriota با 4520 خوانش (5/4 درصد) قرار گرفت. شاخه‌های با فراوانی کمتر شامل Cyanobacteria با 6/1 درصد، Spirochaetota با 8/0 درصد، Thermotogota با 4/0 درصد و Chloroflexi با 3/0 درصد بودند. دسته «سایر» که شامل ۱۴ شاخه اضافی است، 4/1 درصد از جامعه را تشکیل می‌داد و Synergistota  (2/0 درصد) و Bdellovibrionota  (2/0 درصد) برجسته‌ترین اعضای این دسته بودند.

شکل 2: فراوانی شاخه‌های باکتریایی در یک نمونه هاضم بی‌هوازی که توسط توالی‌یابی نسل بعدی شناسایی شده است

Figure 2: Abundance of bacterial phyla in an anaerobic digester sample detected by next-generation sequencing

شکل 3: فراوانی جنس‌های باکتریایی در یک نمونه هاضم بی‌هوازی که توسط توالی‌یابی نسل بعدی شناسایی شده است.

Figure 3: Abundance of bacterial genera in an anaerobic digester sample detected by next-generation sequencing.

نتایج آنالیز متاژنومیک به وضوح نشان می‌دهند (شکل ۳) جامعه میکروبی این هاضم بی‌هوازی تحت سلطه دو توالی با برچسب‌های موقتی DMER64 و LNR_A2-18 است که در پایگاه داده مرجع به سطح جنس شناخته‌شده‌ای تعلق ندارند. این دو توالی به‌ترتیب بیشترین فراوانی نسبی را در نمودار به خود اختصاص داده‌اند. همان‌گونه که در شکل مشاهده می‌شود، پس از این دو، جنس‌های شناخته‌شده‌تری مانند Pseudomonas و Sedimentibacter نیز از باکتری‌های پرجمعیت سیستم محسوب می‌شوند. حضور قابل توجه unidentified_Chloroplast در میان ۳۰ جنس برتر، گواهی بر منشأ گیاهی سوبسترای استفاده‌شده در هاضم است. همچنین، وجود جنس‌های تخمیرکنندة تخصصی مانند Syntrophomonas و Lactobacillus در این مجموعه، نشان‌دهندة قابلیت بالای سیستم در تجزیه مواد آلی پیچیده است.

برای بررسی روابط تکاملی بین اعضای جامعه میکروبی، یک درخت فیلوژنتیک براساس توالی‌های ژن 16S rRNA ساخته شد (شکل ۴). این درخت که توسط شرکت نوواژن به‌عنوان بخشی از خروجی‌های استاندارد تحلیل ارائه شده است، روابط بین ۱۰۰ جنس با بیشترین فراوانی در مجموعه داده‌ها را نشان می‌دهد. رنگ‌آمیزی شاخه‌ها براساس تعلق جنس‌ها به شاخه‌های مختلف انجام گرفته است. نتایج به‌دست‌آمده از تجزیه‌ و تحلیل درخت فیلوژنتیک (مطابق با شکل 4) به‌طور شفاف حضور جنس‌های مختلف متانوژن را در نمونه مطالعه‌شده تأیید کرد؛ ازجمله Methanobrevibacter که به‌عنوان یک هیدروژنوتروف شناخته می‌شود و Methanosarcina که دارای توانایی‌های هیدروژنوتروف و همچنین استاتوکلاستیک است. این جنس‌ها متعلق به شاخه Euryarchaeota هستند و نقش کلیدی در تولید متان طی فرایند تجزیه بی‌هوازی دارند. جنس‌های متانوژن Methanobrevibacter از متانوژن‌های متداول در سیستم‌های هضم بی‌هوازی است و عمدتاً ازطریق کاهش کربن دی‌اکسید با هیدروژن متان تولید می‌کند. همچنین Methanosarcina قادر به تولید متان از منابع مختلفی مانند استات، ترکیبات متیل‌ و هیدروژن/کربن دی‌اکسید است.

شکل 4: درخت فیلوژنتیک براساس توالی ژن 16S rRNA  درخت تکامل روابط بین جنس‌های مختلف باکتری‌ها و آرکی‌ها را نشان می‌دهد.

Figure 4: Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences. The tree shows the evolutionary relationships between different bacterial and archaeal genera.

بحث

موفقیت فرایند هضم بی‌هوازی وابسته به انواع گوناگونی از میکروارگانیسم‌ها است که وظایف مختلفی مانند هیدرولیز، اسیدزایی، استئوژنز و متانوژنز را بر عهده دارند. این میکروارگانیسم‌ها به شکل سینتروفیک فعالیت می‌کنند و هرگونه عدم تعادل در عملکرد آنها می‌تواند موجب ناپایداری در بیوراکتور شود (9).

این مطالعه نشان داد Bacteroidota و Firmicutes بیشترین فراوانی را داشتند؛ موضوعی که در تحقیقات دیگر نیز مشاهده شده است (10، 11) .غلبه Firmicutes ممکن است به دسترسی سوبسترا مرتبط باشد که رشد اعضای متعلق به این شاخه را تقویت می‌کند. Firmicutes قادر به تولید اندوسپورهایی هستند که مقاومت بالایی در برابر شرایط محیطی سخت دارند و درنتیجه حتی در صورت کمبود مواد مغذی، بقای خود را حفظ می‌کنند. فراوانی Bacteroidota احتمالاً به توانایی آنها در مقاومت در برابر فرایندهای تخمیر و تولید اسیدهای آلی به‌عنوان محصولات متابولیک ارتباط دارد؛ ازاین‌رو، حضور Bacteroidota در فرایند هضم بی‌هوازی با سطوح بالای تولید اسیدهای چرب فرار مرتبط است (11).

باکتری‌های سنتروفیک، برای شکستن اسیدهای چرب بلندزنجیر (مثل بوتیرات و پروپیونات) به اسیدهای چرب کوتاه‌زنجیر (استات) و هیدروژن، حتماً باید با متانوژن‌های ‌مصرف‌کنندة هیدروژن[9] همکاری کنند (12).  Syntrophomonasبا 1573 خوانش شاخص‌ترین باکتری سنتروف در این هاضم بی‌هوازی است. این باکتری‌ها در اکسیداسیون اسیدهای چرب بلندزنجیر نقش دارد (13). همچنین Pelotomaculum با 982 خوانش یکی دیگر از سنتروف‌های بسیار مهم در تجزیه اسیدهای چرب بلندزنجیر و پروپیونات است.

متانوژن‌ها مسئول مرحله نهایی تولید متان هستند. خانواده متانوژنیکMethanobacteriaceae  (راسته Methanobacteriales، رده Methanobacteria ) شامل چهار جنس است: Methanobacterium، Methanobrevibacter، Methanosphaera وMethanothermobacter . آنها انرژی خود را از کاهش CO₂ توسط H₂ به دست می‌آورند (9). در این مطالعه Methanobrevibacter با 142 خوانش در نمودار جزء ۳۰ جنس برتر نیست؛ اما در داده‌های حاصل از توالی‌یابی وجود دارد. این جنس، یک متانوژن هیدروژنوتروف کلاسیک و بسیار رایج در هاضم‌ها است که از H₂ و CO₂ متان تولید می‌کند؛ بنابراین، حضور حتی تعداد کم Methanobrevibacter (با ۱۴۲ خوانش) می‌تواند به‌طور غیرمستقیم با تسهیل تولید استات، کارایی کلی تولید متان را افزایش دهد. Methanosarcina که از جنس‌های‌ متان‌ساز هستند، حاوی گونه‌هایی‌اند که قادر به استفاده از استات (استوکلاستیک) هستند. علاوه بر فعالیت استوکلاستیک، گونه‌های Methanosarcina قادر به استفاده از متانول، متیل‌آمین‌ها و گاهی H₂ و CO₂ به‌عنوان بستر رشد هستند (9). Methanosarcinales قادرند از مسیرهای استولاکتیک، هیدروژنوتروفیک و متیلوتروفیک برای تولید متان در شرایط غلظت بالای استات بهره‌برداری کنند. به‌دلیل توانایی آنها در مقاومت در برابر افزایش غلظت عوامل مهارکننده هضم بی‌هوازی همچون آمونیاک، سولفید هیدروژن و اسیدهای چرب فرار، این راسته در مقایسه با دیگر گروه‌ها رقابتی‌تر تلقی می‌شود. این ویژگی‌ها امکان رشد و بقای Methanosarcinales را در فرایندهای هضم بی‌هوازی فراهم می‌کند؛ ازاین‌رو، حضور این میکروارگانیسم‌ها می‌تواند به‌عنوان شاخصی برای نظارت بر فرایند استفاده شود؛ زیرا نشان‌دهندة تجمع استات در سیستم است (11، 14). فراوانی نسبی پایین Methanosarcina (با ۶۳ خوانش) لزوماً به معنای مشارکت ناچیز آن در تولید متان نیست؛ بنابراین، شناسایی آن در این مطالعه می‌تواند نشان‌دهندة ثبات و انعطاف متابولیک سیستم باشد. این شواهد علمی، هنگامی که در کنار هم قرار گیرند، نشان می‌دهند علی‌رغم اینکه میزان فراوانی متانوژن‌ها در محیط راکتور اندک به نظر می‌رسد، جامعه میکروبی شکل‌گرفته در این سیستم از تمامی اجزای ضروری زنجیره غذایی بی‌هوازی شامل هیدرولیتیک‌ها، اسیدوژن‌ها، سنتروف‌ها و متانوژن‌ها تشکیل شده است. این ترکیب زیستی با ایجاد تعاملی پیچیده و همزیستی هماهنگ میان باکتری‌ها و آرکی‌ها نقشی اساسی ایفا می‌کند که درنهایت منجر به فرایند تولید بیوگاز به‌عنوان یکی از مهم‌ترین خروجی‌های این سیستم می‌شود.

حضور جنس Pseudomonas به‌عنوان یکی از جنس‌های با فراوانی نسبی بالا در جامعه میکروبی هاضم بی‌هوازی این مطالعه، ممکن است در نگاه اول تعجب‌برانگیز به نظر رسد؛ زیرا این جنس عمدتاً به‌عنوان یک باکتری هوازی شناخته می‌شود. با این حال، بسیاری از گونه‌های Pseudomonas بی‌هوازی اختیاری بوده‌اند و قادر به تطابق متابولیک و زنده‌ماندن در شرایط کم‌اکسیژن یا حتی بی‌هوازی هستند. این یافته با نتایج مطالعات دیگر همسو است؛ برای مثال، در مطالعه‌ای در بررسی سرنوشت Pseudomonas در هضم بی‌هوازی کود حیوانی گزارش کردند اگرچه تعداد کلی Pseudomonas کاهش می‌یابد، گونه‌های فلورسنت ازجمله Pseudomonas fluorescens حتی پس از هضم بی‌هوازی افزایش می‌یابند (15). این موضوع نشان‌دهندة مقاومت و توانایی تطبیقی ذاتی برخی اعضای این جنس با محیط‌های بی‌هوازی است. حضور Pseudomonas در سیستم این مطالعه می‌تواند ناشی از چند عامل باشد: (۱) ورود مداوم این باکتری‌ها به همراه ذرات خاک یا بقایای گیاهی در زباله شهری، (۲) توانایی متابولیک متنوع آنها در استفاده از طیف وسیعی از سوبستراهای ساده و پیچیده که در مراحل مختلف هضم تولید می‌شوند و (۳) مقاومت ذاتی برخی گونه‌ها در برابر شرایط استرس‌زای محیطی (مانند نوسانات اسیدیته یا حضور مواد بازدارنده). از جنبه کاربردی، حضور گونه‌های بی‌خطر و مفید Pseudomonas مانند P. fluorescens در کود حاصل از هضم می‌تواند یک امتیاز اکولوژیک و کشاورزی محسوب شود و ارزش کود تولیدی را افزایش دهد؛ بنابراین، فراوانی نسبی Pseudomonas لزوماً نشانه اختلال در فرایند بی‌هوازی نیست؛ بلکه می‌تواند بازتابی از پیچیدگی و تنوع متابولیک جامعه میکروبی و همچنین پتانسیل بیشتر محصول نهایی باشد.

داده‌های عملکردی به‌دست‌آمده تأیید می‌کند هاضم در زمان نمونه‌برداری در حالت کارکرد پایدار و کارآمد قرار داشته است. تولید ویژه متان ۵۰۸ m³/t VS و غلظت ۵۵ درصد متان در بیوگاز، ازجمله شاخص‌های مطلوب برای هاضم‌های زباله شهری محسوب می‌شوند. این عملکرد خوب را می‌توان به ساختار میکروبی سالم و کامل شناسایی‌شده در این مطالعه نسبت داد. حفظ pH در محدوده ۹-۷ محیط مناسبی برای فعالیت گروه‌های میکروبی مختلف فراهم کرده است. pH یک سوبسترا نقش مهمی در فعالیت‌های میکروبی و فرایند هضم بی‌هوازی دارد. مقدار پایین pH در هاضم می‌تواند بر فعالیت میکروب‌های مرتبط با فرایند هضم، به‌ویژه باکتری‌های متانوژن تأثیر بگذارد و آن را کاهش دهد. این باکتری‌ها برای فعالیت بهینه نیازمند محدوده pH خنثی تا کمی بازی هستند؛ زیرا نسبت به تغییرات pH حساسیت بالایی دارند (11، 16). در این مطالعه، pH ثبت‌شده در بازه‌ای قرار دارد که برای هضم مؤثر و فعال‌سازی رشد متانوژن‌ها و تولید بیوگاز ضروری است.

همچنین حضور قوی باکتری‌های تخمیرکننده و سنتروفیک (Syntrophomonas، Pelotomaculum) در کنار متانوژن‌های هیدروژنوتروف (Methanobrevibacter) و استاتوکلاستیک (Methanosarcina)، یک شبکه متابولیک یکپارچه را نشان می‌دهد که قادر به تجزیه کارآمد مواد آلی و تبدیل نهایی آنها به متان است؛ بنابراین، ترکیب میکروبی گزارش‌شده توجیه زیستی مناسبی برای عملکرد موفقیت‌آمیز هاضم ارائه می‌دهد.

نتیجه‌گیری

ترکیب جامعه میکروبی شناسایی‌شده در هاضم بررسی‌شده، شاخصی از ویژگی‌های معمول یک هاضم بی‌هوازی زباله شهری را ارائه می‌دهد. حضور غالب باکتری‌های تخمیرکننده نظیر Sedimentibacter، Proteiniphilum و Lactobacillus که در تجزیه پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌ها نقش دارند، همراه با باکتری‌های سنتروفیک تخصصی همچون Syntrophomonas، نشان‌دهندة وجود شبکه‌ای کارآمد برای تجزیه مواد آلی پیچیده زباله شهری است. در انتهای این زنجیره متابولیکی، متان‌زاهای هیدروژنوتروف مانند Methanobrevibacter با استفاده از محصولات نهایی سنتروف‌ها، شامل هیدروژن و کربن دی‌اکسید، نقشی کلیدی در فرایند تولید متان دارند. چنین سازمان‌دهی میکروبی، ضامن بهره‌وری بالای سیستم در تولید بیوگاز تلقی می‌شود.

بررسی نتایج نشان می‌دهد هاضم بی‌هوازی مطالعه‌شده دارای جامعه میکروبی متنوعی است که شامل متانوژن‌های مهمی مانند Methanobrevibacter و Methanosarcina بوده است و توان بالقوه بالایی برای تولید متان دارد. به‌منظور بهبود عملکرد این سیستم، ضروری است شرایط عملیاتی به شکلی بهینه‌سازی شود که از مهار فعالیت متانوژن‌ها جلوگیری شود. همچنین، پیشنهاد می‌شود در آینده آزمون‌های عملکردی متابولیک انجام شود تا جمعیت متانوژن‌های خاص تقویت شود. این اقدامات درنهایت منجر به افزایش کارایی تولید بیوگاز و پایداری فرایند هضم خواهد شد.

قدردانی

 این پژوهش با حمایت مالی سازمان مدیریت پسماند اصفهان به مرحله اجرا درآمد. از همین رو، نویسندگان بر خود لازم می‌دانند که مراتب تشکر و قدردانی خود را نسبت به این سازمان ابراز نمایند و از مساعدت‌های ارزشمند آن در راستای تحقق اهداف تحقیق سپاسگزاری کنند.

[1] - Municipal solid waste (MSW)

[2] - Sanger sequencing

[3] - Next-generation sequencing (NGS)

[4] - Shotgun metagenomic

[5] - Plug flow reactor (PFR)

[6] - Volatile Solids

[7] - Volatile Fatty Acids

[8] - Total Organic Carbon

[9] - Hydrogenotrophic methanogens