نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
2 دانشیار گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران؛ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
3 استاد گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: This research was conducted with the aim of isolating and identifying cowpea root and crown pathogens in Khuzestan province. In addition, the antifungal effectiveness of nine selected strains of five Trichoderma species was surveyed on four root and crown pathogens of cowpea.
Materials and Methods: Out of twenty strainsobtained, four of them were selected for further investigation including pathogenicity test and siderophore assay. The relative amount of the siderophore produced by nine selected strains from five Trichoderma speciesand pathogens was assayed by the chrome Azurol S method (CAS). The radial growth of the pathogen’s colonies in front of the Trichodermastrains was analyzed using a completely randomized design, with three replicates. The pathogenic strains of ITS region were amplified and sequenced. The obtained sequences were compared with the reference strains using BLASTn search and the maximum likelihood (ML) phylogenetic analysis.
Results: In the present study, the following pathogens were identified: Rhizoctonia solani, Fusarium chlamydosporum, F. falciforme, and Macrophomina phaseolina. In CAS assay, all of the Trichoderma strains and pathogens produced the siderophore into growth media under iron starvation.Strains of T. koningiopsis SCUA-Arak-96 and T. pleuroticola SCUA-Isf-15 produced the minimum and maximum siderophore with 31% and 85%, respectively. In the dual culture test, most Trichoderma strains significantly reduced the growth of pathogenic fungi. The most antifungal effect was observed in T. virens SCUA-Ham-65 strain on F. chlamydosporum and F. falciforme pathogens, with 30% and 29% growth inhibitory, respectively.
Discussion and conclusion: The results of the present study showed thatR. solani, F. chlamydosporum, F. falciforme, and M. phaseolina were the most important pathogens of the cowpea causing root and crown rot in Khuzestan province. Trichoderma strains produced the siderophore which chelates minimal iron of environment. In addition, they inhibit the growth of the plant pathogens in vitro.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
لوبیا از مهمترین گونه‌های خانوادة لگومینه و اصلیترین محصول حبوبات در دنیاست و در ایران به‌طور متوسط حدود 680 هزار هکتار از اراضی در هر سال زراعی به حبوبات اختصاص داده می‌شوند (1). ازجمله بیماری‌های قارچی لوبیا چشم‌بلبلی، به پوسیدگی طوقه و ریشه ناشی از قارچ‌های Rhizoctonia solani، Macrophomina phaseolinaو گونه‌های Fusarium می‌توان اشاره کرد (2). بیمارگر M. phaseolina بیشتر به ریشة گیاه میزبان حمله می‌کند و موجب ایجاد لکه‌های بافت‌مرده و پوسیدگی زغالی روی آن می‌شود (3). ایجاد بیماری پوسیدگی زغالی، به مرحلة رشدی و شرایط محیطی بستگی دارد؛ در آب‌وهوای گرم‌وخشک دیده می‌شود و شوری خاک می‌تواند آن را افزایش دهد (4). گیاهانی که مورد حملة گونه‌های Fusarium قرار می‌گیرند، علائم پژمردگی نظیر رنگ‌پریدگی برگ‌ها و کاسبرگ، زردشدن و افتادن برگ‌ها و تغییر رنگ آوند چوبی را نشان می‌دهند و درنهایت، بخش‌های هوایی از بین خواهند رفت (5). ﭘﻮﺳﯿﺪﮔﯽ رﯾﺰوﮐﺘﻮﻧﯿﺎﯾﯽ ریشة لوبیا از ﻣﻬﻢﺗﺮﯾﻦ ﺑﯿﻤﺎریﻫﺎی رﯾﺸﻪ و ﻫﯿﭙﻮﮐﻮﺗﯿﻞ ﻟﻮﺑﯿﺎ اﺳﺖ (6). میزان خسارت واردشده توسط این قارچ بین مزارع یک منطقه و نیز در محصول لوبیا در سال‌های متفاوت متغیر است و دلیل آن تأثیر شرایط آب‌وهوایی و خاک از زمان کشت تا برداشت است (7).
ﺑﺎ توجه به خطرات زﯾﺴﺖﻣﺤﯿﻄﯽ ﮐﺎرﺑﺮد ﺳﻤﻮم ﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ، روشﻫﺎیی مانند اﺳـﺘﻔﺎده از ﻋﻮاﻣﻞ کنترل بیولوژیک برای کنترل بیماری‌های گیاهی اﻫﻤﯿﺖ زیادی می‌یابند؛ ازﺟﻤﻠﻪ ﻋﻮاﻣﻞ کنترل بیولوژیک ﺑﺮای مدیریت ﺑﯿﻤﺎری‌های ﭘﻮﺳﯿﺪﮔﯽ طوقه و ریشة ﻟﻮﺑﯿﺎ، ﮔﻮﻧﻪﻫﺎی Trichodermaهستند. گونه‌های Trichoderma، برخی بیماری‌های خاک‌زاد را ازطریق مکانیسمهای مختلف همچون میکوپارازیتیسم کنترل می‌کنند (8). در بررسی واکنش‌های بین T. harzianumبا Rhizoctoniaو گونه‌های Pythium ، رشد مستقیم میکوپارازیت به طرف میزبان و پیچ‌خوردگی ریسهای اطراف ریسه‌ها مشاهده شده است (9). سیدروفورها یک گروه ناهمگن شیمیایی از متابولیت‌های ثانویه‌اند که با محدودکردن عناصر غذایی مصرفی عوامل بیماری‌زا (همچون آهن)، علیه میکروارگانیسم‌های دیگر به کار گرفته می‌شوند (10). اهمیت تولید سیدروفور به‌عنوان مکانیسم کنترل بیولوژیک، برای نخستین‌بار با استفاده از چندین سویة Pseudomonas fluorescensعلیه بیمارگر باکتریایی Erwinia carotovoraمشخص شد (11). قارچ‌هایی مانند Trichodermaو باکتری‌های تولیدکنندة سیدروفور، قدرت رقابت بیشتری برای جذب آهن دارند و سیدروفور بیشتری تولید می‌کنند؛ بنابراین می‌توانند در شرایط کمبود آهن، آن را از دسترس بیمارگرها خارج کنند و باعث سرکوب بیمارگر شوند (12). حضور و نقش سیدروفورها در قارچ‌های بیمارگر در جوانه‌زنی میسیلیوم و اسپور قارچ (13)، ذخیرة آهن در کنیدیوم و جوانه‌زنی آن (12) و حمل‌ونقل آن در میتوکندری قارچ‌ها به اثبات رسیده است (14).
در این تحقیق، بیمارگرهای قارچی طوقه و ریشة لوبیا از مناطق مهم کشت لوبیا در استان خوزستان، جداسازی و براساس روشهای ریختشناسی و مولکولی شناسایی شدند. سپس، اثر ضدقارچی چند سویة انتخابی Trichoderma روی آنها در محیط آزمایشگاه بررسی شد. همچنین ردیابی و سنجش میزان تولید سیدروفورها در سویه‌های انتخابی بیمارگر و سویه‌های Trichoderma انجام شد.
مواد و روش‌ها
ﺟﺪاﺳﺎزیﺑﯿﻤﺎرﮔﺮها: در بازدید انجام‌شده در مهرماه سال 1395 از مزارع لوبیاکاری شهرستان‌های شوش و اندیمشک در استان خوزستان، ده گیاه لوبیا چشم‌بلبلی با علائم پوسیدگی طوقه و ریشه، جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. برای جداسازی بیمارگرها، قطعاتی به اندازة 5/0 سانتیمتر از حاشیة بین بافت آلوده و سالم، تهیه و بعد از ضدعفونی سطحی با استفاده از هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت دو دقیقه و سه بار شستشو با آب مقطر استریل، روی محیط غذایی سیبزمینی - دکستروز - آگار (PDA) قرار داده شدند (15). پنج تا ده روز پس از نگهداری تشتکهای پتری در انکوباتور در دمای 28 درجة سانتیگراد و تاریکی مطلق، پرگنه‌های ظاهرشدة قارچی روی محیط کشت به محیط تازة PDA منتقل شدند. این جدایهها به روش تکاسپورکردن (Fusarium) و نوکریسه (Rhizoctonia و Macrophomina) خالصسازی شدند.
اثبات بیماری‌زایی: برای انتخاب یک سویه با توانایی ایجاد بیماری از هر گونة شناسایی‌شده، اثبات بیماری‌زایی انجام شد. برای تهیة مایه سویه‌های قارچی، پس از سترون‌کردن مخلوط آرد ذرت، ماسه و دانه‌های ارزن، دیسک‌هایی از کشت درحال رشد به آنها، اضافه و به مدت 15 روز در دمای 28 درجة سانتیگراد و تناوب نوری (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) نگهداری شدند (16). پس از سترون‌کردن مخلوط خاک، ماسه و خاک برگ (با نسبت مساوی)، حدود نیمی از عمق گلدان‌ها با آن پر شد. گلدان‌ها در عمق بعدی با مخلوط خاک استفاده‌شده و مایه سویه‌های قارچی به میزان دو درصد وزنی پر شدند. سپس در یک سانتیمتر عمق بعدی، مخلوط خاک سترون اضافه شد و چهار بذر ضدعفونی سطحی‌شده روی آن قرار گرفتند. یک سانتیمتر بعدی روی بذور با خاک مخلوط سترون پوشش داده شد و پس از آبیاری، گلدان‌ها در شرایط رطوبت نسبی 50 درصد، دمای 28 درجة سانتیگراد و تناوب نوری 12 ساعته درون ژرمیناتور قرار گرفتند. ارزیابی ایجاد علائم بیماری و انتخاب سویه‌ها در 30-15 روز بعد انجام شد (17-18). پس از ظهور علائم، نمونههای بیمارشده دوباره در فرایند جداسازی قرار گرفتند و جدایههای به‌دست‌آمده ازنظر ریختشناسی با قارچ‌های مایهزنیشده مقایسه شدند.
شناسایی ریختشناسی و مولکولی بیمارگرهای انتخاب‌شده: ریختشناسی این سویه‌ها با بررسی ساختارهای رویشی و تولیدمثلی و مقایسة آن با توصیف سویه‌های تایپ انجام شد. پس از رشد میسلیوم‌های قارچی سویه‌های بیمارگر انتخاب‌شده در مرحلة اثبات بیماری‌زایی در محیط مایع، جمع‌آوری تودة میسیلیومی با پمپ خلأ انجام شد و استخراج DNA آنها با روش ریدر و برودا (19) با اندکی تغییر صورت گرفت (20). واکنش زنجیرهای پلیمراز مربوط به سویه‌های انتخاب‌شده با جفت آغازگر عمومی NL4 و ITS1 برای تکثیر نواحی ITS و بخش‌هایی از اسیدریبونوکلئیک ریبوزومی S28 انجام شد (21). قطعات تکثیری نواحی ژنی مربوط به سویه‌های انتخابی با روش استخراج DNA از ژل با استفاده از کیت تجاری Vivantis GF-1 Gel DNA Recavery Kit (مالزی) و منطبق با دستورالعمل ارائهشده خالصسازی و توسط شرکت نرگس (اهواز) با استفاده از آغازگرهای پیشرو و معکوس توالییابی شدند. توالی‌های پیشرو و معکوس با نرم‌افزار DNA Baser Sequence Assembler v.4(HeracleBioSoft, http://www.dnabaser com) و BioEdit مونتاژ و ویراستاری شدند. توالی‌های ITS هر سویه با توالی‌های مربوط به سویه‌های شناخته‌شده در بانک ژن با استفاده از الگوریتم جستجوی BLASTn و تجزیه و تحلیل تبارزایی درستنمایی بیشینه با کمک نرم‌افزار MEGA 6 (22) مقایسه شدند.
اثر سویه‌های Trichoderma در جلوگیری از رشد عامل بیماری در کشت متقابل: نه سویة Trichoderma (شامل T. capillare Isf-7، T. harzianum Arak-12، T. harzianum Isf-B،T. harzianum Arak-6، T. koningiopsis Arak-96، T. pleuroticola Isf-15، T. virens Isf-77T، T. virens Ham-65 و T. virens Arak-14) از مجموعه قارچ‌های زندة گروه گیاه‌پزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز (SCUA: Collection of Fungal Cultures, Department of Plant Protection, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran) انتخاب شدند. یک دیسک نیم سانتیمتری از حاشیة درحال رشد پرگنه دو روزه هر سویة Trichoderma، در یک طرف تشتک پتری و دیسک‌هایی مشابه به قطر نیم سانتیمتر از حاشیة درحال رشد پرگنه قارچ‌های بیمارگر در مقابل آنها قرار داده و تا زمان نزدیک به پرکردن تشتکهای پتری، میزان رشد شعاعی بیمارگرها، تولید رنگدانه، اسپورزایی و میکوپارازیتیسم (پیچیدگی ریسهای اطراف ریسة بیمارگر) بررسی شد (16). میزان رشد در قالب طرح کاملاً تصادفی تجزیه و تحلیل شد و گروهبندی آماری با استفاده از آزمون توکی انجام گرفت. درصد بازدارندگی با فرمول شناختهشدة ذیل محاسبه شد:
درصد بازدارندگی رشد =
RGC: میزان رشد شعاعی در شاهد، RGT: میزان رشد شعاعی در تیمار
بررسی و مقایسة توان تولید سیدروفور در سویه‌های Trichoderma و سویه‌های بیمارگر: محیط حداقلی فاقد آهن حاوی سولفات منیزیم، کلرید کلسیم، سولفات آمونیوم و محلول پایه فلزی (مخلوط سولفات منگنز، سولفات روی و سولفات کبالت) با اسیدیتة 8/6 تهیه شد و سویه‌های Trichoderma(با نسبت 105 اسپور در هر میلی‌لیتر) و بیمارگر (چهار دیسک از حاشیة درحال رشد پرگنه) به آنها، مایه‌زنی و به مدت 15 روز در شیکر انکوباتور با دمای 28 درجة سانتیگراد قرار داده شدند. بعد از توقف رشد تودة میسیلیومی در محیط فوق، فاز مایع محیط با فیلتراسیون از کاغذ صافی و سانتریفوژکردن در دور g 3000 و دمای 4 درجة سانتیگراد جداسازی و جمع‌آوری شدند. سپس 5/0 میلی‌لیتر از عصارة کشت فوق مربوط به هر سویه در لوله‌های آزمایش 5/1 میلیلیتری ریخته شد و به آن 500 میکرولیتر از بافر Chrome Azurol S (CAS، شامل Chrome Azurol S، محلول FeCl3، هگزا دسیل تری متیل آمونیوم یا Hdtma و N2 مورفولین اتان سولفونیک اسید یا Mes Buffer) و 20 میکرولیتر محلول shuttle یا سولفوسالیسیلیک اسید، اضافه و پس از 10 دقیقه تغییر رنگ مشاهده شد. در آخر، از هر نمونه 5/0 میلی‌لیتر در کووت‌های اسپکتروفتومتر ریخته شد و میزان جذب نوری در 630 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر، اندازهگیری و طبق فرمول زیر میزان نسبی تولید سیدروفور توسط هر سویه محاسبه شد (23-24):
میزان نسبی تولید سیدروفو
O1: میزان جذب رفرنس، O2: میزان جذب نمونه
رفرنس شامل عصارة محیط مایهزنینشده، محلول CAS و محلول shuttle بود.
نتایج
بیست سویة قارچی پس از ضدعفونی سطحی و کشت به دست آمدند. این سویه‌ها ازنظر علائم، بیشتر روی ریشه و طوقه )پوسیدگی ریشه و طوقه( در آزمون بیماری‌زایی، ارزیابی و براساس آن، چهار سویه با ریختشناسی متفاوت و ایجادکنندة بیشترین علائم برای بررسیهای بیشتر انتخاب شدند.
اثبات بیماری‌زایی: در هر سه تکرار مربوط به چهار بیمارگر، علائم بیماری مشاهده شد. دو سویة Fusarium، علائم زردی، پژمردگی و پوسیدگی خشک طوقه و ریشه ایجاد کردند (شکل 1، A و B). در بیماری‌زایی سویة M. phaseolina SCUA-M-5P، علائم زردی و پژمردگی به همراه پوسیدگی زغالی طوقه مشاهده شدند (شکل 1، C). سویة R. Solani SCUA-Rh علائم زردی شاخ و برگ به همراه شانکر طوقه و ریشه ایجاد کردند (شکل 1، D). پس از ظهور علائم، نمونههای بیمارشده دوباره در فرایند جداسازی قرار گرفتند و پس از بررسی ریختشناسی سویه‌های به‌دست‌آمده، هر چهار گونه دوباره بازیابی شدند.
شناسایی بیمارگرهای انتخابی: این چهار جدایه براساس صفات ریختشناسی و تکثیر و تجزیه و تحلیل ناحیة ITS (شکلهای 2، 3، 4، 5 و 6)، گونه‌های Rhizoctonia solani (سویة SCUA-Rh، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715170)، Fusarium chlamydosporum(سویة SCUA-5P2، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715168)، F. falciforme (سویة SCUA-3p، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715167) و Macrophomina phaseolina(سویة SCUA-M-5P، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715169) بودند.
شکل 1- آزمون بیماری‌زایی بیمارگرهای مطالعه‌شده. A) پوسیدگی ریشه بعد از مایه‌زنی با سویةF. chlamydosporum SCUA-5p2، B) پوسیدگی ریشه ایجادشده با سویة F. falciforme SCUA-3P، C) پوسیدگی زغالی ناشی از سویة M. phaseolina SCUA-M-5P و D) شانکر طوقه ناشی از .R. solani SCUA-Rh
نتایج جستجوی BLASTn و تبارزایی: جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری ITS مشخص کرد سویة بیمارگر F. chlamydosporum SCUA-5p-2، 99 درصد تشابه نوکلئوتیدی با سویة شناختهشدة F. chlamydosporum CBS 635.76 دارد. در درخت تبارزایی درستنمایی بیشینه که براساس ناحیة ITS (شکل 2) ساخته شده است، سویة F. chlamydosporum SCUA-5p-2 با سویة شناخته‌شده از همین گونه (CBS 635.76) خوشهبندی شد و یک کلاد با ارزش بوتاستراپ 95 درصد ایجاد کرد. سویة بیمارگر F. falciforme SCUA-3p با سویه شناختهشدة F. falciforme CBS 475.67، 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی نشان داد. همچنین در درخت تبارزایی (شکل 2)، این سویه با سویه‌های شناخته‌شده از این گونه (CBS 635.76) و گونه‌های خویشاوند F. keratoplasticum و F. pseudensiforme خوشهبندی شدند و یک کلاد با ارزش بوتاستراپ 97 درصد ایجاد کردند. علاوه بر این، دو سویة R. solani SCUA-Rh و M. phaseolina SCUA-M-5P به‌ترتیب با سویه‌های شناختهشدة R. solani CBS 101782 و M. phaseolina EH2، 99 و 100 درصد تشابه نوکلئوتیدی نشان دادند. در درخت تبارزایی (شکل 2)، سویه‌های R. solani SCUA-Rh و M. phaseolina SCUA-M-5P با سویه‌های شناخته‌شده از گونة خود خوشهبندی شدند و به‌ترتیب کلادهایی به ارزش بوتاستراپ 100 و 91 درصد ایجاد کردند.
شکل 2- درخت تبارزایی بدون مقیاس گونه‌های بیمارگر که در تجزیه و تحلیل درستنمایی بیشینه براساس توالی ITS با استفاده از مدل Kimura two-parameter، توزیع جداگانة گاما و با فرض ثابت‌بودن سایتها(K2+G+I) به دست آمده است. اعداد اعتبارسنجی زیر 50 درصد نشان داده نشده و شاخصهای بوتاستراپ براساس 1000 بار نمونهگیری کاذب به دست آمده‌اند.
شکل 3- گونة Macrophomina phaseolina (سویة SCUA-M-5P): A)میکرواسکلروت و B) شکل پرگنه. رنگآمیزی اسلایدها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتنبلو انجام شده است.
شکل 4- گونة Rhizoctonia solani (سویة SCUA-Rh):A)شکل پرگنه و B-C) انشعابات ریسه. رنگآمیزی اسلایدها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتنبلو انجام شده است.
شکل 5- گونة Fusarium falciforme (سویة SCUA-3p): A-B) کنیدیومها، C) شکل پرگنه وD) کلامیدوسپورها. رنگآمیزی اسلایدها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتنبلو انجام شده است.
شکل 6- گونة Fusarium chlamydosporum(سویة SCUA-5P2): A-B)کنیدیوفورها و کنیدیومها. رنگآمیزی اسلایدها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتنبلو انجام شده است.
.مقایسة میزان تولید سیدروفور توسط سویه‌های Trichodermaو بیمارگرها در محیط کشت حداقلی: با افزودن معرف CAS و محلول shuttleیا سولفوسالیسیلیک اسید به عصارة محیط کشت، تغییر رنگ بعد از ده دقیقه مشاهده شد. این تغییر رنگ با توجه به میزان سیدروفور تولیدشدة سویه‌های Trichoderma و سویه‌های بیمارگر در محیط کشت متفاوت بود و از آبی به نارنجی و صورتی مشاهده می‌شد. در اینجا تغییر رنگ، بیشتر از آبی به صورتی به معنای تولید سیدروفور بیشتر و کلاته‌شده آهن موجود در محلول CAS است.
با اندازهگیری جذب نوری در طول موج 630 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر، میزان تولید سیدروفور توسط سویه‌های مختلف اندازهگیری شد. طبق مشاهدات انجام‌شده، با افزایش میزان سیدروفور تولیدی در محیط رشد مربوط به هر نمونه، آهن بیشتری با سیدروفور آن کلاته می‌شود؛ درنتیجه، میزان جذب نوری در طول موج 630 نانومتر و نیز عدد خوانده‌شده توسط دستگاه کمتر است. عدد جذب کمتر به معنای تولید بیشتر سیدروفور بود.
پس از اندازهگیری جذب نوری با اسپکتروفتومتر، درصد سیدروفور تولیدشدة سویه‌های بیمارگر و سویه‌های عامل کنترل بیولوژیک محاسبه شد (جدول 1). سنجش و ردیابی میزان سیدروفور تولیدشده نشان داد سویة T. pleuroticola Isf-15 بین سویه‌های Trichoderma و سویة Rhizoctonia solani SCUA-Rh بین بیمارگرهای مدنظر، سیدروفور بیشتری تولید کردند.
جدول 1- درصد سیدروفور تولیدشدة سویه‌های مدنظر در محیط کشت
|
درصد تولید سیدروفور |
میزان جذب نوری در 630 نانومتر |
تیمارها1 |
|
- |
0 |
محیط کشت |
|
- |
619/1 |
رفرنس: محیط + محلول CAS + محلول shuttle |
|
13/36 |
034/1 |
T. virens ISF-77 |
|
25/31 |
113/1 |
T. koningiopsis Arak-96 |
|
62/57 |
686/0 |
T. harzianum Arak-6 |
|
86/63 |
583/0 |
T. virens Arak-60 |
|
56/62 |
606/0 |
T. virens Ham-65 |
|
79/64 |
57/0 |
T. harzianum ISF-B |
|
43 |
92/0 |
T. capillare Isf-7 |
|
43/85 |
23/0 |
T. pleuroticola Isf-15 |
|
59 |
667/0 |
T. harzianum Arak- 12 |
|
37/47 |
852/0 |
|
|
71/50 |
798/0 |
M. phaseolina SCUA-M-5P |
|
48/64 |
575/0 |
R. solani SCUA-RH |
|
83/45 |
877/0 |
F. falciform SCUA-3P |
1هر تیمار شامل عصارة کشت قارچ + محلول CAS + محلول shuttle
.نتایج آزمون کشت متقابل نه سویه از پنج گونة Trichoderma علیه بیمارگرهای جداشده: سویه‌های Trichoderma، رشد قارچ‌های بیمارگر را محدود کردند (جدول 2). این سویه‌ها علاوه بر بازدارندگی رشد بیمارگر، روی پرگنة قارچ عامل بیماری نیز رشد کردند که این همپوشانی در سویه‌های T. harzianum Isf-B،T. capillare Isf-7 وT. pleuroticola ISF-15 همراه با تولید رنگدانه و اسپورزایی روی پرگنة قارچ عامل بیماری بود (شکل 7). همچنین، سویه‌های T. pleuroticola ISF-15 وT. Virens Ham-65 پیچیدگی ریسهای (میکوپارازیتیسم) در اطراف میسیلیوم‌های سویة R. solani SCUA-RH ایجاد کردند (شکل 7).مقایسة قدرت بازدارندگی سویه‌ها از رشد سه بیمارگر مدنظر، نشان داد تمامی سویه‌های Trichoderma در جلوگیری از رشد قارچ F. Chlamydosporumو M. phaseolinaنسبت به R. solani بهتر عمل می‌کنند.
.در آزمون کشت متقابل علیه قارچ R. Solani، سویه‌های T. harzianum Isf-B و T.capillare Isf-7 با 6/18 درصد بازدارندگی و سویه‌های T. harzianum Arak-12 وT. virens Isf-77 با 62/4 درصد بازدارندگی، بیشترین و کمترین تأثیر را بر جلوگیری از رشد قارچ R. solaniداشته‌اند. در بررسی اثر سویه‌ها بر جلوگیری از رشد قارچ M. phaseolina، سویه‌های T. harzianum Isf-B و T. pleuroticola Isf-15 با حدود 26 درصد بازدارندگی، بیشترین اثر را در جلوگیری از رشد بیمارگر داشتند و کمترین مقدار بازدارندگی مربوط به سویة T. koningiopsis Arak-96 بوده است. براساس محاسبة درصد بازدارندگی نیز بیشترین میزان جلوگیری از رشد قارچ F. chlamydosporum SCUA-5p2 مربوط به سویة T. virens Ham-65 و کمترین میزان بازدارندگی مربوط به سویة T. harzianum Arak-12 (8 درصد بازدارندگی) بوده است. سویة T. virens Ham-65 با تمامی سویه‌ها اختلاف معنی‌دار داشته و بیشترین اثر بازدارندگی را در محیط کشت بر این بیمارگرها اعمال کرده است.
جدول 2- درصد بازدارندگی رشد قارچ‌های بیمارگر در آزمون کشت متقابل تجزیه و تحلیل شده با یک طرح کاملاً تصادفی (آزمون توکی)
|
F. falciforme |
R. solani |
M. phaseolina |
F .chlamydosporum |
سویه‌ها |
|
29c |
13.8bc |
12.1b |
30b |
T. virensHam-65 |
|
21.3abc |
16.3bc |
13.5b |
13.3a |
T. harzianum Arak-6 |
|
22.6abc |
9ab |
17.7b |
18.7ab |
T. virens Arak-60 |
|
13a |
4.6a |
13.5b |
8a |
T. harzianum Arak-12 |
|
14.1ab |
9.3ab |
4.3a |
13.3a |
T. koningiopsis Arak-96 |
|
25.7bc |
18.6c |
25.5d |
22ab |
T. harzianum-Isf-B |
|
19.7abc |
18.6c |
21.3c |
14.7ab |
T. capillare Isf-7 |
|
27bc |
11.6bc |
25.5d |
22ab |
T. pleuroticola Isf-15 |
|
17.7ab |
4.6a |
13.5b |
18.7ab |
T. virens Isf-77 |
1 هر عدد، میانگین سه تکرار است. حروف غیرمشابه در هر ستون، اختلاف معنی‌دار آماری در سطح احتمال (P≤0.05) با آزمون توکی دارند.
جدول 3- تجزیه واریانس درصدهای بازدارندگی در آزمون کشت متقابل
|
تیمارها |
مجموع مربعات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
مقدار F |
معنی‌داری |
|
F.chlamydosporum |
00/960 |
00/8 |
00/120 |
40/4 |
000/0 |
|
M. phaseolinae |
03/115 |
00/8 |
25/144 |
96/26 |
000/0 |
|
R. solani |
92/697 |
00/8 |
24/87 |
66/9 |
000/0 |
شکل 7- آزمون کشت متقابل. A-B) پیچ‌خوردگی ریسهای T. virens Ham-65 و T. pleuroticola Isf-15 در اطراف ریسههای قارچ بیمارگر R. solani SCUA-RH، C) اسپورزایی و تولید رنگدانه سویة Isf-15 علیه بیمارگر F. falciform SCUA-3PوD) اسپورزایی سویة Arak-12 روی قارچ R. Solani. رنگآمیزی اسلایدها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتنبلو انجام شده است.
بحث
در این مطالعه، گونه‌های Fusarium chlamydosporum، F. falciforme، Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani، به‌عنوان بیمارگرهایی که باعث بیماری طوقه و ریشة لوبیاچشمبلبلی در استان خوزستان می‌شوند، براساس ریختشناسی و تجزیه و تحلیل ناحیة ITS شناسایی شدند. نقش این بیمارگرها در ایجاد بیماری در گیاهان مختلف ازجمله لوبیا در مطالعات قبلی تأیید شده است (1-2-3-4-5-6). در شناسایی قارچ‌ها بررسیهای ریختشناختی منجر به شناسایی دقیق نمیشوند؛ بنابراین لازم است ناحیههای ژنی نیز توالییابی و در تجزیه و تحلیل تبارزایی و جستجوی بلاست استفاده شوند (25). ناحیة تغییرپذیر ITS از ژن ریبوزومی (nrDNA)، به‌عنوان نشانگر، در کنار تعدادی از ژنهای کدکنندة پروتئین ازجمله بتاتوبولین ((tub2، فاکتور تداوم ترجمة 1-آلفا (tef1-α)، دومین زیرواحد بزرگ RNA پلیمراز II (rpb2)، اکتین (ACT)، کالمودولین (Cmd)، gapdh و هیستون H3 (HIS) در شناسایی قارچ‌ها استفاده می‌شود. این ژنها به‌صورت تکناحیهای (single-locus) و چندناحیهای (multi-locus) در تجزیه و تحلیل تبارزایی آرایههای مختلف قارچی استفاده شده و به جداسازی تبارزایی و شناسایی دقیق بسیاری از آرایههای قارچی کمک کرده‌اند (15-20-26-27-28-29-30-31-32-33-34-35-36).
اندازهگیری میزان سیدروفور نشان داد سویه‌های Trichoderma و بیمارگرها می‌توانند در محیط فاقد آهن، سیدروفور درخور توجهی تولید کنند. سیدروفورها کلاتهکنندههای با وزن مولکولی پایین‌اند که بیشتر میکروارگانیسمها ازجمله Trichoderma در شرایط کمبود آهن، آنها را ترشح و آهن محیط را برای خود قابل دسترس و برای سایر موجودات خارج از دسترس می‌کنند (37-38). گونه‌های Trichodermaدر مقایسه با قارچ‌های دیگر مقدار بیشتری سیدروفور در شرایط کمبود آهن، تولید و با بیمارگر گیاهی برای به دست آوردن آهن رقابت می‌کنند (37-38). طبق مطالعات انجام‌شده، حضور و نقش سیدروفورها در قارچ‌های بیمارگر در جوانه‌زنی میسیلیوم و اسپور قارچ (13)، ذخیرة آهن در کنیدیوم و جوانه‌زنی آن (37) و حمل‌ونقل آن در میتوکندری قارچ‌ها به اثبات رسیده است (14). تحقیقات قبلی (39) نشان می‌دهند توان بیماری‌زایی بعضی بیمارگرها با تولید بیومولکولهای اختصاصی همچون سیدروفورها تغییر می‌کند؛ برای مثال، فنیلاستیکاسید در بیماری‌زایی قارچ R. solanنقش دارد و نشان داده شده است که در سویه‌های تولیدکنندة میزان بیشتر فنیلاستیکاسید، درصد مرگ گیاهچة گوجهفرنگی افزایش مییابد (40).
در آزمون کشت متقابل، هشت سویه با رشد سریع پرگنه نسبت به رشد پرگنة قارچ بیمارگر باعث بازدارندگی رشد بیمارگرها شدند. در مطالعات گذشته، تأثیرات بازدارندگی سویههایی از گونه‌های مختلف Trichoderma روی رشد بیمارگرهای گیاهی ثابت شده‌اند؛ ازجمله بازدارندگی گونه‌های T. brevicompactum، T. koningii، T. koningiopsis، T. viridecensو T. virensروی بیمارگر Gaeumannomyces graminis var tritici(16)،گونه‌هایT. gamsii، T. hamatum و T. harzianum روی بیمارگر F. oxysporum f. sp. cepae(41) و گونة T. harzianum روی بیمارگرهای Alternaria solani، Pythium ultimumوR. solani(42). در این مطالعه همانند تحقیقات قبلی (14-16-41 )، برخی از سویه‌های Trichoderma علاوه بر بازدارندگی از رشد بیمارگر، پیچ‌خوردگی ریسهای اطراف ریسة بیمارگر و تولید رنگدانة زیاد در محیط را نشان داده‌اند. در مطالعات گذشته، با قراردادن Phoma betae، Rosellinia necatrix و Botrytis cinereaدر مقابل چند سویة Trichoderma به این نتیجه رسیدند که اسپورزایی و قدرت تهاجمی سویه‌های Trichoderma در آزمون کشت متقابل، به نوع قارچ عامل بیماری و ترکیب محیط کشت بستگی دارد (43). پارازیته‌کردن قارچ عامل بیماری توسط سویه‌های Trichoderma و تولید آنزیم تجزیه‌کنندة دیواره سلولی مانند گلوکوناز در مراحل پارازیتیسم به اثبات رسیده‌اند و در بیشتر مقالات کنترل بیولوژیک به آنها اشاره شده است (37-44-45).
قارچ Trichoderma از ﻣﮑﺎﻧﯿﺴﻢﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻔﯽ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﮐﺎﻫﺶ ﻣﻘﺎوﻣﺖ و واﮐﻨﺶﻫﺎی دﻓﺎﻋﯽ ﮔﯿﺎه، مقابلة ﻣﺴﺘﻘﯿﻢ ازﻃﺮﯾﻖ ﻣﺎﯾﮑﻮﭘﺎرازﯾﺘﯿﺴﻢ، آﻧﺘﯽﺑﯿﻮز و رﻗﺎﺑﺖ ﺑﺮای ﻣﻘﺎﺑﻠﻪ ﺑﺎ ﺑﯿﻤﺎرﮔﺮﻫﺎی ﮔﯿﺎه استفاده می‌کند (46). گونة T. lingnorum در محیط کشت ﻣﻮادی ﺗﺮﺷﺢ می‌کند ﮐﻪ ﺑﺮای R. solani ﻣﺮگ‌آور است (8). گونة T. viride از ﮔﺴﺘﺮش ﺷﻌﺎﻋﯽ پرگنة F. moniliforme ﻣﻤﺎﻧﻌﺖ می‌کند و ﮔﺴﺘﺮش ﺷﻌﺎﻋﯽ گونة ﺑﯿﻤﺎری‌زا را کاهش می‌دهد (47).
)