نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد گروه ژنتیک، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
2 دانشیار گروه ژنتیک، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Alpha-amylase is one of the most widely-used amylase types in the industry. Bacterial amylase production is less expensive and easier. Also, solid-state fermentation is an efficient method for the production of industrial amylase due to its advantages such as significant cost reduction and recycling of nutrient-rich wastes. Agricultural residues containing nutrients such as wheat bran are more economical substrates for solid-state fermentation. The aim of the present study was to optimize the production of alpha-amylase from Bacillus subtilis using wheat bran under solid-fermentation and partial purification of this enzyme.
Materials and Methods: In this study, alpha-amylase production by Bacillus subtilis PTCC 1720 in solid-state fermentation (SSF) was investigated and optimized. The produced alpha-amylase in solid-state fermentation was precipitated, separated, concentrated, and dialyzed with 75% ammonium sulfate. Alpha-amylase activity was measured by the DNS method. The protein content after dialysis was estimated by the Bradford method and the purity of the enzyme was calculated. The molecular weight and partial purity of the enzyme were determined by polyacrylamide-sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis (SDS-PAGE).
Results: The results of the study showed optimal enzyme production was achieved when 10 gr of wheat bran mixed with 10 ml tap water and inoculated with 3 ml of bacterial inoculum with OD=1.0 (109 CFU/mL) and incubated at 37 °C for 72 h. The alpha-amylase activity after precipitation with 75% ammonium sulfate solutions was 3.563 U/mL. As a result, the purity of alpha-amylase precipitated with 75% saturated ammonium sulfate was estimated to be 26.8% and its molecular weight was 63 KDa
Discussion and Conclusion: Based on the results of the study, solid-state fermentation is a new and valuable way for amylase production using Bacillus subtilis.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
آمیلازها به گروه آنزیم‌های گلیکوزیل هیدرولازها تعلق دارند که تجزیة ترکیبات کربوهیدراتی را کاتالیز می‌کنند. سه گروه اصلی از آمیلازها شامل آلفا، بتا و گاما هستند که آلفا آمیلازها در حیوانات، گیاهان، قارچ‌ها و باکتری‌ها؛ بتا آمیلازها در دانه‌های گیاهان، باکتری‌ها و قارچ‌ها و گاما آمیلازها در مخمر و قارچ‌ها یافت می‌شوند. باوجود تقاوت‌هایی در ساختار و نحوة عمل آمیلازها عملکرد اصلی همه آنها تجزیة نشاسته و قند‌هاست. آلفا آمیلاز به‌طور تصادفی نشاسته را تجزیه می‌کند و به‌دلیل همین عملکرد غیراختصاصی سرعت هضم بالاتری نسبت به سایر آمیلازها دارد [1]. آلفا آمیلازها (4→1 آلفا دی‌گلوکان گلوکانوهیدرولازها EC 3.2.1.1;) آنزیم‌های حاوی کلسیم‌اند که یک خانواده از اندو آمیلازها را تشکیل می‌دهند و پیوندهای آلفا دی 4→1 گلیکوزیدی را در نشاسته و کربوهیدرات‌های مرتبط تجزیه می‌کنند [2]. آلفا آمیلاز می‌تواند زنجیره‌های طولانی کربوهیدرات‌ها را تجزیه کند که درنهایت، مالتوز از آمیلوز یا مالتوز، گلوکز و مقداری دکسترین از آمیلو پکتین به دست می‌آید [3]. آلفا آمیلاز به‌صورت گسترده در صنایع مختلف استفاده می‌شود؛ ازجمله برای هیدرولیز نشاسته در فرایند مایع‌سازی نشاسته، برای تبدیل نشاسته به شربت فروکتوز و گلوکز، برای بهبود آرد در صنعت پخت و پز، برای تولید نشاستة اصلاح‌شده در صنعت کاغذ، برای حذف نشاسته در تولید پارچه و به‌عنوان افزودنی مؤثر در تهیه شوینده‌ها [4]. همچنین، در فرایند تولید اتانول زیستی استفاده می‌شود. این آنزیم می‌تواند در زمینه‌های مرتبط با زیست‌فناوری مانند اصلاح آلاینده‌های محیط زیست، تبدیل نشاسته به سوبستراهای مطلوب توسط بسیاری از میکروارگانیسم‌ها، نفوذ به پسماندهای حاوی نشاسته و تولید مواد بیوشیمیایی استفاده شود. با ظهور مرزهای جدید در زیست‌فناوری طیف کاربردهای آمیلاز به بسیاری از زمینه‌های دیگر مانند بالینی، دارویی و شیمی تجزیه گسترش یافته است [5].
آنزیم‌های فعال زیستی از حیوانات، گیاهان و میکروارگانیسم‌ها به دست می‌آیند. آنزیم‌های میکروبی به‌دلیل مزایایی همچون جداسازی و تغلیط آسان‌تر، تولید با هزینة کمتر در یک بازة زمانی، پایداری در شرایط سخت محیطی و کنترل ترکیبات جانبی در حین تولید آنها بیشتر توصیه شده‌اند. بیشتر آنزیم‌های تولیدشده از میکروب‌ها به‌دلیل ترشح به محیط از دیدگاه زیست‌فناوری دارای مزیت‌اند. از میان گونههای میکروبی که آمیلاز ترشح می‌کنند، تولید آمیلاز از باکتری‌ها نسبت به سایر میکروارگانیسم‌ها ارزان‌تر و آسان‌تر است. طیف وسیعی از باکتری‌ها برای تولید آمیلاز معرفی شده‌اند که بیشتر گونههای باسیلوس شامل باسیلوس سابتیلیس[1]، باسیلوس استئاروترموفیلوس[2]، باسیلوس آمیلولیکوئی فاسینس[3]، باسیلوس لیکنی فورمیس[4]، باسیلوس کوآگولانس[5]، باسیلوس پلی‌میکسا[6] هستند [6]. آمیلازهای تولیدشده توسط گونههای مختلف باسیلوس حدود 50 درصد بازار جهانی آنزیم‌ها را به خود اختصاص می‌دهند [7]. گونههای باسیلوس سابتیلیس، باسیلوس استئاروترموفیلوس و باسیلوس لیکنی‌فورمیس منابع مناسبی برای تولید آلفا آمیلاز مقاوم به حرارت‌اند و درنتیجه از لحاظ تجاری گونههای درخور توجهی به شمار می‌روند [8] همچنین، باسیلوس سابتیلیس قادر است سطح بالایی از این آنزیم سودمند را تولید کند [9].
آمیلازها حدود 33-23 درصد از بازار جهانی آنزیم را به خود اختصاص می‌دهند؛ با این حال، هزینة تولید آنزیم در مقیاس صنعتی بالاست. برآورد شده است فرمولاسیون محیط کشت میکروبی حدود 40-30 درصد هزینة نهایی آنزیم را به خود اختصاص می‌دهد. نیاز به کاهش هزینه‌ها برای تولید آنزیم‌های صنعتی باعث تحقیق برای یافتن محیط کشت کم‌هزینه می‌شود. در این راستا باقیمانده‌های کشاورزی به‌عنوان سوبسترا برای آنزیم‌های میکروبی در شرایط تخمیر در حالت جامد استفاده می‌شود [10].
به‌طور عمده دو روش برای تولید آلفا آمیلاز در مقیاس صنعتی وجود دارد: 1- تخمیر در محیط کشت مایع و 2- تخمیر در بستر جامد. تخمیر در حالت جامد یک روش جدید و تخمیر در حالت مایع یک روش متداول برای تولید آنزیم از میکروب‌ها با یک سابقة طولانی است [11]؛ با وجود این، تخمیر در حالت جامد به‌عنوان یک زیستگاه شبیه زیستگاه طبیعی میکروارگانیسم جایگزین تخمیر در حالت مایع می‌شود. تخمیر در حالت جامد به‌دلیل ساده‌بودن، کم‌هزینه‌بودن، نیاز به انرژی کمتر، خروجی آب کمتر و عدم تشکیل کف زیاد نسبت به تخمیر در حالت مایع انتخاب بهتری است [3]. مزیت اصلی در این روش بازیافت مواد زائد سرشار از مواد مغذی و استفاده از آنها به‌عنوان سوبسترا برای محیط کشت است [11]. تعداد زیادی از محصولات جانبی مانند سبوس گندم، پوسته برنج، بقایای فیبر کاساوا، نشاسته برنج، پوست خشک‌شدة سیب‌زمینی، پوست موز، کیک کلزا، کیک روغن نارگیل و کیک روغن خردل به‌عنوان سوبسترا برای تخمیر در حالت جامد استفاده شده‌اند. در این میان، باقیمانده‌های کشاورزی به‌دلیل وجود ترکیبات مغذی، سوبستراهای اقتصادی‌تری برای تخمیر در حالت جامدند. سبوس گندم به‌دلیل اینکه نسبت بالاتری از کربوهیدرات‌های متابولیزه‌شونده (80 درصد) را نسبت به سایر باقیمانده‌های کشاورزی دارد، منبع کربن بهتری است و بیشترین استفاده را به‌عنوان سوبسترا برای تخمیر در حالت جامد دارد. علاوه بر این، سبوس گندم حاوی پروتئین، فیبرهای غذایی، عناصر معدنی و اسید آمینه‌های ضروری مختلف برای رشد و تکثیر باکتری‌ها و درنهایت تولید آنزیم است [12].
آنزیم‌هایی که برای کاربردهای صنعتی استفاده می‌شوند به پردازش و درصد خلوص کمتری نیاز دارند؛ درحالی‌که آنزیم‌های استفاده‌شده در صنایع دارویی و بالینی باید درصد خلوص بالایی داشته باشند. همچنین، زمانی که آنزیم‌ها برای مطالعة ویژگی‌های بیوشیمیایی و رابطة ساختار و عملکرد استفاده می‌شوند باید کامل خالص شده باشند. پروتئین‌ها با استفاده از تکنیک‌های مشخصی خالص‌سازی می‌شوند که شامل رسوب‌دهی با آمونیوم سولفات، اولترافیلتراسیون، دیالیز، کروماتوگرافی تعویض یونی، کروماتوگرافی ستونی است؛ این تکنیک‌ها به خالص‌سازی مرحله به مرحله نیاز دارند. ترکیب این روش‌های بالا در یکسری از مراحل برای رسیدن به درصد خلوص بالا انجام می‌شود [11].
هاشمی و همکاران در سال 1390 تولید آلفا آمیلاز غیروابسته به کلسیم توسط باسیلوس سویة KR-8104 را در دو سامانة تخمیر غوطه‌ور و حالت جامد ارزیابی کردند [13]. همچنین، عظیمی و همکاران در سال 1392 تولید آلفا آمیلاز توسط باسیلوس لیکنی فورمیس را در شرایط تخمیر در حالت جامد با استفاده از سبوس گندم ترکیب‌شده با محلول محیط‌های پایه بهینه‌سازی کردند [14]. کابوسی و همکاران در سال 1393 تولید آلفا آمیلاز توسط باسیلوس آمیلو لیکویی فاسینس را با استفاده از عصارة نخود فرنگی و کنجاله تخم پنبه با روش تخمیر غوطه‌ور بهینه‌سازی کردند [15] و صمد لویی و همکاران در سال 1394 تولید آلفا امیلاز از گونة باکتری مذکور را بررسی و بهینه‌سازی کردند [16]. درنهایت در سال 1396 باسیلوس‌های مولد آلفا آمیلاز مقاوم به حرارت شناسایی شدند و افریشم و همکاران بهینه‌سازی تولید آنزیم و بررسی فعالیت و پایداری آنزیم را بررسی کردند [17].
هدف این پژوهش، بررسی و بهینه‌سازی تولید آلفا آمیلاز از باسیلوس سابتیلیس در شرایط تخمیر در بستر جامد با استفاده از سوبسترای سبوس گندم و بررسی میزان تولید و درصد خلوص آنزیم تولیدشده بعد از خالص‌سازی جزئی به روش رسوب‌دهی با آمونیوم سولفات است.
مواد و روش‌ها
تهیۀ مایه تلقیح: به‌منظور تهیة مایه تلقیح، 50 میلی‌لیتر از محیط کشت TSB با یک پرگنه ایزوله از باکتری باسیلوس سابتیلیسPTCC 1720، تلقیح و به مدت 12 ساعت در انکوباتور شیکردار با دور rpm 130 و دمای 37 درجة سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس 50 میلی‌لیتر از محیط کشت TSB تازه با یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری (با جذب نوری 1 در طول موج 600 نانومتر) به‌دست‌آمده از مرحلة قبل، تلقیح و در انکوباتور شیکردار با دمای 37 درجة سانتی‌گراد و 130 دور در دقیقه به مدت دو ساعت گرماگذاری شد تا جذب نوری مایه تلقیح به 1 (CFU/mL 109) برسد.
شرایط تخمیر در بستر جامد: 10 گرم از سبوس گندم به یک ارلن 250 میلی‌لیتری انتقال داده و با 10 میلی‌لیتر از آب شهری مخلوط شد. ارلن‌ها بعد از پنبه‌گذاری به مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجة سانتی‌گراد در اتوکلاو استریل شدند. بعد از سردشدن در دمای اتاق ارلن‌ها با 2 میلی‌لیتر مایه تلقیح با جذب نوری 1، تلقیح و به مدت 48 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند [12].
استخراج آنزیم: آنزیم‌های تولیدشده در شرایط تخمیر در بستر جامد با اضافه‌کردن 50 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 02/0 مولار با 7 pH= به 10 گرم سبوس گندم بعد از فرایند تخمیر و نگهداری در انکوباتور شیکردار با دمای 4 درجة سانتی‌گراد با دور rpm 100 به مدت 2 ساعت، از فاز جامد به فاز مایع وارد شدند و برای جداسازی آنزیم از سایر ترکیبات سوسپانسیون حاصل به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجة سانتی‌گراد با دور rpm 6000 سانتریفیوژ شد تا آنزیم‌ها در مایه رویی تجمع یابند ]8 و 10[.
سنجش فعالیت آنزیم: فعالیت آنزیم با روش DNS (دی‌نیترو سالیسیلیک اسید) اندازه گیری شد [18]. برای تعیین فعالیت آنزیم، 5/0 میلی‌لیتر از محلول به‌دست‌آمده از مرحلة قبل با 5/0 میلی‌لیتر از محلول نشاستة محلول در آب (سیگما - آلدریچ) یک درصد مخلوط شد و به مدت 5 دقیقه در انکوباتور با دمای 30 درجة سانتی‌گراد و 100 دور در دقیقه قرار گرفت. سپس غلظت قندهای کاهندة آزادشده از سوبسترای نشاسته با اندازه‌گیری جذب نوری محلول در 540 نانومتر با روش DNS سنجش شد.
شاهد استفاده‌شده برای صفرکردن دستگاه اسپکتوفتومتر شامل همه مواد درگیر در واکنش سنجش فعالیت آنزیمی به‌جز محلول حاوی آنزیم تولیدشده توسط باکتری است.
بهینه‌سازی تولید آنزیم: برای شکل‌گیری حداکثر تولید میکروارگانیسم‌ها باید شرایط کشت ازنظر پارامترهایی مانند زمان، دما، میزان رطوبت و میزان حجم مایة تلقیح بهینه‌سازی شوند.
به‌منظور دستیابی به زمان بهینة انکوباسیون بعد از آماده‌سازی 15 عدد ارلن 250 میلی‌لیتری در هر ارلن 10 گرم سبوس گندم با 10 میلی‌لیتر از آب شهری مخلوط شد. ارلن‌ها بعد از پنبه‌گذاری به مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجة سانتی‌گراد در اتوکلاو استریل شدند. بعد از سردشدن در دمای اتاق، ارلن‌ها با 2 میلی‌لیتر مایة تلقیح با جذب نوری 1 تلقیح شدند و بعد از گذشت 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت از زمان کشت در سه تکرار ارزیابی شدند.
به‌منظور بررسی اثر رطوبت محیط بر تولید آنزیم بعد از آماده‌سازی 12 عدد ارلن 250 میلی‌لیتری، به هر ارلن10 گرم سبوس گندم، اضافه و به‌ترتیب هر ارلن با 5، 10، 15 و 20 میلی‌لیتر از آب شهری مخلوط شد. ارلن‌ها بعد از پنبه‌گذاری به مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجة سانتی‌گراد در اتوکلاو استریل شدند. بعد از سردشدن در دمای اتاق، ارلن‌ها با 2 میلی‌لیتر مایة تلقیح با جذب نوری 1، تلقیح و به مدت 72 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند و بعد از این زمان تولید آنزیم بررسی شد.
برای بررسی اثر حجم مایة تلقیح بر تولید آنزیم بعد از آماده‌سازی 12 عدد ارلن 250 میلی‌لیتری، در هر ارلن10 گرم سبوس گندم با 15 میلی‌لیتر از آب شهری مخلوط شد. ارلن‌ها بعد از پنبه‌گذاری به مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجة سانتی‌گراد در اتوکلاو استریل شدند. بعد از سردشدن در دمای اتاق به‌ترتیب هر ارلن با 1، 3 و 4 میلی‌لیتر مایة تلقیح با جذب نوری 1، تلقیح و به مدت 72 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند.
به‌منظور بررسی اثر دمای انکوباسیون بر تولید آنزیم بعد از آماده‌سازی 9 عدد ارلن 250 میلی‌لیتری در هر ارلن 10 گرم سبوس گندم با 15 میلی‌لیتر از آب شهری مخلوط شد. ارلن‌ها بعد از پنبه‌گذاری به مدت 30 دقیقه در دمای 121 درجة سانتی‌گراد در اتوکلاو استریل شدند. بعد از سردشدن در دمای اتاق، ارلن‌ها با 3 میلی‌لیتر مایة تلقیح با جذب نوری 1، تلقیح و به مدت 72 ساعت در انکوباتورهایی با دمای 30، 37 و 40 درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند.
فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز اینگونه تعریف می‌شود؛ میزان پروتئینی که در یک گرم سوبسترای مناسب تولید شده است و می‌تواند یک میلی‌گرم قند کاهنده مانند مالتوز را در یک دقیقه در شرایط سنجش فعالیت آنزیم آزاد کند و به‌صورت U/gds مطرح می‌شود؛ gds میزان سوبسترای خشکی است که محاسبه می‌شود [12].
شاهد استفاده‌شده برای پیشگیری از ایجاد خطا در محاسبات تولید آنزیم، به‌دلیل وجود کربوهیدرات‌های متابولیزه (قندهای کاهنده) در سبوس گندم، شامل همه مواد درگیر در واکنش سنجش فعالیت آنزیمی به‌جز محلول نشاسته است. بهجای محلول نشاسته از آب دوبار تقطیر استفاده شد.
.تخلیص جزئی آلفا آمیلاز ازطریق رسوب‌دهی با آمونیوم سولفات: پروتئین‌های تولیدشده توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس در شرایط تخمیر در بستر جامد (پروتئین‌های موجود در 45 میلی‌لیتر از محلول به‌دست‌آمده در فرایند استخراج آنزیم) در حداقل سه تکرار ازطریق رسوب‌دهی با محلول اشباع 75 درصد نمک آمونیوم سولفات رسوب‌دهی، جداسازی و تغلیظ شدند. سپس برای حذف نمک آمونیوم سولفات از محلول به‌دست‌آمده، فرایند دیالیز با کیسة دیالیز با برش مولکولی[7] 12000 دالتون در مقابل آب مقطر استریل با چرخش مداوم به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجة سانتی‌گراد و تعویض بافر دیالیز در فاصله‌های 2، 4، 6 و 8 ساعت انجام شد.
.الکتروفورز با ژل سدیم دودسیل سولفات پلی‌آکریل‌آمید: الکتروفورز عمودی ژل پلی‌اکریل‌آمید - سدیم دودسیل سولفات (SDS-PAGE) برای مشاهدة اندازة آلفا آمیلاز حاصل‌شده و اطمینان از تخلیص نسبی طبق روش زیر انجام شد؛ ژل جداکننده با غلظت 12 درصد و ژل متراکم‌کننده با غلظت 5 درصد تهیه شد و 40 میکرولیتر از نمونه‌های آماده‌شده درون هریک از چاهک‌ها تزریق شد. در یکی از چاهک‌های کنار نمونه‌ها نیز مارکر اندازه پروتئینی در نظر گرفته شد. پس از رسیدن نمونه‌ها به پایین ژل، جریان برق قطع شد، دو شیشة قالب به آرامی از هم جدا شدند و ژل با آب مقطر شست‌و‌شو داده شد. بعد از آن، ژل به مدت 16 ساعت در محلول رنگ‌زا قرار داده شد و سپس به مدت 4 ساعت در محلول رنگ‌بر قرار گرفت تا باندها قابل مشاهده شدند ]19[.
تعیین میزان غلظت آنزیم: برای بررسی محتوی پروتئینی نمونه‌های تخلیص‌شده و درصد خلوص آلفا آمیلاز، آزمون بردفورد انجام شد. مقدار 8/1 میلی‌لیتر محلول کار بردفورد (6 میلی‌لیتر محلول ذخیرة بردفورد - 53 میلی‌گرم کوماسی بلو، اتانول 95 درصد و 20 میلی‌لیتر اسید فسفریک 85 درصد - 3 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد و 6 میلی‌لیتر اسید فسفریک 85 درصد را با آب دوبار تقطیر به حجم 100 می‌رسانیم) در لوله آزمایش ریخته شد، 200 میکرولیتر نمونة پروتئینی به آن اضافه و به‌عنوان شاهد در یک لوله آزمایش نیز بهجای 200 میکرولیتر نمونة پروتئینی، آب مقطر ریخته شد. از مخلوط حاصل به‌عنوان بلانک در مرحلة بعد استفاده شد. جذب نوری مخلوط‌های پروتئینی در 595 نانومتر اندازه‌گیری شد. با استفاده از نمودار استاندارد بردفورد، میزان پروتئین موجود در هر نمونه محاسبه شد [20].
شکل 1- نمودار استاندارد بردفورد [21]
تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها: تمامی داده‌های حاصل از آزمایش‌های مختلف با نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 23 و با کمک آزمون آنالیز واریانس (ANOVA) در سطح اطمینان 95 درصد تجزیه و تحلیل شدند.
نتایج
اثر مدت زمان انکوباسیون بر تولید آنزیم: شکل 2 اثر مدت زمان انکوباسیون بر میزان تولید آلفا آمیلاز توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس را در شرایط تخمیر در بستر جامد نشان می‌دهد. همان‌طور که مشاهده مشاهده می‌شود با گذشت زمان تولید آنزیم افزایش می‌یابد، در زمان 72 ساعت تولید آنزیم به بیشترین مقدار خود می‌رسد و بعد از آن با گذشت زمان تولید آنزیم کاهش می‌یابد.
72 ساعت پس از گرمخانه‌گذاری، بهینه شرایط برای تولید آلفا آمیلاز توسط باسیلوس سابتیلیس در شرایط تخمیر در بستر جامد اتفاق می‌افتد. اختلاف مشاهده‌شده بین فعالیت آنزیم در زمان 24 با فعالیت آنزیم در سایر زمان‌ها در سطح 5 درصد معنادار است (p<0.05).
اثر رطوبت محیط بر تولید آنزیم: شکل 3 اثر رطوبت بر میزان تولید آلفا آمیلاز توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس را در شرایط تخمیر در بستر جامد نشان می‌دهد. همان‌طور که مشاهده می‌شود میزان تولید آنزیم با افزایش رطوبت محیط افزایش می‌یابد و بیشترین میزان تولید آنزیم زمانی به دست می‌آید که 10 گرم سبوس گندم با 15 میلی‌لیتر آب مخلوط شود و از آن پس با افزایش رطوبت تولید آنزیم کاهش یابد. میزان فعالیت آنزیم در شرایطی که 5 میلی‌لیتر آب به محیط کشت اضافه شده است، با سایر موارد اختلاف نشان می‌دهد این اختلاف در سطح 5 درصد معنادار است (p<0.05).
اثر حجم مایة تلقیح بر تولید آنزیم: شکل 4 اثر حجم مایة تلقیح بر میزان تولید آلفا آمیلاز توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس را در شرایط تخمیر در بستر جامد نشان می‌دهد. میزان بهینه و بیشترین میزان تولید آنزیم با تلقیح 10 گرم سبوس گندم 3 میلی‌لیتر از مایة تلقیح حاصل شد. در حجم‌های کمتر و بیشتر از حجم بهینة مایة تلقیح، میزان تولید آنزیم کاهش یافت. اختلاف مشاهده‌شده در فعالیت آنزیم بین حجم‌های تلقیح 1 و 3 میلی‌لیتر در سطح ۵ درصد معنادار است (p<0.05). معناداربودن اختلاف فعالیت آنزیم بین حجم‌های تلقیح ۳ و 4 نیز در سطح 5 درصد تأیید شد؛ اما بین سطوح دیگر خیر.
شکل 2. بررسی اثر مدت زمان انکوباسیون بر فعالیت آنزیم
شکل 3- بررسی اثر رطوبت محیط بر فعالیت آنزیم
شکل 4- بررسی اثر حجم مایة تلقیح بر فعالیت آنزیم
اثر دما بر تولید آنزیم: اثر دما بر تولید آلفا آمیلاز در شکل 5 مشاهده می‌شود. دمای بهینه برای تولید آلفا آمیلاز از باکتری باسیلوس سابتیلیس در شرایط تخمیر در بستر جامد 37 درجة سانتی‌گراد است و در دماهای پایین‌تر و بیشتر از این دما میزان تولید آنزیم کاهش می‌یابد. اختلاف مشاهده‌شده بین فعالیت آنزیم در دماهای مختلف در سطح 5 درصد معنادار است (p<0.05).
شکل 5- بررسی اثر دمای انکوباسیون بر فعالیت آنزیم
تخلیص جزئی آلفا آمیلاز: تخلیص جزئی آلفا آمیلاز از مجموعه پروتئین‌های تولیدشده توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس در شرایط تخمیر در بستر جامد با استفاده از محلول اشباع 75 درصد نمک آمونیوم سولفات انجام شد (شکل 6) و فعالیت آلفا آمیلاز بعد از رسوب‌دهی، تغلیظ و دیالیز U/mL 563/3 محاسبه شد.
ویژگی‌های آلفا آمیلاز و درصد خلوص: بعد از تخلیص جزئی آلفا آمیلاز تولیدشده در شرایط بهینه با محلول اشباع 75 درصد آمونیوم سولفات برای بررسی کیفیت و وزن مولکولی آلفا آمیلاز تخلیص شده است و نمونه‌ها روی ژل پلی‌آکریل‌آمید 12 درصد بارگزاری شده‌اند. همان‌طور که در شکل 7 مشاهده می‌شود آلفا آمیلاز تخلیص‌شده 63 کیلودالتون است و همچنین حضور این باند تأیید کیفی تخلیص آلفا آمیلاز را اثبات می‌کند. برای محاسبة درصد خلوص آلفا آمیلاز تخلیص‌شده آزمون بردفورد انجام شد. فعالیت ویژة آنزیم U/mg 268/0 و درصد خلوص آنزیم 8/26 محاسبه شده است.
شکل 6- نتیجة سنجش فعالیت آنزیم با معرف DNS بعد از رسوب‌دهی با آمونیوم سولفات 75 درصد و دیالیز. (B- بلانک، A- نمونة بعد از دیالیز)
شکل 7- تصویر الکتروفورز عمودی (SDS-PAGE) خالص‌سازی جزئی آلفا آمیلاز تولیدشده توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس در شرایط تخمیر در بستر جامد (M- مارکر پروتئینی، A- کنترل مثبت، - نمونة حاصل از خالص‌سازی جزئی آلفا آمیلاز تولیدشده در بستر جامد)
بحث
گونههای باسیلوس مهم‌ترین منابع تولید آلفا آمیلاز و سایر آنزیم‌ها با روش‌های مختلف تخمیرند [3]. در این مطالعه توانایی باسیلوس سابتیلیس برای تولید آلفا آمیلاز در شرایط تخمیر بستر جامد بررسی و تأیید شد که به‌نوبه‌خود واجد اهمیت فراوان است. همچنین پارامتر‌های محیطی مانند دمای انکوباسیون، زمان انکوباسیون، رطوبت محیط و حجم مایة تلقیح برای تولید آلفا آمیلاز توسط باکتری باسیلوس سابتیلیس در روش تخمیر در حالت جامد با استفاده از سبوس گندم بهینه‌سازی شدند. بیشترین میزان تولید آنزیم زمانی به دست آمد که10 گرم سبوس گندم با 15 میلی‌لیتر آب شهری، مخلوط و با 3 میلی‌لیتر از مایة تلقیح به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجة سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد.
اثر مدت زمان انکوباسیون بر تولید آنزیم: با توجه به اینکه باکتری باسیلوس سابتیلیس بعد از گذشت 72 ساعت به فاز سکون رشد می‌رسد، حداکثر تجمع آلفا آمیلاز در انتهای فاز لگاریتمی رشد و در همین زمان دیده می‌شود. همچنین کاهش میزان تولید آلفا آمیلاز بعد از گذشت 72 ساعت ممکن است به‌دلیل انتشار سطح بالایی از پروتئازهای درون سلولی هم‌زمان با تشکیل آندوسپور باشد.
اثر رطوبت محیط بر تولید آنزیم: افزایش میزان تولید آنزیم با افزایش رطوبت محیط کشت را می‌توان به نیاز باکتری‌ها به فعالیت بالای آب مرتبط دانست. بدیهی است بهترین میزان رطوبت برای تولید آنزیم در باکتری در شرایطی اتفاق می‌افتد که بهینة رشد انجام شود و حضور مولکول‌های آب مانع انتشار مطلوب اکسیژن و انتقال مواد مغذی به درون سلول‌های باکتری نشود.
اثر حجم مایة تلقیح بر تولید آنزیم: علت میزان کم تولید آنزیم در حجم‌های پایین از مایة تلقیح را می‌توان به تعداد کم سلول‌های زنده در محیط تولید مرتبط دانست و این سلول‌ها به زمان بیشتری برای رشد و رسیدن به تعداد مطلوب برای استفاده از مواد مغذی محیط کشت برای تولید بهینة آنزیم نیاز دارند؛ درحالی‌که ممکن است دلیل میزان کم تولید در حجم‌های بیشتر از حجم بهینة مایة تلقیح، کم‌بودن مواد مغذی برای تعداد زیاد سلول‌های زنده و تجمع متابولیت‌های سمی باشد.
اثر دما بر تولید آنزیم: تولید آنزیم با افزایش دما تا نقطه‌ای روند افزایشی نشان می‌دهد که برای باکتری مناسب است و رشد خود را به خوبی انجام می‌دهد؛ اما با افزایش بیشتر دما تولید آنزیم کاهش می‌یابد. این ممکن است به‌علت از دست دادن رطوبت در بستر جامد و عدم شرایط بهینة فعالیت سلول‌های میکروبی باشد که به کاهش رشد و کاهش تولید آنزیم منجر می‌شود.
نتایج حاصل از تولید و تخلیص جزئی آنزیم و همچنین درصد خلوص آلفا آمیلاز در این مطالعه بیان‌کنندة این موضوع است که روش تخمیر در بستر جامد با بهره‌گیری از ضایعات دورریز کشاورزی مانند سبوس گندم یک پیشنهاد مناسب برای تولید آلفا آمیلاز در مقیاس صنعتی است.
سپاسگزاری
از مدیریت تحصیلات تکمیلی دانشگاه شهرکرد بابت حمایت مالی و از دکتر صادق فرهادیان استادیار گروه زیست‌شناسی بابت مشاوره در زمینة خالص‌سازی آنزیم کمال تشکر و قدردانی را داریم.
)