نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

2 دانشیار گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران؛ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

3 استاد گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران

چکیده

مقدمه: این تحقیق برای جداسازی و شناسایی بیمارگرهای طوقه و ریشة لوبیا چشم‏بلبلی در استان خوزستان انجام شد. علاوه بر این، اثرات ضد‏قارچی نه سویة انتخاب‏شده از پنج گونة Trichoderma روی چهار بیمارگر طوقه و ریشة لوبیا چشم‏بلبلی بررسی شدند.
مواد و روش‏‏ها: از بیست سویة به‌دست‏آمده، چهار سویه برای مطالعة بیشتر، شامل آزمون بیماریزایی و سنجش سیدروفور انتخاب شدند. میزان نسبی تولید سیدروفور توسط نه سویة انتخاب‌شده از پنج گونة Trichoderma و بیمارگرها با استفاده از روش CAS سنجش شد. رشد شعاعی پرگنه‏های بیمارگر در مقابل سویه‏های Trichoderma در قالب یک طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار بررسی شد. ناحیة ITSسویه‏های بیمارگر تکثیر و توالی‏یابی شدند. توالی‏های به‌دست‏آمده با سویه‏های شناخته‏شده با استفاده از جستجوی بلاست و تجزیه و تحلیل تبارزایی با الگوریتم درست‏نمایی بیشینه (ML) مقایسه شدند.
نتایج: بیمارگرهای ذیل شناسایی شدند: Rhizoctonia solani، Fusarium chlamydosporum، F. falciforme و Macrophomina phaseolina. تمام سویه‏های Trichoderma و بیمارگرها در محیط کشت با فقر آهن، سیدروفور تولید کردند. سویه‏های T. koningiopsis SCUA-Arak-96 و T. pleuroticola SCUA-Isf-15 به‌ترتیب حداقل (31 درصد) و حداکثر (85 درصد) تولید سیدروفور را داشتند. در آزمون کشت دوگانه، بیشتر سویه‏های Trichoderma رشد قارچ‏های بیمارگر را در سطح معنی‏داری کاهش دادند. بیشترین اثر ضد‏قارچی برای سویة‏ T. virens SCUA-Ham-65 با 30 و 29 درصد بازدارندگی روی بیمارگرهای F. chlamydosporum  و F. falciforme مشاهده شد.
بحث و نتیجه‏گیری: R. solani،F. chlamydosporum،F. falciforme وM. phaseolinaمهم‏ترین بیمارگرهای ایجاد‏کنندة پوسیدگی طوقه و ریشة لوبیا چشم‏بلبلی در استان خوزستان‌اند. سویه‏های Trichoderma سیدروفور تولید کردند که باعث کلاته‏شدن آهن حد‏اقلی محیط می‏شود. علاوه بر این، آنها رشد بیمارگرهای گیاهی را در محیط آزمایش کاهش می‏دهند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

A Study of the Antifungal Effects of Trichoderm Strains on Four Root and Crown Pathogens of Cowpea

نویسندگان [English]

  • Sadigheh Khodadadi 1
  • Mehdi Mehrabi-Koushki 2
  • Reza Farokhinejad 3

1 Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran

2 Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran; Biotechnology and Bioscience Research Center, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran

3 Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran

چکیده [English]

Introduction: This research was conducted with the aim of isolating and identifying cowpea root and crown pathogens in Khuzestan province. In addition, the antifungal effectiveness of nine selected strains of five Trichoderma species was surveyed on four root and crown pathogens of cowpea.
Materials and Methods: Out of twenty strainsobtained, four of them were selected for further investigation including pathogenicity test and siderophore assay. The relative amount of the siderophore produced by nine selected strains from five Trichoderma speciesand pathogens was assayed by the chrome Azurol S method (CAS). The radial growth of the pathogen’s colonies in front of the Trichodermastrains was analyzed using a completely randomized design, with three replicates. The pathogenic strains of ITS region were amplified and sequenced. The obtained sequences were compared with the reference strains using BLASTn search and the maximum likelihood (ML) phylogenetic analysis.
Results: In the present study, the following pathogens were identified: Rhizoctonia solani, Fusarium chlamydosporum, F. falciforme, and Macrophomina phaseolina. In CAS assay, all of the Trichoderma strains and pathogens produced the siderophore into growth media under iron starvation.Strains of T. koningiopsis SCUA-Arak-96 and T. pleuroticola SCUA-Isf-15 produced the minimum and maximum siderophore with 31% and 85%, respectively. In the dual culture test, most Trichoderma strains significantly reduced the growth of pathogenic fungi. The most antifungal effect was observed in T. virens SCUA-Ham-65 strain on F. chlamydosporum and F. falciforme pathogens, with 30% and 29% growth inhibitory, respectively.
Discussion and conclusion: The results of the present study showed thatR. solani, F. chlamydosporum, F. falciforme, and M. phaseolina were the most important pathogens of the cowpea causing root and crown rot in Khuzestan province. Trichoderma strains produced the siderophore which chelates minimal iron of environment. In addition, they inhibit the growth of the plant pathogens in vitro.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cowpea
  • root and crown rot
  • Siderophore
  • Trichoderma

مقدمه

لوبیا از مهم‏ترین گونه‌های خانوادة لگومینه و اصلی‏ترین محصول حبوبات در دنیاست و در ایران به‌طور متوسط حدود 680 هزار هکتار از اراضی در هر سال زراعی به حبوبات اختصاص داده می‌شوند (1). ازجمله بیماری‌های قارچی لوبیا چشم‌بلبلی، به پوسیدگی طوقه و ریشه ناشی از قارچ‌های Rhizoctonia solani، Macrophomina phaseolinaو گونه‌های Fusarium می‌توان اشاره کرد (2). بیمارگر M. phaseolina بیشتر به ریشة گیاه میزبان حمله می‌کند و موجب ایجاد لکه‌های بافت‌مرده و پوسیدگی زغالی روی آن می‌شود (3). ایجاد بیماری پوسیدگی زغالی، به مرحلة رشدی و شرایط محیطی بستگی دارد؛ در آب‌وهوای گرم‌وخشک دیده می‌شود و شوری خاک می‌تواند آن را افزایش دهد (4). گیاهانی که مورد حملة گونه‌های Fusarium قرار می‌گیرند، علائم پژمردگی نظیر رنگ‌پریدگی برگ‌ها و کاسبرگ، زردشدن و افتادن برگ‌ها و تغییر رنگ آوند چوبی را نشان می‌دهند و درنهایت، بخش‌های هوایی از بین خواهند رفت (5). ﭘﻮﺳﯿﺪﮔﯽ رﯾﺰوﮐﺘﻮﻧﯿﺎﯾﯽ ریشة لوبیا از ﻣﻬﻢﺗﺮﯾﻦ ﺑﯿﻤﺎریﻫﺎی رﯾﺸﻪ و ﻫﯿﭙﻮﮐﻮﺗﯿﻞ ﻟﻮﺑﯿﺎ اﺳﺖ (6). میزان خسارت واردشده توسط این قارچ بین مزارع یک منطقه و نیز در محصول لوبیا در سال‌های متفاوت متغیر است و دلیل آن تأثیر شرایط آب‌وهوایی و خاک از زمان کشت تا برداشت است (7).

ﺑﺎ توجه به خطرات زﯾﺴﺖﻣﺤﯿﻄﯽ ﮐﺎرﺑﺮد ﺳﻤﻮم ﺷﯿﻤﯿﺎﯾﯽ، روشﻫﺎیی مانند اﺳـﺘﻔﺎده از ﻋﻮاﻣﻞ کنترل بیولوژیک برای کنترل بیماری‌های گیاهی اﻫﻤﯿﺖ زیادی می‌یابند؛ ازﺟﻤﻠﻪ ﻋﻮاﻣﻞ کنترل بیولوژیک ﺑﺮای مدیریت ﺑﯿﻤﺎری‌های ﭘﻮﺳﯿﺪﮔﯽ طوقه و ریشة ﻟﻮﺑﯿﺎ، ﮔﻮﻧﻪﻫﺎی Trichodermaهستند. گونه‌های Trichoderma، برخی بیماری‌های خاک‌زاد را ازطریق مکانیسم‏های مختلف همچون میکوپارازیتیسم کنترل می‌کنند (8). در بررسی واکنش‌های بین T. harzianumبا Rhizoctoniaو گونه‌های Pythium ، رشد مستقیم میکوپارازیت به طرف میزبان و پیچ‌خوردگی ریسه‏ای اطراف ریسه‌ها مشاهده شده است (9). سیدروفورها یک گروه ناهمگن شیمیایی از متابولیت‌های ثانویه‌اند که با محدودکردن عناصر غذایی مصرفی عوامل بیماری‌زا (همچون آهن)، علیه میکروارگانیسم‌های دیگر به کار گرفته می‌شوند (10). اهمیت تولید سیدروفور به‌عنوان مکانیسم کنترل بیولوژیک، برای نخستین‌بار با استفاده از چندین سویة Pseudomonas fluorescensعلیه بیمارگر باکتریایی Erwinia carotovoraمشخص شد (11). قارچ‌هایی مانند Trichodermaو باکتری‌های تولیدکنندة سیدروفور، قدرت رقابت بیشتری برای جذب آهن دارند و سیدروفور بیشتری تولید می‌کنند؛ بنابراین می‌توانند در شرایط کمبود آهن، آن را از دسترس بیمارگر‌ها خارج کنند و باعث سرکوب بیمارگر شوند (12). حضور و نقش سیدروفورها در قارچ‌های بیمارگر در جوانه‌زنی میسیلیوم و اسپور قارچ (13)، ذخیرة آهن در کنیدیوم و جوانه‌زنی آن (12) و حمل‌ونقل آن در میتوکندری قارچ‌ها به اثبات رسیده است (14).

در این تحقیق، بیمارگر‏های قارچی طوقه و ریشة لوبیا از مناطق مهم کشت لوبیا در استان خوزستان، جداسازی و براساس روش‏های ریخت‏شناسی و مولکولی شناسایی شدند. سپس، اثر ضد‏قارچی چند سویة انتخابی Trichoderma روی آنها در محیط آزمایشگاه بررسی شد. همچنین ردیابی و سنجش میزان تولید سیدروفورها در سویه‏های انتخابی بیمارگر و سویه‏های Trichoderma انجام شد.

مواد و روش‌ها

ﺟﺪاﺳﺎزیﺑﯿﻤﺎرﮔﺮها: در بازدید انجام‌شده در مهرماه سال 1395 از مزارع لوبیاکاری شهرستان‌های شوش و اندیمشک در استان خوزستان، ده گیاه لوبیا چشم‌بلبلی با علائم پوسیدگی طوقه و ریشه، جمع‏آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. برای جداسازی بیمارگرها، قطعاتی به اندازة 5/0 سانتی­متر از حاشیة بین بافت آلوده و سالم، تهیه و بعد از ضد‏عفونی سطحی با استفاده از هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت دو دقیقه و سه بار شستشو با آب مقطر استریل، روی محیط غذایی سیب­زمینی - دکستروز - آگار (PDA) قرار داده شدند (15). پنج تا ده روز پس از نگهداری تشتک‏های پتری در انکوباتور در دمای 28 درجة سانتی­گراد و تاریکی مطلق، پرگنه‌های ظاهرشدة قارچی روی محیط کشت به محیط تازة PDA منتقل شدند. این جدایه‏ها به روش تک‏اسپورکردن (Fusarium) و نوک‏‏ریسه (Rhizoctonia و Macrophomina) خالص‏سازی شدند.

اثبات بیماریزایی: برای انتخاب یک سویه با توانایی ایجاد بیماری از هر گونة شناسایی‌شده، اثبات بیماری‌زایی انجام شد. برای تهیة مایه سویه‏های قارچی، پس از سترون‌کردن مخلوط آرد ذرت، ماسه و دانه‌های ارزن، دیسک‌هایی از کشت درحال رشد به آنها، اضافه و به مدت 15 روز در دمای 28 درجة سانتی­گراد و تناوب نوری (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) نگهداری شدند (16). پس از سترون‌کردن مخلوط خاک، ماسه و خاک برگ (با نسبت مساوی)، حدود نیمی از عمق گلدان‌ها با آن پر شد. گلدان‌ها در عمق بعدی با مخلوط خاک استفاده‌شده و مایه سویه‏های قارچی به میزان دو درصد وزنی پر شدند. سپس در یک سانتی‏متر عمق بعدی، مخلوط خاک سترون اضافه شد و چهار بذر ضدعفونی سطحی‌شده روی آن قرار گرفتند. یک سانتی­متر بعدی روی بذور با خاک مخلوط سترون پوشش داده شد و پس از آبیاری، گلدان‌ها در شرایط رطوبت نسبی 50 درصد، دمای 28 درجة سانتی­گراد و تناوب نوری 12 ساعته درون ژرمیناتور قرار گرفتند. ارزیابی ایجاد علائم بیماری و انتخاب سویه‏ها در 30-15 روز بعد انجام شد (17-18). پس از ظهور علائم، نمونه‏های بیمارشده دوباره در فرایند جداسازی قرار گرفتند و جدایه‏های به‌دست‏آمده ازنظر ریخت‏شناسی با قارچ‏های مایه‏زنی‌شده مقایسه شدند.

شناسایی ریخت‏شناسی و مولکولی بیمارگرهای انتخاب‌شده: ریخت‏شناسی این سویه‏ها با بررسی ساختار‏های رویشی و تولید‏مثلی و مقایسة آن با توصیف سویه‏های تایپ انجام شد. پس از رشد میسلیوم‌های قارچی سویه‏های‌ بیمارگر انتخاب‏شده در مرحلة اثبات بیماری‌زایی در محیط مایع، جمع‌آوری تودة میسیلیومی با پمپ خلأ انجام شد و استخراج DNA آنها با روش ریدر و برودا (19) با اندکی تغییر صورت گرفت (20). واکنش زنجیره‏ای پلیمراز مربوط به سویه‌‏های انتخاب‌شده با جفت آغازگر عمومی NL4 و ITS1 برای تکثیر نواحی ITS و بخش‌هایی از اسیدریبونوکلئیک ریبوزومی S28 انجام شد (21). قطعات تکثیری نواحی ژنی مربوط به سویه‏های انتخابی با روش استخراج DNA از ژل با استفاده از کیت تجاری Vivantis GF-1 Gel DNA Recavery Kit (مالزی) و منطبق با دستورالعمل ارائه‏شده خالص‏سازی و توسط شرکت نرگس (اهواز) با استفاده از آغازگرهای پیشرو و معکوس توالی‏‏یابی شدند. توالی‌های پیشرو و معکوس با نرم‌افزار  DNA Baser Sequence Assembler v.4(HeracleBioSoft, http://www.dnabaser com) و BioEdit مونتاژ و ویراستاری شدند. توالی‏های ITS  هر سویه با توالی‏های مربوط به سویه‏های شناخته‌شده در بانک ژن با استفاده از الگوریتم جستجوی BLASTn و تجزیه و تحلیل تبارزایی درست‏نمایی بیشینه با کمک نرم‏افزار MEGA 6 (22) مقایسه شدند.

اثر سویه‌های Trichoderma در جلوگیری از رشد عامل بیماری در کشت متقابل: نه سویة Trichoderma (شامل T. capillare Isf-7، T. harzianum Arak-12، T. harzianum Isf-B،T. harzianum Arak-6، T. koningiopsis Arak-96، T. pleuroticola Isf-15، T. virens Isf-77T، T. virens Ham-65 و T. virens Arak-14) از مجموعه قارچ‌های زندة گروه گیاهپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز (SCUA: Collection of Fungal Cultures, Department of Plant Protection, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran) انتخاب شدند. یک دیسک نیم سانتی­متری از حاشیة درحال رشد پرگنه دو روزه هر سویة Trichoderma، در یک طرف تشتک‌ پتری‌ و دیسک‌هایی مشابه به قطر نیم سانتی­متر از حاشیة درحال رشد پرگنه قارچ‌های بیمارگر در مقابل آنها قرار داده و تا زمان نزدیک به پرکردن تشتک‏های پتری، میزان رشد شعاعی بیمارگرها، تولید رنگدانه، اسپورزایی و میکوپارازیتیسم (پیچیدگی ریسه‏ای اطراف ریسة بیمارگر) بررسی شد (16). میزان رشد در قالب طرح کاملاً تصادفی تجزیه و تحلیل شد و گروه‏بندی آماری با استفاده از آزمون توکی انجام گرفت. درصد بازدارندگی با فرمول شناخته‏شدة ذیل محاسبه شد:

درصد بازدارندگی رشد =

RGC: میزان رشد شعاعی در شاهد، RGT: میزان رشد شعاعی در تیمار

بررسی و مقایسة توان تولید سیدروفور در سویه‌های Trichoderma و سویه‌های بیمارگر: محیط حداقلی فاقد آهن حاوی سولفات منیزیم، کلرید کلسیم، سولفات آمونیوم و محلول پایه فلزی (مخلوط سولفات منگنز، سولفات روی و سولفات کبالت) با اسیدیتة 8/6 تهیه شد و سویه‏های Trichoderma(با نسبت 105 اسپور در هر میلی‌لیتر) و بیمارگر (چهار دیسک از حاشیة درحال رشد پرگنه) به آنها، مایه‏زنی و به مدت 15 روز در شیکر انکوباتور با دمای 28 درجة سانتیگراد قرار داده شدند. بعد از توقف رشد تودة میسیلیومی در محیط فوق، فاز مایع محیط با فیلتراسیون از کاغذ صافی و سانتریفوژکردن در دور g 3000 و دمای 4 درجة سانتی­گراد جداسازی و جمع‏آوری شدند. سپس 5/0 میلی‌لیتر از عصارة کشت فوق مربوط به هر سویه در لوله‌های آزمایش 5/1 میلی‏لیتری ریخته شد و به آن 500 میکرولیتر از بافر Chrome Azurol S (CAS، شامل Chrome Azurol S، محلول FeCl3، هگزا دسیل تری متیل آمونیوم یا Hdtma و N2 مورفولین اتان سولفونیک اسید یا Mes Buffer) و 20 میکرولیتر محلول shuttle  یا سولفوسالیسیلیک اسید، اضافه و پس از 10 دقیقه تغییر رنگ مشاهده شد. در آخر، از هر نمونه 5/0 میلی‌لیتر در کووت‌های اسپکتروفتومتر ریخته شد و میزان جذب نوری در 630 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر، اندازه­گیری و طبق فرمول زیر میزان نسبی تولید سیدروفور توسط هر سویه محاسبه شد (23-24):

میزان نسبی تولید سیدروفو

O1: میزان جذب رفرنس، O2: میزان جذب نمونه

رفرنس شامل عصارة محیط مایه‏زنی‌نشده، محلول CAS و محلول shuttle  بود.

 

نتایج

بیست سویة قارچی پس از ضدعفونی سطحی و کشت به دست آمدند. این سویه‌ها ازنظر علائم، بیشتر روی ریشه و طوقه )پوسیدگی ریشه و طوقه( در آزمون بیماری‌زایی، ارزیابی و براساس آن، چهار سویه با ریخت‌شناسی متفاوت و ایجاد‏کنندة بیشترین علائم برای بررسی‏های بیشتر انتخاب شدند.

اثبات بیماری‌زایی: در هر سه تکرار مربوط به چهار بیمارگر، علائم بیماری مشاهده شد. دو سویة Fusarium، علائم زردی، پژمردگی و پوسیدگی خشک طوقه و ریشه ایجاد کردند (شکل 1، A و B). در بیماری‌زایی سویة M. phaseolina SCUA-M-5P، علائم زردی و پژمردگی به همراه پوسیدگی زغالی طوقه مشاهده شدند (شکل 1، C). سویة R. Solani SCUA-Rh علائم زردی شاخ و برگ به همراه شانکر طوقه و ریشه ایجاد کردند (شکل 1، D). پس از ظهور علائم، نمونه‏های بیمار‏شده دوباره در فرایند جداسازی قرار گرفتند و پس از بررسی ریخت‏شناسی سویه‏های به‌دست‌آمده، هر چهار گونه دوباره بازیابی شدند.

شناسایی بیمارگرهای انتخابی: این چهار جدایه براساس صفات ریخت­شناسی و تکثیر و تجزیه و تحلیل ناحیة ITS (شکل‏های 2، 3، 4، 5 و 6)، گونه‏های Rhizoctonia solani (سویة SCUA-Rh، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715170)، Fusarium chlamydosporum(سویة SCUA-5P2، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715168)، F. falciforme (سویة SCUA-3p، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715167) و Macrophomina phaseolina(سویة SCUA-M-5P، شمارة دسترسی در بانک ژن: MH715169) بودند. 

شکل 1- آزمون بیماری‌زایی بیمارگرهای مطالعه‌شده. A) پوسیدگی ریشه بعد از مایه‌زنی با سویةF. chlamydosporum SCUA-5p2، B) پوسیدگی ریشه ایجادشده با سویة F. falciforme SCUA-3P، C) پوسیدگی زغالی ناشی از سویة M. phaseolina SCUA-M-5P و D) شانکر طوقه ناشی از .R. solani SCUA-Rh

نتایج جستجوی BLASTn و تبارزایی: جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری ITS مشخص کرد سویة ‌بیمارگر F. chlamydosporum SCUA-5p-2، 99 درصد تشابه نوکلئوتیدی با سویة شناخته‏شدة F. chlamydosporum CBS 635.76 دارد. در درخت تبارزایی درست‏نمایی بیشینه که براساس ناحیة ITS (شکل 2) ساخته شده است، سویة F. chlamydosporum SCUA-5p-2 با سویة شناخته‌شده از همین گونه (CBS 635.76) خوشه‏بندی شد و یک کلاد با ارزش بوت‏استراپ 95 درصد ایجاد کرد. سویة بیمارگر F. falciforme SCUA-3p با سویه شناخته‏شدة F. falciforme CBS 475.67، 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی نشان داد. همچنین در درخت تبارزایی (شکل 2)، این سویه‏ با سویه‏های شناخته‌شده از این گونه (CBS 635.76) و گونه‏های خویشاوند F. keratoplasticum و F. pseudensiforme خوشه‏بندی شدند و یک کلاد با ارزش بوت‏استراپ 97 درصد ایجاد کردند. علاوه بر این، دو سویة R. solani SCUA-Rh و M. phaseolina SCUA-M-5P به‌ترتیب با سویه‏های شناخته‏شدة R. solani CBS 101782 و M. phaseolina EH2، 99 و 100 درصد تشابه نوکلئوتیدی نشان دادند. در درخت تبارزایی (شکل 2)، سویه‏های R. solani SCUA-Rh و M. phaseolina SCUA-M-5P با سویه‏های شناخته‏شده از گونة خود خوشه‏بندی شدند و به‌ترتیب کلادهایی به ارزش بوت‏استراپ 100 و 91 درصد ایجاد کردند.

 

شکل 2- درخت تبارزایی بدون مقیاس گونه‏های بیمارگر که در تجزیه و تحلیل درست‏نمایی بیشینه براساس توالی ITS با استفاده از مدل Kimura two-parameter، توزیع جداگانة گاما و با فرض ثابت‌بودن سایت‏ها(K2+G+I) به دست آمده است. اعداد اعتبار‏سنجی زیر 50 درصد نشان داده نشده و شاخص‏های بوت‏استراپ براساس 1000 بار نمونه‏گیری کاذب به دست آمده‌اند.

 

 

شکل 3- گونة Macrophomina phaseolina  (سویة SCUA-M-5P): A)میکرواسکلروت و B) شکل پرگنه. رنگ‏آمیزی اسلاید‏ها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتن‏بلو انجام شده است.

 

 

شکل 4- گونة Rhizoctonia solani  (سویة‏ SCUA-Rh):A)شکل پرگنه و B-C) انشعابات ریسه. رنگ‏آمیزی اسلاید‏ها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتن‏بلو انجام شده است.

 

شکل 5- گونة Fusarium falciforme (سویة SCUA-3p): A-B) کنیدیوم‏ها، C) شکل پرگنه وD) کلامیدوسپورها. رنگ‏آمیزی اسلاید‏ها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتن‏بلو انجام شده است.

  

شکل 6- گونة Fusarium chlamydosporum(سویة SCUA-5P2): A-B)کنیدیوفورها و کنیدیوم‏ها. رنگ‏آمیزی اسلاید‏ها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتن‏بلو انجام شده است.

 

.مقایسة میزان تولید سیدروفور توسط سویه‏های Trichodermaو بیمارگرها در محیط کشت حداقلی: با افزودن معرف CAS و محلول shuttleیا سولفوسالیسیلیک اسید به عصارة محیط کشت، تغییر رنگ بعد از ده دقیقه مشاهده شد. این تغییر رنگ با توجه به میزان سیدروفور تولیدشدة سویه‌های Trichoderma و سویه‌های بیمارگر در محیط کشت متفاوت بود و از آبی به نارنجی و صورتی مشاهده می‌شد. در اینجا تغییر رنگ، بیشتر از آبی به صورتی به معنای تولید سیدروفور بیشتر و کلاته‌شده آهن موجود در محلول CAS است.

با اندازه‌گیری جذب نوری در طول موج 630 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر، میزان تولید سیدروفور توسط سویه‏های مختلف اندازه­گیری شد. طبق مشاهدات انجام‌شده، با افزایش میزان سیدروفور تولیدی در محیط رشد مربوط به هر نمونه، آهن بیشتری با سیدروفور آن کلاته می‌شود؛ درنتیجه، میزان جذب نوری در طول موج 630 نانومتر و نیز عدد خوانده‌شده توسط دستگاه کمتر است. عدد جذب کمتر به معنای تولید بیشتر سیدروفور بود.

پس از اندازه‌گیری جذب نوری با اسپکتروفتومتر، درصد سیدروفور تولیدشدة سویه‌های بیمارگر و سویه‏های عامل کنترل بیولوژیک محاسبه شد (جدول 1). سنجش و ردیابی میزان سیدروفور تولیدشده نشان داد سویة T. pleuroticola Isf-15 بین سویه‏های Trichoderma و سویة Rhizoctonia solani SCUA-Rh بین بیمارگرهای مدنظر، سیدروفور بیشتری تولید کردند.

 

جدول 1- درصد سیدروفور تولیدشدة سویه‏های مدنظر در محیط کشت

درصد تولید سیدروفور

میزان جذب نوری در 630 نانومتر

تیمارها1

-

0

محیط کشت

-

619/1

رفرنس: محیط + محلول CAS + محلول shuttle

13/36

034/1

T. virens ISF-77

25/31

113/1

T. koningiopsis Arak-96

62/57

686/0

T. harzianum Arak-6

86/63

583/0

T. virens Arak-60

56/62

606/0

T. virens Ham-65

79/64

57/0

T. harzianum ISF-B

43

92/0

T. capillare Isf-7

43/85

23/0

T. pleuroticola Isf-15

59

667/0

T. harzianum Arak- 12

37/47

852/0

F. chlamydosporum SCUA-5p

71/50

798/0

M. phaseolina SCUA-M-5P

48/64

575/0

R. solani SCUA-RH

83/45

877/0

F. falciform SCUA-3P

1هر تیمار شامل عصارة کشت قارچ + محلول CAS + محلول shuttle

 


.نتایج آزمون کشت متقابل نه سویه از پنج گونة Trichoderma علیه بیمارگرهای جداشده: سویه‏های Trichoderma، رشد قارچ‌های بیمارگر را محدود کردند (جدول 2). این سویه‏ها علاوه بر بازدارندگی رشد بیمارگر، روی پرگنة قارچ عامل بیماری نیز رشد کردند که این همپوشانی در سویه‌های T. harzianum Isf-B،T. capillare Isf-7  وT. pleuroticola ISF-15 همراه با تولید رنگدانه و اسپورزایی روی پرگنة قارچ عامل بیماری بود (شکل 7). همچنین، سویه‌های T. pleuroticola ISF-15 وT. Virens Ham-65 پیچیدگی ریسه‏ای (میکوپارازیتیسم) در اطراف میسیلیوم‌های سویة R. solani SCUA-RH ایجاد کردند (شکل 7).مقایسة قدرت بازدارندگی سویه‌ها از رشد سه بیمارگر مدنظر، نشان داد تمامی سویه‌های Trichoderma در جلوگیری از رشد قارچ F. Chlamydosporumو M. phaseolinaنسبت به R. solani بهتر عمل می‏کنند.

.در آزمون کشت متقابل علیه قارچ R. Solani، سویه‌های T. harzianum Isf-B و T.capillare Isf-7 با 6/18 درصد بازدارندگی و سویه‌های T. harzianum Arak-12 وT. virens Isf-77  با 62/4 درصد بازدارندگی، بیشترین و کمترین تأثیر را بر جلوگیری از رشد قارچ R. solaniداشته‌اند. در بررسی اثر سویه‌ها بر جلوگیری از رشد قارچ M. phaseolina، سویه‌های T. harzianum Isf-B و T. pleuroticola Isf-15 با حدود 26 درصد بازدارندگی، بیشترین اثر را در جلوگیری از رشد بیمارگر داشتند و کمترین مقدار بازدارندگی مربوط به سویة T. koningiopsis Arak-96 بوده است. براساس محاسبة درصد بازدارندگی نیز بیشترین میزان جلوگیری از رشد قارچ F. chlamydosporum SCUA-5p2 مربوط به سویة T. virens Ham-65 و کمترین میزان بازدارندگی مربوط به سویة T. harzianum Arak-12 (8 درصد بازدارندگی) بوده است. سویة T. virens Ham-65 با تمامی سویه‌ها اختلاف معنی‌دار داشته و بیشترین اثر بازدارندگی را در محیط کشت بر این بیمارگر‏ها اعمال کرده است.


 

جدول 2- درصد بازدارندگی رشد قارچ‌های بیمارگر در آزمون کشت متقابل تجزیه و تحلیل شده با یک طرح کاملاً تصادفی (آزمون توکی)

F. falciforme

R. solani

M. phaseolina

F .chlamydosporum

سویه‌ها

29c

13.8bc

12.1b

30b

T. virensHam-65

21.3abc

16.3bc

13.5b

13.3a

T. harzianum Arak-6

22.6abc

9ab

17.7b

18.7ab

T. virens Arak-60

13a

4.6a

13.5b

8a

T. harzianum Arak-12

14.1ab

9.3ab

4.3a

13.3a

T. koningiopsis Arak-96

25.7bc

18.6c

25.5d

22ab

T. harzianum-Isf-B

19.7abc

18.6c

21.3c

14.7ab

T. capillare Isf-7

27bc

11.6bc

25.5d

22ab

T. pleuroticola Isf-15

17.7ab

4.6a

13.5b

18.7ab

T. virens Isf-77

1 هر عدد، میانگین سه تکرار است. حروف غیرمشابه در هر ستون، اختلاف معنی‏دار آماری در سطح احتمال (P≤0.05) با آزمون توکی دارند.

 

جدول 3- تجزیه واریانس درصد‏های بازدارندگی در آزمون کشت متقابل

تیمارها

مجموع مربعات

درجه آزادی

میانگین مربعات

مقدار F

معنی‌داری

F.chlamydosporum

00/960

00/8

00/120

40/4

000/0

M. phaseolinae

03/115

00/8

25/144

96/26

000/0

R. solani

92/697

00/8

24/87

66/9

000/0

 

 

شکل 7- آزمون کشت متقابل. A-B) پیچ‌خوردگی ریسه‏ای T. virens Ham-65 و T. pleuroticola Isf-15 در اطراف ریسه‏های قارچ بیمارگر R. solani SCUA-RH، C) اسپورزایی و تولید رنگدانه سویة Isf-15 علیه بیمارگر F. falciform SCUA-3PوD) اسپورزایی سویة Arak-12 روی قارچ R. Solani. رنگ‏آمیزی اسلاید‏ها با استفاده از محلول لاکتوفنل - کاتن‏بلو انجام شده است.

بحث

در این مطالعه، گونه‏های Fusarium chlamydosporum، F. falciforme، Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani، به‏عنوان بیمارگرهایی که باعث بیماری طوقه و ریشة لوبیا‏چشم‏بلبلی در استان خوزستان می‏شوند، براساس ریخت‏شناسی و تجزیه و تحلیل ناحیة ITS شناسایی شدند. نقش این بیمارگرها در ایجاد بیماری در گیاهان مختلف ازجمله لوبیا در مطالعات قبلی تأیید شده است (1-2-3-4-5-6). در شناسایی قارچ‏ها بررسی‏های ریخت‏شناختی منجر به شناسایی دقیق نمی‏شوند؛ بنابراین لازم است ناحیه‏های ژنی نیز توالی‏یابی و در تجزیه و تحلیل تبارزایی و جستجوی بلاست استفاده شوند (25). ناحیة تغییر‏پذیر ITS از ژن ریبوزومی (nrDNA)، به‌عنوان نشانگر، در کنار تعدادی از ژن‏های کد‏کنندة پروتئین ازجمله بتاتوبولین ((tub2، فاکتور تداوم ترجمة 1-آلفا (tef1-α)، دومین زیرواحد بزرگ RNA پلیمراز II (rpb2)، اکتین (ACT)، کالمودولین (Cmd)، gapdh و هیستون H3 (HIS) در شناسایی قارچ‏ها استفاده می‌شود. این ژن‏ها به‌صورت تک‏ناحیه‏ای (single-locus) و چند‏ناحیه‏ای (multi-locus) در تجزیه و‏ تحلیل تبارزایی آرایه‏های مختلف قارچی استفاده شده و به جداسازی تبارزایی و شناسایی دقیق بسیاری از آرایه‏های قارچی کمک کرده‌اند (15-20-26-27-28-29-30-31-32-33-34-35-36).

اندازه‏گیری میزان سیدروفور نشان داد سویه‌های Trichoderma و بیمارگرها می‌توانند در محیط فاقد آهن، سیدروفور درخور توجهی تولید کنند. سیدروفورها کلاته‏کننده‏های با وزن مولکولی پایین‌اند که بیشتر میکروارگانیسم‏ها ازجمله Trichoderma در شرایط کمبود آهن، آنها را ترشح و آهن محیط را برای خود قابل دسترس و برای سایر موجودات خارج از دسترس می‏کنند (37-38). گونه‌های Trichodermaدر مقایسه با قارچ‌های دیگر مقدار بیشتری سیدروفور در شرایط کمبود آهن، تولید و با بیمارگر گیاهی برای به دست آوردن آهن رقابت می‌کنند (37-38). طبق مطالعات انجام‌شده، حضور و نقش سیدروفورها در قارچ‌های بیمارگر در جوانه‌زنی میسیلیوم و اسپور قارچ (13)، ذخیرة آهن در کنیدیوم و جوانه‌زنی آن (37) و حمل‌ونقل آن در میتوکندری قارچ‌ها به اثبات رسیده است (14). تحقیقات قبلی (39) نشان می‏دهند توان بیماری‏زایی بعضی بیمارگرها با تولید بیومولکول‏های اختصاصی همچون سیدروفورها تغییر می‏کند؛ برای مثال، فنیل‏استیک‏اسید در بیماری‏زایی قارچ R. solanنقش دارد و نشان داده شده است که در سویه‏های تولیدکنندة میزان بیشتر فنیل‏استیک‏اسید، درصد مرگ گیاهچة گوجه‏فرنگی افزایش می‏یابد (40).

در آزمون کشت متقابل، هشت سویه‌ با رشد سریع پرگنه نسبت به رشد پرگنة قارچ بیمارگر باعث بازدارندگی رشد بیمارگرها شدند. در مطالعات گذشته، تأثیرات بازدارندگی سویه‏هایی از گونه‏های مختلف Trichoderma روی رشد بیمارگرهای گیاهی ثابت شده‌اند؛ ازجمله بازدارندگی گونه‏های T. brevicompactum، T. koningii، T. koningiopsis، T. viridecensو T. virensروی بیمارگر Gaeumannomyces graminis var tritici(16)،گونه‏هایT. gamsii، T. hamatum و T. harzianum روی بیمارگر F. oxysporum f. sp. cepae(41) و گونة‏ T. harzianum روی بیمارگرهای Alternaria solani، Pythium ultimumوR. solani(42). در این مطالعه همانند تحقیقات قبلی (14-16-41 )، برخی از سویه‌های Trichoderma علاوه بر بازدارندگی از رشد بیمارگر، پیچ‌خوردگی ریسه‏ای اطراف ریسة بیمارگر و تولید رنگدانة زیاد در محیط را نشان داده‌اند. در مطالعات گذشته، با قراردادن Phoma betae، Rosellinia necatrix و Botrytis cinereaدر مقابل چند سویة Trichoderma به این نتیجه رسیدند که اسپورزایی و قدرت تهاجمی سویه‌های Trichoderma در آزمون کشت متقابل، به نوع قارچ عامل بیماری و ترکیب محیط کشت بستگی دارد (43). پارازیته‌کردن قارچ عامل بیماری توسط سویه‌های Trichoderma و تولید آنزیم تجزیه‌کنندة دیواره سلولی مانند گلوکوناز در مراحل پارازیتیسم به اثبات رسیده‌اند و در بیشتر مقالات کنترل بیولوژیک به آنها اشاره شده است (37-44-45).

قارچ Trichoderma از ﻣﮑﺎﻧﯿﺴﻢﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻔﯽ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﮐﺎﻫﺶ ﻣﻘﺎوﻣﺖ و واﮐﻨﺶﻫﺎی دﻓﺎﻋﯽ ﮔﯿﺎه، مقابلة ﻣﺴﺘﻘﯿﻢ ازﻃﺮﯾﻖ ﻣﺎﯾﮑﻮﭘﺎرازﯾﺘﯿﺴﻢ، آﻧﺘﯽﺑﯿﻮز و رﻗﺎﺑﺖ ﺑﺮای ﻣﻘﺎﺑﻠﻪ ﺑﺎ ﺑﯿﻤﺎرﮔﺮﻫﺎی ﮔﯿﺎه استفاده می‌کند (46). گونة T. lingnorum در محیط کشت ﻣﻮادی ﺗﺮﺷﺢ می‌کند ﮐﻪ ﺑﺮای R. solani ﻣﺮگ‌آور است (8). گونة T. viride از ﮔﺴﺘﺮش ﺷﻌﺎﻋﯽ پرگنة F. moniliforme ﻣﻤﺎﻧﻌﺖ می‌کند و ﮔﺴﺘﺮش ﺷﻌﺎﻋﯽ گونة ﺑﯿﻤﺎری‌زا را کاهش می‌دهد (47).

(1) Anonymous. Agricultural statistics. volume III (horticultural products). Published by the ministry of agriculture. Department of planning and economic. In Persian: Office of statistics and information technology; 2013.
(2) Singh BB, Mohan-raj DR, Dashiell KE, Tackai LEN. Copublication of International Institute of Tropical Agriculture and Japan International Research Center for Agriculture Science (JIRCAS). IITA, Ibadan. Nigeria. Advanced in cowpea research. 1997; 375.
(3) Adam T. Contribution a Iaconnaissance des maladies du niebe (Vigna unguiculata (L.) Waip.) au Niger avec mention special au Macrophomina phaseolina Goid. Universitde renne. 1986.
(4) Short GE, Wyllie TD, Bristow PR. Surrvival of Macrophomina phaseolina in soil and residue of soybean, phytopathogens. 1980; 70: 13–17.
(5) Altinok HH, Can C. Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. melongenae isolated from eggplant in turkey by pathogenicity, VCG and PAPD analysis. Phythoparasitica. 2010; 38(2): 149–157.
(6)Abawi GS, Pastor-Corrales MA. Root rots of beans in Latin America and Africa: diagnosis, research methodologies and management strategies. Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia; 1990.
(7) Naseri B. Epidemics of Rhizoctonia root rot in association with biological and physicochemical properties of field soil in bean crops. Journal of Phytopathology. 2013; 161(6): 397–404.
(8) Weindling R. Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology. 1932; 32: 837–845.
(9) Chet I, Inbar J. Biological control of fungal pathogens. Applied Biochemistry and Biotechnology. 1994; 48(1): 37–43.
(10) Demain AL, Fang A. The natural function of secondary metabolites. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 2000; 69: 1–39.
(11) Kloepper JW, Leong J, Teintze M, Schiroth MN. Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth promoting Rhizobacteria. Nature. 1980; 286: 885–886.
 
(12) Matzanke BF, Bill E, Trautwein AX, Winkelmann G. Role of siderophores in iron storage in spores of Neurospora crassa and Aspergillus ochraceus. Journal of Bacteriology. 1987; 169(12): 5873–76.
(13) Winkelmann G. Rhizoferrin a novel siderophore from the fungus Rhizopus microsporus var rhizopodiformis. Biology of Metals. 1991; 4(4): 238–243.
(14) Charlang GNgB, Horowitz NH, Horowitz RM. Cellular and extracellular siderophores of Aspergillus nidulans and Penicillium chrysogenum. Molecular and Cellular Biology. 1981; 1(2): 94–100.
(15) Mehrabi-Koushki M, Pooladi P, Eisvand P, Babaahmadi G. Curvularia ahvazensis and C. rouhanii spp. nov. from Iran. Mycosphere. 2018; 9(6): 1173–1186.
(16) Zafari D, Mehrabi Koushki M, Bazgir E. Biocontrol evaluation of wheat take-all disease by Trichoderma screened isolates. African Journal of Biotechnology. 2008; 7(20): 3650–3656.
(17) Bhattacharya D, Basu S, Chattapadhyay J P, Bose SK. Biocontrol of Macrophomina root rot disease of jute by an antagonistic organism, Aspergillus versicolor. Plant Soil. 1985; 87(3): 435–438.
(18) Naseri B. Root rot of common bean in Zanjan, Iran: major pathogens and yield loss estimates. Australasian Plant Pathology. 2008; 37(6): 546–551.
(19) Raeder U, Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Applied Microbiology. 1985; 1(1):17–20.
(20) Ahmadpour SA, Mehrabi-Koushki M, Farokhinejad R. Neodidimelliopsis farokhinejadii, a new fungal species from dead branches of trees in Iran. Sydowia. 2017; 69: 171–182.
(21) White TJ, Bruns T, Lee S. Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. (eds). PCR protocols. a guide to methods and applications. Academic Press: New York, 1990; 18(1): 315–322.
(22) Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 2013; 30(12): 2725–2729.
(23) Saha M, Sarkar S, Sarkar B, Sharma B, Bhattacharjee S, Tribedi P. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 2016; 23(5): 3984–3999.
(24) Schwyn B, Neilands JB. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 1987; 160(1): 47–56.
(25) Summerbell RC, Levesque CA, Seifert KA, Bovers M, Fell JW, Diaz MR, Boekhout T, de Hoog GS, Stalpers J, Crous PW. Microcoding: the second step in DNA barcoding. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2005; 360: 1897–1903.
(26) Ahmadpour SA, Farokhinejad R, Mehrabi-Koushki M. Further characterization and pathogenicity of Didymella microchlamydospora causing stem necrosis of Morus nigra in Iran. Mycosphere. 2017; 8(7): 835–852.
(27) Babaahmadi G, Mehrabi-Koushki M, Hayati J. Allophoma hayatii sp. nov, an undescribed pathogenic fungus causing dieback of Lantana camara in Iran. Mycological Progress. 2018; 17(3): 365–379.
(28) Dehdari F, Mehrabi-Koushki M, Hayati J. Curvularia shahidchamranensis sp. nov, a crude oil-tolerant fungus. Current Research in Environmental and Applied Mycology. 2018; 8(6): 572–584.
(29) Heidari K, Mehrabi-Koushki M, Farokhinejad R. Curvularia mosaddeghii sp. nov, a novel species from the family Pleosporaceae. Mycosphere. 2018; 9(4): 635–646.
(30) Heidari K, Farokhinejad R, Mehrabi-Koushki M. Occurrence of purslane leaf spot caused by Dichotomophthora lutea in Iran. Australasian Plant Disease Notes. 2018; 13(1):1–4.
(31) Mehrabi-Koushki M, Khodadadi-Pourarpanahi S, Jounbozorgi S. Fungal endophytes associated with some thermo-tolerant plants in salt-stress ecosystem. Mikologiya i Fitopatologiya. 2018; 52(3): 187–195.
(32) Jonbozorgi S, Mehrabi-Koushki M, Farokhinejad R. Isolation and identification of fungal endophytes of the cowpea in Khuzestan Province. Biological Journal of microorganisms. 2019; 8(29): 97–115.
(33) Larki R, Mehrabi-Koushki M, Farokhinejad R. Ectophoma iranica sp. nov. and new hosts and records of Allophoma spp. in Iran. Journal of Phytopathology. 2019; 167(9): 538–545.
(34) Song J, Liang JF, Mehrabi-Koushki M, Krisai-Greilhuber I. et al. Fungal systematics and evolution 5. Sydowia. 2019; 71: 141–245.
(35) Safi A, Mehrabi-Koushki M, Farokhinejad R. 2020. Amesia khuzestanica and Curvularia iranica spp. nov. from Iran. Mycological Progress. 2020; 19(9): 935–945.
(36) Aghyl H, Mehrabi-Koushki M, Esfandiari M. Chaetomium iranicum and Collariella capillicompacta spp. nov. and notes to new hosts of Amesia species in Iran. Sydowia. 2021; 73: 21–30.
(37) Harman GE, Howell CR, Viterbo A, Chet I, Lorito M. Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews Microbiology. 2004; 2(1): 43–56.
(38) Wallner A, Blatzer M, Schrettl M, Sarg B, Lindner H, Haas H. a siderophore involved in intra- and transcellular iron distribution in Aspergillus fumigatus. Applied and Environmental Microbiology. 2009; 75(12): 4194–4196.
(39) Calderone RA, Fonzi WA. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 2001; 9(7): 327–335.
(40) Renshaw JC, Robson GD, Trinci AP, Wiebe MG, Livens FR, Collison D. Fungal siderophores: structures, functions and applications. Mycological Research. 2002; 106(10): 1123–1142.
(41) Bunbury-Blanchette AL, Walker AK. Trichoderma species show biocontrol potential in dual culture and greenhouse bioassays against Fusarium basal rot of onion. Biological Control. 2019; 130: 127–135.
(42) Mazrou YSA, Makhlouf AH, Elseehy MM, Awad MF, Hassan, MM. Antagonistic activity and molecular characterization of biological control agent Trichoderma harzianum from Saudi Arabia. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 2020;30: 4.
(43) Hermosa MR, Grondona I, Iturriaga EA, Diaz-Minguez JM, Castro C, Monte E. Molecular characterization and identification of biocontrol isolates of Trichoderma spp. Applied Environmental Microbiology. 2000; 66: 1890–1898.
(44) McIntyre M, Nielsen J, Arnau J, van der Brink H, Hansen K, Madrid S. Proceedings of the 7th European Conference on Fungal Genetics. Copenhagen: Denmark; 2004.
(45) Howell CR. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Disease. 2003; 87: 4–10.
(46) Papavizas GC. Trichoderma and Gliocladium biology, ecology and potential for biocontrol. Annual Review Phytopathology. 1985; 23: 23–45.
(47) Yates IE, Meredith F, Smart W, Bacon CW, Jaworski AJ. Trichoderma viride suppresses fumonisin B1 production by Fusarium moniliforme. Journal of Food Protection. 1999; 62: 1326–1332.