نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
3 دانشیار گروه شیمی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Although there are different methods for the production of nanoparticles, today the synthesis of nanoparticles with biological methods has attracted the attention of researchers because it is an easy, environmentally friendly, and cost-effective method. The present study investigates the biosynthesis of gold nanoparticles using Lactobacillus paracasei (MN809528) exopolysaccharide and studies the antibacterial, anti-biofilm, and antioxidant properties.
Materials and Methods: For the synthesis of gold nanoparticles, 30 ml of 1% exopolysaccharide (0.1 g) solution was added to an equal volume of 1 mM aqueous HAuCl4 solution and mixed well using stirred (180 rpm) for 48 h at room temperature. The characterization of synthesized gold nanoparticles was performed using UV-VIS, FT-IR, DLS, XRD, EDX, FE-SEM spectroscopic analysis. Antibacterial activity of produced gold nanoparticles by agar well diffusion method, anti-biofilm activity by 96 well microplate dilution method, and antioxidant activity of nanoparticles using DPPH radical adsorption capability were examined.
Results: Spectroscopic data showed the presence of a peak at 524 nm, which is specific to gold nanoparticles. Examination of the shape and size of nanoparticles with FE-SEM showed that the produced nanoparticles were spherical in shape and their average size is 2o-50 nm. Antibacterial activity of gold nanoparticles at a concentration of 50 µg /ml was observed against all bacterial tests. However, the highest antibacterial activity was observed against Acinetobacter baumannii (ATCC 17978). In the present study, the gold nanoparticles produced acted as biofilm and DPPH radical inhibitors.
Discussion and Conclusion: The results of the study show that Lactobacillus paracasei (MN809528) is a good biological source for the synthesis of gold nanoparticles. The study is the first report on the production of gold nanoparticles by exopolysaccharides isolated from indigenous lactic acid bacteria.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
در علم نانوتکنولوژی سنتز نانومواد مختلف در زمینههای مختلف از قبیل پزشکی (هدفگیری دارو، تصویربرداری و بیوسنسورها) علوم غذایی و علوم محیطی کاربرد دارد (1 و 2). با توجه به غلبه و افزایش میکروارگانیسمهای مقاوم به چند آنتیبیوتیک و همچنین افزایش هزینههای مراقبتهای بهداشتی، بسیاری از محققان علاقمند به توسعة روشهای ضدمیکروبی مؤثر و جدید بدون مقاومت هزینههای بالا هستند (3). نانوذرات فلزی بهعنوان یک نسل جدید از عوامل ضدمیکروبی و یک ابزار مقرونبهصرفه برای غلبه بر مشکلات مقاومت دارویی به باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی تقسیم شدهاند (4). در گذشته روشهای شیمیایی و فیزیکی مختلف برای تولید نانوذرات استفاده شدهاند. سنتز نانوذرات با استفاده از روشهای شیمیایی و فیزیکی معمولی دارای عملکرد پایین و دشوار، به دما، فشار و زمان زیادی نیاز دارند و هزینهبر هستند و در این روشها آمادهکردن نانوذرات با یک اندازة مناسب دشوار است؛ بنابراین، امروزه برای تولید نانوذرات از روشهای زیستی استفاده میشود. سنتز زیستی یک رویکرد سازگار با محیط زیست و مقرونبهصرفه است که در آن از پلیمرهای تجزیهپذیر زیستی میتوان برای احیای یونهای فلزات، پایداری و تثبیت فلزات استفاده کرد (5). باکتریها، قارچها و عصارة گیاهی مختلف پتانسیل تولید و سنتز نانوذرات را دارند. تاکنون از میکروارگانیسمها برای سنتز نانوذرات مختلف مانند طلا، نقره، آهن، پلاتین، سولفید کادمیوم و تیتانیوم استفاده شده است (6). بین نانوذرات، نانوذرات طلا دارای کاربردهایی در زمینة زیست پزشکی بهعنوان عوامل آنتیباکتریال، آنتیHIV، آنتیبیوفیلم، آنتیتومور و آنتیمالاریا هستند (7). علاوه بر این، نانوذرات طلا بهدلیل کمبودن سمیت، ثبات بالا و فعالیت کاتالیزوری توجه محققان را به خود جلب کردهاند (8). پلیساکاریدها یک گروه متنوع از ماکرومولکولهای زیستیاند که در ارگانیسمهای مختلف یافت میشوند؛ آنها طبیعی، غیرسمی و تجزیهپذیرند و در فرایندهای زیستی مختلف مانند پاسخ ایمنی، عفونت و انتقال سیگنال نقش دارند (9). پلیساکاریدها بهطور فزایندهای بهعنوان عوامل کاهشدهنده و تثبیتکننده برای تولید نانوذرات به کار میروند؛ زیرا مزایای متعددی دارند. زنجیرة ماکرومولکولی این پلیمرهای زیستی، گروههای هیدروکسیل بسیاری دارند که با یونهای فلزی پیوند قوی برقرار میکنند و به احیای یون، کنترل شکل، اندازه و پراکندگی نانوذرات تشکیلشده منجر میشوند. علاوه بر این، پلیساکاریدها دارای عملکرد با ارزشی از قبیل موکوادهسین هستند و یک پوشش خنثی با انرژی سطح پایین را فراهم و تشخیص گیرندههای غیراختصاصی پروتئین را محدود میکنند. همچنین، اگزوپلیساکاریدها معمولاً شامل گروههای عملکردی مختلفیاند که نقش مهمی در پایداری نانوذرات فلزی دارند (10 و 11). باکتریهای اسیدلاکتیک تولیدکنندة اگزوپلیساکارید متعلق به گونههای استرپتوکوکوس، لاکتوباسیلوس، لاکتوکوکوس، لوکونوستوک و پدیوکوکوس هستند. مطالعات نشان دادند برخی از سویههای بیفیدیوباکتر توانایی تولید این بیوپلیمرها را دارند (12 و 13). نانوذرات فلزی سنتزشده توسط اگزوپلیساکارید بهدلیل خاصیت مغناطیسی، جذب، بیحرکتی و فعالیتهای بیوکاتالیستی، قابلیت حلالبودن و واکنشپذیری سطح میتوانند در کاربردهای مختلف صنعتی، زیست پزشکی و بیوتکنولوژیکی استفاده شوند (7). با ظهور نانوتکنولوژی و با توجه به خاصیت ضدمیکروبی طلا، از آنها در مبارزه با پاتوژنهای مختلف نیز میتوان بهره برد. نانوذرات طلا، ذراتی با تأثیرگذاری بالا و عمل سریع، غیرسمی و بیضرر برای انساناند. این ذرات با از بین بردن قارچها و باکتریها بر خلاف سایر آنتیبیوتیکها هیچگونه مقاومتی در برابر باکتریها ایجاد نمیکنند (10)؛ بنابراین، هدف اصلی از انجام این تحقیق، سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلیساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN809528) و بررسی اثر ضدباکتریال، ضدبیوفیلمی و آنتیاکسیدانی آنها است. تاکنون تحقیق جامعی دربارة تولید اگزوپلیساکاریدهای سویههای بومی باکتریهای پروبیوتیک ازجمله لاکتوباسیلوس پاراکازئی و نیز استفاده از آنها بهعنوان پلیمرهای حد واسط برای سنتز نانوذرات فلزی طلا با پایداری بیشتر و دارای اثرات ضدباکتریایی و ضدبیوفیلمی و آنتیاکسیدانی علیه عوامل باکتریایی بیماریزا در داخل کشور انجام نشده است.
مواد و روشها
معرفها و سویهها: هیدروژن تترا کلرو آئورات[1]، اتانول، تری کلرو اسید استیک، اسید استیک و کلیه مواد شیمیایی از شرکت سیگما - آلدریج (Sigma–Aldrich) خریداری شدند. میکروارگانیسمهای پاتوژن از قبیل اشریشیا کلی (ATCC 25922)، سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853)، اسینتوباکتر بومانی (ATCC 17978) و استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923) از کلکسیون میکروبی انستیتو پاستور تهیه شدند. لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN809528) قبلاً طی مطالعهای توسط آقای دکتر آقایی و همکاران از محصولات لبنی در استان قم جداسازی و شناسایی شد.
آمادهسازی سویه: لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN809528) روی محیط MRS (De Man, Rogosa and Sharpe)[2] آگار (مرک، آلمان) کشت داده شد. سپس پلیت به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد درون جار بیهوازی گرمخانهگذاری شد.
.استخراج و خالصسازی اگزوپلیساکارید از لاکتوباسیل پاراکازئی (MN809528): برای تولید اگزوپلیساکارید، ابتدا باکتری لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN809528) در 500 میلیلیتر محیط کشت MRS براث (مرک، آلمان) تلقیح و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد (در شرایط جار بیهوازی) گرمخانهگذاری شد. بعد از گرمخانهگذاری کشت براث بهمنظور غیرفعالکردن آنزیمهای تجزیهکنندة اگزوپلیساکارید و آزادکردن اگزوپلیساکارید به مدت 10 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد حرارت داده شد. بعد از 24 ساعت سوسپانسیون میکروبی درون فالکونهای 50 میلیلیتری خالی شد و فالکونها به مدت 10 دقیقه در سانتریفیوژ یخچالدار با 6000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. سپس با جمعآوری سوپرناتانت تودههای سلولی باکتریایی دور ریخته شدند. پس از آن، به سوپرناتانت، اسید تری کلرو استیک با غلظت نهایی 14 درصد برای رسوبکردن پروتئین اضافه شد. برای اینکه پروتئینها بهطور کامل رسوب داده شوند، درون انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شدند. بعد از 30 دقیقه سوپرناتانت از انکوباتور خارج شد و مجدد درون فالکونها ریخته و به مدت 20 دقیقه با دور 10000 و در 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. به این صورت، سوپرناتانت حاوی اگزوپلیساکارید، جمعآوری و رسوب پروتئینی دور ریخته شد. برای استخراج اگزوپلیساکارید از روش ترسیب با اتانول سرد استفاده شد؛ به این صورت که 2 برابر سوپرناتانت اتانول 96 درصد سرد، اضافه و به مدت 1 شبانهروز در دمای 4 درجه سانتیگراد در یخچال نگهداری شد. بعد از 24 ساعت ارلن حاوی سوپرناتانت و اتانول به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. به این ترتیب، اگزوپلیساکارید رسوب کرد و رسوب آن دوبار با آب مقطر شسته شد (14 و 15).
.سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلیساکارید: سنتز نانوذرة طلا با استفاده از اگزوپلیساکارید طبق روش کیم و همکارانش با تغییرات جزئی انجام شد. 30 میلیلیتر محلول 1 درصد اگزوپلیساکارید (1/0 گرم) در آب دیونیزه تهیه و سپس به حجم مساوی از محلول آبی HAuCl41 میلیمولار اضافه شد. مخلوط اگزوپلیساکارید و HAuCl4 درون یک ارلن ریخته شد که کاملاً با آلومینیوم پوشانده شده بود. سپس ارلن به مدت 48 ساعت روی استیرر (180 دور در دقیقه) در دمای اتاق قرار گرفت. درنهایت، برای جداکردن ذرات نانو از باقیماندة اگزوپلیساکارید، 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با 20000 دور در دقیقه سانتریفیوژ انجام شد (16).
بررسی ویژگیهای نانوذرات طلا سنتزشده: برای تأیید حضور نانوذرات طلا، جذب نوری محلول با اسپکتروفتومتر UV-Vis[3] مدل CARY-100, Varian, Australia از طیف 200 تا 800 نانومتر بررسی شد. از آنالیز [4]FT-IR مدل FTIR-4200, Jasco, japan با محدودة طول موج cm-1600-4200 برای تعیین ساختار نانوذرات طلا و همچنین بررسی گروههای عملکردی استفاده شد. برای این منظور نانوذرات خشکشده و پودرشدة طلا برای تولید قرص با برمید پتاسیم مخلوط شدند. توزیع و پراکندگی نانوذرات طلا سنتزشده در محلول توسط آنالیز دستگاهی DLD[5] بررسی شدند. اسپکتوفتومتری XRD[6] مدل Ultima IV XRD, Rigaku, Japan و EDX[7] مدل BRUKER flash 6/10 بهترتیب برای بررسی ساختار نانوذرات و تأیید حضور نانوذرات طلا در محلول استفاده شد. با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (FE-SEM)[8] مورفولوژی سطح و سایز نانوذرات طلا بررسی شدند (17).
بررسی مهار رشد باکتریهای پاتوژن: فعالیت ضدباکتریایی در مقابل باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت با استفاده از روش انتشار در چاهک بررسی شد (18). باکتریهای پاتوژن استاندارد اشریشیا کلی (ATCC 25922) سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853)، اسینتوباکتربومانی (ATCC 17978)، استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923) در محیط نوترینت براث[9] (مرک، آلمان) به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده شدند. سپس از کشت تازة باکتریها نیم مک فارلند (CFU/mL 108 ×1.5) تهیه شد. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی بهصورت متراکم روی محیط مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) کشت داده و بعد از ایجاد چاهک (6 میلیمتر) در سطح محیط از نانوذرات طلا تهیهشده غلظتهای مختلف (µg/mL 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50) در چاهکها ریخته شد. پلیت باکتریها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری و هالة عدم رشد باکتریها بعد از مدت زمان گرمخانهگذاری بررسی شد.
تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC)[10]: تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی نانوذرات طلا سنتز شده با استفاده از روش میکرودایلوشن با پروتکل استاندارد انجام شد (19). در این روش ازمیکروپلیتهای 96 خانهای استفاده شد. ابتدا 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث (مرک، آلمان) درون 96 چاهک میکروپلیت تلقیح شد، سپس به اولین چاهک هر ردیف 100 میکرولیتر نانوذرات طلا سنتز شده با غلظتهای مختلف (µg/mL 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50) اضافه شد و از چاهک دوم به سوم به همین ترتیب تا چاهک دهم نانوذرات تلقیح شده رقیق شد. در آخر به همه چاهکها 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی رقیق شده معادل نیم مک فارلند اضافه گردید (یک چاهک به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد که شامل 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث و 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی رقیق شده معادل نیم مک فارلند بود. یک چاهک به عنوان کنترل منفی که فقط حاوی 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث بود). سپس میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد بعد از مدت زمان گرمخانهگذاری، غلظت آخرین چاهکی که هیچ کدورتی در آن مشاهده نشده معادل حداقل غلظت مهارکنندگی در نظر گرفته شد.
حداقل غلظت کشندگی نانوذرات طلا سنتز شده (MBC)[11]: برای تعیین حداقل غلظت کشندگی نانوذرات طلا، 10 میکرولیتر از چاهکهای فاقد کدورت به محیط مولر هینتون آگار تلقیح شد. سپس پلیتها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. میزان حداقل غلظت کشندگی براساس حداقل غلظتی از مادة ضدمیکروبی تعیین میشود که از رشد باکتری در سطح پلیت جلوگیری میکند (20).
.بررسی فعالیت ضدبیوفیلمی نانوذرات طلا سنتزشده: تعیین فعالیت ضدبیوفیلمی نانوذرات طلا در برابر باکتریهای گرم منفی (اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی) و گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس) با استفاده از روش میکروتیتر پلیت سنجیده شد. ابتدا یک کشت 24 ساعته از میکروارگانیسمهای مدنظر تهیه شد. 100 میکرولیتر از میکروارگانیسمهای مورد آزمایش با OD=0.1 (در طول موج 600 نانومتر) و 50 میکرولیتر از نانوذرات طلای سنتزشده با غلظت کمتر از حداقل غلظت بازدارنده به میکروپلیت 96 خانهای تلقیح شدند (یک چاهک بهعنوان کنترل در نظر گرفته شد). سپس میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. بعد از مدت زمان گرمخانهگذاری محلول رویی میکروپلیت دور ریخته و با سرم فیزیولوژی سه بار شست و شو داده شد. سپس میکروپلیت به مدت 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه خشک شد. 200 میکرولیتر کریستال ویولة 1 درصد به مدت 20 دقیقه روی چاهکها اضافه شد، بعد از 20 دقیقه کریستال ویوله دور ریخته شد و با آب مقطر سه بار شستشو داده و رنگ اضافه خارج شد. برای تثبیت ساختار بیوفیلمی 220 میکرولیتر اسید استیک به مدت 15 دقیقه به چاهکها اضافه شد. سپس جذب نوری هر چاهک با دستگاه الایزاریدر (Bio Tek, USA) در طول موج 570 نانومتر تعیین شد. درصد مهار تشکیل بیوفیلم با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (21).
[1- (OD sample / OD control)] ×100 = درصد مهار بیوفیلم
فعالیت آنتیاکسیدانی نانوذرات طلا با استفاده از تست [12]DPPH: فعالیت آنتیاکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده با روش پتانسیل مهار رادیکال آزادDPPH بررسی شد (22). بهطور خلاصه یک محلول 1/0میلیمولار DPPH در متانول بهعنوان استوک تهیه شد. 100 میکرولیتر از محلول DPPH 1/0 میلیمولار (در متانول) به غلظتهای مختلف نانوذرات طلای (50- 125/3 میکروگرم در میلیلیتر) سنتزشده، اضافه و بعد از 30 دقیقه گرمخانهگذاری در تاریکی و در دمای اتاق، جذب نمونهها در 517 نانومتر خوانده شد. اسید آسکوربیک بهعنوان استاندارد استفاده شد. درصد فعالیت رادیکال آزاد ازطریق فرمول زیر محاسبه شد.
100×جذب کنترل/(جذب نمونه - جذب کنترل) = درصد جذب رادیکال.
نتایج
تعیین ویژگی نانوذرات طلای سنتزشده: سنتز نانوذرات طلا با مشاهدات چشمی با تغییر رنگ محلول از بیرنگ به قرمز یاقوتی تأیید شد (شکل 1، a). نتایج حاصل از آنالیز اسپکتروفتومتری با نور ماورای بنفش، یک پیک جذبی قوی را در 524 نانومتر نشان داد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید میکند (شکل 1، b). سپس نانوذرات طلای سنتزشده برای آنالیزهای بعدی خشک شدند (شکل 1، c). آنالیز FT-IR برای شناسایی ارتباط احتمالی بین یونهای طلا و اگزوپلیساکارید انجام شد؛ بهطوریکه اگزوپلیساکارید میتواند برای کاهش یونهای طلا و پایداری نانوذرات طلا استفاده شود. همانطور که در شکل 2 مشاهده میشود، پیکهای جذبیcm-1 3433، cm-1 2931، cm-12897، cm-11689 وcm-11535 شناسایی شدند.
|
|
|
|
b |
a |
|
|
|
|
c |
|
شکل 1- نانوذرات طلای سنتزشده (a) طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش - مرئی نانوذرات طلا (b)، نمونة خشکشده نانوذرات طلای سنتزشده (c)
شکل 2- طیف FTIR نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از اگزوپلیساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی
با استفاده از گراف پراکندگی نور دینامیکی نشان داده شد که نانوذرات طلای سنتزشده بهطور متوسط سایزی حدود 8/25 داشتند (شکل3،a ). الگوی پراش اشعه ایکس (XRD) برای ماهیت کریستالی نانوذرات استفاده میشود. الگوی XRD نانوذرات طلا (شکل3،b) پیکهای شارپی در نواحی 9/37، 6/43، 6/63 و 1/77 نشان داد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید میکند. آنالیز ساختاری نشان داد نانوذرات طلا دارای ساختار بلوری با شاخصهای میلر 111، 200، 220 و 311 در شبکة مکعبی است. پیک 111 در مقایسه با سایر پیکها شدیدتر است؛ درنتیجه، صفحات بلوری نانوذرات طلا بیشتر در این جهت تشکیل شدهاند. آنالیز EDX حضور عنصر طلا را در نانوذرات سنتزشده به روش زیستی نشان داد (شکل 3، c).
|
|
|
a |
|
|
|
b |
|
|
|
c |
شکل 3- گراف پراکندگی نور دینامیکی (a)، پراش پرتو ایکس نانوذرات طلای سنتزشده (b)، طیف سنجی پراش انرژی پرتو ایکس نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از اگزوپلیساکارید (c)
علاوه بر پیکهای جذبی قوی عناصر طلا، سیگنالهای ضعیفی از اتمهای کربن و اکسیژن در مقایسه با عناصر طلا گزارش شدند. نتایج بهدستآمده از میکروسکوپ الکترونی (FE-SEM) در شکل 4 نشان دادند نانوذرات طلای سنتزشده توسط اگزوپلیساکارید به شکل کروی و بهطور متوسط سایزی حدود 20 تا 50 نانومتر دارند.
.نتایج مهار رشد باکتریهای پاتوژن با استفاده از نانوذرات طلا: نتایج بررسی اثرات ضدباکتریایی نانوذرات طلا نشان داد نانوذرات طلای سنتزشده اثر مهارکنندگی قابل قبولی بر همه باکتریهای مدنظر دارد؛ بهطوریکه با افزایش غلظت نانوذرات، این اثر مهارکنندگی، بیشتر و قطر هالة عدم رشد نیز بیشتر میشود. نتایج حاصل از تأثیر غلظتهای مختلف نانوذرات طلای سنتزشده در جدول 1 نشان داده شدند. نتایج نشان میدهند نانوذرات طلای سنتزشده بیشترین اثر بازدارندگی را علیه باکتریهای گرم منفی نسبت به باکتری گرم مثبت دارد. در میان باکتریهای گرم منفی اسینتوباکتر بومانی (قطر هالة 20 میلیمتر) و سودوموناس آئروژینوزا (قطر هالة 17 میلیمتر) بیشترین مهار رشد را داشتهاند. نتایج حاصل از مهار رشد باکتریهای پاتوژن در شکل 5 نشان داده شدند.
شکل 4- تصویر میکروسکوپ الکترونی FE-SEM نانوذرات طلای سنتزشده
جدول 1- نتایج بررسی اثرات ضدباکتریایی نانوذرات طلای سنتزشده در مقایسه با آنتیبیوتیک سفکسیم / سفتریاکسون و نانوذرات طلای سنتزشده به روش شیمیایی
|
قطر هالة عدم رشد برحسب میلیلیتر |
|||||||
|
باکتریهای تست |
غلظتهای نانوذرات طلای سنتزشده (میکروگرم در میلیلیتر) |
غلظت نانوذرات طلای سنتزشده به روش شیمیایی |
کنترل |
||||
|
125/3 µg. mL |
25/6 µg. mL |
5/12 µg. mL |
25 µg. mL |
50 µg. mL |
50 µg. mL |
سفکسیم / سفتریاکسون µg. mL 30 |
|
|
اسینتوباکتر بومانی (ATCC 17978) |
- |
- |
10 |
13 |
20 |
- |
مقاوم |
|
سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853) |
- |
- |
- |
11 |
17 |
- |
13 |
|
اشریشیا کلی (ATCC 25922) |
10 |
11 |
12 |
13 |
15 |
- |
25 |
|
استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923) |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
- |
23 |
شکل 5- فعالیت آنتیباکتریال نانوذرات طلای سنتزشده با غلظتهای مختلف (125/3، 25/6، 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلیلیتر) و کنترل (نانوذرات طلای سنتزشده به روش شیمیایی، آنتیبوتیک سفکسیم / سفتریاکسون)
. نتایج بررسی MIC و MBC نانوذرات سنتزشده روی سویههای گرم منفی و گرم مثبت: نتایج مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) نانوذرات طلای سنتزشده علیه باکتریهای منتخب در جدول 2 نشان داده شدهاند. بیشترین حساسیت بین باکتریهای مورد آزمایش را باکتری اسینتوباکتر بومانی (125/3MIC) و کمترین حساسیت به نانوذرات طلای سنتزشده را باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (25(MIC دارد.
بررسی مهار بیوفیلم باکتریهای پاتوژن با استفاده از نانوذرات سنتزشده: در تحقیق انجامشده بیوفیلم همه باکتریهای پاتوژن توسط نانوذرات طلای سنتزشده مهار شد. تیمار باکتریهای گرم منفی اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی به مدت 24 ساعت با غلظت کمتر از حداقل غلظت بازدارندة نانوذرات طلای سنتزشده بهترتیب باعث کاهش تشکیل بیوفیلم 46 درصد، 65 درصد و 78 درصد شد. بیوفیلم باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس 56 درصد مهار شد. نتایح حاصل از مهار بیوفیلم باکتریهای پاتوژن در شکل 6 گزارش شدهاند.
فعالیت آنتیاکسیدانی: در این مطالعه، فعالیت جذب رادیکالهای DPPH نانوذرات طلای سنتزشده با اگزوپلیساکارید بررسی شد. نتایج نشان دادند حذف رادیکالهای DPPH با افزایش غلظت نانوذرات طلا افزایش یافت؛ بنابراین، یک فعالیت وابسته به غلظت است. درصد فعالیت مهار رادیکال آزاد در شکل 7 نشان داده شده است. همانطور که مشاهده میشود نانوذرات طلا در غلظت 50 میکروگرم در میلیلیتر حداکثر درصد مهار (81 درصد) را در مقایسه با نمونة استاندارد (اسید آسکوربیک 98 درصد) نشان میدهند.
جدول 2- MIC و MBC نانوذرات طلای سنتزشده توسط اگزوپلیساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN809528) برای باکتریهای تست
|
باکتریهای تست |
MIC |
MBC |
|
اسینتوباکتر بومانی (ATCC 17978) |
125/3 |
25/6 |
|
سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853) |
25/6 |
25/6 |
|
اشریشیا کلی (ATCC 25922) |
5/12 |
5/12 |
|
استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923) |
25 |
25 |
شکل 6- عکس SEM پاتوژنهای مختلف اشریشیا کلی (A)، سودوموناس آئروژینوزا(B)، استافیلوکوکوس اورئوس (C)، اسینتوباکتر بومانی (D) قبل و بعد از تیمارشدن با نانوذرات طلای سنتزشده توسط EPS
شکل 7- فعالیت آنتیاکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده توسط اگزوپلیساکارید
بحث و نتیجهگیری
امروزه توجه زیادی به نانوذرات ضدباکتریایی بهعنوان وسیلهای برای غلبه بر مشکلات مقاومت دارویی در میکروارگانیسمهای مختلف بیماریزا وجود دارد. در میان نانوذرات فلزی، نانوذرات طلا بهدلیل شکل و اندازة خود، خصوصیات منحصربهفردی دارند؛ به همین علت در زمینههای مختلف تحقیقاتی ازجمله پزشکی، تکنولوژی و بیوشیمی کاربرد دارند (23). اگزوپلیساکارید پروبیوتیکها نقش مهمی در چسبندگی به سلول و اتصال به اپیتلیال دارند (24)؛ به همین دلیل میتوانند اتصال باکتریهای بیماریزا را به حداقل برسانند و به بهبود سیستم ایمنی کمک کنند. بهطور کلی، کربوهیدراتها به اندازة کافی قویاند که کلرید طلا را کاهش دهند و بهعنوان یک عامل پایدارکننده عمل کنند و درنهایت، تعامل سطح به سطح نانوذرات طلا را کاهش دهند. حضور چندین گروه کربوکسیل و انتهای کاهشدهندة همیاستیل در بیوپلیمرها منجر به پایداری نانوذرات سنتزشده میشود (25 و 26)؛ بنابراین، در این تحقیق از اثرات سودمند اگزوپلیساکارید سنتزشده توسط لاکتوباسیلوس پاراکازئی برای سنتز نانوذرات طلا استفاده شد. تحلیل نمونهها با اسپکتوفتومتری نور ماورای بنفش، یک پیک جذبی مشخص را در طول موج 524 نانومتر نشان داد؛ ظهور رزونانس پلاسمون سطحی در این منطقه بیانکنندة وجود نانوذرات طلا است (27 و 28). در تحقیق انجامشده، نانوذرات سنتزشده سبب تغییر رنگ محلول از بیرنگ به قرمز ارغوانی شد و باند رزونانس پلاسمون سطحی قوی در 524 نانومتر نشان داد که وجود نانوذرات طلا را تأیید میکند. رنگ محلول نانوذرات طلای سنتزشده بهدلیل نوسانات جمعی الکترونهای آزاد القاشده بهوسیلة تعامل با میدان الکترومغناطیسی است که برای هر نوع ذره با هر اندازهای مخصوص به خود آن ذره است (29). در مطالعة نارایانان[xiii] و همکاران (2010)، نانوذرات طلای سنتزشده طیف جذبی را در ناحیه 536 نانومتر نشان دادند (30). آنالیز طیفسنجی FT-IR برای شناسایی گروههای فعال و احیاکنندة یونهای طلا انجام شد. در این مطالعه با استفاده از آنالیز FTIR پیکهای جذبی cm-1 3433 ارتعاشات کششی کربوکسیل در الکلها و ترکیبات فنلی را نشان میدهند که قدرت قوی برای توانایی تعامل با نانوذرات دارند (31). باند جذبی cm-1 2931 ارتعاشات کششی C-H (غیرمتقارن) را نشان میدهد که مربوط به قلههای کششی گروه آلکانها است و باند جذبی cm-1 2897 ارتعاشات کششی C-H (متقارن) را نشان میدهد که مربوط به گروه 3CH است (32). طیفهای جذبی cm-1 1689 و cm-1 1535 بهترتیب مربوط به باندهای آمیدی و باندهای خموشی از گروه C-O-C هستند (33). در مطالعة ساتیانارایانان[xiv] و همکاران (2014)، باندهای جذبی cm-1 3432، 2919، 2846 و 1578 توسط اسپکتوفتومتری FTIR شناسایی شدند (34). DLS یک تکنیک ارزشمند است که سایز ذرات و توزیع ذرات در محلول را بررسی میکند (35). در مطالعة حاضر، الگوی DLS نشان داد سایز نانوذرات طلای سنتزشده 8/25 نانومتر بود که نشان میدهد اگزوپلیساکارید سنتزشده توانایی سنتز نانوذرات طلا با اندازة متوسط را دارد. اسپکتوفتومتری XRD یک ابزار اصلی و اولیه برای تعیین خصوصیات بلوری مانند اندازة کریستال نانوذرات طلا است (36). الگوی XRD پیکهای مشخصی از کریستالهای طلا را نشان میدهد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید میکند (37). طبق نتایج بهدستآمده، سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلیساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی تأیید میشود و با سایر تحقیقات دربارة سنتز نانوذرات طلا مشابه است (38). حضور عنصر طلا در محلول نانوذرات سنتزشده با استفاده از EDX تأیید شد. گراف EDX، پیکهای قوی اطرافKeV 2 و KeV10 نشان داد که حضور نانوذرات طلا را تأیید میکند (39). ساختار و شکل نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ الکترونی FE-SEM تعیین شد (40). در مطالعة حاضر اندازة نانوذرات طلای سنتزشدة کروی، 50-20 نانومتر بود. در تحقیقی مشابه، از کیتوزان برای سنتز نانوذرات طلا استفاده کردند که نتایج نشان دادند نانوذرات طلای سنتزشده اندازة 10 تا 50 نانومتر دارند (41). مطالعات نشان دادهاند به تازگی از نانوذرات طلا بهعنوان یک ترکیب ضدباکتریایی قوی استفاده میشود و همچنین بررسیها نشان دادند نانوذرات طلا نقش مهی در حذف باکتریهای مقاوم به آنتیبیوتیک دارند (42). مطالعة حاضر نشان داد نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از اگزوپلیساکارید باکتری لاکتوباسیلوس پاراکازئی با روش انتشار در چاهک روی 4 باکتری مؤثرند و فعالیت ضدمیکروبی بیشتری روی باکتریهای گرم منفی نسبت به باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس نشان میدهند. فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات طلا در برابر باکتریهای گرم منفی مربوط به دیوارة سلولی نازک آنهاست که آنها را نسبت به عملکرد نانوذرات طلا حساستر کرده است. مکانیسم دیگر فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات طلا بهدلیل تولید گونههای واکنشدهندة اکسیژن در داخل سلولهای باکتریایی است که باعث افزایش استرس اکسیداتیو سلولهای میکروبی میشود (43). وانگ[xv] و همکاران در سال 2019، مکانیسم ضدباکتریایی نانوذرات طلا را با استفاده از روشهای ترانسکترومیک و پروتئومیک بررسی کردند. آنها دریافتند نانوذرات طلا فعالیتهای ضدباکتریایی را با جلوگیری از ترکیب زیرواحد کوچک (s30) ریبوزومی با tRNA و فروپاشی پتانسیل غشایی انجام میدهند (44).
در تحقیقی آروگوئتا[xvi] و همکاران (2010) نشان دادند نانوذرات طلا دارای خواص ضدمیکروبیاند (45). موتوکومار[xvii] و همکاران (2016) نشان دادند نانوذرات طلا فعالیت ضدباکتریایی بیشتری در برابر باکتریهای گرم منفی نسبت به باکتریهای گرم مثبت دارند (46). در مطالعهای مشابه توسط ساتیانارایانان و همکاران (2014)، نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلیساکارید سنتز شدند و فعالیت ضدباکتریایی آنها در برابر اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، کلبسیلا پنومونیه، استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بررسی شد (34). مهار بیوفیلم توسط نانوذرات طلا با استفاده از روش میکروتیتر پلیت انجام شد. با توجه به اینکه نانوذرات طلا اندازة کوچکی دارند، به راحتی میتوانند وارد ماتریکس بیوفیلم شوند. بیشتر مطالعات نشان میدهند نانوذرات طلا میتوانند باعث مهار بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس شوند (47). بررسیها نشان دادند نانوذرات طلا باعث کاهش چشمگیر در شکلگیری بیوفیلم توسط سودوموناس آئروژینوزا میشوند. این موضوع ممکن است بهدلیل سمیت نانوذرات طلا برای سلول باکتریایی باشد (48). آنتیاکسیدانها ماکرومولکولهاییاند که رادیکال آزاد گونههای اکسیژن واکنشپذیر از قبیل یونهای سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، یونهای هیدرواکسید آزاد و اکسیژن منفرد را از بین میبرند که با انتقال یک الکترون تولید میشوند و به این ترتیب از اکسیدشدن ماکرومولکولهای زیستی جلوگیری میکنند (48). فعالیت آنتیاکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از روش سنجش رادیکال آزاد DPPH انجام شد. نتایج نشان دادند نانوذرات طلای سنتزشده با انتقال یک الکترون یا هیدروژن به رادیکال آزاد، آن را تبدیل به DPPH-H پایدار میکنند که با نتایج سایر مطالعات مشابه است (49). کیم[xviii] و همکاران در سال 2007 فعالیت آنتیاکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده را بررسی کردند و نتیجه گرفتند نانوذرات طلای سنتزشده فعالیت آنتیاکسیدانی دارند و فعالیت آنتیاکسیدانی آنها با افزایش غلظت نانوذرات افزایش مییابد (16). اگزوپلیساکارید تولیدشده توسط لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN809528) بهعنوان منبع بسیار مناسبی برای سنتز و تولید زیستی نانوذرات طلا با اثرات ضدمیکروبی، ضدبیوفیلمی و آنتیاکسیدانی است؛ ازاینرو، مطالعات بیشتر در خصوص بهینهسازی شرایط تولید اگزوپلیساکاریدهای سویههای بومی باکتریهای لاکتیکاسید میتوانند کاربرد مهم و گستردهای در تولید انواع نانوذرات فلزی با کاربردهای زیست فناوری دارویی باشند.
[1]- HAuCl4
[2]- DeMan, Rogosa, and Sharpe
[3]- Ultraviolet-Visible Spectroscopy
[4]- Fourier – Transform Infrared Spectroscopy
[5]- Dynamic light scattering
[6]- X-ray diffraction
[7]- Energy Dispersive X-ray
[8]- Field Emission Scanning ElectronMicroscopy
[9]- Nutrient Broth
[10]- Determination of minimum inhibitory concentration
[11]- Determination of minimal bactericidal concentration
[12]- 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
[xiii]- Narayanan
[xiv]- Sathiyanarayanan
[xv]- Wang
[xvi]- Arugueta
[xvii]- Muthukumar
[xviii]- Kim
(2) Liu WT. Nanoparticles and their biological and environmental applications. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006; 102 (1): 1-7.
(3) Fayaz AM, Balaji K, Girilal M, Yadav R, Kalaichelvan PT, Venketesan R. Biogenic synthesis of silver nanoparticles and their synergistic effect with antibiotics: a study against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Nanomedicine. 2010; 6 (1): 103-109.
(4) Abdel- Mohsen AM, Hrdina R, Burgert L, Abdel – Rahman RM, Hasova M, Smejkalova D, et al. Antibacterial activity and cell viability of hyaluronan fiber with silver nanoparticles. Carbohydrate Polymers. 2013; 92 (2): 1177-1187.
(5) Ghabooli A, Mirzaei S. Biosyntheis of Silver Nanoparticles using Aspergillus Flavus and Investigation of some Effective Factors in its production. Biological Journal of Microorganism. 2018; 7 (27): 81-94.
(6) Kumar KM, Mandal B, Sinha M, Varadhan K. Terminalia chebula mediated green and rapid synthesis of gold nanoparticles. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 2012; 86: 490-494.
(7) Jeyarani S, Vinita NM, Puja P, Senthamilselvi S, Devan U, Velangani AJ, et al. Biomimetic gold nanoparticles for its cytotoxicity and biocompatibility evidenced by fluorescence-cancerous (HEK-293) cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2020; 202: 111715.
(8) Badeggi UM, Ismail E, Adeloye AO, Botha S, Badmus JA, Marnewik JL, et al. Green synthesis of gold nanoparticles capped with procyanidins from Leucosidea sericea as potential antidiabetic and antioxidant agents. Biomolecules. 2020; 10: 452.
(9) Kumar AS, Mody K, Jha B. Bacterial exopolysaccharides, a perception. Journal of Basic Microbiology. 2007; 47 (2): 103-117.
(10) Hwang IS, Hwang JH, Choi H, Kim KJ, Lee DG. Synergistic effects between silver nanoparticles and antibiotics and the mechanisms involved. Journal of Medical Microbiology. 2012; 61 (12): 1719-1726.
(11) Madiedo P, Gavilan CG. Methods for the screening. Isolation and characterization of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Journal of Dairy science. 2005; 88 (3): 843-856.
(12) Liu W, Bao Q, Qing M, ChenX, Sun T, Li M, et al. Isolation and identification of lactic acid bacteria from Tarag in Eastern Inner Mongolia of China by 16S rRNA sequences and DGGE analysis. Microbiological Research. 2012; 167 (2): 110-115.
(13) Kavitha P, Sindhuja D, Banumathi M. Isolation and Characterization of Lactobacillus species Isolated from Dahi. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2016; 5 (4): 1042-1049.
(14) Bachtarzi N, Kharroub K, Ruas-Madiedo P. Exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria isolated from traditional Algerian dairy products and their application for skim-milk fermentations. LWT. 2019; 107: 117-124.
(15) Kanmani P, Kumar RS, Yuvaraj N, Paari KA, Pattukumar V, Arul V. Production and purification of a novel exopolysaccharide from lactic acid bacterium Streptococcus phocae PI80 and its functional characteristics activity in vitro. Bioresource Technology. 2011; 102 (7): 4827-4860.
(16) Kim D, Park S, Lee JH, Jeong YY, Jon S. Antibiofouling polymer-coated gold nanoparticles as a contrast agent for in vivo X-ray computed tomography imaging. Journal of the American Chemical Society. 2007; 129(24): 7661-7665.
(17) Binupriya AR, Sathishkumar M, Yun SI. Biocrystallization of silver and gold ions by inactive cell filtrate of Rhizopus stolonifer. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010; 79 (2): 531-535.
(18) Mahendran S, Saravanan, Pandian V, Kasirajan A. Antibacterial potential of microbial exopolysaccharide from Ganoder malucidum and lysine Bacillus fusiformis. International Journal of Recent Scientific Research. 2013; 4 (5): 501-505.
(19) Andrews JM. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2001; 48 (1): 5-16.
(20) Rigi M. Antimicrobial activities of gold nanoparticles against E. coli. International Journal of Advanced Biological and Biomedical Research. 2016; 4 (1): 100-103.
(21) Wei GX, Campagna AN, Bobek LA. Effect of MUC7 peptides on the growth of bacterial and on Streptococcus mutans biofilm. Journal of antimicrobial chemotherapy. 2006; 57 (6): 1100-1109.
(22) Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food Science and Technology. 1995; 28 (1): 25-30.
(23) Fan J, Cheng Y, Sun M. Function Gold Nanoparticles: Synthesis, Properties and Biomedical Application. The Chemical Record. 2020; 20 (12): 1447-1504.
(24) DeepikaG, Green RJ, Frazier RA, Charalampopoulos D. Effect of growth time on the surface and adhesion properties of Lactobacillus rhamnosus GG. Journal Applied Microbiology. 2009; 107 (4): 1230-1240.
(25) HuangH, Yang X. Synthesis of Polysaccharide-Stabilized Gold and Silver Nanoparticles: A Green Method. Carbohydrate Research. 2004; 339: 2627-2631.
(26) Sathiyanarayanan G, Kiran GS, Selvin J, Saibaba G. Optimization of polyhydroxybutyrate production by marine Bacillus megaterium MSBNO4 under solid state culture. International Journal of Biological Macromolecules. 2013; 60: 253-261.
(27) Moreno-Trejo MB, Sánchez-Domínguez M. Mesquite gum as a novel reducing and stabilizing agent for modified tollens synthesis of highly concentrated Ag nanoparticles. Materials. 2016; 9 (10): 817.
(28) Majzika A, Fülöpb L, Csapóa E, Bogárb F, Martinekc T, et al. Functionalization of gold nanoparticles with amino acid, amyloid peptides and fragment. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2010; 81 (1): 235-241.
(29) Philip D, Unni C. Extracellular biosynthesis of gold and silver nanoparticles using Krishna tulsi (Ocimum sanctum) leaf. Physica E: Low – dimensional System and Nanostructures. 2011; 43 (7): 1318-1322.
(30) Narayanan KB, Sakthivel N. Phytosynthesis of gold nanoparticles using leaf extract of coleus amboinicus lur. Materials Characterization. 2010; 61 (11): 1232-1238.
(31) Talat M, Singh AK, Srivastava O. Optimization of process variables by central composite design for the immobilization of urease enzyme on functionalized gold nanoparticles for various applications. Bioprocess and biosystems engineering. 2011; 34 (6): 647-657.
(32) Lin Z, Zhang H. Anti-tumor and immunoregulatory activities of Ganoderma lucidum and its possible mechanisms. Acta Pharmacologica Sinica. 2004; 25 (11): 1387-1395.
(33) Li S, Shen Y, Xie A, Yu X, Qiu L, et al. Green synthesis of silver nanoparticles using capsicum annum L. extract. Green Chemistry. 2007; 9 (8): 852-858.
(34) Sathiyanarayanan G, Vignesh V, Saibaba G, Vinothkanna A, Dineshkumar K, et al. Synthesis of carbohydrate polymer encrusted gold nanoparticles using bacterial exopolysaccharide: A novel and greener approach. RSC Advances. 2014; 4 (43): 22817-22827.
(35) Sanyasi S, Majhi R, Kumar S, Mishra M, Ghosh A, Suar M, et al. Polysaccharide-capped silver Nanoparticles inhibit biofilm formation and eliminate multi-drug-resistant bacteria by disrupting bacterial cytoskeleton with reduced cytotoxicity towards mammalian cells. Scientific Reports. 2016; 6: 24929.
(36) Khorsand Zak A, Abd Majid WH, Abrishami ME, Yousefi R. X-ray analysis of ZnO nanoparticles by Williamson-Hall and size-strain plot methods. Solid State Sciences. 2011; 13(1): 251-256.
(37) Leff DV, Brandt L, Heath JR. Synthesis and characterization of hydrophobic, organicallysoluble gold nanocrystals functionalized with primary amines. Langmuir. 1996; 12 (20): 4723-4730.
(38) Bindhu M, Umadevi M. Antibacterial activities of green synthesized gold nanoparticles. Materials Letters. 2014; 120: 122-125.
(39) Chandran SP, Chaudhary M, Pasricha R, Ahmad A, Sastry M. Synthesis of Gold Nano Triangles and Silver Nanoparticles Using Aloe Vera Plant Extract. Biotechnology Progress. 2006; 22 (2): 577-583.
(40) Wang ZL. Transmission Electron Microscopy of Shape-Controlled Nanocrystals and Their Assemblies. The Journal of Physicsl Chemistry. 2000; 104 (6): 1153-1175.
(41) Sun C, Qu R, Chen H, Ji C, Wang C, Sun Y, et al. Degradation behavior of chitosan chains in the ‘green’ synthesis of gold nanoparticles. Carbohydrate Research. 2008; 343 (15): 2595–2599.
(42) Grace AN, Pandian K. Quinolone Antibiotic-Capped Gold Nanoparticles and Their Antibacterial Efficacy against Gram Positive And Gram Negative Organisms. Journal of Bionanoscience. 2007; 1 (2): 96-105.
(43) Zada S, Ahmad A, Khan S, Iqbal A, AhmadS, Ali H, et al. Biofabrication of gold nanoparticles by Lyptolyngbya JSC-1 extrac as super reducing and stabilizing agents: Synthesis, Characterization and antibacterial activity. Microbial Pathogenesis. 2018; 114: 116-123.
(44) Wang Z, Huang X, Jin S, Wang H, Yuan L, Brash JL. Rapid antibacterial effect of sunlight-exposed silicon nanowire arrays modified with Au/Ag alloy nanoparticles. Journal of Materials Chemistry. 2019; 7 (40): 6202–6209.
(45) Aruguete DM, Hochella MF. Bacteria-nanoparticle interactions and their environmental implications. Environmental Chemistry. 2010; 7 (1): 3-9.
(46) Muthukumar T, Sudhakumari , Sambandam B, Aravinthan A, Sastry TP, Kim JH. Green synthesis of gold nanoparticles and their enhanced synergistic antitumor activity using HepG2 and MCF7 cells and its antibacterial effects. Process Biochemistry. 2016; 51 (3): 384 - 391.
(47) Aswathanarayan JB, Vittal RR. Antimicrobial, biofilm inhibitory and anti-infective activity of metallic nanoparticles against pathogens MRSA and Pseudomonas aeruginosa PA01. Pharmaceutical Nanotechnology. 2017; 5 (2): 148-153.
(48) Rajput N, Bankar A. Bio-inspired gold nanoparticles synthesis and their anti-biofilm efficacy. Journal of Pharmaceutical Investigation. 2017; 47 (6): 521-530.
(49) Sirajunnisa AR, Surendhiran D. Nanosilver Fabrication Mediated by Exopolysaccharides from Pseudomonas fluorescens and Its Biological Activities. American Journal of Pharmtech Reserch. 2014; 4 (1): 2249-3387.
)