شناسایی و بهبود تولید آنزیم L- آسپاراژیناز با استفاده از سویة قارچی جداشده از خاک: Sarocladium kiliense IBRC-M 30453

نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات، تهران، ایران

2 بانک میکروارگانیسم‌ها، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: L- آسپاراژیناز یک آنزیم ضدسرطان مهم است که در صنایع پزشکی و غذایی کاربرد دارد. با در نظر داشتن اهمیت L- آسپاراژیناز در صنایع مختلف، یافتن سویه‌های مولد جدیدی ارجحیت می‌یابد که بتوانند سطح بالاتری از آنزیم با حداقل عوارض جانبی را تولید کنند.
مواد و روش‏‏ها: غربالگری اولیه سویه‌های مولد L- آسپاراژیناز با آزمون کیفی روی پلیت محیط کشت زاپک داکس آگار تغییریافته حاوی L- آسپاراژین به‌عنوان منبع نیتروژن و فنل رد به‌عنوان اندیکاتور pH انجام شد. فعالیت L- آسپاراژینازی سویة مولد با استفاده از روش نسلریزاسیون اندازه‌گیری شد. شناسایی سویة قارچی با تعیین ویژگی‌های مورفولوژیک و آنالیز فیلوژنی ژن‌های ریبوزومی ITS (نواحی فاصله‌انداز رونویسی‌شوندة داخلی) و ژن LSU (زیرواحد بزرگ ریبوزومی) انجام شد. تولید L- آسپاراژیناز با روش یک عامل در هر زمان بهینه‌سازی شد. تأثیر دما، میزان مایه تلقیح، منبع کربن و نیتروژن بر تولید آنزیم ارزیابی شد.
نتایج: سویة Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 از خاک، جداسازی و به‌عنوان یک سویة بالقوه مولد L- آسپاراژیناز شناسایی شد. روش تولید آنزیم خارج سلولی بود. فعالیت بهینة آنزیم U ml−1 4/62 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، میزان مایه تلقیح حجمی 9 درصد و با استفاده از سوکروز به‌عنوان منبع کربن و آمونیوم کلراید به‌عنوان منبع نیتروژن به دست آمد. فرایند بهینه‌سازی به افزایش 8/2 برابری تولید آنزیم منجر شد.
بحث و نتیجه‏گیری: به‌دلیل افزایش کاربردهای پزشکی و غذایی L- آسپاراژیناز در بازار تجاری، تقاضا برای این آنزیم از منابع جدید و با عوارض جانبی کمتر وجود دارد و L- آسپاراژیناز قارچی می‌تواند پاسخی مناسب به وضعیت کنونی بازار باشد؛ با وجود این، به‌کارگیری روش‌های آماری بهینه‌سازی و دست‌ورزی‌های ژنتیکی در مطالعات پیش رو برای دستیابی به حداکثر میزان تولید و بهبود قابلیت تولید صنعتی توصیه می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification and Enhanced Production of L-Asparaginase Enzyme Using A Soil-Isolated Fungal Strain: Sarocladium kiliense IBRC-M 30453

نویسندگان [English]

  • Neda Fazeli 1
  • Nayyereh Alimadadi 2
  • Shaghayegh Nasr 2
1 Department of Microbial Biotechnology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Microorganisms Bank, Iranian Biological Resource Center (IBRC), ACECR, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: L-asparaginase is a significant anticancer enzyme used both in medicine and food industries. Considering the importance of L-asparaginase in different industries, finding new sources of producer strains that can produce higher levels of this enzyme with minimum side effects is preferred.
Materials and Methods: Initial screening for L-asparaginase-producing strain was performed via qualitative plate assay on modified Czapex Dox's agar medium using L-asparagine as the nitrogen source and phenol red as pH indicator. L-asparaginase activity of the fungal strain was quantified by the nesslerization method. Its identification was performed by using both morphological characteristics and phylogenetic analyses of DNA sequence data, including ribosomal DNA regions of ITS (Internal Transcribed Spacer) and LSU (large Sub-Unit) rDNA. L-asparaginase production was optimized by the One Factor-At-the-Time (OFAT) technique. The impacts of temperature, inoculum size, nitrogen, and carbon sources on the enzyme production were then evaluated.
Results: Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 was isolated from soil and identified as a potent enzyme-producing strain. The enzyme production was based on the extracellular mode. An optimum enzyme activity of 62.4 U ml−1 was obtained at the temperature of 25°C with inoculum size of 9% (v/v) and sucrose containing carbon and ammonium chloride as the nitrogen source. The optimization process led to 2.8-fold increase in the enzyme production.
Discussion and Conclusion: There is a market demand for an alternate source of L-asparaginase with fewer adverse effects due to an increase in the clinical and industrial applications of this enzyme. Fungal L-asparaginase can be the proper answer to the current status of the market. However, application of statistical optimization processes and genetic manipulation have been recommended in other studies to achieve its maximum production level and improve feasibility of its industrial production.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Anticancer
  • Isolation
  • L-asparaginase
  • Optimization
  • Submerged Fermentation
  • Yeast-Like Microorganisms

اصل مقاله

مقدمه.

آنزیم L- آسپاراژیناز یا به عبارت کامل‌تر L- آسپاراژین آمینوهیدرولاز[1] آنزیمی است که هیدرولیز اسید آمینة آسپاراژین را به آسپارتیک اسید و آمونیاک کاتالیز می‌کند (1). این آنزیم از لحاظ ساختاری هموتترامریک است و معمولاً وزن مولکولی 140 تا 150 کیلودالتون دارد (2). L- آسپاراژیناز کاربرد گسترده‌ای در صنایع غذایی و داروسازی دارد. آنزیم L- آسپاراژیناز در صنایع غذایی با هدف کاهش میزان تولید آکریل آمید در واکنش میلارد و در هنگام پخت یا سرخ‌شدن مواد غذایی غنی از نشاسته به کار گرفته می‌شود (1) و در صنایع دارویی با مصرف L- آسپاراژین در سلول‌های سرطانی، موجب مهار سنتز پروتئین‌ها و توقف رشد سلول در مرحلة G1 می‌شود و سلول‌ها را به سمت آپوپتوز سوق می‌دهد؛ ازاین‌رو به‌عنوان داروی ضدسرطان در درمان لوکمی لنفوبلاستیک حاد[2] و به‌صورت تزریق درون سیاهرگی یا عضلانی استفاده می‌شود (3 و 4). سلول‌های سرطانی به‌دلیل فقدان آنزیمL - آسپاراژین سنتتاز نمی‌توانند اسید آمینة L- آسپاراژین مورد نیاز خود را بسازند و ازاین‌رو به منابع خارجی آن وابسته‌اند؛ درحالی‌که سلول‌های سالم به‌دلیل داشتن آنزیم مذکور قادرند پاسخگوی نیاز خود بهL - آسپاراژین باشند (5). علاوه بر صنایع فوق، آنزیم L- آسپاراژیناز می‌تواند ازطریق تعیین میزانL - آسپاراژین به‌عنوان سنسور زیستی در صنایع غذایی و سایر صنایع به کار گرفته شود (6). بازار جهانی آنزیم‌های کاربردی در بخش درمانی روند رو به رشدی دارد و انتظار می‌رود این بازار با رشد 4/7 درصدی از 5 میلیارد دلار در سال 2016 به 3/6 میلیارد دلار در سال 2021 برسد. آنزیم L- آسپاراژیناز 40 درصد کل آنزیم مورد نیاز در جهان و یک سوم نیاز به ترکیبات ضدلوکمی و ضدلنفوما را تأمین می‌کند (3).

آنزیم L- آسپاراژیناز در بافت‌های حیوانی و توسط گیاهان و میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شود؛ اما انسان قابلیت تولید این آنزیم را ندارد (7) و منابع میکروبی تولید، به‌دلیل سرعت بالای رشد میکروارگانیسم‌ها و امکان به‌کارگیری سوبسترای ارزان قیمت در فرایند تولید نسبت به سایر منابع ترجیح داده می‌شوند (2). در زمان حاضر تمامی L- آسپاراژیناز دارویی موجود در بازار از دو منبع باکتریایی Escherichia coli و Dickeya dadantii (با نام قبلی Erwinia chrysanthemi) تولید می‌شوند (1 و 3)؛ اگرچه مصرف این آنزیم‌ها می‌تواند با عوارض جانبی مانند واکنش حساسیت بیش از حد در بیماران و به‌دنبال آن شوک آنافیلاکسی و خنثی‌شدن دارو همراه شود (8). در مقابل تولید آنزیم از منابع یوکاریوتی به‌دلیل شباهت بیشتر این میکروارگانیسم‌ها به انسان می‌تواند با عوارض جانبی کمتری همراه باشد و سمیت کمتر و پاسخ ایمنی کمتری را القا کند (9 و 10). برخی از ویژگی‌های این آنزیم مانند حساسیت حرارتی به دماهای بالا، نیمه‌عمر کوتاه و واکنش‌های آلرژیک، فعالان حوزة بیوتکنولوژی را بر آن داشته است تا به‌دنبال یافتن منابع میکروبی جدید برای تولید این آنزیم با بازده تولید بالاتر و عوارض جانبی کمتر باشند (9 و 10). آنزیم L- آسپاراژیناز در میکروارگانیسم‌ها به‌صورت درون سلولی و خارج سلولی تولید می‌شود؛ اما آنزیم‌های خارج سلولی به‌دلیل داشتن ویژگی‌هایی مانند تمایل بالاتر برای آسپاراژین به‌عنوان سوبسترا، سهولت استخراج آنزیم، پایداری بیشتر و کاهش هزینه‌های فرایند تولید نسبت به نمونه‌های درون سلولی برتری دارند. با توجه به اینکه قارچ‌ها توانایی بالایی در تولید آنزیم‌های خارج سلولی دارند، می‌توانند به‌عنوان منابع میکروبی مناسبی برای تولید آنزیم به کار گرفته شوند (2 و 9).

هدف این پژوهش معرفی سویة جدید قارچی مولد آنزیم L- آسپاراژیناز خارج سلولی و بهبود کارایی تولید آنزیم در این سویه با به‌کارگیری روش بهینه‌سازی یک عامل در هر زمان طی فرایند کشت غوطه‌ور است.

مواد و روش‌ها.

میکروارگانیسم و شرایط کشت: سویة قارچ مدنظر از نمونه خاک (تهران، 35°42'46.1"N 51°18'15.4"E)، با تهیه رقت‌های سریال 1-10 تا 6-10 از محلول نمکی (NaCl 9/0 درصد) و به روش کشت سطحی[3] روی محیط کشت رز بنگال کلرامفنیکل آگار[4] جداسازی شد. پلیت‌ها ﺑﻪ ﻣﺪت 7 روز در اینکوباتور ﺑﺎ دﻣﺎی 25 درجه سانتی‌گراد ﮔﺮﻣﺎﮔـﺬاری ﺷﺪﻧﺪ. ترکیب محیط کشت رز بنگال کلرامفنیکل آگار شامل پپتون سویا 5، گلوکز 10، پتاسیم دی هیدروژن فسفات 1، سولفات منیزیم هفت آبه 5/0، رنگ رز بنگال 05/0، کلرامفینیکل 1/0 و آگار 17 گرم در هر لیتر است و pH محیط کشت روی 5/5 تنظیم شد (11). سویة قارچی پس از آن به محیط کشت عصارة مخمر - پپتون - دکستروز آگار[5] (YPD آگار) انتقال داده و نگهداری موقت قارچ با تجدید کشت با فواصل زمانی یک ماهه روی همین محیط انجام شد.

.غربالگری سویه‌های قارچی برای دستیابی به سویه‌های مولد L- آسپاراژیناز: کشت تازه از قارچ هدف، در محیط کشت مایع YPD تلقیح شد و پس از 48 ساعت گرماگذاری در شیکر اینکوباتور در دمـــای 25 درجه سانتی‌گراد و دور همزنی rpm 150، مقدار 5/1 میلی‌لیتر محیط کشت از لوله‌ها برداشته و به درون میکروتیوب‌های استریل ریخته شد. سپس میکروتیوب‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق در ×g 10000 سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ مایع رویی تخلیه شد و مقدار 1/0 میلی‌لیتر از محلول تلقیح (حاوی 1/0 درصد تویین 80 و 5/0 درصد آگار) به میکروتیوب افزوده و سپس همگن شد. سپس مقدار 5 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی با استفاده از سرسمپلر استریل برداشته و سویة‌ مدنظر به‌صورت نقطه‌ای روی محیط کشت زاپک داکس آگار تغییریافته[6] حاوی معرف فنل رد 009/0 درصد کشت داده شد و پلیت‌ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 روز گرماگذاری شدند (11 و 12). pH اولیه محیط کشت روی 2/6 تنظیم شد و پلیت‌های تلقیح‌نشده، کنترل در نظر گرفته شدند (13). فعالیت آنزیم آسپاراژیناز با آزادسازی آمونیاک ناشی از هیدرولیز آسپاراژین باعث قلیایی‌شدن محیط می‌شود و رنگ محیط اطراف کلنی مخمرها تغییر می‌کند. قطر ناحیة تغییر رنگ یافته به‌عنوان هاله هیدرولیز اندازه‌گیری شد (4 و 14).

ترکیب محیط کشت مایع YPD شامل عصارة مخمر 5، پپتون 10 و گلوکز 20 گرم در هر لیتر است (15). ترکیب محیط کشت غربالگری شامل گلوکز 2، L- آسپاراژین 10، پتاسیم دی هیدروژن فسفات 52/1، کلرید پتاسیم 52/0، سولفات منیزیم هفت آبه 52/0 و آگار 20 گرم در هر لیتر است و pH محیط کشت روی 2/6 تنظیم شد (16).

غربالگری برای فعالیت آنزیمی گلوتامینازی: فعالیت L- گلوتامینازی در سویة قارچی مولد L- آسپاراژیناز بررسی شد. برای این منظور در ترکیب محیط‌کشت زاپک داکس آگار تغییریافته به‌جای L- آسپاراژین مقدار 10 گرم در لیتر L- گلوتامین قرار گرفت و قابلیت تولید گلوتامیناز پس از 5 روز گرماگذاری در دمای 25 درجه سانتی‌گراد بررسی شد (17).

تهیه مایه تلقیح در محیط پیش‌کشت: برای تلقیح محیط تولید، سویة قارچ مدنظر در لوله آزمایش حاوی 3 میلی‌لیتر محیط زاپک داکس آگار تغییریافته کشت داده شد و برای مدت 72 ساعت در شیکر اینکوباتور با دمای 25 درجه سانتی‌گراد و دور همزنی rpm 150 گرماگذاری شد. سپس مایع کشت به مدت 15 دقیقه در ×g 10000، سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد. سلول‌های رسوب داده شده در محیط کشت مایع سوسپانسیون شدند و جذب نوری محیط کشت تولید به کمک این سلول‌ها در طول موج 600 نانومتر روی 1/0 تنظیم شد.

.تولید L- آسپاراژیناز در محیط تولید به روش کشت غوطه‌ور: فلاسک 100 میلی‌لیتری حاوی 20 میلی‌لیتر محیط کشت مایع زاپک داکس آگار تغییریافته با سویة قارچی تلقیح شد و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و دور همزنی rpm 150 گرماگذاری شد. پس از 4 روز گرماگذاری، محیط کشت با سانتریفیوژ یخچالدار در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه در ×g 10000، سانتریفیوژ و مایع شفاف رویی به‌عنوان آنزیم خام در آنالیزهای بعدی استفاده شد.

ارزیابی روش تولید آنزیم: روش تغییریافتة چاهک پلیت برای ارزیابی نحوة تولید آنزیم L- آسپاراژیناز استفاده شد. در این روش پلیت جامد حاوی محیط کشت زاپک داکس آگار تغییریافته به همراه 009/0 درصد رنگ فنل رد تهیه و پس از جامدشدن محیط کشت چاهک‌هایی به قطر 8 میلی‌متر با استفاده از پیپت پاستور در آنها ایجاد شد. چاهک‌ها با 100 میکرولیتر آنزیم خام فیلترشده (با استفاده از فیلتر 2/0 میکرومتر استات سلولز شرکت سارتوریوس[7]) پر شدند. آب مقطر استریل به‌عنوان کنترل منفی استفاده شد. سپس پلیت‌ها به مدت 72 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. تشکیل هاله تغییر رنگ یافته در اطراف چاهک به‌عنوان فعالیت L- آسپاراژینازی خارج سلولی تلقی خواهد شد (18).

سنجش میزان فعالیت آنزیمی: میزان تولید آنزیم L- آسپاراژیناز در سویة قارچی مدنظر با استفاده از روش نسلریزاسیون ارائه‌شده توسط ریستون[8] و یلین[9] در سال 1973 (19) و ایمادا[10] و همکاران در سال 1973 (20) ازطریق سنجش میزان آمونیاک آزادشده به‌عنوان محصول نهایی واکنش آنزیمی کمی‌سازی شد. مخلوط واکنش حاوی 5/0 میلی‌لیتر L- آسپاراژین 4/0 مولار، 5/0 میلی‌لیتر بافر تریس - اسید کلریدریک 05/0 مولار با pH برابر 6/8 و 5/0 میلی‌لیتر غلظت مناسبی از آنزیم خام است که برای مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. واکنش آنزیمی با افزودن 5/0 میلی‌لیتر از محلول 5/1 مولار تری کلرو استیک اسید متوقف می‌شود. نمونه کنترل منفی با افزودن آنزیم خام غیرفعال (تیمارشده در دمای جوش به مدت 30 دقیقه) پس از گرماگذاری در شرایط مشابه خوانش شد. برای حذف پروتئین‌های رسوب‌کرده، مخلوط واکنش به مدت 5 دقیقه در ×g 10000، سانتریفیوژ و مایع شفاف رویی برای انجام سنجش جمع‌آوری شد. برای سنجش میزان آمونیاک آزادشده، 1/0 میلی‌لیتر از مایع شفاف رویی واکنش آنزیمی با 5/3 میلی‌لیتر آب مقطر استریل و 2/0 میلی‌لیتر معرف نسلر مخلوط شد. پس از مدت زمان 10 دقیقه میزان جذب نوری نمونه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل UV-1800 (شرکت شیماتزو[11] سوئیس) در طول موج 450 نانومتر خوانش شد. میزان آمونیاک آزادشده در نمونه مجهول با مقایسة میزان جذب نوری این نمونه با منحنی استاندارد رسم‌شده برای غلظت‌های 9/0-0 میلی‌مولار آمونیوم سولفات به دست آمد. یک واحد L- آسپاراژیناز (U) به‌صورت میزان آنزیمی تعریف شد که در هر دقیقه 1 میکرومول آمونیاک در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 6/8 pH تولید می‌کند.

تعیین ویژگی‌های مورفولوژیک: ویژگی‌های ماکروسکوپی و میکروسکوپی سویة قارچی پس از 72 ساعت رشد روی محیط کشت YPD آگار در دمای 25 درجه سانتی‌گراد بررسی و تصویربرداری شد.

شناسایی مولکولی: استخراج DNA به روش فنل کلروفرم و با استفاده از دانه‌های شیشه‌ای انجام شد (21). برای شناسایی سویة قارچی، ناحیة D1/D2 ژن rRNA زیرواحد بزرگ ریبوزومی (LSU) با استفاده از پرایمرهای NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′) و NL4 (5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′) و ناحیة ITS (شامل قسمت انتهایی ژن rRNA زیرواحد کوچک ریبوزومی، ناحیة ITS1، ژن 5.8S rRNA، ناحیة ITS2 و قسمت ابتدایی ژن LSU rRNA) با استفاده از پرایمرهای ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) و ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) به روش PCR تکثیر و سپس توالی‌یابی شد (22 و 23). برنامة PCR شامل مرحلة واسرشت‌شدن در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه و 35 سیکل شامل 45 ثانیه واسرشت‌شدن در 95 درجه سانتی‌گراد، اتصال پرایمر در دمای 58 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، طویل‌شدن برای مدت 1 دقیقه و یک مرحلة طویل‌شدن نهایی 7 دقیقه‌ای تنظیم شد. محصول واکنش PCR روی ژل آگارز 1 درصد در بافر X TAE 5/0، بارگذاری و پس از الکتروفورز به مدت 45 دقیقه در ولتاژ 120 ولت و رنگ‌آمیزی ژل با رنگ اتیدیوم برماید بررسی شد. پس از مشاهدة باند حاصل روی ژل الکتروفورز، محصول واجد کیفیت مناسب برای تعیین توالی به شرکت فزاپژوه فرستاده شد. پس از توالی‌یابی، توالی‌های به‌دست‌آمده با نرم‌افزار ChromasPro ویرایش شدند و توالی حاصل از خوانش در دو جهت مونتاژ شد و توالی نهایی در پایگاه‌های داده CBS و GenBank بررسی و سویه شناسایی شد.

رسم درخت فیلوژنتیکی: سویه‌های شاخص نزدیک در جنس مدنظر انتخاب شد و توالی‌های آنها از پایگاه داده GenBank دریافت شدند. برای هم‌ترازی توالی‌ها از الگوریتم Clustal W (24) موجود در نرم‌افزار MEGA7 استفاده شد. برای تعیین موقعیت تاکسونومیک سویه‌ها، درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor-Joining توسط نرم‌افزار MEGA7 با استفاده از الگوریتم کیمورا[12] دو پارامتره رسم شد (25). سطوح اطمینان شاخه‌ها توسط آنالیز Bootstrap (26) با 1000 تکرار تخمین زده شد.

.بهینه‌سازی تولید آنزیم با روش یک عامل در هر زمان: فرایند بهینه‌سازی سویة قارچی مدنظر، براساس روش یک عامل در هر زمان[13] انجام شد که در آن در هر مرحله از آزمایش تنها یک فاکتور تغییر می‌کند و بقیه عوامل ثابت نگاه داشته می‌شوند. در این بررسی 50 میلی‌لیتر محیط کشت درون فلاسک 250 میلی‌لیتری به‌عنوان حجم تولید لحاظ شد. پارامترهای میزان مایه تلقیح (1، 3، 6 و 9 درصد حجمی)، دمای گرماگذاری (15، 20، 25، 30، 35 و 37 درجه سانتی‌گراد)، منابع کربن مختلف با غلظت 1 درصد (گلوکز، سوکروز، سیتریک‌اسید و گلیسرول)، منابع نیتروژن غیرآلی با غلظت 1 درصد (کلرید آمونیوم و نیترات سدیم) و منابع نیتروژن آلی با غلظت 1 درصد (عصارة مخمر، پرولین و L- آسپاراژین) ارزیابی شدند. نمونه‌برداری از محیط تولید، پس از 96 ساعت گرماگذاری انجام و تراکم سلولی در طول موج 600 نانومتر و میزان فعالیت آنزیمی در هر نمونه تعیین شد.

آنالیزهای آماری: تمامی آزمایش‌ها با سه بار تکرار انجام شدند و نتایج ارائه‌شده حاصل میانگین این تکرارها ± استاندارد خطای میانگین این سه تکرار مستقل‌اند. داده‌ها به روش آنالیز واریانس یک‌طرفه و آزمون توکی با ضریب اطمینان 95 درصد با استفاده از نرم‌افزار Minitab ویرایش 17، آنالیز و داده‌هایی با P values کمتر از 05/0 معنادار تلقی شدند.

نتایج.

غربالگری برای تولید آنزیم‌های آسپاراژیناز و گلوتامیناز: سویة قارچی IBRC-M 30453 از خاک جداسازی شد و قابلیت تولید آنزیم L- آسپاراژیناز توسط آن روی محیط کشت زاپک داکس آگار تغییریافتة حاوی L- آسپاراژین و معرف فنل رد بررسی شد. پس از 5 روز گرماگذاری در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، تغییر رنگ در محیط کشت به‌صورت تشکیل هاله‌ای به رنگ قرمز با قطر حدود 5/2 سانتی‌متر مشاهده شد (شکل a1). این تغییر رنگ بیان‌کنندة تولید آنزیم L- آسپاراژیناز و قلیایی‌شدن محیط بر اثر آزادسازی آمونیاک ناشی از هیدرولیز آسپاراژین است. در شرایط گرماگذاری یکسان، کشت سویة قارچی روی محیط کشت حاوی L- گلوتامین و معرف فنل رد نیز منجر به تشکیل هاله‌ای قرمز رنگ به قطر حدود 5 سانتی‌متر شد که بیان‌کنندة تولید آنزیم گلوتامیناز توسط این سویه است.

به‌منظور بررسی نحوة تولید آنزیم آسپاراژیناز، کشت غوطه‌ور در محیط کشت زاپک داکس آگار تغییریافته، انجام و فعالیت آنزیمی مایع بدون سلول به‌دست‌آمده، به روش چاهک پلیت ارزیابی شد. در اطراف چاهک هاله تغییر رنگ به قطر حدود 3 سانتی‌متر مشاهده شد که بیان‌کنندة تولید آسپاراژیناز خارج سلولی توسط این سویه است (شکل b1).

شکل 1- تشکیل هاله تغییر رنگ در محیط کشت زاپک داکس آگار تغییریافته به همراه 009/0 درصد رنگ فنل رد؛ a) کشت سویة قارچی برای غربالگری اولیه، b) روش چاهک پلیت برای بررسی خارج سلولی بودن آنزیم L- آسپاراژیناز

تولید آنزیم آسپاراژیناز در کشت غوطه‌ور: کشت غوطه‌ور سویة قارچی IBRC-M 30453 در فلاسک‌های حاوی محیط کشت مایع زاپک داکس تغییریافته به مدت 4 روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و دور همزنی rpm 150 انجام شد. فعالیت آنزیمی مایع رویی کشت با سنجش میزان آمونیاک آزادشده به روش نسلریزاسیون و با استفاده از منحنی استاندارد (شکل 2) اندازه‌گیری شد. میزان تولید آنزیم آسپاراژیناز توسط این سویه U ml-1 2/4 ± 3/22 به دست آمد.

شکل 2- منحنی استاندارد برای سنجش میزان آمونیاک با استفاده از معرف نسلر که بیان‌کنندة رابطة خطی بین جذب نوری و غلظت یون آمونیوم در دامنه‌های مشخص‌شدة جذب و غلظت است.

شناسایی سویة مولد آسپاراژیناز: ویژگی‌های مورفولوژیک سویة قارچی IBRC-M 30453 پس از رشد روی محیط کشت YPD آگار به مدت 72 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد بررسی شدند (شکل 3). کلنی این سویة گلبهی رنگ، مات، محدب، با قوام کره‌ای و با حاشیة میسلیومی گسترده بود. سلول‌ها بیضی شکل تا استوانه‌ای با انتهای گرد بودند و با جوانه‌زنی قطبی تکثیر می‌شدند. سلول‌های کشیده‌تر و هیف نیز در کشت این سویه مشاهده شدند که بیان‌کنندة حالت شبه مخمری و دی‌مورفیک‌بودن آن هستند.

شکل 3- تصاویر ماکرومورفولوژی (a) و میکرومورفولوژی (b) سویة قارچی Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 پس از رشد روی محیط کشت YPD آگار به مدت 72 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد

شناسایی مولکولی سویة قارچی IBRC-M 30453 با استفاده از آنالیز دو توالی ریبوزومی انجام شد. قطعه‌ای به طول حدود 600 جفت‌باز به‌عنوان محصول PCR برای هر دو ناحیه تکثیر شد (شکل 4). پس از توالی‌یابی، توالی ناحیة D1/D2 در ژن LSU rDNA و ITS به‌ترتیب با شماره دسترسی MN128534 و MN128515 در پایگاه داده GenBank ثبت شد. مقایسة توالی‌های به‌دست‌آمده با توالی‌های موجود در پایگاه‌های داده GenBank و CBS نشان داد این توالی‌ها به میزان 100-99 درصد به توالی‌های مربوط به سویه‌هایی از گونة Sarocladium kiliense شباهت داشت. با جستجوی توالی‌های ناحیة D1/D2 میان توالی‌های سویه‌های شاخص[14] در پایگاه‌های داده مشخص شد نزدیک‌ترین توالی مربوط به سویة شاخص گونة S. kiliense با میزان تشابه 83/99 درصد است (جدول 1). این توالی همچنین به میزان 100 درصد با توالی سویه‌هایی از این گونه مانند سویه‌های CBS 145.62 و CBS 377.70F (شماره دسترسی MH878541 و MH871482) شباهت داشت. با مقایسة توالی ناحیة ITS در پایگاه‌های داده نیز نزدیک‌ترین توالی مربوط به سویة شاخص گونة S. kiliense با میزان تشابه 62/99 درصد است (جدول 1). توالی ناحیة ITS این سویه به میزان 100 درصد با توالی ITS سویه‌هایی از این گونه مانند سویه‌های AUMC 11033 و Kw63-15 (شماره دسترسی KX384658 و LN864540) شباهت دارد.

برای تعیین موقعیت تاکسونومیک سویة قارچی، درخت فیلوژنتیکی براساس توالی‌های به‌دست‌آمده و توالی‌های سویه‌های شاخص گونه‌های نزدیک رسم شد. این سویه در درخت‌های فیلوژنتیکی رسم‌شده برای نواحی D1/D2 ژن LSU rRNA و ITS (شکل‌های 5 و 6)، در جایگاه یکسانی با گونة S. kiliense قرار گرفت. این جایگاه فیلوژنتیک با نتایج به‌دست‌آمده از BLAST توالی‌ها در پایگاه‌های داده نیز مطابقت داشت؛ بنابراین، براساس میزان تشابه و همچنین آنالیز فیلوژنتیکی توالی‌ها تعلق سویة قارچی IBRC-M 30453 به گونة S. kiliense تأیید شد.

 

 

شکل 4- تصویر ژل الکتروفورز محصولات PCR تکثیرشده از ناحیة D1/D2 در ژن LSU rRNA (a) و ناحیة ITS (b) در سویة قارچی Sarocladium kiliense IBRC-M 30453

 

 

جدول 1- نتایج BLAST توالی‌های به‌دست‌آمده با توالی‌های سویه‌های شاخص موجود در پایگاه‌های داده GenBank و CBS

قطعه ژنی

طول توالی

نزدیک‌ترین سویه‌های شاخص

شماره دسترسی

تشابه (%)

هم‌پوشانی (%)

Score

D1/D2

588

S. kiliense CBS 122.29T

MH866490

83/99

100

1081

S. zeae CBS 800.69T

NG_067385

81/98

100

1048

S. strictum CBS 346.70T

MH871457

47/98

100

1037

ITS

567

S. kiliense MUCL 9724T

NR_130684

62/99

94

974

S. strictum CBS 346.70T

AY138845

26/94

100

872

S. hominis UTHSC 04-1034T

NR_155779

42/95

95

863

 

 Sarocladium bactrocephalum CBS 749.69T (HQ231994)

 Sarocladium strictum CBS 346.70T (HQ232141)

 Sarocladium pseudostrictum UTHSC 02-1892T (HG965073)

 Sarocladium hominis UTHSC 04-1034T (HG965060)

 Sarocladium oryzae CBS 180.74T (HG965047)

 Sarocladium kiliense CBS 122.29T (HQ232052)

 Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 (MN128534)

 Sarocladium zeae CBS 800.69T (HQ232152)

 Sarocladium ochraceum CBS 428.67T (HQ232070)

 Sarocladium implicatum CBS 959.72T (HG965072)

 Sarocladium gamsii CBS 707.73T (HG965062)

 Sarocladium bifurcatum UTHSC 05-3311T (HG965057)

 Sarocladium subulatum MUCL 9939T (HG965075)

 Sarocladium bacillisporum CBS 425.67T (HE608658)

 Sarocladium terricola CBS 134.71T (HG965082)

 Sarocladium glaucum CBS 796.69T (HE608657)

 Sarocladium summerbellii CBS 430.70T (HG965078)

 Acremonium variecolor CBS 130361T (HE608652)

81

98

65

46

40

37

42

38

77

75

73

86

39

34

50

0.01

شکل 5- درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده با استفاده از آنالیز Neighbor-Joining برای توالی ناحیة‌ LSU rDNA D1/D2 که موقعیت سویة مورد بررسی (♦) را در میان گونه‌های خویشاوند در جنس Sarocladium نشان می‌دهد. شماره‌ دسترسی به توالی‌ها در GenBank در پرانتز نوشته شده است. قارچ Acremonium variecolor CBS 130361T به‌عنوان گروه خارجی تعیین شد. میزان Bootstrap (1000 تکرار) در محل انشعابات درخت نشان داده شده است. خط مقیاس، 01/0 جایگزینی نوکلئوتیدی به‌ازای هر جایگاه نوکلئوتیدی را نشان می‌دهد.

 Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 (MN128515)

 Sarocladium kiliense CBS 122.29T (FN691446)

 Sarocladium hominis UTHSC 04-1034T (HG965012)

 Sarocladium zeae CBS 800.69T (FN691451)

 Sarocladium oryzae CBS 180.74T (HG965026)

 Sarocladium pseudostrictum UTHSC 02-1892T (HG965029)

 Sarocladium bactrocephalum CBS 749.69T (HG965006)

 Sarocladium strictum CBS 346.70T (FN691453)

 Sarocladium ochraceum CBS 428.67T (HG965025)

 Sarocladium summerbellii CBS 430.70T (HG965034)

 Sarocladium subulatum MUCL 9939T (HG965031)

 Sarocladium terricola CBS 134.71T (HG965038)

 Sarocladium bacillisporum CBS 425.67T (HE608639)

 Sarocladium bifurcatum UTHSC 05-3311T (HG965009)

 Sarocladium glaucum CBS 796.69T (FN691454)

 Sarocladium gamsii CBS 707.73T (HG965015)

 Acremonium alcalophilum CBS 114.92 (MH862344)

90

100

99

39

40

89

56

97

91

100

85

43

46

99

0.05

شکل 6- درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده با استفاده از آنالیز Neighbor-Joining برای توالی ناحیة‌ ITS که موقعیت سویة مورد بررسی (♦) را در میان گونه‌های خویشاوند در جنس Sarocladium نشان می‌دهد. شماره‌ دسترسی به توالی‌ها در GenBank در پرانتز نوشته شده است. قارچ Acremonium alcalophilum CBS 114.92 به‌عنوان گروه خارجی تعیین شد. میزان Bootstrap (1000 تکرار) در محل انشعابات درخت نشان داده شده است. خط مقیاس، 05/0 جایگزینی نوکلئوتیدی به‌ازای هر جایگاه نوکلئوتیدی را نشان می‌دهد.

بهینه‌سازی تولید آنزیم آسپاراژیناز: برای تعیین عوامل مؤثر بر میزان تولید آنزیم آسپاراژیناز، چهار عامل میزان مایه تلقیح یا اینوکولوم، دمای گرماگذاری، منبع کربن و منبع نیتروژن به‌ترتیب بررسی شدند. برای مقایسة شرایط مختلف، میزان فعالیت آنزیمی و میزان رشد براساس جذب نوری کشت پس از 96 ساعت گرماگذاری با دور همزنی rpm 150 اندازه‌گیری شدند.

برای بهینه‌سازی میزان اینوکولوم، پیش‌کشت با نسبت حجمی 1، 3، 6 و 9 درصد به محیط کشت تولید آنزیم تلقیح شد. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی با میزان اینوکولوم 9 درصد مشاهده شد که تفاوت آن از لحاظ آماری نسبت به اینوکولوم 1 درصد معنادار بود؛ اما با اینوکولوم‌های 6 و 3 درصد تفاوت معنی‌داری نشان نداد؛ بنابراین، اینوکولوم 9 درصد که بالاترین میزان فعالیت آنزیمی با آن مشاهده شد، به‌عنوان اینوکولوم منتخب برای آزمایش‌های بعدی در نظر گرفته شد. بیشترین میزان رشد نیز با اینوکولوم 9 درصد مشاهده شد؛ اگرچه تفاوت رشد در اینوکولوم‌های مختلف معنادار نبود (شکل a7).

برای بهینه‌سازی دما، کشت‌ها در محیط تولید آنزیم در دماهای 15، 20، 25، 30، 35 و 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد مشاهده شد که تفاوت آن نسبت به دمای 15 درجه سانتی‌گراد معنادار بود؛ اما نسبت به سایر دماها از لحاظ آماری تفاوت معناداری نداشت. با توجه به اینکه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد فعالیت آنزیمی بالاتری به دست آمد، این دما به‌عنوان دمای منتخب در آزمایش‌های بعدی در نظر گرفته شد. بیشترین میزان رشد در دمای 35 درجه سانتی‌گراد مشاهده شد که تفاوت آن نسبت به دماهای 15، 20 و 25 درجه سانتی‌گراد معنادار بود؛ اما نسبت به دماهای 30 و 37 درجه سانتی‌گراد تفاوت معناداری از لحاظ آماری نداشت (شکل b7).

اثر منابع کربن مختلف شامل گلوکز، سوکروز، گلایسین و گلیسرول با غلظت 1 درصد بر میزان رشد و تولید آنزیم بررسی شد. میزان تولید آنزیم در حضور منابع کربن مختلف از لحاظ آماری تفاوت معناداری نداشت؛ اما با توجه به مقدار فعالیت آنزیمی بیشتر در حضور سوکروز و ارزان و در دسترس بودن این منبع کربن، سوکروز به‌عنوان منبع کربن منتخب برای آزمایش بعدی در نظر گرفته شد. میزان رشد سویة قارچی در حضور منابع کربن مختلف متفاوت بود و بیشترین میزان رشد به‌ترتیب در حضور گلوگز، سوکروز، گلیسرول و سیتریک‌اسید به دست آمد (شکل c7).

اثر سه منبع نیتروژن آلی شامل آسپاراژین، پرولین و عصارة مخمر و دو منبع نیتروژن معدنی شامل سدیم نیترات و آمونیوم کلراید با غلظت 1 درصد بر میزان رشد و تولید آنزیم بررسی شد. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی و بیشترین میزان رشد با تفاوت معنادار از لحاظ آماری، در حضور آمونیوم کلراید، مشاهده و به‌عنوان منبع نیتروژن بهینه در نظر گرفته شد. پس از آمونیوم کلراید، بیشترین تولید آنزیم به‌ترتیب در حضور L- آسپاراژین و عصارة مخمر به دست آمد. کمترین میزان تولید آنزیم نیز با L- پرولین و سدیم نیترات به دست آمد (شکل d7).

در پایان، بهینه‌سازی به روش یک عامل در هر زمان، میزان تولید آنزیم توسط سویة Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 U ml−1 6/1 ± 4/62 در شرایط دمای 25 درجه سانتی‌گراد و میزان مایه تلقیح 9 درصد و با استفاده از سوکروز به‌عنوان منبع کربن و آمونیوم کلراید به‌عنوان منبع نیتروژن به دست آمد؛ بنابراین، میزان تولید آنزیم فرایند بهینه‌سازی به افزایش 8/2 برابری تولید آنزیم منجر شد.

 

 

 

 

 

شکل 7- اثر عوامل مختلف بر میزان تولید آنزیم (ستون‌های خاکستری) و رشد (ستون‌های سفید) سویة قارچی Sarocladium kiliense IBRC-M 30453. شرایط ثابت آزمایش: گرماگذاری 96 ساعت و دور همزنی rpm 150

بحث و نتیجه‌گیری.

آنزیم L- آسپاراژیناز، کاربردهای مختلفی در درمان سرطان‌ها و بیماری‌های خودایمنی و عفونی، فرآوری مواد غذایی و فناوری بیوسنسورها دارد (3 و 27). با توجه به کاربردهای گسترده این آنزیم و ویژگی‌های بیوشیمیایی، ساختاری و فارماکولوژیکی متنوع L- آسپاراژینازهای شناسایی‌شده، تمایل به یافتن منابع جدید تولید این آنزیم با بازده بالاتر و خواص عملکردی متفاوت و سهولت و کاهش هزینه‌های فرایندهای فرودستی وجود دارد. امروزه از میان منابع میکروبی آنزیم L- آسپاراژیناز، قارچ‌ها به‌دلیل واکنش‌های آلرژیک کمتر، بازده تولید بالا و تولید آنزیم خارج سلولی درخور توجه قرار گرفته‌اند (2 و 9 و 10 و 28). هنوز محصول تجاری از آنزیم L- آسپاراژیناز قارچی برای کاربرد دارویی در بازار وجود ندارد؛ اما محصولات تجاری با نام‌های PreventASe® و ®Acrylaway، به‌ترتیب تولیدشده توسط قارچ‌های Aspergillus niger و A. oryzae، در صنایع غذایی استفاده می‌شوند (27). این پژوهش با هدف شناسایی سویة قارچی مولد آنزیم L- آسپاراژیناز و بررسی اولیه شرایط تولید آنزیم در کشت غوطه‌ور انجام شد.

قابلیت تولید آنزیم L- آسپاراژیناز در سویه‌های قارچی متعددی گزارش شده است. از مهم‌ترین قارچ‌های رشته‌ای می‌توان به جنس‌های Aspergilus، Penicillium، Fusarium، Cladosporium، Trichoderma و Rhizomucor اشاره کرد (3). سویه‌های مخمری و شبه مخمری از جنس‌هایی مانند Candida، Cryptococcus، Saccharomyces، Pichia، Rhodotorula، Yarrowia، Sporobolomyces، Aureobasidium، Fereydounia و Coniochaeta نیز به‌عنوان قارچ‌های مولد این آنزیم گزارش شده‌اند (3 و 9). در این مطالعه، سویه شبه‌ مخمری Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 به‌عنوان سویة مولد آنزیم L- آسپاراژیناز معرفی شد. جنس Sarocladium ازنظر تاکسونومی در شاخة Ascomycota، ردة Sordariomycetes، راستة Hypocreales و خانوادة Sarocladiaceae قرار دارد و از قارچ‌های دی‌مورفیک یا شبه مخمری به شمار می‌رود. قارچ‌های شبه مخمری به‌دلیل امکان تغییر بین دو حالت مخمری و رشته‌ای ازنظر بیوتکنولوژی درخور توجه‌اند؛ زیرا می‌توان فرم مخمری را برای تکثیر سلولی و فرم رشته‌ای را برای تولید آنزیم‌های خارج سلولی به کار گرفت (29 و 30). تولید آنزیم L- آسپاراژیناز در این جنس در گونه‌های S. kiliense، S. strictum و S. terricola گزارش شده است (28 و 31 و 32).

تولید آنزیم L- آسپاراژیناز در بیشتر میکروارگانیسم‌ها به‌صورت درون سلولی است. در مقیاس صنعتی، ترشح خارج سلولی آنزیم‌ها به‌دلیل امکان تولید بیشتر در شرایط طبیعی، پایدارتربودن محصول و آسان‌ترشدن خالص‌سازی و کاهش هزینه‌های تولید ارجحیت دارد (3 و 33). در این مطالعه نشان داده شد سویة شبه‌ مخمری Sarocladium kiliense IBRC-M 30453 آنزیم L- آسپاراژیناز را به‌صورت خارج سلولی تولید می‌کند. تولید این آنزیم در بیشتر قارچ‌ها به‌صورت خارج سلولی است؛ اما تولید درون سلولی آن نیز در برخی قارچ‌های رشته‌ای مانند Penicillium brevicompactum، P. funicolosum، Aspergillus fumigatus و A. phoenicis (34) و برخی گونه‌های مخمری مانند Saccharomyces cerevisiae، Schizosaccharomyces pombe و Leucosporidium scottii گزارش شده است (35 و 36 و 37).

برخی از انواع آنزیم L- آسپاراژیناز فعالیت ثانویة هیدرولیز و دآمینه‌کردن آمینواسید گلوتامین نیز دارند (38). برخی میکروارگانیسم‌ها علاوه بر تولید آنزیم L- آسپاراژیناز، آنزیم L- گلوتامیناز نیز تولید می‌کنند (39). آنزیم L- گلوتامیناز نیز یکی از آنزیم‌هایی است که به‌دلیل فعالیت ضدتوموری و ضدویروسی در کاربردهای پزشکی اهمیت دارد (40). در برخی مطالعات نشان داده شده است فعالیت ثانویة گلوتامینازی آنزیم L- آسپاراژیناز برای فعالیت ضدتوموری آن نیاز است (41)؛ با وجود این، مطالعات دیگری بیان‌کنندة بروز اثرات جانبی منفی مانند واکنش‌های آلرژیک، حالت تهوع و پانکراتیت به‌دلیل فعالیت گلوتامینازی غیراختصاصی این آنزیم است. ازاین‌رو، سویه‌های فاقد یا دارای مقادیر اندک این فعالیت آنزیمی برای تولید آنزیم L- آسپاراژیناز درخور توجه قرار گرفته‌اند (3). در این پژوهش، فعالیت گلوتامینازی به روش سنجش کیفی روی محیط جامد حاوی L- گلوتامین در سویة مدنظر مشاهده شد؛ با وجود این، در شرایط تولید آنزیم L- آسپاراژیناز حضور همزمان این فعالیت‌های آنزیمی بررسی نشد. برای سویه‌های تجاری امکان حذف یا کاهش فعالیت گلوتامینازی با روش‌های مهندسی ژنتیک وجود دارد. در مطالعة بارگاوی[xv] و مادهوری[xvi] (2021)، تولید آنزیم گلوتامیناز توسط سویة مولد L- آسپاراژیناز S. kiliense بررسی نشد (32)؛ اما در سویة S. strictum مولد L- آسپاراژیناز گزارش‌شده توسط گلبابائی[xvii] و همکاران (2020) فعالیت غیراختصاصی گلوتامینازی برای آنزیم L- آسپاراژیناز تولیدشده شناسایی نشد (28).

تولید صنعتی آنزیم L- آسپاراژیناز توسط باکتری‌ها و قارچ‌ها بیشتر به روش کشت غوطه‌ور انجام می‌شود (27). میزان تولید آنزیم تأثیرگرفته از ترکیب محیط کشت، به‌ویژه منابع کربن و نیتروژن و عوامل فیزیکی مانند دما، pH، همزنی، تراکم اینوکولوم و مدت زمان کشت است. هر میکروارگانیسم نیازمندی‌های خاص خود را برای بیشترین میزان تولید آنزیم دارد؛ بنابراین، بهینه‌سازی شرایط برای بررسی قابلیت تولید آنزیم سویه‌های میکروبی مختلف ضروری است (42). در این پژوهش، اثر چهار عامل میزان اینوکولوم، دمای گرماگذاری و منابع کربن و نیتروژن بر تولید L- آسپاراژیناز توسط سویة مدنظر به روش یک عامل در هر زمان بررسی شد.

میزان اینوکولوم یا تراکم اولیه سلولی یکی از فاکتورهای مهم در فرایندهای زیستی به شمار می‌رود (43). در این مطالعه، بیشترین میزان تولید آنزیم (Uml−10/5 ±4/38) با اینوکولوم 9 درصد و کمترین میزان تولید آنزیم (U ml−1 0/2 ± 9/24) با اینوکولوم 1 درصد به دست آمد. افزایش نسبی تولید آنزیم در میزان اینوکولوم بیشتر که در این مطالعه مشاهده شد، با نتایج پژوهش‌های دیگر مطابقت دارد؛ برای مثال، موگل[xviii] و همکاران (2020) نشان دادند افزایش تراکم اولیه سلولی، به افزایش سرعت مصرف سوبسترا، افزایش سرعت و میزان تولید آنزیم L- آسپاراژیناز توسط مخمر Leucosporidium scottii منجر شد. تراکم اولیه بالای سلولی راهکاری برای تولید آنزیم با حداقل میزان رشد و حداقل میزان مواد مورد نیاز برای حفظ بقای سلول است و در طراحی فرایند تولید، به کاهش هزینه‌ها نیز منجر خواهد شد (37).

دما یکی دیگر از عوامل مؤثر بر فرایندهای تولید محصولات زیستی است و بر رشد میکروبی، ترشح آنزیم، سرعت واکنش‌های شیمیایی و میزان فعالیت آنزیمی تأثیر می‌گذارد (44). دمای بهینه برای تولید آنزیم L- آسپاراژیناز توسط بیشتر میکروارگانیسم‌ها در دامنة 37-25 درجه سانتی‌گراد گزارش شده است (3). در این مطالعه، تولید آنزیم در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نسبت به دمای 15 درجه سانتی‌گراد بیشتر بود؛ اما باوجود میانگین تولید آنزیم بیشتر در دمای 25 درجه سانتی‌گراد (U ml−1 2/1 ± 8/37)، تفاوت معناداری در میزان تولید آنزیم در دامنة 37-25 درجه سانتی‌گراد مشاهده نشد؛ بنابراین، تولید آنزیم L- آسپاراژیناز توسط این سویه در دامنة دمایی نسبتاً گسترده‌ای انجام می‌شود. در مطالعه‌ای روی سویة دیگری از S. kiliense تولید آنزیم L- آسپاراژیناز در دماهای 60-20 درجه سانتی‌گراد بررسی و دمای 40 درجه سانتی‌گراد به‌عنوان دمای بهینه گزارش شد (32).

انتخاب سوبسترای مناسب براساس ارزش غذایی، قابلیت دسترسی و هزینه نقش مهمی در تولید تجاری آنزیم‌ها دارد (45). محیط کشت زاپک داکس تغییریافته حاوی گلوکز و آسپاراژین رایج‌ترین محیط کشت گزارش‌شده برای تولید آنزیم L- آسپاراژیناز در کشت غوطه‌ور توسط قارچ‌ها است (3 و 42). منابع کربن مختلفی مانند گلوکز، سوکروز، فروکتوز، لاکتوز، مالتوز، گلیسرول، نشاسته و سیتریک‌اسید برای تولید آنزیم L- آسپاراژیناز گزارش شده و مطالعات بسیاری گلوکز را به‌عنوان منبع کربن بهینه معرفی کرده‌اند (27 و 42). در این مطالعه، منابع کربن گلوکز، سوکروز، گلایسین و گلیسرول با غلظت 1 درصد بررسی شدند. میزان تولید آنزیم در حضور این منابع کربن از لحاظ آماری تفاوت معناداری نداشت؛ اما بیشترین میزان تولید (U ml−1 2/2 ± 4/35) در سوکروز مشاهده شد. بیشترین میزان رشد نیز ابتدا در حضور گلوکز و سپس در حضور سوکروز انجام گرفت؛ بنابراین، با توجه به مقدار فعالیت آنزیمی بیشتر در حضور سوکروز و ارزان و در دسترس بودن این منبع کربن، سوکروز به‌عنوان منبع کربن برای آزمایش بعدی انتخاب شد. سوکروز دی‌سکاریدی است که توسط هیدرولازها به مونوساکاریدهای تشکیل‌دهنده شامل گلوکز و فروکتوز، تبدیل و توسط میکروارگانیسم مصرف می‌شود. این سوبسترا به‌دلیل توسعه‌یافتگی صنعت شکر به‌طور گسترده در فرایندهای زیست‌فناوری صنعتی استفاده می‌شود (46). گلیسرول نیز منبع کربن ارزان قیمتی است که به‌عنوان محصول جانبی صنایع سوخت زیستی تولید می‌شود و تبدیل آن به فرآورده‌هایی با ارزش بالا شایان توجه پژوهشگران قرار دارد (47). میزان چشمگیری از تولید آنزیم توسط سویة مدنظر در این پژوهش، در حضور گلیسرول به دست آمد؛ بنابراین، استفاده از گلیسرول می‌تواند هزینة تولید آنزیم توسط این سویه را کاهش دهد. در پژوهش انجام‌شده روی سویة دیگری از این گونه، یعنی S. kiliense BKJM2، از میان پنج منبع کربن بررسی‌شده با غلظت 1/0 درصد، بیشترین میزان تولید آنزیم L- آسپاراژیناز به‌ترتیب با گلوکز، مالتوز، سوکروز، فروکتوز و لاکتوز به دست آمد (32) که با نتایج این مطالعه متفاوت است و می‌تواند به‌دلیل متفاوت‌بودن فیزیولوژی سویه‌های مختلف و شرایط آزمایش‌ها باشد.

منبع نیتروژن یکی از مؤثرترین عوامل بر میزان تولید آنزیم L- آسپاراژیناز است. در مطالعات متعددی L- آسپاراژین و L- پرولین به‌عنوان بهترین منابع نیتروژن برای تولید این آنزیم گزارش شده‌اند (17 و 42). اگرچه L- آسپاراژین القاگر تولید این آنزیم است، می‌تواند به‌عنوان عامل محدودکنندة تولید آنزیم نیز به شمار رود (48). علاوه بر این آمینواسیدها، ترکیبات دیگری مانند اوره، عصارة مخمر، پپتون، آمونیوم نیترات، آمونیوم سولفات و آمونیوم کلراید نیز عوامل مهمی در تولید آنزیم L- آسپاراژیناز هستند (42). در این پژوهش، بیشترین میزان رشد و تولید آنزیم در حضور آمونیوم کلراید با تفاوت چشمگیری نسبت به دیگر منابع بررسی‌شده به دست آمد و L- آسپاراژین دومین منبع نیتروژن ازنظر اثر مثبت بر تولید آنزیم بود. در پژوهش انجام‌شده روی S. kiliense BKJM2، از میان چهار منبع نیتروژن بررسی‌شده، بیشترین میزان تولید آنزیم به‌ترتیب در حضور پپتون، آمونیوم سولفات، عصارة گوشت و عصارة مخمر مشاهده شد (32). اثر مثبت آمونیوم و اثر منفی عصارة مخمر بر تولید آنزیم، ویژگی مشترک به‌دست‌آمده از مطالعه روی این دو سویة متفاوت S. kiliense است. در پژوهش انجام‌شده روی شبه مخمر S. strictum AG90 نتایج متفاوتی به دست آمد و اثر مثبت برای عصارة مخمر و L- آسپاراژین و اثر منفی برای آمونیوم سولفات گزارش شد (28).

در این پژوهش، میزان تولید آنزیم L- آسپاراژیناز توسط سویة شبه مخمری S. kiliense IBRC-M 30453 پس از بهینه‌سازی به روش یک عامل در هر زمان به U ml−1 6/1 ± 4/62 رسید. میزان تولید این آنزیم توسط S. kiliense BKJM2 و S. strictum AG90 به‌ترتیب U ml−1 80/20 و U ml−1 812/1 گزارش شده است (28 و 32). از بیشترین میزان تولید L- آسپاراژیناز گزارش‌شده در سویه‌های وحشی قارچ‌ها می‌توان به تولید U ml−1 160 توسط Penicillium cyclopium (49) و تولید U ml−1 185 توسط Aspergillus sp. (50) اشاره کرد. در بهینه‌سازی ابتدایی در این مطالعه تولید آنزیم به‌طور چشمگیری افزایش یافت؛ اما رسیدن به شرایط بهینه به انجام آزمایش‌های بیشتر، بررسی عوامل مختلف و برهمکنش آنها و استفاده از روش‌های طراحی آزمایش نیازمند است. همچنین، مطالعات فراتر مانند بررسی سوبستراهای ارزان قیمت، کشت در بیوراکتور و خالص‌سازی و تعیین خصوصیات آنزیم امکان بررسی پتانسیل تجاری این سویه را فراهم می‌کند.

[1]- L-Asparagine aminohydrolase (EC 3.5.1.1)

[2]- Acute lymphoblastic leukemia (ALL)

[3]- Spread plate

[4]- Rose Bengal Chloramphenicol Agar

[5]- Yeast extract Peptone Dextrose Agar

[6]- Modified Czapex dox's agar

[7]- Sartorius

[8]- Wriston

[9]- Yellin

[10]- Imada

[11]- Shimadzu

[12]- Kimura

[13]- One Factor at A Time

[14]- Type strains

[xv]- Bhargavi

[xvi]- Madhuri

[xvii]- Golbabaie

[xviii]- Moguel

مراجع

  • Barros T, Brumano L, Freitas M, Pessoa A, Parachin N, Magalhães PO. Escherichia coli Bl21 (De3): from shaker to bioreactors. Pharmaceutics. 2021; 13: 14.
  • Naser S, Saber W, El-Metwally M, Moustafa M, El-Kott A. Fungal assembly of L-asparaginase using solid-state fermentation: a review. 2020; 44 (2): 147-155.
  • Chand S, Mahajan RV, Prasad JP, Sahoo DK, Mihooliya NK, Dhar MS, et al. A comprehensive review on microbial L-asparaginase: Bioprocessing, characterization and industrial applications. Biotechnology and Applied Biochemistry. 2020; 67 (4): 619-647.
  • Ashok A, Doriya K, Rao JV, Qureshi A, Tiwari AK, Kumar DS. Microbes producing L-asparaginase free of glutaminase and urease isolated from extreme locations of antarctic soil and moss. Scientific Report. 2019; 9: 1423.
  • El-Naggar NE, El-Shweihy NM. Bioprocess development for L-asparaginase production by Streptomyces rochei, purification and in-vitro efficacy against various human carcinoma cell lines. Scientific Report. 2020; 10: 7942.
  • Abdelrazek NA, Elkhatib WF, Raafat MM, Aboulwafa MM. Experimental and bioinformatics study for production of l‑asparaginase from Bacillus licheniformis: a promising enzyme for medical application. AMB Express. 2019; 9: 39.
  • Prihanto AA, Yanti I, Murtazam MA, Jatmiko YD. Optimization of glutaminase-free L-asparaginase production using mangrove endophytic Lysinibacillus fusiformis F1000Research 2020; 8: 1938.
  • Husain I, Sharma A, Kumar S, Malik F. Purification and characterization of glutaminase free asparaginase from Enterobacter cloacae: in-vitro evaluation of cytotoxic potential against human myeloid leukemia HL-60 cells. PLoS One. 2016; 11: e0148877.
  • Fazeli N, Alimadadi N, Nasr S. Screening and optimization of process parameters for the production of L-asparaginase by indigenous fungal-type strains. Iranian Journal of Science and Technology, Transactions A: Science. 2021; 45: 409-416.
  • Hatamzadeh S, Rahnama K, Nasrollahnejad S, Fotouhifar BK, Hemmati K, White JF, et al. Isolation and identification of L-asparaginase-producing endophytic fungi from the Asteraceae family plant species of Iran. Peer Journal. 2020; 8: e8309.

 

  • Nasr S, Bien S, Soudi MR, Alimadadi N, Shahzadeh Fazeli SA, Damm U. Novel Collophorina and Coniochaeta species from Euphorbia polycaulis, an endemic plant in Iran. Mycological Progress. 2018; 17: 755-771.
  • Mihooliya KN, Nandal J, Swami L, Verma H, Chopra L. A new pH indicator dye-based method for rapid and efficient screening of L-asparaginase producing microorganisms. Enzyme and Microbial Technology. 2017; 107: 72-
  • Mahajan RV, Saran S, Saxena RK, Srivastava AK. A rapid, efficient and sensitive plate assay for detection and screening of L-asparaginase-producing microorganisms. FEMS Microbiology Letters. 2013; 341 (2): 122-
  • Vimal, A, Kumar A. In vitro screening and in silico validation revealed key microbes for higher production of significant therapeutic enzyme L-asparaginase. Enzyme and Microbial Technology. 2017; 98: 9-
  • Kurtzman CP, Fell JW, Boekhout T, Robert V. Methods for isolation, phenotypic characterization and maintenance of yeasts. In: Kurtzman CP, Fell JW, Boekhout T, editors. The yeasts, a taxonomic study. 5th ed. Amsterdam: Elsevier; 2011: 87-110.
  • Thirunavukkarasu N, Suryanarayanan TS, Murali TS, Ravishankar JP, Gummadi SN. L-asparaginase from marine derived fungal endophytes of seaweeds. Mycosphere. 2011; 2: 147-155.
  • Doriya K, Kumar DS. Isolation and screening of L-asparaginase free of glutaminase and urease from fungal sp. 3 Biotech. 2016; 6: 239.
  • El-Naggar NEA, Moawad H, El-Shweihy NM, El- Ewasy SM. Optimization of culture conditions for production of the anti-leukemic glutaminase free L-asparaginase by newly isolated Streptomyces olivaceus NEAE-119 using response surface methodology. BioMed Research International. 2015; 627031.
  • Wriston J, Yellin L-asparaginase: a review. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. 1973; 39: 185-248.
  • Imada A, Igarasi S, Nakahama K, Isono M. Asparaginase and glutaminase activities of micro-organisms. Journal of General Microbiology. 1973; 76 (1): 85-99.
  • Hanna M, Xiao W. Isolation of nucleic acids. In: Xiao W, editor. Yeast Protocols (Methods in Molecular Biology). 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2006: 15-20.
  • White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, editors. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego, USA: Academic Press; 1990: 315-322.
  • Kurtzman CP, Robnett CJ. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek. 1998; 73: 331-371.
  • Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acid Research. 1997; 24: 4876-4882.
  • Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 1980; 16: 111-120.
  • Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. 1985; 39: 783-791.
  • da Cunha MC, dos Santos Aguilar JG, de Melo RR, Nagamatsu ST, Ali F, de Castro RJS, et al. Fungal L-asparaginase: Strategies for production and food applications. Food Research International. 2019; 126 (1): 108658.
  • Golbabaie A, Nouri H, Moghimi H, Khaleghian A. L-asparaginase production and enhancement by Sarocladium strictum: In vitro evaluation of anti-cancerous properties. Journal of Applied Microbiology. 2020; 129 (2): 356-366.
  • Doiphode N, Joshi C, Ghormade V, Deshpande MV. Biotechnological applications of dimorphic yeasts. In: Satyanarayana T, Kunze G, editor. Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. 1st ed. Dordrecht: Springer; 2009: 635-650.
  • Goldbeck R, Andrade CCP, Pereira GAG, Maugeri Filho F. Screening and identification of cellulase producing yeast-like microorganisms from Brazilian biomes. African Journal of Biotechnology. 2012; 11 (53): 11595-11603.
  • Bhargavi M, Madhuri RJ. Optimization, production, purification and characterization of anti-cancer enzyme L-asparaginase from marine Sarocladium kiliense. Bioscience Biotechnology Research Communications. 2021; 13 (15): 93-102.
  • de Pádua APSL, de Sousa Freire KTL, de Oliveira TGL, da Silva LF, Araújo-Magalhães GR, Agamez-Montalvo GS, et al. Fungal endophyte diversity in the leaves of the medicinal plant Myracrodruon urundeuva in a Brazilian dry tropical forest and their capacity to produce L-asparaginase. Acta Botanica Brasilica. 2019; 33 (1): 39-49.
  • Batool T, Makky EA, Jalal M, Yusoff MM. A comprehensive review on L-asparaginase and its applications. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2016; 178 (5): 900-923.
  • Elshafei AM, Hassan MM, Abouzeid MA, Mahmoud DA, Elghonemy DH. Screening and optimization of L-asparaginase and L-glutaminase production by some filamentous fungi. British Microbiology Research Journal. 2012; 2 (3): 158-174.
  • Bon EP. Asparaginase II of Saccharomyces cerevisiae. GLN3/URE2 regulation of periplasmic enzyme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 1997; 63-65: 203-212.
  • Borek D, Jaskólski M. Sequence analysis of enzymes with asparaginase activity. Acta Biochimica Polonica. 2001; 484 (4): 893-902.
  • Moguel IS, Yamakawa CK, Pessoa, AJr, Mussatto SI. L-asparaginase production by Leucosporidium scottii in a bench-scale bioreactor with co-production of lipids. Frontiers in bioengineering and biotechnology. 2020; 8: 576511.
  • Brumano LP, Santos da Silva FV, Costa-Silva TL, Apolinário AC, Madalena Santos JHP, Kleingesinds EK, et al. Development of L-asparaginase biobetters: Current research status and review of the desirable quality profiles. Frontiers in bioengineering and biotechnology. 2019; 6: 212.
  • Amobonye A, Singh S, Pillai S. Recent advances in microbial glutaminase production and applications—a concise review. Critical Reviews in Biotechnology. 2019; 39 (7): 944-963.
  • Orabi HM, El-Fakharany EM, Abdelkhalek ES, Sidkey NM. L-Asparaginase and L-glutaminase: Sources, production, and applications in medicine and industry. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 2019; 9 (2): 179-190.
  • Chan WK, Horvath TD, Tan L, Link T, Harutyunyan KG, Pontikos MA, et al. Glutaminase activity of L-asparaginase contributes to durable preclinical activity against acute lymphoblastic leukemia. Molecular Cancer Therapy. 2019; 18: 1587-1592.
  • Souza PM, Freitas MM, Cardoso SL, Pessoa A, Guerra ENS, Magalhães PO. Optimization and purification of L-asparaginase from fungi: A systematic review. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2017; 120: 194-202.
  • Serrano NFG, Rodrigues L, Hokka CO, Sousa CP, Teixeira JA, Mussatto SI. Optimal glucose and inoculum concentrations for production of bioactive molecules by Paenibacillus polymyxa RNC-D. Chemical Papers. 2012; 66: 1111-1117.
  • El-Hadi AA, Ahmed HM, Hamzawy RA. Optimization and characterization of L-asparaginase production by a novel isolated Streptomyces strain. Egyptian Pharmaceutical Journal. 2019; 18 (2): 111-122.
  • Ghosh S, Murthy S, Govindasamy S, Chandrasekaran M. Optimization of L-asparaginase production by Serratia marcescens (NCIM 2919) under solid state fermentation using coconut oil cake. Sustainable Chemical Processes. 2013; 1: 9.
  • Marques WL, Raghavendran V, Stambuk BU, Gombert AK. Sucrose and Saccharomyces cerevisiae: a relationship most sweet. FEMS Yeast Research. 2015; 16 (1): fov107.
  • Klein M, Swinnen S, Thevelein JM, Nevoigt E. Glycerol metabolism and transport in yeast and fungi: established knowledge and ambiguities. Environmental Microbiology. 2017; 19 (3): 878-893.
  • Baskar G, Renganathan S. Statistical and evolutionary optimisation of operating conditions for enhanced production of fungal L-asparaginase. Chemical Papers. 2011; 65 (6): 798-804.
  • El-Refai HA, El-Shafei MS, Mostafa H, El-Refai AMH, El-Beih FM, Awad GEA, et al. Statistical optimization of anti-leukemic enzyme L-asparaginase production by Penicillium cyclopium. Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. 2014; 8 (2), 130-142.
  • Sanjotha G, Sudheer I. Isolation, screening, optimization and production of anti-tumor asparaginase by fungi from Karwar coastal region. Research Journal of Recent Sciences. 2017; 6 (3): 1-7.

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار