نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، واحد کازرون، دانشگاه آزاد اسلامی، کازرون، ایران
2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، واحد کازرون، دانشگاه آزاد اسلامی، کازرون، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Abstract
Introduction: Indole acetic acid (auxin) is a plant hormone that, in addition to plants, is produced by a number of bacteria. The aim of the present study was to optimize the production of indole acetic acid from whey substrate by bacteria isolated from rhizosphere and phyllosphere of plants.
Materials and Methods: The desired bacteria were isolated and purified from phyllosphere and rhizosphere of green beans, cowpea, mint, and parsley plants. The ability of isolates to grow in whey substrate and production of auxin was evaluated. The effect of pH and temperature parameters on the function of isolates was investigated. Impure auxin powder was prepared from the bacterial culture in whey substrate and its function was evaluated on the seed growth rate of lentil and mung bean plants.
Results: Out of 26 isolated bacterial samples, 5 isolates (19.2%) had the ability to produce indole acetic acid and grow in whey substrate simultaneously. Two isolates with the highest auxin production capacity were identified using 16S rDNA region sequencing. One isolate had 97% similarity to Enterobacter soli and the other isolate had 99% similarity to Enterobacter mori. These isolates showed the highest auxin production capacity at 30 and 35°C respectively and in pH 7. Seed irrigation of the studied plants with produced auxin solutions significantly increased the longitudinal growth of stems of these plants in comparison with control solutions.
Discussion and Conclusion: Auxin-producing strains can be isolated from soil and plants, and by using inexpensive substrates such as whey, this phytohormone can be produced on an industrial scale and used as a plant growth stimulant.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
امروزه بهدلیل افزایش جمعیت، کاهش منابع آب شیرین، فرسایش خاک و محدودشدن دسترسی بشر به زمینهای قابل کشت، لزوم استفاده از کشاورزی نوین و بهکارگیری عوامل زیستی بهمنظور بهبود وضعیت رشد گیاهان بیش از پیش احساس میشود. میکروارگانیسمهای موجود در خاک اطراف ریشه یا مستقر روی اندامهای هوایی گیاه نقش بسیار مهم و سازندهای در ایجاد برهمکنشهای مثبت با گیاه میزبان و بهبود وضعیت رشد گیاه دارند. بسیاری از این میکروارگانیسمها از پتانسیل تولید هورمونهای گیاهی و مواد تحریککنندة رشد گیاه همچون اکسین[1]، جیبرلین[2]، آبسیزیک اسید[3] و اتیلن[4] برخوردارند؛ بنابراین، مدیریت صحیح تعاملات مثبت بین میکروب و گیاه میتواند با بهبود وضعیت حاصلخیزی خاک و ایجاد توازن در اکوسیستم خاک - گیاه، نیاز به استفاده از کودهای شیمیایی را کاهش و تولید محصولات کشاورزی را به سمت کشاورزی ارگانیک و طبیعی سوق دهد (1).
ایندول استیک اسید[5] عضو اصلی خانوادة اکسینها است که توسط گیاهان تولید میشود و در بسیاری از فعالیتهای گیاه از قبیل تشکیل برگ، رشد رویان گیاه، شروع رشد ریشه، نورگرایی و رشد میوه نقش مهمی دارد. ایندول استیک اسید با افزایش تعداد انشعابات ریشه به جذب آب و عناصر معدنی لازم از خاک اطراف ریشه کمک شایانی میکند. تعداد چشمگیری از باکتریها، قارچها و جلبکهای مختلف از پتانسیل تولید ایندول استیک اسید برخوردارند. تولید ایندول استیک اسید در گیاهان و میکروبها از مسیرهای بیوشیمیایی به هم پیوستهای صورت میگیرد که مسیر وابسته به اسید آمینة تریپتوفان مهمترین مسیر شناختهشده است (2 و3).
برای تولید زیستی ایندول استیک اسید توسط باکتریها، هزینة سوبسترای مورد نیاز رشد باکتری یک عامل کلیدی است که بر قیمت محصول نهایی اثر میگذارد. استفاده از سوبستراهای ارزان قیمت بهویژه محصولات جانبی کشاورزی یا صنایع لبنی باعث صرفهجویی زیادی در هزینة تولید میشود. آب پنیر یک محصول جانبی صنایع لبنی است که قند لاکتوز و نیاز به اکسیژن زیستی[6] بالایی دارد، از آلایندههای مهم محیط زیست محسوب میشود و معمولاً دفع آن مشکلات زیادی برای کارگاههای پنیرسازی ایجاد میکند. استفاده از قند لاکتوز موجود در آب پنیر بهعنوان یک منبع کربن مناسب و ارزان قیمت برای تولید زیستی ایندول استیک اسید محسوب میشود (4).
هدف از این تحقیق، بهینهسازی تولید زیستی ایندول استیک اسید از سوبسترای آب پنیر با استفاده از باکتریهای جداسازیشده از ریزوسفر و فیلوسفر گیاهان بود. در این راستا تأثیر عواملی همچون دما و pH بر میزان تولید ایندول استیک اسید، مطالعه و همچنین چگونگی تأثیر محصول تولیدی بر میزان رشد بذر چند گیاه بررسی شد.
جداسازی و شناسایی باکتریها: در این تحقیق پژوهشیکاربردی، چندین نمونه گیاه شامل لوبیا سبز، لوبیا چشم بلبلی، نعناع و جعفری از مزارع اطراف شهرستان کازرون جمعآوری شدند. اندامهای هوایی و ریشه هر گیاه بهصورت مجزا بستهبندی و در محفظة سرد به آزمایشگاه انتقال داده شدند. از بخش فیلوسفر گیاهان توسط سواب مرطوب، نمونهبرداری و از خاک متصل به ریشه گیاهان نیز در سرم فیزیولوژی رقتهای متوالی تهیه شد. از محیط کشت نوترینت آگار برای کشت نمونهها استفاده شد. پلیتهای کشت داده شده در یک محفظة مرطوب قرار داده و به مدت 3 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند. به تدریج از کلنیهای رشدکرده نمونهبرداری شد و بهمنظور خالصسازی، مجدداً در پلیتهای جدید کشت داده شدند.
کلنیهای خالصسازیشده براساس ویژگیهای مورفولوژیک، رنگآمیزی گرم و آزمونهای کاتالاز و اکسیداز، تحرک و تولید اسپور، دستهبندی و موارد تکراری حذف شدند. با توجه به اینکه در این تحقیق، قابلیت رشد باکتری در سوبسترای آب پنیر و تولید ایندول استیک اسید معیارهای اصلی مدنظر بودند، از آزمون تخمیر قند لاکتوز برای اثبات قابلیت رشد در سوبسترای آب پنیر و از آزمون سالکوفسکی[7] برای اثبات قابلیت تولید ایندول استیک اسید (اکسین) استفاده شد. برای اجرای آزمون سالکوفسکی، از کشت 18 ساعتة باکتریهای جداسازیشده که غلظت آنها معادل لوله 1 استاندارد مکفارلند (108 × 3) تنظیم شده بود، به لولههای حاوی محیط نوترینت براث استریل تلقیح شد و لولهها به مدت 2 روز در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند. سپس لولههای کشت با گشتاور 6۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شدند تا سلولهای باکتری رسوب کنند. میزان ۲ سیسی از مایع رویی لولهها برداشته و در لولههای آزمایش استریل ریخته شد. یک لوله حاوی محیط کشت نوترینت براث استریل نیز بهعنوان شاهد در نظر گرفته شد. به هریک از لولهها (همچنین به لوله شاهد) میزان ۴ سیسی معرف تازه تهیه شدة سالکوفسکی اضافه شد. این معرف از افزودن ۲ میلیلیتر محلول کلروفریک[8] 5/0 مولار به ۱۰۰ میلیلیتر محلول 35 درصد پرکلریک اسید[9] به دست آمد (5). سر لولهها با پارافیلم بسته شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق و در تاریکی قرار داده شدند. ایجاد رنگ صورتی تا قرمز نشانة حضور اکسین در لولهها بود. برای دقت بیشتر، جذب نوری محتویات لولهها، در طول موج ۵۳۰ نانومتر، نسبت به لوله شاهد اندازهگیری شد. جدایههایی در این مرحله انتخاب شدند که بیشترین قابلیت تولید ایندول استیک اسید را از خود نشان دادند و بقیه آزمونها روی آنها ادامه یافت (6).
بررسی تأثیر pH آب پنیر بر میزان تولید ایندول استیک اسید: برای این منظور ابتدا در چندین ارلن حاوی سوبسترای آب پنیر (تهیهشده از افزودن سرکه به شیر پاستوریزه کمچربی با دمای 80 درجه سانتیگراد)، با افزودن تدریجی اسید کلریدریک 1 نرمال یا هیدروکسید سدیم 1 نرمال، pHهای مختلف 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 و 9 تهیه و باکتریهای منتخب (با غلظت معادل 1 مک فارلند) بهصورت مجزا در این ارلنها کشت داده شدند. ارلنها به مدت 2 روز روی دستگاه همزن با گشتاور 100 دور در دقیقه و در دمای ثابت ۳۵ درجه سانتیگراد قرار داده شدند و میزان ایندول استیک اسید تولیدی بعد از 24 و 48 ساعت با روش سالکوفسکی و اندازهگیری جذب نوری ارزیابی شد (7).
.بررسی تأثیر دمای محیط بر میزان تولید ایندول استیک اسید: باکتریهای منتخب (با غلظت معادل 1 مک فارلند) در چندین ارلن حاوی سوبسترای آب پنیر با pH بهینه (که در آزمایش pH مشخص شد) کشت داده و به مدت 2 روز در دماهای مختلف 25، 30، 35 و 40 درجه سانتیگراد روی همزن با گشتاور 100 دور در دقیقه قرار داده شدند و میزان ایندول استیک اسید تولیدی بعد از 24 و 48 ساعت اندازهگیری شد (10).
تهیه پودر ناخالص ایندول استیک اسید (اکسین): برای هر باکتری منتخب، یک ارلن حاوی ۱۰۰۰ سیسی آب پنیر تازه در نظر گرفته شد که pH آن در مقدار بهینه تنظیم شده بود و به میزان ۱۰ سیسی از باکتری منتخب (با غلظت معادل 1 مک فارلند) به ارلن اضافه شد. ارلنها در دمای بهینه به مدت 3 روز روی همزن با گشتاور ۱0۰ دور در دقیقه قرار داده شدند. سپس محتویات ارلنها به تعداد زیادی لوله سانتریفیوژ استریل انتقال داده و با گشتاور 6۰۰۰ دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی لولهها به ظروف پهن استریل انتقال داده و با قراردادن در آون با دمای ۴۰ درجه سانتیگراد کاملاً خشک شد؛ درنهایت، پودر اکسین ناخالص تولیدشده، جمعآوری و به مدت 3 ساعت در دسیکاتور قرار داده شد تا هر گونه رطوبت احتمالی آن حذف شود و سپس با دقت وزن شد (4).
.بررسی تأثیر پودر اکسین ناخالص بر رشد بذرهای ماش و عدس: برای این منظور، بذر گیاهان ماش و عدس (هرکدام 30 عدد) ابتدا با الکل ۷۰ درصد به مدت ۳۰ ثانیه و سپس با هیپوکلریت سدیم 1 درصد به مدت ۲ دقیقه، ضدعفونی و سپس سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. برای هر نمونه بذر، ۴ ظرف شیشهای استریل هماندازه اختصاص داده شد. در تمامی ظروف، بذرها بین چندین لایه گاز استریل قرار گرفتند و ظروف در شرایط دمایی و نوری یکسان قرار داده شدند. از چهار ظرف اختصاص داده شده برای هر بذر، یک ظرف بهعنوان نمونه شاهد بود که با آب مقطر، روزانه به میزان 3 سیسی آبیاری میشد و یک ظرف بهعنوان کنترل منفی بود که روزانه با آب پنیر هر بار به میزان 3 سیسی آبیاری میشد. یک ظرف بهعنوان آزمون اکسین رقیق که با محلول آبی اکسین 1 درصد آبیاری میشد و یک ظرف نیز بهعنوان آزمون اکسین غلیظ که با محلول آبی اکسین ۲ درصد آبیاری میشد. به تدریج با افزایش طول ساقه و ریشه و نیاز بیشتر گیاهان به آب، حجم محلولهای آبیاری بهصورت یکسان برای همه ظروف افزایش داده شد. پس از گذشت ۱۵ روز که رشد گیاهان به حد مطلوب رسید، با استفاده از خطکش میلیمتری طول ساقه و ریشهها اندازهگیری شد. همچنین از آزمون آماری تی[10] برای بررسی نتایج میزان رشد گیاهان استفاده شد (8 و9).
.شناسایی باکتریهای منتخب با روش مولکولی: باکتریهایی انتخاب شدند که بیشترین میزان تولید ایندول استیک اسید را در pH و دمای مناسب نشان دادند و با استفاده از کیت استخراج ژنوم (یکتا تجهیزآزما) عمل استخراج و خالصسازی ژنوم آنها انجام گرفت. سپس با استفاده از آغازگرهای همگانی F27 و R1492 واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تکثیر بخشی از ژن16S rDNA باکتریها انجام گرفت. محصولات واکنش روی ژل آگاروز ۲ درصد الکتروفورز شد و درنهایت برای تعیین توالی، نمونهها به شرکت پیشگام ارسال شدند. توالیهای نوکلئوتیدی بهدستآمده، در پایگاه اینترنتی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی[11]، بلاست[12] و جدایهها شناسایی شدند.
نتایج
از مجموع 26 باکتری جداسازیشده از فیلوسفر و ریزوسفر گیاهان بررسیشده، تعداد 5 جدایه دارای قابلیت تخمیر قند لاکتوز و تولید ایندول استیک اسید بهصورت همزمان بودند. جدول 1 برخی از آزمونهای انجامشده روی این پنج جدایه را نشان میدهد.
جدول 1: نتایج آزمونهای بیوشیمیایی روی پنج باکتری منتخب
|
جذب نوری بعد از 48 ساعت در 530 نانومتر |
آزمون سالکوفسکی |
تخمیر لاکتوز |
شکل باکتری |
آزمون اکسیداز |
آزمون کاتالاز |
رنگآمیزی گرم |
کد باکتری |
|
۹۳۷/۰ |
+ |
+ |
میلهای کوتاه |
ـ |
+ |
- |
الف1 |
|
81۰/2 |
+ |
+ |
میلهای کوتاه |
ـ |
+ |
- |
الف2 |
|
363/3 |
+ |
+ |
میلهای کوتاه |
ـ |
+ |
- |
الف3 |
|
11۰/3 |
+ |
+ |
میلهای کوتاه |
+ |
+ |
- |
ب1 |
|
73۰/۱ |
+ |
+ |
میلهای کوتاه |
+ |
+ |
- |
ب2 |
الف: باکتری فیلوسفری، ب: باکتری ریزوسفری
در ادامة تحقیق، از 5 باکتری منتخب، 2 باکتری با کدهای الف3 و ب1 انتخاب شدند که بیشترین قابلیت تولید ایندول استیک اسید را نشان دادند و بقیه مراحل تحقیق در خصوص این 2 باکتری انجام گرفت. در بررسی تأثیر pH آب پنیر بر میزان تولید ایندول استیک اسید مشخص شد هر دو باکتری در 7=pH بیشترین توانایی تولید ایندول استیک اسید را دارند. نتایج این آزمون در شکلهای 1 و 2 نشان داده شدهاند.
شکل 1- نتایج بررسی pH در خصوص جدایه الف 3
شکل 2- نتایج بررسی pH در خصوص جدایه ب1
بررسی تأثیر دما بر میزان تولید ایندول استیک اسید نشان داد جدایه الف3 در دمای 30 درجه سانتیگراد و جدایه ب1 در دمای 35 درجه سانتیگراد بیشترین قابلیت تولید ایندول استیک اسید را دارند. نتایج این بررسی در شکل 3 نشان داده شدهاند.
شکل ۳- نتایج تأثیر دما بر میزان تولید ایندول استیک اسید توسط جدایههای منتخب
در این تحقیق، تأثیر پودر اکسین ناخالص تولیدشده توسط جدایههای الف3 و ب1، بر میزان رشد بذر گیاهان ماش و عدس بهطور مجزا بررسی شد. نتایج نشان دادند آبیاری این گیاهان با محلول اکسین 2 درصد، بیشترین تأثیر را بر افزایش طول ساقه و ریشه (در مقایسه با نمونههای کنترل منفی و شاهد) داشته است. نتایج آبیاری با اکسین تولیدشده توسط جدایه الف3 در شکلهای 4 و 5 و نتایج آبیاری با اکسین تولیدشده توسط جدایه ب1 در شکلهای 6 و 7 نشان داده شدهاند.
شکل 4- نتایج میزان رشد گیاه عدس آبیاریشده با اکسین تولیدشده توسط جدایه الف3
شکل 5- نتایج میزان رشد گیاه ماش آبیاریشده با اکسین تولیدشده توسط جدایه الف3
شکل 6: نتایج میزان رشد گیاه عدس آبیاریشده با اکسین تولیدشده توسط جدایه ب1
شکل 7- نتایج میزان رشد گیاه ماش آبیاریشده با اکسین تولیدشده توسط جدایه ب1
جدول ۲- نتایج آنالیز آماری جدایههای الف3 و ب1
|
مقایسه محلولهای آبیاری |
جدایه الف3 |
جدایه ب1 |
||
|
گیاه عدس |
گیاه ماش |
گیاه عدس |
گیاه ماش |
|
|
اکسین 1 درصد نسبت به کنترل |
588/6 |
9/2 |
934/1 |
0702/2 |
|
(00001/0) |
(004773/0) |
(034976/0) |
(027488/0) |
|
|
اکسین 2 درصد نسبت به کنترل |
461/3 |
377/5 |
894/1 |
447/3 |
|
(001394/0) |
(000021/0) |
(037651/0) |
(001655/0) |
|
|
اکسین 1 درصد نسبت به اکسین 2 درصد |
128/0 |
209/0 |
0275/0 |
907/0 |
|
(449912/0) |
(418317/0) |
(489195/0) |
(188195/0) |
|
|
محلول شاهد نسبت به کنترل |
396/1 |
0273/1 |
125/1 |
328/1 |
|
(089863/0) |
(158944/0) |
(137684/0) |
(100387/0) |
|
اعداد جدول: مقادیر آزمون t
اعداد داخل پرانتز: میزان احتمال خطا در سطح معنیداری 05/0= α
در این تحقیق، دو جدایه که از لحاظ تولید ایندول استیک اسید وضعیت مطلوبتری داشتند، برای شناسایی مولکولی انتخاب شدند. باکتری با کد الف3 جداسازیشده از فیلوسفر لوبیا چشم بلبلی و باکتری با کد ب1 جداسازیشده از ریزوسفر گیاه جعفری بالاترین قابلیت تولید اکسین را نشان دادند. با استفاده از آغازگرهای همگانیF 27 و R1492 توالیهای نوکلئوتیدی برای سویه کد الف3 با طول ۱۵۰۱ نوکلئوتید و برای سویه کد ب1 با طول ۱۴۳۹ نوکلئوتید ایجاد شدند.
نتایج شناسایی مولکولی جدایهها نشان دادند جدایه الف3 به میزان ۹۷ درصد با باکتری انتروباکتر سولی[13] سویه LF7a(T) (شماره دسترسی در بانک ژنیMH071140.1 ) و جدایه ب1 نیز به میزان ۹۹ درصد با باکتری انتروباکتر موری[14] سویه R3-3 (شماره دسترسی در بانک ژنی GQ406569.1) خویشاوندی دارد. شکلهای 8 و 9 نتایج مقایسه و ردیفسازی توالیهای نوکلئوتیدی جدایههای بررسیشده را نشان میدهند.
Query: None Query ID: lcl|Query_56325 Length: 1075
>Enterobacter soli strain LF7a(T) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Sequence ID: MH071140.1 Length: 1501
Range 1: 411 to 1463
Score:1777 bits(962), Expect:0.0,
Identities:1028/1058(97%), Gaps:15/1058(1%), Strand: Plus/Minus
Query 12 aaaGTGGT-AGCGCCCT-CCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCAT 69
|||||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1463 AAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCAT 1404
Query 70 GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTAC 129
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1403 GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTAC 1344
Query 130 GATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG 189
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1343 GATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG 1284
Query 190 CACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGC 249
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1283 CACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGC 1224
Query 250 ACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCA 309
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1223 ACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCA 1164
Query 310 GTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG 369
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1163 GTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGGACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG 1104
Query 370 GTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGC 429
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1103 GTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGC 1044
Query 430 AGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTC 489
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1043 AGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTC 984
Query 490 AAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC 549
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 983 AAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC 924
Query 550 GGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACT 609
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 923 GGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACT 864
Query 610 TAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAGCCTCCAAGTCGACATCGTTTA 669
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 863 TAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACTCCTCAAGGGAACAGCCTCCAAGTCGACATCGTTTA 804
Query 670 CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGT 729
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 803 CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGT 744
Query 730 CAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTC 789
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 743 CAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTC 684
Query 790 ACCGCTymryasrTGGAATTCTAcccccccTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAA 849
|||||| | |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 683 ACCGCTAC--ACCTGGAATTCTACCCCCC-TCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAA 627
Query 850 TGCAGTTCWRAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCG 909
|||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 626 TGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCG 567
Query 910 CTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA 969
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 566 CTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA 507
Query 970 CGGAGTTAGCCCGGTGCCTCCTCCTGCGAGTAACGTCA-TCCACAAGAT-A-TAACCTTG 1026
||||||||||| ||||| || | ||||||||||||||| || |||| | | |||||||
Sbjct 506 CGGAGTTAGCC-GGTGCTTCTT-CTGCGAGTAACGTCAATCACCAAGGTTATTAACCTTA 449
Query 1027 ATGGCT-C-TCCTCGCTGAG-GTACTT-ACCACC-GAA 1059
||| || | |||||||||| |||||| || ||| |||
Sbjct 448 ATGCCTTCCTCCTCGCTGAAAGTACTTTACAACCCGAA 411
شکل 8- نتیجة مقایسه و ردیفسازی توالی نوکلئوتیدی جدایه الف3
Query: None Query ID: lcl|Query_32079 Length: 960
>Enterobacter mori strain R3-3 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Sequence ID: GQ406569.1 Length: 1288
Range 1: 328 to 1280
Score:1727 bits(935), Expect:0.0,
Identities:949/955(99%), Gaps:5/955(0%), Strand: Plus/Minus
Query 9 CAAAGTGGTAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCAT 68
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1280 CAAAGTGGTAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCAT 1221
Query 69 GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTAC 128
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1220 GGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTAC 1161
Query 129 GATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG 188
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1160 GATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG 1101
Query 189 CACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGC 248
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1100 CACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATGCGCCATTGTAGC 1041
Query 249 ACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCA 308
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1040 ACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCA 981
Query 309 GTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCKAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG 368
||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||
Sbjct 980 GTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGG 921
Query 369 GTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGC 428
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 920 GTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGC 861
Query 429 AGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTC 488
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 860 AGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTC 801
Query 489 AAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC 548
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 800 AAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGC 741
Query 549 GGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACT 608
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 740 GGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACT 681
Query 609 TAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTA 668
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 680 TAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTA 621
Query 669 CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGT 728
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 620 CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGT 561
Query 729 CAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTC 788
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 560 CAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTC 501
Query 789 ACCGCTACACCTGGAAATTCTAcccccccTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAAT 848
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 500 ACCGCTACACCTGGAA-TTCTACCCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAAT 442
Query 849 GCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGGCCTGCGTGCG 908
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||
Sbjct 441 GCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCG-CCTGCGTGCG 383
Query 909 CTTTACGCCCAGTAATTCCGATTA-CGCTTGCACCCTCCGTAT-AC-GCGGCTGC 960
|||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| || ||||||||
Sbjct 382 CTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGC 328
شکل 9- نتیجة مقایسه و ردیفسازی توالی نوکلئوتیدی جدایه ب1
بسیاری از میکروارگانیسمها بهواسطة تولید و ترشح هورمونهای گیاهی، توانایی افزایش یا بهبود رشد گیاهان را دارند و امروزه برخی از این محصولات میکروبی که رشد گیاهان را افزایش میدهند، تجاریسازی شدهاند. در این تحقیق از مجموع 26 باکتری جداسازیشده از فیلوسفر و ریزوسفر گیاهان، 5 جدایه (2/19 درصد) از قابلیت تولید ایندول استیک اسید و تخمیر قند لاکتوز بهصورت همزمان برخوردار بودند. هر 5 جدایه گرم منفی، کاتالاز مثبت، فاقد اسپور و میلهای کوتاه بودند. تأثیر pH آب پنیر و دمای محیط بر میزان تولید ایندول استیک اسید توسط دو جدایه برتر بررسی شد. نتایج نشان دادند هر دو جدایه، در 7=pH از بیشترین توانایی تولید ایندول استیک اسید برخوردار بودند. تحقیقات مختلف نشان دادهاند بیشتر باکتریها در pHهای نزدیک به خنثی (بین ۶ تا ۸) بهترین شرایط رشد و طبیعتاً بهترین شرایط را برای تولید محصولات ثانویه دارند. مشابه این بررسی نیز توسط دیگر محققین صورت گرفته است؛ برای مثال، باروچا[xv] و همکاران در سال ۲۰۱۳ تولید بهینة ایندول استیک اسید را برای یک سویه از باکتری سودوموناس پوتیدا[xvi] در 5/7=pH گزارش کردهاند (7).
در بررسی اثر دما، نتایج نشان دادند جدایه با کد الف3 در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد و جدایه با کد ب1 در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد از پتانسیل بیشتری برای تولید ایندول استیک اسید برخوردارند. در مطالعه محققین مختلف همچون سودها[xvii] و همکاران در سال ۲۰۱۲ و ساچدو[xviii] و همکاران در سال ۲۰۰۹، بهترتیب دمای ۲۸ درجه و ۳۱ درجه سانتیگراد بهعنوان بهینه دمای تولید ایندول استیک اسید گزارش شده است (10 و 11). در مطالعة سریسوک[xix] و همکاران در سال ۲۰۱۸ نیز بهترین دما برای تولید ایندول استیک اسید در حضور سوبسترای آب پنیر ۳۰ درجه سانتیگراد گزارش شده است (4).
در این تحقیق، از آب پنیر بهعنوان یک سوبسترای ارزان قیمت برای کاهش هزینة تولید ایندول استیک اسید استفاده شد. در تحقیق سریسوک و همکاران در سال ۲۰۱۸، برای بهینهسازی تولید ایندول استیک اسید توسط انتروباکتر از آب پنیر شیرین بهعنوان منبع کربن و انرژی استفاده شده بود (4). در تحقیق پنگ[xx] و همکاران در سال ۲۰۱۴ نیز از آرد ذرت بهعنوان منبع کربن و از سویا بهعنوان منبع نیتروژن با استفاده از باکتری سودوموناس پوتیدا توانسته بودند ایندول استیک اسید تولید کنند (12).
نتایج آبیاری بذر گیاهان ماش و عدس با محلولهای آبی تهیهشده از اکسین ناخالص تولیدی نشان دادند محلول اکسین 2 درصد بیشترین تأثیر را بر رشد طولی ساقه گیاهان بررسیشده دارد. نتایج آزمون آماری (جدول 2) نشان دادند در خصوص هر دو جدایه، بهکارگیری محلولهای اکسین ۱ درصد و 2 درصد بهصورت معنیداری میتواند رشد طولی ساقه گیاهان را نسبت به محلول کنترل افزایش دهد؛ اما نتایج بهدستآمده در خصوص تأثیر اکسین تولیدی بر رشد ریشه گیاهان بررسیشده در سطح 05/0= α در همه موارد معنیدار نبود )05/0<P) (نتایج تأثیر اکسین بر ریشه گیاهان، در جدول 2 نشان داده نشدهاند). در این بررسی همچنین مشخص شد ازنظر آماری تفاوت معنیداری بین محلول آبیاری شاهد (آب مقطر) با محلول آبیاری کنترل (آب پنیر) وجود ندارد )05/0<(P.
در خاتمه، با توجه به نتایج بهدستآمده از این تحقیق و موارد مشابه میتوان نتیجه گرفت برای تولید زیستی هورمون اکسین توسط باکتریهای جداسازیشده از خاک و گیاهان، میتوان از آب پنیر بهعنوان یک سوبسترای ارزان قیمت و در مقیاس وسیع استفاده کرد. همچنین در صورت خالصسازی هورمون اکسین تولیدی میتوان از آن به شکل مؤثری برای بهبود وضعیت رشد گیاهان بهویژه تیره حبوبات استفاده کرد.
[1]- Auxin
[2]- Gibberellin
[3]- Abscisic acid
[4]- Ethylene
[5]- Indole acetic acid(IAA)
[6]- Biochemical oxygen demand(BOD)
[7]- Salkowski
[8]- FeCl3
[9]- HClO4
[10]- t- test
[11]- National Center for Biotechnology Information
[12]- BLAST
[13]- Enterobacter soli
[14]- Enterobacter mori
[xv]- Bharucha
[xvi]- Pseudomonas putida
[xvii]- Sudha
[xviii]- Sachdev
[xix]- Srisuk
[xx]- Peng
)