نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکدۀ کشاورزی، واحد اصفهان (خوراسگان)، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
2 استادیار گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکدۀ کشاورزی، واحد اصفهان (خوراسگان)، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
3 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
4 دانشیار گروه علوم پایه، دانشکدۀ دندانپزشکی، واحد اصفهان (خوراسگان)، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Monascus purpureus is a filamentous ascomycetes fungus that has the ability to produce natural pigments. The aim of the present study was to investigate the effects of mutagenic chemical agents of Sodium Azide and Nitro Acid on the morphology of Monascus purpureus and stable pigment production by this fungus.
Materials and methods: Initial sporulation of Monascus purpuoreus was affected by chemical mutagens (Sodium Azide and Nitrous Acid). Then, the morphological features (appearance and microscopy) of the suspected colonies were examined. Wild and selected colonies were cultured under the submerge fermentation for up to two generations to measure biomass and pigment under immersion conditions.
Results: The production of biomass and yellow, orange, and red pigments in the first and second generation of NA2 (nitrous acid, 0.4 M, 45 min), NA3 (nitrous acid, 0.4 M, 30 min), and NA6 (nitrous acid, 0.2 M, 30 min) samples did not change significantly (P <0.05). NA2 sample significantly produced the maximum amount of pigment (P <0.05). The concentrations of yellow, orange, and red pigments produced by this sample were 0.64, 0.42, and 0.45 units per milliliter, respectively.
Discussion and conclusion: In the present study, the morphology of all selected samples showed changes compared to the wild sample. Most of the selected samples produced significantly more pigments than the wild strain which were stable for up to two generations (P <0.05). The treatment method of Monascos purpureus with nitrous acid can successfully lead to the production of samples with higher and more stable pigment production.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
قارچهای آسکومیست[1] رشتهای ازجمله موجوداتیاند که بیشتر در فرایندهای بیوتکنولوژی صنعتی استفاده میشوند. بیشتر این قارچها در شاخة آسکومایکوتا[2] طبقهبندی میشوند (1). قارچ موناسکوس یک نوع قارچ آسکومیست رشتهای است که ژنوم آن متعلق به کلاس آسکومایستها و خانوادة موناسکاسه[3]است. این قارچ منبعی از متابولیتهای ثانویه با ساختار پلیکتیدی است که حداقل شش رنگدانه یعنی دو نوع رنگدانة زرد، دو نوع رنگدانة نارنجی و دو نوع رنگدانة قرمز تولید میکند (2، 3). این رنگدانهها مجموعهای از متابولیتهای قارچی به نام آزافیلونها هستند (4) و چندین کاربرد در صنایع غذایی مانند تولید سوسیس چینی، نودلهای فوری و محصولات لبنی دارند و در صنایع گوشت نیز بهجای نمک نیترات، پیشساز نیتروزآمینها، استفاده میشوند (5). از میان این رنگدانهها، رنگدانة قرمز قرنهاست که بهعنوان مادة رنگی خوراکی در آسیا بهطور گسترده استفاده شده است و اکنون نیز بهوسیلة تخمیر باموفقیت تولید میشود (6). یکی از مهمترین چالشهای استفاده از قارچهای رشتهای مانند موناسکوس برای تولید متابولیتهای قارچی، کنترل مورفولوژی میسلیومهاست. این ویژگی از اهمیت ویژهای برخوردار است؛ زیرا مورفولوژی قارچ بر عملکرد تولید متابولیتهای هدف در طول تخمیر غوطهوری تأثیر میگذارد. مورفولوژی میسلیوم بهطور چشمگیری تأثیرگرفته از شرایط تخمیر مانند منابع کربن، pH، میزان مخلوطشدن، طراحی اسپارژر و میزان هوادهی است (7). هاگزایی غیرجنسی یک روش تولیدمثلی رایج برای گونههای موناسکوس است. اندازه و شکل اسپورها و پرگنههای قارچهای رشتهای از عوامل مهم در شناسایی قارچها هستند (8). موناسکوس را به راحتی میتوان با آسکوسپورهای آن تشخیص داد که ازنظر شکل به قطر 5 میکرون هستند. میسلیوم در مراحل اولیه سفید است و بهسرعت به یک رنگ صورتی غنی و متعاقباً به یک رنگ زرد - نارنجی تغییر میکند (9). جهش میکروارگانیسمهای مهم صنعتی برای توسعة موفقیتآمیز سویههای مختلف مورد نیاز در تولید محصولات مختلف زیستی مهم است (10). پیش از این، تحقیقات دیگری در زمینة ایجاد جهش بر قارچ موناسکوسپورپورئوس انجام شده است. در مطالعة دیکشیت و تالاپراگادا[4]، قارچ موناسکوس در معرض عوامل جهشزای اشعة ماوراءبنفش و اتیلمتانسولفونات قرار گرفت و مورفولوژی سویههای جهشیافته نسبت به سویة وحشی تفاوت داشت. همچنین سویههای جهشیافته، لواستاتین و رنگدانة بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید کردند (11). در مطالعة دیگری که قارچ موناسکوس در معرض اشعة ماوراءبنفش قرار گرفت، سویههای جهشیافته چند برابر رنگدانة بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید کردند (12). با توجه به اینکه استفاده از مواد شیمیایی جهشزا نسبت به سایر روشها ارزانتر و راحتتر است، میتواند نتایج بهتری در افزایش تولید محصول مدنظر نسبت به سایر روشهای ژنتیکی پرهزینهتر ارائه دهد؛ ازاینرو در این مطالعه، سوسپانسیون قارچی موناسکوسپورپورئوس در معرض عوامل جهشزای سدیمآزید و اسید نیترو قرار گرفت و ویژگیهای مورفولوژی و تولید رنگدانه بررسی شدند.
مواد و روشها
مواد: قارچ موناسکوس پورپورئوسATCC 16362 از سازمان تحقیقات علمی و صنعتی ایران، تهیه و روی محیط سیبزمینی دکستروز آگار[5] کشت شد و به مدت 7 روز در انکوباتور با دمای 30 درجة سانتیگراد قرار گرفت. سپس در یخچال تا زمان استفاده نگهداری شد (13). همچنین، تمامی مواد شیمیایی استفادهشده در این مطالعه از شرکت مرک آلمان خریداری شدند.
تهیة سوسپانسیون اسپوری: به محیط کشت جامد 7 روزه آب مقطر استریل اضافه شد و اسپورها برداشته شدند. شمارش اسپورها با لام نئوبار، انجام و غلظت سوسپانسیون اسپوری به میزان 106 ×5/1 اسپور در هر میلیلیتر تنظیم شد (14، 15).
اعمال تیمار اسید نیترو و سدیمآزید: اسید نیترو با غلظتهای 2/0، 4/0، 6/0 و 8/0 مولار به مدت 15، 30 و 45 دقیقه به اسپورهای موناسکوس اضافه شد. برای تیمار با سدیمآزید، 100، 250، 500، 750 و 1000 میکروگرم بر میلیلیتر سدیمآزید به مدت 60 و 90 دقیقه به رسوبها اضافه شد. سپس سلولها سانتریفیوژ شدند و مادة رویی حذف شد. در مرحلة بعد، بافر فسفات به سلولهای جداشده اضافه شد و مجدداً توسط سانتریفیوژ شستشو داده شدند. این کار سه بار تکرار شد و اسپورها در بافر فسفات به حالت محلول درآمده و روی محیط PDA کشت شدند (16، 17).
بررسی تأثیر مادة جهشزا بر ویژگیهای مورفولوژی قارچ: پرگنههای با خصوصیات ظاهری متفاوت، انتخاب و روی محیط PDA کشت شدند و به مدت 7 روز در گرمخانه با دمای 30 درجة سانتیگراد قرار گرفتند. از روز دوم تا هفتم مشخصات پرگنههای جهشیافته نسبت به سویة وحشی بررسی و ثبت شد (11). در روز هفتم تمام ویژگیهای میکروسکوپی با میکروسکوپ نوری نیکون (E100) ساخت ژاپن بررسی شد. قطر میسلیوم با استفاده از دوربین دیجیتال و نرمافزار Toup view (version: X64, 4.8.16143. 20191216)بررسی و اندازهگیری شد (14، 18، 19).
کشت غوطهوری: سوسپانسیون اسپوری نمونههای انتخابشده در یک حمام آب در دمای 80 درجة سانتیگراد به مدت 1 دقیقه قرار گرفت (13، 20). بهمنظور اندازهگیری زیستتوده و رنگدانه این سوسپانسیون در محیط پودر مخمر - نشاسته محلول[6]، تلقیح و در دمای 30 درجة سانتیگراد به مدت 16 روز در انکوباتور شیکردار نگهداری شد (21، 22).
استخراج و اندازهگیری رنگدانه: محتویات ارلن با الکل 70 درصد مخلوط شد و در حمام اولتراسونیک و سپس در گرمخانة شیکردار قرار گرفت و سانتریفیوژ شد. پس از آن، با کاغذ صافی واتمن شماره 1 (ساخت انگلستان)، صاف و غلظت رنگدانه در سه طول موج 400، 470 و 505 نانومتر بهترتیب برای رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز با اسپکتوفتومتر بررسی شد (7، 23).
اندازهگیری زیستتوده: 10 میلیلیتر از محیط کشت حاوی میکروارگانیسم کشت داده شده با استفاده از کاغذ صافی به وزن رسیده صاف شد و در آون با دمای 65 درجة سانتیگراد، خشک و با ترازوی دیجیتال وزن شد. اختلاف وزن قبل و بعد کاغذ محاسبه شد (7).
تجزیه و تحلیل آماری: بهمنظور بررسی پایداربودن نمونههای انتخابشده از طرح بلوکهای کاملاً تصادفی استفاده شد. مقایسة میانگینها با استفاده از نرمافزار SAS 9.1 و براساس آزمون حداقل تفاوت معنیداری[7] در سطح اطمینان 95 درصد انجام گرفت.
نتایج
تأثیر عوامل شیمیایی بر ویژگیهای ظاهری: با توجه به جدول 1 و شکل 1، در سویة موناسکوسپورپورئوس وحشی در سطح پلیت پرگنهها تقریباً بدون رنگ بودند و در مرکز پرگنه رنگ نارنجی خیلی ملایمی مشاهده شد. رنگ پشت پرگنه بهصورت حلقوی با هالة سفید پهن بود. شکل پرگنه، پرزی و سطح تمام پرگنه، صاف و در مرکز برآمده بود. افزایش اندازة قطر پرگنه در هر روز روند تقریباً یکنواختی داشت. اندازة پرگنهها بزرگ بود؛ بهطوریکه قطر سویة وحشی در روز هفتم 35 میلیمتر اندازهگیری شد.
در پرگنه انتخابشده که با 2/0 مولار اسید نیترو به مدت 45 دقیقه تیمار شده بود، رنگ سطح پرگنه، نارنجی پررنگ و در سطح کل پرگنه یکنواخت بود. رنگ پشت پرگنه قرمز تیره و یکنواخت بود و هالة خیلی باریک و شفافی مشاهده شد. بافت پرگنه پرزی و برآمدگی در کل پرگنه وجود داشت. اندازة قطر پرگنه در روز دوم تا چهارم، در هر روز 4 میلیمتر افزایش یافت؛ درحالیکه از روز چهارم تا هفتم این افزایش قطر پرگنه، کمتر و در هر روز 1 یا 2 میلیمتر پرگنه بزرگتر شد. پرگنه انتخابشده کوچک بود و حدود 6 میلیمتر کاهش قطر نسبت به سویة وحشی در آن مشاهده شد (شکل 1).
در تیمارNA2، تأثیرگرفته از اسید نیترو با غلظت 4/0 مولار به مدت 45 دقیقه، رنگ در سطح کل پرگنه نارنجی تیره بود و فقط هالة خیلی باریک سفیدی مشاهده شد. رنگ پشت پرگنه بهصورت حلقوی و در مرکز قرمز خیلی تیره و پس از آن، نارنجی و زرد با هالة باریک سفید بود. سطح پرگنه کاملاً صاف بود. از روز دوم تا چهارم کشت، سرعت افزایش قطر پرگنه بالا بوده است و بیشترین افزایش قطر پرگنه از روز دوم تا سوم دیده شد. از روز چهارم به بعد، سرعت افزایش قطر پرگنه کمتر بود و قطر پرگنه در روز هفتم 20 میلیمتر اندازهگیری شد (شکل 1).
همانطور که در شکل 2 سویة NA3 (غلظت اسید نیترو: 4/0 مولار و مدت زمان: 30 دقیقه) نشان داده شده است، رنگ سطح پرگنه در تیمار NA3 بهصورت یکنواخت، نارنجی و رنگ پشت پرگنه بهصورت یکنواخت قهوهای تیره بود و هالة خیلی باریک زردی در پشت پرگنه قارچ دیده شد. پرگنه، برجسته و نسبت به سویة وحشی کاهش اندازة چشمگیری داشت. حداکثر افزایش قطر پرگنه در روز سوم تا چهارم بود و قطر پرگنه در روز هفتم 14 میلیمتر اندازهگیری شد. اطراف پرگنه موجدار بود.
رنگ سطح پرگنه در تیمار NA4 (غلظت اسید نیترو: 2/0 مولار و مدت زمان: 30 دقیقه)، قهوهای و نارنجی بود و حالت درهم پخششدگی داشت. در پشت پرگنه رنگ بهصورت حلقوی و در مرکز قرمز خیلی تیره، قرمز، سپس نارنجی و هالة زرد مشاهده شد. سطح پرگنه تورفتگی داشت. حداکثر افزایش قطر پرگنه در روز سوم تا چهارم دیده شد که در روز چهارم حدود 9 میلیمتر نسبت به روز قبل افزایش داشت. اندازة پرگنه در روز هفتم 5 میلیمتر نسبت به سویة وحشی کاهش یافته بود (شکل 2).
در تیمارNA5، تأثیرگرفته از اسید نیترو با غلظت 2/0 مولار به مدت 30 دقیقه، پرگنه بهصورت پرزی و برآمده بود. در سطح پرگنه، رنگ نارنجی روشن و نارنجی تیرهتر حالت درهم پخششدگی داشتند. پشت پرگنه رنگ بهصورت حلقوی و در مرکز قرمز خیلی تیره، قرمز و نارنجی بود. اطراف پرگنه تقریباً صاف بود، افزایش اندازة پرگنه از روز دوم تا پنجم روند تقریباً یکنواختی داشت، از روز پنجم تا ششم هیچ تغییری مشاهده نشد و از روز ششم تا هفتم تنها 1 میلیمتر به اندازة قطر پرگنه اضافه شد. قطر پرگنه در روز هفتم 25 میلیمتر اندازهگیری شد (شکل 2).
مطابق با شکل 2 سویة NA6 (غلظت اسید نیترو: 4/0 مولار و مدت زمان: 30 دقیقه)، سطح پرگنه نارنجی رنگ بود و روی پرگنه برآمدگی کوچک دیگری دیده شد که همان برآمدگی در پشت پرگنه نیز رنگ خیلی تیرهای داشت. رنگ پشت پرگنه بهصورت حلقوی و در مرکز قرمز خیلی تیره، نارنجی و با هالة سفید مشاهده شد. پرگنه بهصورت پرزی و برآمده بود، قطر آن از روز سوم تا چهارم 11 میلیمتر افزایش داشت و روند افزایش قطر پرگنه در بقیه روزها آهستهتر بود. قطر پرگنه در روز هفتم 27 میلیمتر اندازهگیری شد.
در تیمار NA7، تأثیرگرفته از اسید نیترو با غلظت 4/0 مولار به مدت 15 دقیقه، پرگنه کاملاً مسطح بود. در سطح پرگنه رنگ بهصورت حلقوی و ترکیبی از چند نارنجی (تیره در مرکز پرگنه و روشن در اطراف پرگنه) بود. رنگ پشت پرگنه نیز بهصورت حلقوی از قرمز خیلی تیره در مرکز تا نارنجی در اطراف آن بود. همچنین، هالة خیلی باریک و شفاف زردی مشاهده شد. قطر پرگنه از روز دوم تا چهارم در هر روز 8 میلیمتر افزایش یافت و پس از آن، روند افزایش قطر پرگنه سرعت کمتری داشت. قطر پرگنه در روز هفتم 30 میلیمتر اندازهگیری شد (شکل 3).
در تیمار سدیمآزید با غلظت 500 میکروگرم بر میلیلیتر و زمان 60 دقیقه (SA1)، سطح پرگنه بهصورت کاملاً یکنواخت نارنجی و پشت پرگنه بهصورت یکنواخت رنگ قرمز تیره با هالة شفاف زرد بود. پرگنهها تقریباً برآمده بودند، قطر پرگنه از روز دوم تا پنجم افزایش یافت و از روز پنجم به بعد ثابت ماند. قطر پرگنه در روز هفتم 20 میلیمتر بود (شکل 3).
رنگ سطح پرگنه انتخابشدة SA2 (غلظت سدیمآزید: 750 میکروگرم بر میلیلیتر و مدت زمان: 90 دقیقه) نارنجی و رنگ پشت پرگنه قرمز تیره با هالة ضخیم نارنجی بود. برآمدگی کمی در مرکز پرگنه دیده شد و اطراف پرگنه تقریباً صاف بود. قطر پرگنه از روز دوم تا چهارم در هر روز 7 میلیمتر و از روز چهارم تا ششم در هر روز 2 میلیمتر افزایش یافت و از روز ششم تا هفتم اندازة پرگنه ثابت ماند. قطر پرگنه در روز هفتم 24 میلیمتر اندازهگیری شد (شکل 3).
در سویة SA3، تأثیرگرفته از اسید نیترو با غلظت 1000 میکروگرم بر میلیلیتر به مدت60 دقیقه، با توجه به شکل 3، سطح پرگنه بهصورت کاملاً یکنواخت نارنجی و پشت پرگنه بهصورت یکنواخت قرمز تیره بود و فقط در اطراف پرگنه هالة باریک زرد مشاهده شد. پرگنهها برآمده بودند و اطراف پرگنه کاملاً صاف نبود. حداکثر افزایش قطر پرگنه در روز ششم تا هفتم، مشاهده و قطر پرگنه در روز هفتم 30 میلیمتر اندازهگیری شد.
تأثیر عوامل شیمیایی بر ویژگیهای میکروسکوپی: نتایج حاصل از اعمال تیمارهای سدیمآزید و اسید نیترو بر ویژگیهای میکروسکوپی نمونههای انتخابشده به شرح زیر است که تصاویر آن در قسمت نمای میکروسکوپی شکل 1، 2 و 3 نمایش داده شده است.
در سویة وحشی قارچ موناسکوسپورپورئوس، مطابق با بخش ج شکل 1، میسلیومها شفاف و دیوارهها نازک و ساده بودند. تعداد انشعابات کم بود و آسک در بررسی میکروسکوپی ملاحظه نشد. قطر میسلیوم از 24/4 تا 6 میکرومتر متغیر بود.
در نمونة NA1 میسلیومها به نسبت زیاد پیچ خورده بودند و قطر متوسط میسلیومها 5/22 میکرومتر بود. تعداد دیوارة عرضی در طول میسلیوم زیاد بود و آسک مشاهده نشد که در بخش نمای میکروسکوپی شکل 1 ملاحظه میشود.
جدول 1- بررسی ویژگیهای ظاهری پرگنه موناسکوسپورپورئوس
|
نمونه |
زمان (دقیقه) |
غلظت مادة جهشزا |
رنگ سطح |
رنگ پشت |
بافت |
قطر پرگنه (میلیمتر) |
||||||
|
روز 2 |
روز 3 |
روز 4 |
روز 5 |
روز 6 |
روز 7 |
|
||||||
|
وحشی |
- |
- |
نارنجی خیلی ملایم |
قرمز، نارنجی، زرد، با هالة پهن سفید |
پرزی و در مرکز برآمده |
9 |
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
|
|
NA1 |
45 |
2/0 مولار اسید نیترو |
نارنجی تیره |
قرمز تیره با هالة باریک و شفاف |
پرزی و برآمده |
7 |
11 |
15 |
16 |
17 |
19 |
|
|
NA2 |
45 |
4/0 مولار اسید نیترو |
نارنجی تیره |
قرمز تیره، نارنجی، زرد، با هالة باریک سفید |
پرزی و صاف |
4 |
10 |
15 |
17 |
19 |
20 |
|
|
NA3 |
30 |
4/0 مولار اسید نیترو |
نارنجی |
قهوهای با هالة باریک زرد |
پرزی و برآمده |
1 |
4 |
9 |
11 |
12 |
14 |
|
|
NA4 |
30 |
2/0 مولار اسید نیترو |
مرکز قهوهای، نارنجی کمرنگ |
قرمز خیلی تیره، قرمز، نارنجی ، با هالة زرد |
پرزی و با تورفتگی در سطح پرگنه |
7 |
11 |
20 |
24 |
27 |
30 |
|
|
NA5 |
30 |
2/0 مولار اسید نیترو |
نارنجی کمرنگ و تیرهتر |
قرمز تیره و قرمز و در اطراف نارنجی |
پرزی و برآمده |
10 |
15 |
20 |
24 |
24 |
25 |
|
|
NA6 |
30 |
2/0 مولار اسید نیترو |
نارنجی |
قرمز تیره، نارنجی، با هالة سفید |
پرزی و برآمده |
1 |
5 |
16 |
20 |
23 |
27 |
|
|
NA7 |
15 |
4/0 مولار اسید نیترو |
نارنجی تیره |
قرمز تیره، نارنجی تیره، نارنجی روشن، با هالة خیلی شفاف باریک زرد |
پرزی و صاف |
7 |
15 |
23 |
26 |
29 |
30 |
|
|
SA1 |
60 |
500 میکروگرم بر میلیلیتر سدیمآزید |
نارنجی تیره |
قرمز تیره، با هاله شفاف زرد |
پرزی و برآمده |
9 |
14 |
17 |
20 |
20 |
20 |
|
|
SA2 |
90 |
750 میکروگرم بر میلیلیتر سدیمآزید |
نارنجی |
قرمز تیره با هالة نارنجی |
پرزی و برآمده |
7 |
14 |
21 |
23 |
24 |
24 |
|
|
SA3 |
60 |
1000 میکروگرم بر میلیلیتر سدیمآزید |
نارنجی |
قرمز یکنواخت با هالة خیلی باریک زرد شفاف |
پرزی و بر آمده |
9 |
13 |
19 |
20 |
21 |
30 |
|
با توجه به بخش نمای میکروسکوپی شکل 1، تشکیل میسلیوم در نمونة NA2 بسیار کم و محدود بود و میسلیومها بدون انشعاب بودند. قطر در طول میسلیوم متغیر (9 تا 22 میکرومتر) بود. تعداد دیوارههای عرضی، کم و رنگدانههای زیادی تشکیل شده بود.
ساختار میکروسکوپی نمونة NA3 نشان داد میسلیومها در این تیمار متراکم شده بودند و انشعابات در میسلیومها کم بود. میسلیومها در برخی نواحی پیچخوردگی داشتند و قطر میسلیوم 47/22 تا 6/28 میکرومتر بود.
میسلیومها در نمونة NA4 با دیوارههای ضخیم تشکیل شده بودند. همانطور که در قسمت نمای میکروسکوپی شکل 2 دیده میشود در برخی نواحی میسلیوم از محل دیوارة عرضی قطعهقطعه شده بود و کلامیدوسپور کنیدیایی مشاهده شد. قطر میسلیوم از 31/19 تا 34 میکرومتر متغیر بود.
در نمونة NA5 میسلیومها متراکم و بالشتکی بودند و تشکیل حالتی شبیه به اسپورودوخیوم دیده شد. انشعابات میسلیومی در این نمونه کم بود و میسلیومها در برخی نواحی تاخورده بودند. مطابق با نمای میکروسکوپی شکل 2، قطر میسلیوم نسبت به سایر تیمارها، بسیار کم و حدود 8 میکرومتر در تمام طول میسلیوم بود.
از بین نمونههای تیمارشده با اسید نیترو، در نمونة NA6 تعداد میسلیومها کم بود. میسلیومها دیوارة عرضی داشتند و در برخی نواحی میسلیومها خرد شده بودند. قطر میسلیوم 87/18 تا 87/30 میکرومتر در طول میسلیوم متغیر بود. همانطور که در بخش نمای میکروسکوپی شکل 2 نشان داده شده است، میسلیوم به حالت آرتروکنیدی و کلامیدوسپور کنیدیایی تشکیل شده بود.
تشکیل میسلیومها در نمونة NA7 بسیار کم و محدود بود. مطابق با شکل 3 در قسمت نمای میکروسکوپی، در برخی نواحی میسلیومها استخوانی شکل بودند. قطر میسلیوم در این نمونه 16 تا 80/17 میکرومتر بود.
ساختار میکروسکوپی نمونة SA1 نشان داد انشعابات میسلیومی در این نمونه بهشدت افزایش یافته است. قطر میسلیوم در طول میسلیومها متغیر بود و در برخی نقاط تورم مشاهده شد. همانطور که در قسمت نمای میکروسکوپی شکل 3 ملاحظه میشود، در برخی نقاط قطر سلول میسلیوم افزایش یافته است و تا بیش از 50 میکرومتر نیز ملاحظه شد. ورود به فاز تشکیل کلامیدوسپور کنیدیایی در شکل میکروسکوپی ملاحظه میشود.
میسلیومها در نمونة SA2 کم تشکیل شدهاند؛ اما متراکم بودند. تعداد انشعابات در میسلیوم، کم و میسلیوم در برخی نواحی متورم بود. مطابق با نمای میکروسکوپی شکل 3، قطر میسلیوم از 63/21 تا 21/34 میکرومتر متغیر بود.
در نمونة SA3، همانطور که در قسمت نمای میکروسکوپی شکل 3 مشخص است، تشکیل میسلیوم در این نمونه بسیار کم بود و میسلیومها انشعابات کمی داشتند. هیچ ساختاری به غیر از میسلیوم مشاهده نشد و قطر میسلیوم 10 تا 42/14 میکرومتر متغیر بود.
|
تصویر میکروسکوپی |
تصویر پشت پرگنه |
تصویر سطح پرگنه |
|
|
سویةWild |
|||
|
سویةNA1 |
|||
|
سویة NA2 |
شکل 1- روز هفتم بررسی ویژگیهای مورفولوژیکی تیمارهای انتخابشده. تصویر میکروسکوپی با بزرگنمایی 50 درصد
|
تصویر میکروسکوپی |
تصویر پشت پرگنه |
تصویر سطح پرگنه |
|
|
سویة NA3 |
|||
|
سویة NA4 |
|||
|
سویة NA5 |
|||
|
سویة NA6 |
شکل 2- روز هفتم بررسی ویژگیهای مورفولوژی تیمارهای انتخابشده. تصویر میکروسکوپی با بزرگنمایی 50 درصد
|
تصویر میکروسکوپی |
تصویر پشت پرگنه |
تصویر سطح پرگنه |
|
|
سویة NA7 |
|||
|
سویة SA1 |
|||
|
سویة SA2 |
|||
|
سویة SA3 |
|||
|
شکل 3- روز هفتم بررسی ویژگیهای مورفولوژی تیمارهای انتخابشده. تصویر میکروسکوپی با بزرگنمایی 50 درصد |
|||
بررسی پایداری و میزان تولید زیستتوده، رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز: براساس جدول 2، میزان تولید زیستتوده در بیشتر نمونههای انتخابشده با نمونة وحشی اختلاف آماری معنیداری نداشت (05/0 P<). در تولید رنگدانة زرد بین نمونههای انتخابشده و نمونة موناسکوسپورپورئوس وحشی، اختلاف آماری معنیداری ملاحظه میشود (05/0 P<). میزان تولید رنگدانة زرد در نمونههای انتخابشدةNA2 ،NA3 ،NA6 ، SA1و SA3بهطور معنیداری بیشتر از نمونة وحشی است (05/0 P<). میزان تولید رنگدانة نارنجی در نمونههایNA2 ،NA3 وNA6 در هر دو نسل بهطور معنیداری بیشتر از نمونة وحشی است (05/0 P<). نمونههایNA2 ،NA3 ، NA6 و NA7 در هر دو نسل بهطور معنیداری رنگدانة قرمز بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید میکنند (05/0 P<). با بررسی میزان تولید زیستتوده و رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز طی نسل اول و دوم کشت مشخص شد در نمونههای NA2، NA3 و NA6 مانند نمونة وحشی ازلحاظ مشخصههای بالا اختلاف آماری معنیداری وجود ندارد. همچنین، مقدار زیستتوده و رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز تولیدشده در نسل اول و دوم تولید همچنان بهطور معنیداری تغییر نکرده که نشاندهندة پایداری زیستتوده و هر سه رنگدانه در نمونههای گفتهشده طی دو نسل متوالی است (05/0 P<)
جدول 2- مقایسة میانگین تأثیر تیمار بر رشد زیستتوده و تولید رنگدانة قرمز، نارنجی و زرد
|
رنگدانة قرمز (رنگدانه در هر میلیلیتر) |
رنگدانة نارنجی (رنگدانه در هر میلیلیتر) |
رنگدانة زرد (رنگدانه در هر میلیلیتر) |
زیستتوده ( گرم بر لیتر) |
نمونه |
||||
|
نسل 2 |
نسل 1 |
نسل 2 |
نسل 1 |
نسل 2 |
نسل 1 |
نسل 2 |
نسل 1 |
|
|
f B 001/0 ± 21/0 |
d B 006/0 ± 23/0 |
f B 001/0 ± 18/0 |
d B 001/0 ± 18/0 |
f B 007/0 ± 33/0 |
e B 007/0 ± 32/0 |
b A 04/0 ± 94/4 |
ab A 04/0 ± 86/4 |
وحشی |
|
b B 03/0 ± 49/0 |
a B 04/0 ± 45/0 |
b B 007/0 ± 43/0 |
a B 01/0 ± 42/0 |
c B 007/0 ± 65/0 |
b B 02/0 ± 64/0 |
bc A 12/0 ± 80/4 |
b A 04/0 ± 78/4 |
NA2 |
|
d B 006/0 ± 40/0 |
b B 005/0 ± 39/0 |
c B 002/0 ± 38/0 |
b B 001/0 ± 38/0 |
d B 009/0 ± 53/0 |
c B 002/0 ± 54/0 |
a A 04/0 ± 14/5 |
a A 004/0 ± 99/4 |
NA3 |
|
c B 003/0 ± 44/0 |
a B 004/0 ± 44/0 |
e B 012/0 ± 30/0 |
c B 03/0 ± 30/0 |
b C 011/0 ± 67/0 |
b C 007/0 ± 66/0 |
bc A 14/0 ± 85/4 |
b AB 21/0 ± 75/4 |
NA6 |
|
e B 004/0 ± 35/0 |
c B 002/0 ± 34/0 |
d C 001/0 ± 35/0 |
d D 002/0 ± 20/0 |
d C 004/0 ± 53/0 |
e D 002/0 ± 31/0 |
bc A 002/0 ± 87/4 |
c B 15/0 ± 49/4 |
NA7 |
|
e C 001/0 ± 32/0 |
d D 002/0 ± 23/0 |
g D 001/0 ± 11/0 |
d C 001/0 ± 19/0 |
e D 004/0 ± 44/0 |
d C 003/0 ± 47/0 |
c A 03/0 ± 73/4 |
b A 04/0 ± 73/4 |
SA1 |
|
a B 03/0 ± 68/0 |
d C 002/0 ± 24/0 |
a C 002/0 ± 52/0 |
d D 002/0 ± 20/0 |
a D 008/0 ± 72/0 |
a C 005/0 ± 95/0 |
b A 004/0 ± 92/4 |
ab B 03/0 ± 86/4 |
SA3 |
در هر ستون، میانگینهای با حروف متفاوت کوچک، در سطح پنج درصد آزمون LSD اختلاف معنیدار دارند.
در هر ردیف، میانگینهای با حروف متفاوت بزرگ، در سطح پنج درصد آزمون LSD بهصورت جداگانه برای هر مشخصه اختلاف معنیدار دارند.
بحث و نتیجهگیری
بررسی ویژگیهای مورفولوژیکی قارچها بهخصوص قارچ موناسکوسپورپورئوس از اهمیت ویژهای برخوردار است؛ زیرا مطالعات قبلی گزارش کردهاند تغییرات مورفولوژیکی یک مداخلهکنندة اصلی در رشد سلولی و تولید رنگدانه است (24). گزارش شده است تغییرات مورفولوژی میسلیوم در قارچهای رشتهای از شاخصهای مهم وضعیت متابولیسم طی تخمیر است (19). در مطالعة دیکشیت و تالاپراگادا، همة جهشیافتههای موناسکوس تغییراتی در مورفولوژی اسپور نشان دادند که بهنوبةخود بر تولید متابولیتهای ثانویه و عملکرد آنها تأثیر گذاشته بودند (11). نتایج حاصل از بررسی عوامل جهشزای شیمیایی اسید نیترو و سدیمآزید بر ویژگیهای ظاهری پرگنه قارچ موناسکوسپورپورئوس در این مطالعه نشان داد ویژگیهای ظاهری پرگنههای انتخابشده که در معرض عوامل شیمیایی بودند، نسبت به سویة وحشی تغییر کردهاند. براساس نتایج بهدستآمده مشاهده شد قطر پرگنه در تمامی سویههای انتخابشده نسبت به سویة وحشی کاهش یافته است. به نظر میرسد عوامل جهشزا باعث کاهش اندازة قطر پرگنه میشوند؛ زیرا در مطالعة یانگاسمیت و همکاران[viii]، جهشهای قرمز و زرد موناسکوس اندازة پرگنه کوچکتری نسبت به سویة وحشی داشتند (12). در مطالعة مالا و همکاران[ix] نیز که از تیمار ماوراءبنفش بر قارچ آسپرژیلوسنایجر استفاده کردند، اندازة پرگنه در سویههای جهشیافته کاهش یافت (25). همچنین در مطالعة جاستین و همکاران[x] که از تیمار اسید نیترو بر آسپرژیلوسنایجر استفاده کردند، بررسیهای مورفولوژیکی نشان داد سویههای جهشیافته در مقایسه با سویة وحشی پرگنههای کوچکتری داشتند و این پرگنهها فقط با ذرهبین متمایز میشدند (26).کمترین میزان قطر مشاهدهشده متعلق به تیمار NA3 بود که بیشترین تغییر ظاهری را نسبت به سویة وحشی داشت. اندازه و شکل پرگنههای قارچهای رشتهای از فاکتورهای مهم برای شناسایی قارچاند. تقسیم هستهای و انشعابات میسلیومی قارچ موناسکوسپورپورئوس وحشی تقریباً یک پرگنه مدور ایجاد میکند که در آن قطر با سرعت یکنواختی افزایش مییابد (27). افزایش اندازة قطر پرگنه در سویة وحشی در روزهای بررسیشده روند یکنواختی داشت؛ درحالیکه در بیشتر سویههای در معرض عوامل شیمیایی، حداکثر افزایش قطر پرگنه در روز سوم تا چهارم دیده شد و پس از آن، سرعت افزایش قطر پرگنه خیلی آهسته بود و گاهی ثابت میماند. رنگ سطح پرگنه تمامی تیمارها نسبت به سویة وحشی تیرهتر بود و با افزایش زمان این رنگ تیرهتر شد. رنگ پشت پرگنههای انتخابشده قرمز تیره بود، درحالیکه در سویة وحشی نارنجی روشن بود. در مطالعهای که قارچ موناسکوس در معرض جهشزایی قرار گرفته بود، پرگنههای سویة مادری سفید و نارنجی بودند؛ درحالیکه رنگ پرگنههای سویة جهشیافته تیرهتر و نارنجی و قرمز بود (28)؛ این نتایج با یافتههای مطالعة حاضر مطابقت داشتند. در مطالعة حاضر هالة پرگنه در سویة وحشی سفید و پهن بود؛ درحالیکه در بقیة سویهها هاله باریکتر و رنگی بود. میسلیوم در سویة وحشی از تمامی تیمارها، بلندتر و سفید رنگ بود؛ اما در بقیة تیمارها میسلیومها کوتاهتر و سفید و رنگی بود. در مطالعة سو و همکاران[xi] در موناسکوسپورپورئوس سویة وحشی میسلیوم بلند و سفید بود و میسلیوم سویههای جهشیافته کوتاه و سفید و قرمز بودند (28). همچنین در مطالعة دیگری، میسلیومهای موناسکوسپورپورئوس سویة وحشی بلند بود؛ اما جهشهای سفید، زرد و قرمز میسلیومهای کوتاهی داشتند (14). نتایج دو مطالعة اخیر امکان ایجاد جهش در مطالعة حاضر را تأیید میکند. در پژوهش حاضر سطح پرگنه در سویة وحشی، صاف و فقط در مرکز برآمده بود؛ درحالیکه بیشتر سویههای تیمارشده سطح پرگنهشان کاملاً صاف یا کاملاً برآمده بود. تیمار NA2 که بیشترین رنگدانه را تولید کرده بود، سطح پرگنه صافی داشت. در مطالعة سو و همکاران، پرگنه جهشیافته موناسکوسپورپورئوس مسطح بود و به نظر میرسید رنگدانة قرمز بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید کرده است (28).
براساس شکل 1، 2 و 3، ویژگیهای میکروسکوپی نمونههای انتخابشده از تیمارهای مختلف قارچ موناسکوسپورپورئوس که در معرض اسید نیترو و سدیمآزید بودند، بهشدت تغییر کردند. برخی تغییرات شامل ضخیمشدگی، پیچخوردگی، تورم میسلیومی، تولید کلامیدوسپور کنیدیایی و تغییراتی در تعداد دیوارههای عرضی در نمای میکروسکوپی مشاهده شدند. دیوارة عرضی در تیمارهای NA1، NA2، NA4 و NA6 مشاهده شد و دیوارة عرضی در تیمار NA4 قطعهقطعه شده بود. در بیشتر تیمارها کلامیدوسپور کنیدیایی مشاهده شد، اما کلامیدوسپور کنیدیایی در سویة وحشی دیده نشد؛ زیرا در موارد خیلی نادر کلامیدوسپور کنیدیایی تشکیل میشود (29). در تیمار NA1 میسلیومها بهشدت پیچخوردگی داشتند و در تیمار NA3 شدت پیچخوردگی کمتر بود.
بیشتر سویههای انتخابشده ازلحاظ مورفولوژیکی و قطر میسلیوم نزدیک به هم بودند. قطر میسلیوم در سویههای انتخابشده در مقایسه با سویة وحشی افزایش یافته بود؛ بهطوریکه در تیمار SA1 بیشترین افزایش قطر ملاحظه شد (شکل3) و قطر میسلیوم بیش از 50 میکرومتر بود. در مطالعة سانتیگو و همکاران[xii] که از عوامل جهشزا برای جهشزایی بر آسپرژیلوسنایجر استفاده کردند، طول و قطر میسلیوم در سویههای جهشیافته بهطور معنیداری نسبت به سویة وحشی تغییر کرده و افزایش یافته بودند (30). تجمع رنگدانههای موناسکوس با مورفولوژی میسلیوم بهویژه قطر میسلیوم ارتباط زیادی دارد. تغییرات در قطر میسلیوم ممکن است نتیجة تجمع تودة داخل سلولی باشند و میتوانند بهعنوان شاخصی برای کنترل بیوسنتز و ترشح رنگدانهها در تخمیر استفاده شوند. بیوسنتز رنگدانه را با تنظیم قطر میسلیوم میتوان کنترل کرد. حفظ مورفولوژی مناسب میسلیوم، به بازدهی رنگدانهای پایدار و بالا در تخمیر منجر میشود (19). تولیدمثل جنسی و غیرجنسی توسط سویههای انتخابشده، در پژوهش حاضر مشاهده شد. طی 7 روز زمان گرمخانهگذاری تیمار NA1 آسک تولید کرده بود که آسک محصول تولیدمثل جنسی است. بقیة تیمارها هیچکدام آسک تولید نکردند و عوامل شیمیایی اسید نیترو بر تولیدمثل موناسکوس تأثیر گذاشته بود؛ زیرا موناسکوسپورپورئوس گونهای از جنس موناسکوس است که بهطور کلی تولیدمثل غیرجنسی دارد، اگرچه اشکال کامل (اشکال تولیدمثل جنسی) نیز یافت شدهاند (27). در پژوهش دیگری تصویر میکروسکوپی تیمارهای موناسکوس که در معرض عوامل جهشزا قرار گرفتند، چرخة زندگی غیرجنسی و جنسی را نشان دادند؛ آنهایی چرخة زندگی جنسی داشتند که رنگدانة بیشتری تولید کردند و ممکن است این دلیل بالاتربودن رنگدانة جهشیافتهها نسبت به سویة وحشی باشد (11). درحالیکه در مطالعة لین و ایزوکا[xiii] موناسکوسکوآلیانگ جهشیافته توانایی تشکیل آسکوسپور (تولیدمثل جنسی) در محیط PDA را از دست داد و تمایل به تشکیل کنیدیوم (تولیدمثل غیرجنسی) داشت و رشد نیز بهشدت کاهش یافت (31)؛ بنابراین، جهش در این پژوهش تأثیر منفی بر تولید رنگدانه گذاشته است.
نتایج نشان دادند نمونههای انتخابشده طی مراحل تیمار سوسپانسیون اسپوری با اسید نیترو بهطور معنیداری با نمونة وحشی اختلاف داشتند و ویژگیهای رشد و تولید متابولیتهای رنگدانة زرد، قرمز و نارنجی با نمونة وحشی متفاوت بودند. میزان تولید زیستتوده در نمونههای انتخابشدة NA3 بیشتر از بقیة نمونهها بود؛ اما در نسل اول اختلاف آماری معنیداری با نمونة وحشی و نمونة SA3نداشت (05/0 P<). بیشتر سویههای تیمارشده بهطور معنیداری رنگدانة بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید کردند (05/0 P<). میزان تولید رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز در نمونههای انتخابشدةNA2 ،NA3 و NA6 بهطور معنیداری بیشتر از نمونة وحشی بود (05/0 P<). در مطالعة دیکشیت و تالاپراگادا نیز سویههای موناسکوس جهشیافته دو برابر رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید کردند (11). در پژوهش یانگاسمیت و همکاران نیز پس از اندازهگیری رنگدانه مشخص شد جهش بیشترین تأثیر را بر افزایش تولید رنگدانة گونههای موناسکوس داشته است (14). در مطالعة حاضر پس از بررسیهای انجامشده بر تولید رنگدانه و زیستتوده مشخص شد بهجز سویة وحشی اختلاف آماری معنیداری در نمونههای NA2،NA3 و NA6 در میزان زیستتوده و رنگدانة زرد، نارنجی و قرمز طی دو نسل وجود ندارد و نشاندهندة پایداری این نمونهها طی دو نسل متوالی است. در مطالعات قبلی نیز مشخصة رشد موناسکوس جهشیافته پایدار بوده است (32). در پژوهش وانگسورن و همکاران[xiv] ثبات موناسکوسپورپورئوس جهشیافته نسبت به حلالهای مختلف در سویة وحشی و تمام نسلهای جهشیافته مشاهده شد (33). در مطالعات دیگر که از عوامل جهشزا برای جهشزایی دیگر میکروارگانیسمها استفاده شده بود، سویههای جهشیافته تا چند نسل پایدار بودند؛ برای مثال، در مطالعهای که از جهشزایی آسپرژیلوسترئوس برای افزایش تولید لوواستاتین استفاده شد، بازده تولید لواستاتین در جهشیافتهها تا 9 نسل پایدار بود (34). نتایج پژوهش حاضر تأثیرگذاری عوامل شیمیایی جهشزا بر قارچ موناسکوسپورپورئوس را نشان داد؛ درنتیجه، با عوامل شیمیایی جهشزا به سویههایی میتوان دست یافت که بهطور معنیداری تا چند برابر رنگدانة بیشتری نسبت به سویة وحشی تولید میکنند و این سویهها میتوانند پایدار باشند. بهکارگیری اسید نیترو بهعنوان تیمار شیمیایی جهشزا، بر ویژگیهای مورفولوژیکی و تولید رنگدانة قارچ موناسکوس میتواند تأثیرگذار باشد که احتمالاً بهدلیل ایجاد جهش در ساختار ژنتیکی این قارچ است.
[1]- Ascomycetes
[2]- Ascomycota
[3]- Monascaceae
[4]- Dikshit and Tallapraga
[5]- Potato dextrose agar (PDA)
[6]- Yeast powder-Soluble starch
[7]- Least Significant Difference (LSD)
[viii]- Yongsmith et al
[ix]- Mala et al
[x]- Justin et al
[xi]- Suh et al
[xii]- Santiago et al
[xiii]- Lin and Iizuka
[xiv]- Wongsorn et al
)