نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

2 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده علوم و فناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

3 دانشیار گروه گیاهان دارویی، دانشکده گیاهان دارویی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

4 استادیار، گروه صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: امروزه، کاربرد گستردۀ پپتیدهای ضدمیکروبی به‌شکل نگهدارندۀ طبیعی به‌علت عوارض نگهدارنده‌های مصنوعی (ایجاد سرطان‌ها و آسیب به کبد در داروها و غذاها) مدنظر قرار گرفته است.
مواد و روش‏‏ها: در پژوهش حاضر، پنج پپتید ضدباکتریایی شامل نایسین A از Lactococcus lactis، ملیتین ازApis mellifera، کوپسین ازCoprinopsis cinerea، ترپن از Erythrolobus australicus و تیونین از Arabidopsis thaliana با تحلیل‌های بیوانفورماتیکی مطالعه شدند.
نتایج: نتایج نشان دادند پپتیدهای بررسی‌شده در یوکاریوت‌ها و پروکاریوت مطالعه‌شده دارای هدف‌گیری سیتوپلاسمی هستند و در موجودات مختلف محافظت‌شده نیستند. پپتیدهای بررسی‌شده ازنظر تعداد مارپیچ‌های آلفا و صفحه‌های بتا تنوع داشتند. نتایج درخت فیلوژنتیکی با Mega5 نشان دادند به‌غیر‌از Apis mellifera، چهار گونۀ دیگر در یک خوشه قرار می‌گیرند. دومین‌ها در پنج گونۀ بررسی‌شده متفاوت بودند، اما همگی دارای ویژگی‌های ضدباکتری بودند. پپتیدهای مطالعه‌شده دامنۀ متنوعی از ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی را نشان دادند. الگوی جانشینی، مدل جایگزینی و D- Tajima توالی پپتیدهای مطالعه‌شده نشان داد Apis mellifera در طول تکامل از سایر گونه‌ها جدا شده است. مدل‌سازی سه‌بعدی پپتیدهای بررسی‌شده به روش همولوژی مدلینگ و با استفاده از پایگاه دادۀ Swiss Model نشان داد ساختار سه‌بعدی ترپن و تیونین کیفیت زیادی دارد. مراجعه به سایت‌های peptidecutter و allermatch نشان داد پپتیدهای نایسین A، ملیتین، کوپسین، ترپن و تیونین حساسیت‌زا نیستند. به‌منظور تعیین حداقل غلظت کشندگی و حداقل غلظت بازدارندگی از روش دیسک بلانک و روش چاهک‌گذاری استفاده شد. نتایج بازدارندگی با پپتید نایسین استخراج‌شده از باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس نشان دادند بیشترین هالۀ بازدارندگی در استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی به روش چاهک‌گذاری و دیسک بلانک به‌ترتیب 19 و 23 میلی‌متر و 5 و 1 میلی‌متر است.
بحث و نتیجه‏گیری: نتایج نشان دادند نایسین می‌تواند به‌شکل نگهدارندۀ طبیعی برای تأخیر در فاسدشدن مواد غذایی در برابر باکتری‌‌های گرم مثبت استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

A Bioinformatics Analysis of Antibacterial Peptides in Five Species of Prokaryote and Eukaryote and the Evaluation of Antibacterial Effects of Nisin on Gram-positive and Gram-negative Bacteria

نویسندگان [English]

  • Masoumeh Fallah ziarani 1
  • Masoud Tohidfar 2
  • Mohammad hosein Mirjalili 3
  • Hassan Ahmadi gavlighi 4

1 Ph.D. student، Faculty of Plant Biotechnology, Department of Plant Biotechnology & Life Science, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran

2 Associate Professor, Faculty of Plant Biotechnology, Department of Plant Biotechnology & Life Science, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran

3 Associate Professor, Faculty of Medicinal Plants, Medicinal Plants and Drugs Research Institute, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran.

4 Associate Professor,Faculty of Food Science and Technology, Departeman of Agriculture, Tarbiat modarres University, Tehran, Iran.

چکیده [English]

Introduction: Nowadays, the widespread use of antimicrobial peptides as a natural preservative due to the side effects of synthetic preservatives (cancers and liver damages in medicines and foods) has received much attention.
Materials and methods: In the present study, five antibacterial peptides including Nisin A of Lactococcus lactis, melitin of Apis mellifera, copsin from Coprinopsis cinerea, Terpene of Erythrolobus australicus, and thionin from Arabidopsis thaliana were studied using bioinformatics analysis.
Results: The results showed that these peptides (peptides studied in eukaryotics and prokaryotics) had cytoplasmic targeting and the studied peptides were not protected in different organisms. There was a variation in the number of α helixes and β sheets among the studied peptides. The results of the phylogenetic tree by Mega5 showed that besides Apis mellifera, four other species were located in the same cluster. The domains were different in the five studied species, but all domains had antibacterial properties. These peptides showed a wide range of physicochemical properties. The substitution template, substitution model, and D-Tajima sequence of the studied peptides showed that Apis mellifera was isolated from other species during evolution. Three-dimensional (3-D) modeling of peptides by the homology modeling method and Swiss Model database showed that the three-dimensional structure of terpene and thionin had high quality. Using peptidecutter and allermatch websites, it was found that nisin A, melitin, copsine, terpene, and thionin were not allergenic. To determine the minimum lethal concentration and minimum inhibitory concentration, the disk diffusion method was used. The highest inhibition of nisin of Lactococcus Lactis was obtained in Staphylococcus aureus and Escherichia coli by disk diffusion. Blank discs were 19, 23 mm, 5, and 1 mm, respectively.
Discussion and conclusion: The results showed that nisin can be used as a natural preservative to delay food spoilage against gram-positive bacteria.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioinformatic analysis
  • Antibacterial Peptides
  • Eukaryote and Prokaryote
  • Allergen
  • Inhibitory effects

مقدمه

باکتری‌هایی که منافع مشترک دارند، ترکیبات ضد‌میکروبی را به‌منظور بقای خود تولید می‌کنند؛ پپتیدهای ضدمیکروبی[1] نوعی ترکیب ضدمیکروبی از این گروه هستند که به اختصار AMP نامیده می‌شوند. پپتیدهای ضدمیکروبی متنوعی از منابع مختلف گیاهان و حشرات تا مهره‌داران پست و پستانداران شناسایی شده‌اند (1-4). ترکیبات یادشده به‌طور مشخص شامل دو گروه باکتریوسین‌ها و آنتی‌بیوتیک‌های پپتیدی می‌شوند که بر پایۀ سازوکار بیوسنتز طبقه‌بندی شده‌اند. باکتریوسین‌ها، ترکیباتی هستند که ریبوزوم‌ها آنها را سنتز می‌کنند و در باکتری‌ها تولید می‌شوند و علیه باکتری‌هایی فعال هستند که خویشاوندی نزدیکی با باکتری تولید‌کننده دارند (5). بیشتر باکتریوسین‌ها با ویژگی آبدوستی یا آبگریزی، غشای سلولی را هدف می‌گیرند؛ درحالی‌که برخی از آنها بیوسنتز پلیمرهای زیستی یا فعالیت آنزیم‌ها را مهار و آثار مهاری خود را اِعمال می‌کنند (6).

این ترکیبات در برابر حرارت، اسیدیتۀ کم، حلال‌های آلی ضعیف، سرما و یخ، نمک‌ها و آنزیم‌ها مقاوم هستند و درنتیجه، این ترکیبات به‌شکل نگهدارنده در مواد غذایی استفاده می‌شوند (6).

یکی از کاربردهای پپتیدهای ضدباکتری، استفاده از آنها به‌شکل نگهدارنده در داروها و مواد غذایی است (4). باتوجه‌به اهمیت این پپتیدها، داده‌های بررسی روابط تکاملی و بررسی ساختار ژن و پروئین ضروری است.

هدف پژوهش حاضر، بررسی in silico شباهت‌ها و تفاوت‌های پپتیدهای ضدباکتری در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی ازجمله قارچ Coprinopsis cinerea، گیاه Arabidopsis thaliana، زنبور عسل Apis mellifera(یوکاریوت‌های پرسلولی)، باکتری Lactococcus lactis (موجود پروکاریوت) و جلبک  Erythrolobus australicus(پروکاریوت تک‌سلولی) است؛ علاوه‌براین، تجزیه‌و‌تحلیل فیلوژنتیک این پپتیدها و مشخص‌کردن عملکرد آنها، بررسی ساختمان دوم و سوم پروتئین، تغییرات پس‌از ترجمه، هدف‌گیری و بررسی تحلیل‌های بیوانفورماتیکی آنها در راستای تعیین ویژگی‌های این پروتئین‌ها از دیگر اهداف پژوهش حاضر است. هدف اصلی پژوهش حاضر، بررسی شباهت‌ها و تفاوت‌های پپتیدهای ضدمیکروبی در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی است؛ همچنین در پژوهش حاضر، اثر پروتئین نایسین روی یک باکتری گرم مثبت و یک باکتری گرم منفی بررسی می‌شود.

 

مواد و روش‌ها

توالی‌های mRNA و پروتئین پنج پپتید ضدباکتری شامل نایسین A از Lactococcus lactis، ملیتین از Apis mellifera، کوپسین از Coprinopsis cinerea، ترپن از Erythrolobus australicus و تیونین از Arabidopsis thaliana که در بانک ژن دردسترس بودند، از پایگاه دادۀ NCBI[2] دریافت شدند؛ به این منظور، ابتدا برنامۀ [3]T-Coffee برای هم‌ردیفی چندگانۀ توالی‌ها به کار رفت و از نرم‌افزار MEGA 5 برای رسم درخت فیلوژنتیکی استفاده شد. ویژگی‌های پروتئین با مراجعه به بانک swissprot بررسی شدند. ساختار دوم و سوم پپتیدهای ضدباکتری تحلیل شدند. به‌منظور بررسی هدف‌گیری این پپتیدها از بانک TargetP استفاده شد. دومین‌های محافظت‌شدۀ پنج نوع پپتید مطالعه‌شده در پژوهش حاضر با Interproscan بررسی شدند. ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی شامل تعداد آمینواسید، وزن مولکولی، نقطۀ ایزوالکتریک، درصد چربی و درصد آبگریزی در پپتیدهای ضدباکتری مطالعه‌شده با protparam server بررسی شدند. الگوی جانشینی، مدل جایگزینی و D- Tajima توالی پپتیدهای مطالعه‌شده نیز تعیین شدند. به‌منظور پیش‌بینی ساختار ثانویۀ پروتئین‌ها از نرم‌افزار PSIPRED و سرور GoRI استفاده شد. به‌منظور تعیین مدل ساختاری این پپتیدها، ابتدا توالی آمینواسیدی آنها از پایگاه دادۀ NCBI به فرمت FASTA ذخیره شد و سپس با ابزار [4]BLASTP و PSIBLAST در پایگاه دادۀ PDB جستجو شد تا از این طریق، الگوی مناسبی برای انجام مشابهت مدلینگ به دست آید. در انتخاب الگو، معیارهایی نظیر وضوح کمتر از 3 آنگستروم مربوط به کریستالوگرافی اشعۀ X، R- value کمتر از 3/0، شباهت بیش از 35 درصد الگو با توالی مطالعه‌شده و E- value کم اِعمال شدند (7) تا اعتبار و اطمینان‌پذیری مدل افزایش یابد. پس‌‌از هم‌ردیفی توالی الگو با توالی مطالعه‌شده، مدل‌سازی به روش مدلینگ و با استفاده از پایگاه اطلاعاتی Swiss Model انجام شد (7)؛ در ادامه، ساختار مدل‌سازی‌شده با برنامۀ SPDB viewer (8-10) بهینه‌سازی انرژی (Energy minimization) شد. ارزیابی کیفیت شاخص‌های ساختاری مدل ساخته‌شده و ترسیم نمودار راماچاندران با سرورRampage (9) انجام شد. به‌منظور تأیید ساختارهای مدل‌سازی‌شده از سرور PROSA استفاده شد و در نهایت، حساسیت‌زایی پپتیدهای مدنظر با دو سایت [5]Allermatch و peptidecutter[6] بررسی شد.

به‌منظور سنجش اثر ضد‌میکروبی پپتید نایسین، پروتئین مدنظر از باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس استخراج شد (11). باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس سویۀ ATCC 11454 از مرکز منطقه‌ای مجموعه قارچ‌ها و باکتری‌های صنعتی ایران[7] تهیه شد و روش‌های دیسک‌گذاری و چاهک‌گذاری برای بررسی اثر ضدمیکروبی نایسین استخراج‌شده از باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس استفاده شدند (12).

در روش دیسکی، کلنی 24 ساعتۀ باکتری اشریشیا کلی به‌عنوان نمونۀ گرم منفی و باکتری استافیلوکوکوس اورئوس به‌عنوان نمونۀ گرم مثبت کشت‌شده با لوپ برداشته و در 5 میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی استریل درون لولۀ آزمایش استریل به‌طور کامل مخلوط شدند؛ سپس سوسپانسیون یکنواختی به غلظت نیم مک فارلند معادل CFU/ml 106×5/1 از باکتری آزمایش‌شده تهیه و با سواپ استریل به‌طور چمنی روی محیط LB آگار کشت داده شد. به‌منظور تهیۀ دیسک‌های حاوی عصارۀ نایسین، 200 ماکرولیتر پروتئین حاوی نایسین حل‌شده در حلال مربوطه روی دیسک‌های بلانک استریل اضافه و دو ساعت زمان داده شد تا عصاره به‌طور کامل جذب دیسک‌های کاغذی شود؛ سپس دیسک‌ها در فواصل مناسب روی پلیت قرار داده شدند و نمونه‌ها به‌مدت 18 ساعت در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد انکوبه شدند.

در روش چاهک از پلیت‌های حاوی محیط‌کشت LB آگار آغشته به باکتری‌های اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که با پیپت پاستور استریل مخصوص ایجاد چاهک، گودی در محیط‌کشت ایجاد شد و با سمپلر 50 لاندا از پروتئین مدنظر در هر چاهک قرار داده شد؛ سپس پلیت‌ها به‌مدت 18 ساعت در انکوباتور 37 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند. عملیات یادشده دو بار برای هر نمونه تکرار شد؛ سپس قطر هالۀ رشدنکردن ارزیابی و بر اساس میلی‌متر محاسبه و میانگین آن ثبت شد. کانامایسین برای شاهد مثبت و سرم فیزیولوژی برای شاهد منفی در هر دو روش چاهک‌گذاری و دیسک بلانک استفاده شدند. قطر هالۀ رشد بیشتر از 11 میلی‌متر به معنای رشدنکردن، هالۀ 8 تا 10 میلی‌متر و هالۀ 5 تا 7 میلی‌متر به‌عنوان شاهد متوسط و هالۀ کمتر از 5 میلی‌متر به معنای عدم مهارکنندگی محسوب می‌شود (12).

در روش تعیین حداقل غلظت ممانعت‌کنندگی[8]، 10 عدد فالکون 50 میلی‌لیتری برای هر باکتری تهیه و به هر فالکون، 500 ماکرولیتر LB مایع اضافه شد. به‌منظور رقت‌سازی، 500 ماکرولیتر از عصاره به لولۀ شمارۀ 1 اضافه و با شیکر کاملاً مخلوط شد؛ سپس از لولۀ شمارۀ 1، 500 ماکرولیتر محلول (عصاره + LB) به لولۀ شمارۀ 2 اضافه شد و این کار با ‌ترتیب یادشده تا فالکون شمارۀ 7 ادامه یافت؛ درنهایت پس‌از شیکرکردن فالکون شمارۀ 7، 500 ماکرولیتر از محلول آن دور ریخته شد. مقدار 100 ماکرولیتر از سوسپانسیون باکتری با غلظت نیم مک‌فارلند  CFU/ml)106 × 5/1( که از پیش تهیه شده بود، به تمام هفت فالکون اضافه شد. فالکون شمارۀ 8 حاوی عصاره + LB (بدون باکتری) بود. فالکون شمارۀ 9 حاوی محیط LB + باکتری بدون عصاره بود و به‌عنوان شاهد رشد برای تعیین کدورت رشد باکتری استفاده شد. فالکون شمارۀ 10 که تنها حاوی محیط LB بود، شاهدی برای کنترل استریلیتی محیط‌کشت بود؛ به این معنا که اگر باکتری رشد نکند، شفافیت محیط درون فالکون باید به این شکل باشد. به‌منظور انجام آزمایش یادشده، غلظت‌هایی از 500، 250، 125، 5/62، 25/31، 63/15، 81/7 استفاده شدند. نتیجۀ MIC بر اساس کدورت محیط‌کشت که نشان‌دهندۀ رشد باکتری است، بررسی شد (12).

به‌منظور تعیین حداقل غلظت کشندگی پس‌از تعیین MIC (غلظتی از آنتی‌بیوتیک که رشد باکتری را مهار می‌کند)، از فالکون‌هایی که تعیین رقت شده بودند با سوآپ روی محیط‌کشت LB آگار کشت داده شد. پلیت‌ها به‌مدت 16 تا 18 ساعت در انکوباتور 37 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند و رشدنکردن باکتری نشان‌دهندۀ MBC[9] بود (MBC، حداقل غلظتی از پپتید ضدباکتری است که باکتری را از بین می‌برد). سرم فیزیولوژی برای شاهد منفی و کانامایسین برای شاهد مثبت استفاده شد.

نتایج

نتایج T- coffee و هم‌ردیفی توالی‌های پپتیدهای مطالعه‌شده با نرم‌افزار MEGA 5 نشان دادند پپتیدهای ضدباکتری در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی بررسی‌شده طی تکامل محافظت‌شده نیستند و در موجودات مختلف تغییر یافته‌اند (شکل 1). در هم‌ردیفی پپتیدهای مطالعه‌شده با استفاده ازT- coffee مشخص شد تمام نمونه‌ها در بخش N ترمینال سه آمینواسید اول محافظت‌شده‌اند و در هم‌ردیفی توالی‌های آنها، 18 آمینواسید در سه نمونه از پنج نمونه و 44 آمینواسید در دو نمونه از پنج نمونۀ بررسی‌شده در طول تکامل محافظت‌شده‌اند که از دلایل آن می‌توان به درصد GC در این توالی‌ها اشاره کرد (11).

تحلیل فیلوژنتیکی نشان داد پنج پپتید بررسی‌شده در مطالعۀ حاضر در دو خوشه قرار می‌گیرند. بر اساس نتایج خوشه‌بندی مشخص شد ملیتین در Apis mellifera پیش‌تر از چهار پپتید دیگر اشتقاق یافته است و چهار پپتید دیگر شامل نایسین از Lactococcus lactis، کوپسین از Coprinopsis cinerea، ترپن از Erythrolobus australicus و تیونین از Arabidopsis thaliana به‌تازگی اشتقاق یافته‌اند و در یک گروه قرار گرفته‌اند (شکل 1). نتایج خوشه‌بندی نشان دادند خوشه‌بندی پپتیدهای ضدباکتری ارتباطی با گونۀ مدنظر ندارد؛ به‌طوری‌که پپتید موجود در باکتری Lactococcus lactis با سه گونۀ موجود از یوکاریوت‌ها در یک گروه قرار دارد و ملیتین در Apis melliferaکه جزو گروه یوکاریوت‌هاست، در گروه جداگانه‌ای قرار می‌گیرد (شکل 2).  

شکل 1- نتایج هم‌ردیفی پپتیدهای بررسی‌شده با T- Coffee 

شکل 2- درخت فیلوژنی بر اساس توالی پپتیدهای ضدباکتری پنج گونۀ مطالعه‌شده با استفاده از روش خوشه‌بندی Maximum likelihood

مقایسۀ گونه‌های بررسی‌شده در ماتریس تشابه نشان داد کمترین تفاوت با عدد 56/1 (یعنی دو گونه‌ای که بیشترین شباهت را به هم دارند) به دو گونۀ Coprinopsis cinerea و Lactococcus lactis تعلق دارد که گونۀ Coprinopsis cinerea جزو یوکاریوت‌های پرسلولی و Lactococcus lactisجزو پروکاریوت‌های تک‌سلولی است و بیشترین تفاوت با عدد 94/2 به دو گونۀ Apis melliferaو Lactococcus lactis تعلق دارد که Apis mellifera جزو یوکاریوت‌های پرسلولی و Lactococcus lactis جزو پروکاریوت‌هاست و کمترین شباهت را به هم دارند (جدول 1)؛ یکی از دلایل شبیه‌نبودن این دو گونه، متفاوت‌بودن درصد GC آنهاست (13).

 

 

جدول 1- ماتریس عدد تشابه

 

1

2

3

4

5

1. AAS18311.1 nisin Lactococcus lactis

 

 

 

 

 

2. AFI40556.1 melittin Apis mellifera

2.94

 

 

 

 

3. AIU55999.1 copsin precursor Coprinopsis cinerea

1.56

2.30

 

 

 

4. AZO92734.1 terpene synthase 2 Erythrolobus australicus

2.66

2.30

2.38

 

 

5. AAC41678.1 thionin Arabidopsis thaliana

2.43

2.86

2.70

2.60

 

 

 

دومین پپتیدهای بررسی‌شده در Arabidopsis thaliana جزو خانوادۀ Thionin-like superfamily، در Lactococcus lactis جزو خانوادۀ Gallidermin، در Apis mellifera جزو خانوادۀ Melittin/Api allergen، در Coprinopsis cinerea جزو خانوادۀ Fungal defensin Copsin و در Erythrolobusaustralicus جزو خانوادۀ Isoprenoid synthase domain superfamily است و اگرچه دومین‌ها متفاوت هستند، تمام دومین‌های بررسی‌شده ویژگی‌های ضدباکتری مشابه دارند.

تحلیل هدف‌گیری نشان داد تمام پپتیدهای ضدباکتری مطالعه‌شده جزو پروتئین‌های سیتوپلاسمی هستند که این امر به‌علت نقش پپتیدهای ضدباکتری است. در سلول‌های پروکاریوت (سلول باکتری)، پپتیدهای ضدمیکروبی آبدوست لیپیدهای آنیونی موجود در سطح خارجی غشای باکتری را می‌شناسند و در سلول‌های یوکاریوت، لیپیدهای آنیونی یادشده در سمت سیتوپلاسمی غشا قرار می‌گیرند (14).

درصد GC (درصد گوانین و سیتوزین در توالی بررسی‌شده) نشان داد در یوکاریوت‌های بررسی‌شده، بیشترین درصد GC با مقدار 46/59 درصد به Arabidopsis thaliana و کمترین درصد GC با مقدار 53/23 درصد به Apis melliferaتعلق دارد. تحلیل محتوای GC نشان داد ژن‌های دارای محتوای GC زیاد نسبت به ژن‌های دارای محتوای GC کمتر پایداری بیشتری در برابر حرارت دارند (12). نتایج نشان دادند پایداری این پپتیدها متنوع است و ارتباطی با گونۀ بررسی‌شده، پروکاریوت یا یوکاریوت تک‌سلولی و پرسلولی‌بودن این گونه‌ها ندارد.

مقایسۀ پپتیدهای بررسی‌شده در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها نشان داد تعداد آمینواسید، وزن مولکولی، مقدار دامنۀ ایزوالکتریک، شاخص آلیفاتیک، شاخص ناپایداری و متوسط GRAVY (ویژگی آبگریزی پروتئین) پپتیدهای بررسی‌شده متنوع است. شاخص آلیفاتیک نشان داد ساختار پپتیدهای مطالعه‌شده در یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌ها ازنظر دامنۀ پایداری در دما متنوع است؛ پپتیدهای پایدار در دمای زیاد می‌توانند به‌شکل نگهدارنده در مواد غذایی استفاده شوند. نتایج نشان دادند شاخص ناپایداری در پپتیدهای بررسی‌شده در گستره‌ای از پروتئین‌های پایدار تا ناپایدار قرار می‌گیرد و پایداری پروتئین‌ها در استفاده از آنها ‌شکل نگهدارنده مؤثر است. متوسط GRAVY کل محاسبه‌شده برای پروتئین‌ها از تقسیم مجموع هیدروپاتی (شاخصی از میزان آبگریزی آمینواسید) محاسبه‌شده برای تمام آمینواسیدها در پروتئین بر تعداد کل آمینواسیدهای آن پروتئین به دست می‌آید. در بررسی GRAVY پروتئین در یوکاریوت و پروکاریوت‌های بررسی‌شده مشخص شد پپتیدهای بررسی‌شده در دامنۀ متفاوتی ازنظر آبگریزی قرار دارد. از پپتیدهای آبگریز می‌توان به‌شکل نگهدارنده در داروها استفاده کرد؛ زیرا این پپتیدهای ضدباکتری را می‌توان درون پپتیدهای آبدوست قرار داد و باتوجه‌به هدف مدنظر استفاده کرد.

آزمون فرضیۀ خنثی نشان داد پپتیدهای مطالعه‌شده در یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌های بررسی‌شده مشابهت زیادی باهم دارند، ولی ملیتین درApismellifera الگوی جانشینی بسیار متفاوتی دارد که نشان می‌دهد در طول تکامل، این گونه از دیگر گونه‌ها جدا شده است.

بر اساس تحلیل انتخاب مدل جایگزینی[10]، بهترین مدل جایگزینی برای تحلیل فیلوژنتیکی، مدل WAG + I است. تحلیل تنوع ژنتیکی در یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی و پروکاریوت بررسی‌شده نشان داد در حدود 55 درصد از طول توالی پپتیدهای مطالعه‌شده، جهش‌های نوع جایگزینی رخ داده‌اند که در این میان، حدود 26 درصد از طول توالی ژن دارای چندشکلی‌های آگاهی‌بخش (تعداد سایت‌های تفرق‌یافته به کل سایت‌ها) است. تنوع نوکلئوتیدی در یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی و پروکاریوت مطالعه‌شده حدود 24 درصد است. نتایج نشان دادند D- Tajima که به‌منظور بررسی اثر فشار انتخاب روی یک ژن در پروکاریوت و یوکاریوت‌های بررسی‌شده به کار برده می‌شود، 42/0 است؛ با استفاده از D- Tajima که برای آزمون تئوری خنثی[11] به کار برده می‌شود، مشخص شد ژن‌هایی که تنوع فراوانی اللی آنها کم است، D- Tajima منفی (کمتر از صفر) دارند و الل‌های نادر افزایش می‌یابند و جمعیت پس‌از یک bottleneck (جمعیتی که شامل تعداد محدودی از جمعیت اولیه است) جدید گسترش می‌یابد (جدول 2). تحلیل تنوع ژنتیکی در یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی و پروکاریوت‌ها به‌طور هم‌زمان دقیقاً مانند نتایج تحلیل تنوع ژنتیکی در یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی است.

 

 

جدول 2- نتیجۀ آزمون D- Tajima برای پپتیدهای مطالعه‌شده

m

S

Ps

Ɵ

Π

D

5

179

545732/0

261951/0

247561/0

418805/0-

 

 

بررسی ساختار دوم پپتید نایسین در Lactococcus lactis نشان داد این پروتئین حاوی 3 رشتۀ مارپیچ β است. ساختار دوم پپتید ملیتین در Apis mellifera حاوی 4 رشتۀ مارپیچ helix α، ساختار دوم پپتید کوپسین درCoprinopsis cinerea حاوی 5 رشتۀ مارپیچ helix α و 3 رشتۀ مارپیچ β، ساختار دوم پپتید ترپن در Erythrolobus australicus حاوی 16 رشتۀ مارپیچ helix α و 2 رشتۀ مارپیچ β و ساختار دوم پپتید تیونین درArabidopsis thaliana حاوی 2 رشتۀ مارپیچ helix α است. هرچه تعداد مارپیچ helix α بیشتر باشد، انعطاف پروتئین کمتر و پایداری آن بیشتر می‌شود و می‌توان آن را به‌شکل نگهدارندۀ طبیعی در مواد غذایی‌ای که آماده‌کردن آنها در دمای زیاد انجام می‌شود، استفاده کرد. نتایج نشان دادند ساختار دوم پپتیدهای بررسی‌شده در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌های بررسی‌شده متنوع است.

الگوی منتخب برای مدل‌سازی پپتید نایسین در Lactococcus lactis (1wco.1.A) با قدرت تفکیک 4 آنگستروم از نایسین Z، ملیتین در Apis mellifera (2mlt.1.A) از ملیتین، کوپسیندر Coprinopsis cinerea(2mn5.1.A) از کوپسین، ترپن در Erythrolobus australicus (5dz2.1.A) با قدرت تفکیک 4 آنگستروم از Germacradienol/geosmin synthase و تیونین درArabidopsis thaliana (1orl.1.A) از Viscotoxin C1 کریستالوگرافی شد و این مدل‌ها به‌ترتیب دارای 34، 70، 57، 73 و 46 آمینواسید بودند. میزان یکسانی الگوهای پیش‌بینی‌شده با پپتیدهای هدف به‌ترتیب 12/94، 100، 25/98، 05/23 و 86/41 درصد بود؛ با مدل‌سازی مناسب می‌توان پپتیدهای دیگر را که خاصیت ضدباکتری دارند، شناسایی کرد. نتایج نشان دادند میزان یکسانی الگوهای پیش‌بینی شده با پپتیدهای هدف در پروکاریوت بررسی‌شده و در یوکاریوت‌های پرسلولی و تک‌سلولی قابل‌قبول است.

باتوجه‌به میزان شباهت کم الگوی 5dz2.1.A و 1orl.1.A با پپتید هدف، این احتمال وجود داشت که مدل‌سازی به‌شکل ضعیف‌تری انجام شده باشد؛ ازاین‌رو و با‌توجه‌به اهمیت این پپتیدها به‌عنوان ضدباکتری، نخستین گام در مطالعه‌های بعدی، مدل‌سازی این پروتئین بود که از طریق سایت Swiss Model انجام شد.

 

1

2

3

4

5

 

شکل 3- ساختار مدل‌سازی‌شدۀ 1. پپتید نایسین در Lactococcus lactis، 2. پپتید ملیتین در Apis mellifera، 3. پپتید کوپسیندرCoprinopsis cinerea، 4. پپتید ترپن در Erythrolobus australicus، 5. پپتید تیونیندرArabidopsis thaliana

 

جدول 3- میزان همسانی آمینواسیدهای پپتید هدف با الگو

Template

Seq identity (%)

Oligo- state

Resolution

Range

Description

1wco.1.A

12/94

Monomer

Å 4

57-24

NISIN Z

2mlt.1.A

100

Homo-tetramer

(matching prediction)

-

69-44

MELITTIN

2mn5.1.A

25/98

Monomer

-

184-128

Copsin

5dz2.1.A

05/23

Monomer

Å 4

327–15

Germacradienol/geosmin synthase

1orl.1.A

86/41

Monomer

-

67-25

Viscotoxin C1

 

ساختار سه‌بعدی پروتئین‌های مدل‌سازی‌شده در شکل 3 آورده شده است. ارزیابی مدل‌های پیشنهاد‌شده در Swiss Model بر اساس شاخص‌های [12]GMQE و QMEAN4 انجام می‌شود. تابع QMEAN4، تابع حسابی مرکب برای ارزیابی کیفیت ساختار کلی و آمینواسید ساختار مدل‌سازی‌شده است. نمودار کیفیت برای هر آمینواسید در مدل (محور (X، شباهت موردانتظار به ساختار طبیعی[13] (محور Y) را نشان می‌دهد. به طور معمول، آمینواسیدهایی که اسکور زیر 6/0 را نشان بدهند، کیفیتکمی دارند. تابع QMEAN4 شامل چهار توصیف ساختاری پتانسیل زاویۀ چرخش، پتانسیل فاصلۀ اتم‌ها، اثر متقابل کربن بتا و پتانسیل حلال‌پوشی است. GMQE، یک ارزیابی کیفی است که ویژگی‌های هم‌ترازی مدل الگو را ترکیب می‌کند. نمودارهای ارزیابی کیفی موضعی، ساختار و میزان Z- score برای تابع حسابی مرکب QMEAN4، تمام اتم‌ها، کربن بتا، حلالیت و زوایای چرخشی در شکل 3 نشان داده شده‌اند. ارزیابی کیفیت ساختار مدل‌شده پس‌از بهینه‌سازی انرژی از طریق نمودار راماچاندران[14] با استفاده از ابزار Rampage انجام شد. نمودار راماچاندران، روش بسیار پرکاربردی برای پلات زوایای چرخشی پروتئین و ارزیابی کیفیت استرئوشیمیایی ساختار مدل‌سازی‌شده است.

بخش مشکل‌ساز مدل پیش‌بینی‌شده با سرور proSA[15] بررسی شد؛ این سرور ابزاری است که به‌طور گسترده برای چک‌کردن مدل 3D از ساختار پروتئین پیش‌بینی‌شده برای پتانسیل خطا استفاده می‌شود.

کیفیت کل مدل سه‌بعدی پروتئین با PROSA- Web (Z-Score) ارزیابی شد. روش PROSA مجموع فولد صحیح و غیرصحیح را به‌طور جداگانه و دقیق حساب می‌کند؛ این مدل برای مقایسۀ Z-Score مدل مشابه و الگو استفاده می‌شود.

نتایج Z-Score ترپن و تیونین برای همولوژی مدل و نمونه نزدیک به هم بود و نشان داد ساختار سه‌بعدی پیش‌بینی‌شده از کیفیت زیادی دارد (شکل 4). با‌توجه‌به همولوژی مدل و نمونه، نتایج Z-Score نایسین، ملیتین و کوپسین فاصلۀ زیادی از هم دارد و ساختار سه‌بعدی پیش‌بینی‌شده برای این سه پروتئین کیفیت مناسبی ندارد (شکل 4)؛ اما از طریق دومین‌های این پروتئین‌ها می‌توان به نقش آنها پی برد و از آنها در کارهای پژوهشی بعدی مانند داکینگ استفاده کرد و از این طریق پروتئین‌هایی با خاصیت مشابه (ضدباکتری) یافت. برهم‌کنش انرژی برای هر باقیمانده از ساختار با پلات انرژی PROSA ارزیابی شد. اعتبار هر پنج مدل تأیید شد (شکل 4). نتایج نشان دادند به‌جز ملیتین که بخشی از پلات انرژی آن در قسمت مثبت و بخشی از آن در قسمت منفی قرار دارد، پلات انرژی ترپن، نایسین، کوپسین و تیونین کلاً در قسمت منفی قرار دارد (شکل 5).

این نمودار، کیفیت مدل ورودی را با محاسبۀ درصد آمینواسیدهای قرارگرفته در نواحی مطلوب، مجاز یا غیرمجاز تعیین می‌کند. همان‌طور که در شکل 6 دیده می‌شود، 7/95، 3/4 و صفر درصد آمینواسید برای ساختار مدل‌شده برای کوپسین، 9/97، 1/2 و صفر درصد آمینواسید برای ساختار مدل‌شده برای ملیتین، 9/73، 3/19 و 8/6 درصد آمینواسید برای ساختار مدل‌شده برای ملیتین، 100، صفر و صفر درصد برای ساختار مدل‌شده برای ترپن و 2/81، 4/15 و 4/3 درصد آمینواسید برای ساختار مدل‌شده برای تیونین به‌ترتیب در مناطق مطلوب، مجاز و غیر‌مجاز قرار دارند و این بدان معناست که هر پنج مدل برای پروکاریوت و یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی برای پپتیدهای ضدباکتری کیفیت زیادی دارند و از این طریق می‌توان به ویژگی‌های دومین‌های آنها پی برد.

 

نایسین

A

B

C

 

Z- score: -10.02

 

ملیتین

A

B

C

Z-Score: -0.99

Z-Score: -6.15

 

کوپسین

A

B

C

Z-Score: -0.99

Z-score: -6.15

 

 

ترپن

A

B

C

Z-Score: -8.42

Z-Score: -9.53

 

تیونین

A

B

C

Z-Score: -4.25

Z-Score: -4.25

 

شکل 4- انرژی محاسبه‌شده به‌وسیلۀZ- Score با استفاده از نرم‌افزار PROSA کیفیت مدل سرتاسری پروتئین را مشخص می‌کند و ارزش آنها در پلاتی که حاوی Z- Score از آزمایش‌های مشخص‌شده از زنجیره‌های α و β پروتئین در PDB است، آشکار می‌شود؛ A. مدل مشابه، B. الگو، C. محاسبۀ پلات انرژی PROSA برای مدل مشابه

 

به‌منظور بررسی حساسیت‌زایی از دو سایت allermatch و peptidecutter استفاده شد.

نتایج حساسیت‌زایی نشان دادند به‌جز ملیتین در Apis mellifera که در سایت allermatch در قسمت80- amino- acid sliding window alignment cut of 35 حساسیت‌زایی را نشان می‌دهد، سایر پپتیدهای بررسی‌شده هیچ‌گونه حساسیت‌زایی را نشان ندادند. ازآنجاکه ملیتین در سایت allermatch و سایت peptidecutter حساسیت‌زایی را نشان نمی‌دهد، پس حساسیت‌زا نیست. نتایج نشان دادند پپتیدهای ضدباکتری در پروکاریوت و یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی حساسیت‌زا نیستند. نتایج سایت peptidecutter در جدول 4 نشان داده شده‌اند. اگر پپتیدهای بررسی‌شده با آنزیم‌های برشی هضم شوند، حساسیت‌زا نیستند. آنزیم‌هایی که در این پژوهش استفاده شدند، عبارتند از: تریپسین[16]، پپسین[17] و چموتریپسین[18]. تمام پپتیدهای بررسی‌شده با آنزیم‌های برشی هضم شدند، پس حساسیت‌زا نیستند (جدول 4).

 

 

1

 

 

2

 

 

3

 

 

4

 

 

5

 

 

 

شکل 5- نمودارهای ارزیابی کیفی موضعی ساختار و نمودار Z-score

 

 

نتایج بررسی آثار ضدمیکروبی نایسین و مقایسه با آنتی‌بیوتیک تتراساکلین به روش انتشار دیسک در آگار و چاهک‌گذاری نشان دادند قطر منطقۀ رشدنکردن ایجاد‌شده در اثر این ترکیبات در استافیلوکوکوس اورئوس (باکتری گرم مثبت) بیشتر از اشریشیا کلی (باکتری گرم منفی) است. نتایج نشان دادند اثر نایسین روی باکتری‌های گرم مثبت بیشتر از باکتری‌های گرم منفی است. قطر هالۀ رشدنکردن توسط نایسین در هر دو باکتری بیشتر از آنتی‌بیوتیک بود.

در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، بیشترین هالۀ بازدارندگی در روش چاهک‌گذاری برابر 19 میلی‌متر و در روش دیسک بلانک برابر 23 میلی‌متر بود. اندازه‌گیری‌ها با خط‌کش انجام شدند (شکل 7).

در باکتری اشریشیا کلی بر اساس روش چاهک‌گذاری و استفاده از دیسک بلانک، بیشترین هالۀ بازدارندگی 9 میلی‌متر بود (شکل 8).

 

 

A

 

 

B

 

 

C

 

 

D

 

 

E

 

 

 

شکل 6- نمودار راماچاندران ساختار پپتیدهای ضدباکتری مدل‌سازی‌شده در A. کوپسین، B. ملیتین، C. نایسین، D. ترپن، E. تیونین

 

 

نتایج آزمایش‌های MBC و MIC مشخص کردند میزان مهار رشد باکتری توسط عصاره با میزان عصارۀ موجود در رقت‌ها رابطۀ مستقیم دارد و با افزایش میزان عصاره در هر رقت، از تعداد کلنی‌های باکتری پس‌از کشت کاسته می‌شود. در غلظت 25 میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر عصارۀ پروتئین، بازدارندگی کامل استافیلوکوکوس اورئوس انجام شد؛ ولی همین غلظت سبب بازدارندگی کامل اشریشیا کلی نشد که نشان‌دهندۀ تاثیر کمتر نایسین روی باکتری‌های گرم منفی است. حداقل غلظت ممانعت‌کنندگی در باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (گرم مثبت) در غلظت 5/12 میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر به دست آمد؛ اما در باکتری گرم منفی اشریشیا کلی حداقل غلظت ممانعت‌کنندگی در غلظت 25 میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر به دست آمد.

همچنین در استافیلوکوکوس اورئوس بر اساس روش چاهک‌گذاری و روش دیسک بلانک، کمترین هالۀ بازدارندگی به‌ترتیب برابر با 5 و 1 میلی‌متر بود (شکل 7). در باکتری اشریشیا کلی، کمترین هالۀ بازدارندگی در روش‌های چاهک‌گذاری و دیسک بلانک به‌ترتیب 2 و 1 میلی‌متر به دست آمد (شکل 8).

 

 

جدول 4- تعداد قطعه‌های ایجاد‌شده در اثر هضم آنزیمی به‌وسیلۀ سایت peptidecutter

تعداد سایت‌های برش ایجاد‌شده به‌وسیلۀ آنزیم‌های برشی

پپتیدهای بررسی‌شده

نوع موجود بررسی‌شده

چیموتریپسین

پپسین

تریپسین

 

 

10

9

7

A نایسین

پروکاریوت

13

19

6

ملیتین

یوکاریوت پرسلولی

23

33

14

کوپسین

یوکاریوت پرسلولی

86

99

30

ترپن

یوکاریوت تک‌سلولی

21

20

13

تیونین

یوکاریوت پرسلولی

 

A

B

C

D

شکل 7- هالۀ بازدارندگی در باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس؛ A. با استفاده از دیسک بلانک، B. با استفاده ازچاهک‌گذاری، C و D. شاهد منفی

 

A

C

D

شکل 8- هالۀ بازدارندگی در باکتری گرم منفی اشریشیا کلی؛ A. با استفاده از چاهک‌گذاری، B. با استفاده از دیسک بلانک، C و D. شاهد منفی

 


بحث

باتوجه‌به اهمیت پپتید‌های ضدباکتری؛ در پژوهش حاضر به بررسی بیوانفورماتیکی پپتید‌های ضدباکتری پرداخته شد و با بررسی جامعی که انجام شد، تاکنون مطالعه‌ای به‌طوور جامع در زمینۀ بررسی پپتیدهای ضدباکتری انجام نشده است.

نتایج نشان دادند نوع دومین‌ها در پپتیدهای بررسی‌شده متفاوت است، اما عملکرد تمام دومین‌ها در پروکاریوت و یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی یکسان است. بررسی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پپتیدهای ضدباکتری نشان داد این پپتیدها ازنظر وزن مولکولی، تعداد آمینواسید، نقطۀ ایزوالکتریک، شاخص آلیفاتیک، شاخص ناپایداری و حلالیت پپتیدهای ضدباکتری در پروکاریوت و در یوکاریوت‌های تک‌سلولی و پرسلولی بررسی‌شده دارای دامنه‌ای از تنوع هستند. تعیین ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پپتیدهای ضدباکتری می‌تواند برای شناخت بهتر و شناسایی آنها بسیار سودمند باشد. شاخص ناپایداری پروتئین‌ها بیان‌کنندۀ میزان پایداری آنها در لولۀ آزمایش در برابر حرارت است و این به نوع آمینواسیدهای موجود بستگی دارد (15). شاخص ناپایداری محاسبه‌شده برای پپتیدهای بررسی‌شده نشان داد پروتئین‌هایی که شاخص ناپایداری آنها کمتر از 40 باشد، باثبات هستند و در غیر این حالت، بی‌ثبات خواهند بود (15)؛ بر اساس این تخمین می‌توان گفت پپتیدهای بررسی‌شده در پنج گونه در دامنه‌ای از ناپایداری تا پایداری قرار دارند و این موضوع به پروکاریوت‌بودن یا پرسلولی و تک‌سلولی‌بودن یوکاریوت‌های بررسی‌شده بستگی ندارد. پپتیدهای پایدار در شرایط تنش مانند تنش حرارتی می‌توانند ساختار سوم خود و در‌نتیجه، عملکردشان را در شرایط تنش حفظ کنند (16). شاخص آلیفاتیک عبارتست از حجم نسبی پروتئین که با زنجیره‌های آلیفاتیک اشغال شده است (A, V, I, L) و به‌عنوان فاکتور مثبت در افزایش ثبات حرارتی پروتئین‌های گلبول‌مانند محسوب می‌شود و به‌همین‌علت، در باکتری‌های مقاوم به گرما، پروتئین‌ها دارای شاخص آلیفاتیک زیادی هستند. پروتئین‌های دارای شاخص آلیفاتیک بسیار زیاد (بیشتر از 100) ممکن است در دامنۀ دمایی بسیار زیادی از خود ثبات نشان دهند (17). در بررسی حاضر بین یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌های بررسی‌شده، شاخص آلیفاتیک پپتیدهای بررسی‌شده در دامنۀ متنوعی ازنظر پایداری دمایی قرار گرفتند. پپتیدهای پایدارتر را می‌توان به‌شکل نگهدارنده در مواد غذایی و داروها استفاده کرد. چنانچه متوسط هیدروپاتی کل (GRAVY) (خاصیت آبگریزی پروتئین) محاسبه‌شده برای پروتئین منفی باشد، بدین معناست که آن پروتئین غیرقطبی است و در صورت مثبت‌بودن، آن پرونئین قطبی محسوب می‌شود. پپتیدهای بررسی‌شده در پژوهش حاضر، در دامنه‌ای از پروتئین‌های قطبی تا غیرقطبی قرار گرفتند. پپتیدهای غیرقطبی را می‌توان به‌شکل نگهدارنده در مواد غذایی و داروها استفاده کرد. حلالیت پروتئین‌های قطبی بیشتر از حلالیت پروتئین‌های غیرقطبی است و در برابر حلال‌های ویژۀ هر پروتئین، پروتئین‌های غیرقطبی در وسط و پروتئین‌های قطبی در بخش بیرونی تجمع می‌یابند. پروتئین‌های غیرقطبی را می‌توان به‌شکل اهدافی برای انتقال دارو به نقطۀ مدنظر استفاده کرد؛ این طراحی با افزودن سیگنال خاص به پروتئین برای انتقال به قسمت مدنظر و قراردادن مادۀ هدف (دارو) در پروتئین انجام می‌شود (18 و 19).

درخت فیلوژنی بر اساس توالی پپتیدهای بررسی‌شده بین پنج گونه (پروکاریوت و یوکاریوت‌های بررسی‌شده به‌طور هم‌زمان) مشخص کرد به‌جز گونۀ Apis mellifera، سایر گونه‌ها در یک زمان اشتقاق یافته‌اند و گونه‌های بررسی‌شده ازنظر تاکسونومی در جایگاه مناسبی از درخت فیلوژنی قرار نگرفته‌اند. آزمون فرضیۀ خنثی، اختلاف مشاهده‌شده برای یک جفت توالی را که با الگوی جایگزینی مشابه تکامل یافته‌اند، اندازه‌گیری می کند؛اساس این کار، مقایسۀ فرکانس نوکلئوتید یا آمینواسید در توالی جفتی و تعداد تفاوت مشاهده‌شده بین توالی‌هاست. در زیست‌شناسی، مدل جایگزینی فرایندی را توصیف می‌کند که تغییر یک صفت را در یک فرایند زمانی بر اثر فشار انتخاب نشان می‌دهد (18). این مدل در تفسیر درخت تکاملی در فیلوژنتیک و شاخه‌بندی و شبیه‌سازی توالی با آزمون روش‌ها و الگوریتم‌های دیگر کاربرد دارد. یکی از آزمون‌هایی که برای بررسی اثر فشار انتخاب روی یک ژن به کار برده می‌شود، D- Tajima است؛ این آزمون بر اساس مقایسۀ تنوع نوکلئوتیدی حاصل از فراوانی آللی جایگاه‌های چندشکلی است (20). استفاده از D- Tajima که برای آزمون تئوری خنثی به کار برده می‌شود، نشان داد ژن‌هایی که تنوع فراوانی آللی آنها زیاد است، D- Tajima مثبت (بیشتر از صفر) دارند و با انتخاب متعادل در جمعیت همراه هستند؛ در‌حالی‌که ژن‌هایی که تنوع فراوانی آللی آنها کم است، D- Tajima منفی دارند و با فشار انتخابی همراه هستند که یک واریانت سودمند را در جمعیت جایگزین سایر واریانت‌ها می‌کند. ژن‌هایی که به‌تازگی در معرض انتخاب قرار گرفته‌اند و آلل سودمند هنوز آلل اصلی در جمعیت نشده است، به‌سادگی با استفاده از D- Tajima قابل‌مطالعه نیستند (21). منفی‌بودن D- Tajima پپتیدهای بررسی‌شده در مطالعۀ پنج گونه (یوکاریوت‌ها و پروکاریوت بررسی‌شده) بیان‌کنندۀ آن است که جمعیت تحت‌تأثیر selective sweep قرار داشته است و الل‌های با فراوانی کم گسترش یافته‌اند و فشار انتخاب روی آنها مؤثر بوده است.

معمول‌ترین مکان برای مارپیچ آلفا، سطح هسته‌های پروتئین است که رابطی را برای تعامل با محیط آبی بیرون ایجاد می‌کند. قسمت داخلی مارپیچ تمایل به داشتن آمینواسیدهای آبگریز و قسمت بیرونی تمایل به داشتن آمینواسیدهای آبدوست دارد؛ بنابراین در طول مارپیچ، سه آمینواسید از هر چهار آمینواسید آبگریز خواهند بود؛ سایر آمینواسیدهای موجود در هستۀ پروتئین یا داخل غشای سلولی خاصیت آبگریزی دارند. به‌طور‌کلی مارپیچ‌های قرارگرفته در سطح، تعداد کمتری آمینواسید آبگریز دارند؛ از این ویژگی می‌توان در پیش‌بینی ساختار پروتئین‌ها کمک گرفت؛ برای نمونه، نواحی با مقادیر بیشتر از آلانین، گلوتامین، لوسین و متیونین و مقادیر کمتر از پرولین، گلیسین، تیروزین و سرین تمایل به تشکیل مارپیچ آلفا دارند. ساختار صفحه‌های بتا، ساختار دوم بسیار کشیده و چین‌داری است. یکی از تفاوت‌های مهم صفحه‌های بتا با مارپیچ آلفا این است که آمینواسیدهایی که معمولاًَ در ساختار اول زنجیرۀ پروتئینی با فاصلۀ زیاد از هم قرار گرفته‌اند، در تشکیل این ساختار در مجاورت یکدیگر قرار می‌گیرند؛ بنابراین، صفحه‌های بتا تمایل به سختی و انعطاف‌پذیری ناچیزی دارند. پیوندهای هیدروژنی بین‌رشته‌ای که میان گروه‌های CO یک رشتۀ بتا و NH رشتۀ بتای مجاور ایجاد می‌شوند، به صفحه‌های بتا پایداری می‌بخشند و باعث می‌شوند این صفحه‌ها ظاهری زیگزاگ داشته باشند. بررسی ساختار دوم پپتیدهای بررسی‌شده در یوکاریوت‌ها و پروکاریوت‌های بررسی‌شده نشان داد این پپتیدها در پنج گونۀ بررسی‌شده گسترۀ متنوعی از مارپیچ‌های آلفا و صفحه‌های بتا را دارند. پپتیدهایی که مارپیچ‌های آلفا و صفحه‌های بتای بیشتری دارند، انعطاف کمتر و حلالیت کمتری دارند؛ انعطاف‌پذیری کمتر سبب پایداری بیشتر پروتئین می‌شود. نتایج نشان دادند نایسین در پروکاریوت و ملیتین و تیونین که جزو پپتیدهای ضدباکتری موجود در یوکاریوت‌های پرسلولی هستند و تنها مارپیچ‌های آلفا را دارند نسبت به کوپسین که جزو یوکاریوت‌های پرسلولی است و ترپن که جزو یوکاریوت‌های تک‌سلولی است و دارای مارپیچ آلفا و صفحه‌های بتا است، پایداری کمتری دارند؛ درنتیجه مشخص شد پایداری پپتیدهای ضدباکتری به گونۀ مدنظر بستگی ندارد. هرچه پایداری پپتید بررسی‌شده بیشتر باشد، امکان استفاده از آن به‌شکل نگهدارندۀ طبیعی در محصولاتی که آماده‌کردن آنها به دمای زیاد نیاز دارد، وجود دارد.

در روش مشابهت مدلینگ یا مدل‌سازی مقایسه‌ای، ساختمان پروتئین بر اساس مشابهت توالی با ساختمان‌های شناخته‌شده با روش‌های تجربی پیش‌بینی می‌شود؛ درحقیقت، روش یادشده بر این اصل استوار است که اگر دو پروتئین مشابهت توالی زیادی داشته باشند، احتمالاً ساختمان سه‌بعدی بسیار مشابهی دارند. ساختار سه‌بعدی پروتئین منبع مهم اطلاعاتی برای درک بهتر عملکرد پروتئین و برهم‌کنش آن با اجزای دیگر (لیگاندها، پروتئین و ...) است. باتوجه‌به سختی و پر‌هزینه‌بودن فرایند کریستالوگرافی به‌ویژه در زمینۀ پروتئین‌های مهمی مانند پپتیدهای ضدباکتری، پیشگویی ساختار آنها از طریق ابزار In silico به‌منزلۀ میانبری برای مطالعه‌های بعدی و بررسی جزئیات ساختاری آنهاست؛ به عبارت دیگر، طراحی یک لیگاند مؤثر برای فعال‌کردن یا مهار پروتئین در مسیر خاص با شبیه‌سازی ساختار سوم آن پروتئین مقرون‌به‌صرفه است و روند مطالعه‌ها را تسریع می‌کند. با‌توجه‌به نتایج ارزیابی کیفی مدل‌های ایجاد‌شده، این مدل‌ها را می‌توان با ضریب اطمینان بالایی در تحلیل‌ها و طراحی‌های بعدی استفاده کرد. نتایج مدل‌سازی پژوهش ما در جدول 3 ارائه شده است. ارتباط و وظایف دومین‌ها را می‌توان از مدل‌های به‌دست‌آمده شناسایی کرد؛ در پژوهش حاضر، پپتیدها خاصیت ضدباکتری داشتند.

نتایج نشان دادند اثر پپتید نایسین روی باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس بیشتر از باکتری گرم منفی اشریشیا کلی است. قطر هالۀ بازدارندگی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بیشتر از 15 میلی‌متر و نشان‌دهندۀ فعالیت زیاد پپتید و مهارکنندگی کامل بود، اما هالۀ بازدارندگی باکتری اشریشیا کلی به‌وسیلۀ پپتید نایسین زیر 10 میلی‌متر و نشان‌دهندۀ فعالیت مهارکنندگی متوسط پپتید نایسین روی این باکتری بود. پپتید نایسین روی غشای باکتری‌ها مؤثر است و چون باکتری گرم منفی دو غشا دارد، اثر پپتید نایسین روی آن محدود است (22). باکتری‌های گرم مثبت در برابر عصاره‌ها حساس‌تر از باکتری‌های گرم منفی هستند که این امر از تفاوت در ساختار سلول باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت ناشی می‌شود؛ زیرا باکتری‌های گرم مثبت موکوپپتید بیشتری در ترکیب دیوارۀ سلولی خود دارند و این در حالیست که باکتری های گرم منفی تنها یک لایۀ نازک از موکوپپتید دارند؛ بنابراین، باکتری‌های گرم منفی مقاوم‌تر هستند (23). شفقت[xix] و همکاران (2014) حداقل غلظت مهارکنندگی عصارۀ زنیان بر استافیلوکوکوس اورئوس را 25/1 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر و بر اشریشیا کلی را 5 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر گزارش کرده‌اند (24). امیری[xx] و همکاران (2016)، حداقل غلظت بازدارندگی رشد عصارۀ زنیان را بر استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی‌سیلین برابر 50 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر، بر استافیلوکوکوس اورئوس حساس به متی‌سیلین برابر 25 میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر و بر اشریشیا کلی O157H برابر50 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر گزارش کرده‌اند (25). در مطالعۀ دیگری، شفقت و همکاران (2015) اسانس گیاه زنیان را به روش تقطیر با آب و با دستگاه کلونجر تهیه و خاصیت ضدباکتریایی آن را روی باکتری اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس مشخص کردند. حداقل بازدارندگی اسانس زنیان بر باکتری گرم مثبت برابر 87/1 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر و بر باکتری گرم منفی اشریشیا کلی برابر 3/75 میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر گزارش شد (26-30).

نتایج پژوهش حاضر نشان دادند پپتیدهای ضدباکتری با‌توجه‌به وظیفۀ مشترکی که دارند، ویژگی‌های متنوعی را در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌های پرسلولی و تک‌سلولی نشان می‌دهند و این امر به گونۀ بررسی‌شده مربوط نمی‌شود. در پژوهش حاضر، اثر پروتئین نایسین روی دو باکتری گرم مثبت و گرم منفی بررسی شد و نتایج مهارکنندگی خوبی حاصل شدند.

پپتیدهای ضدباکتری می‌توانند به‌شکل نگهدارنده در مواد غذایی و داروها استفاده شوند. ازآنجاکه مواد نگهدارندۀ مصنوعی عوارضی مانند سرطان و آسیب به کبد را ایجاد می‌کنند، امروزه استفاده از نگهدارندۀ طبیعی مدنظر قرار گرفته است و با‌توجه‌به غیرحساسیت‌زابودن پپتیدهای مطالعه‌شده می‌توان از آنها در پژوهش‌ها و پس‌از بررسی به‌شکل نگهدارندۀ طبیعی در مواد غذایی و داروها استفاده کرد.

نتایج مقالۀ حاضر در مطالعۀ رفتار و کنش پپتیدهای ضدباکتری بسیار کمک‌کننده است و به فهم چگونگی میان‌کنش پروتئین‌های ضدباکتری با سایر پروتئین‌ها کمک می‌کند و زمینه‌ساز روشن‌شدن شیوۀ فعالیت آنها در سلول‌هاست.

امروزه به‌علت افزایش جمعیت، صنایع غذایی یکی از صنایع مهم در ایران و جهان به شمار می‌آیند؛ از‌این‌رو، تولید مواد غذایی با ماندگاری بیشتتر یکی از اهداف پژوهش‌هاست؛ هرچند در حال حاضر، نگهدارنده‌های مصنوعی زیادی استفاده می‌شوند که مضررات زیادی برای بدن دارند و به همین علت، جایگزین‌کردن آنها با نگهدارنده های طبیعی جزو الویت‌ها محسوب می‌شود. پژوهش حاضر نشان داد نایسین می‌تواند به‌شکل نگهدارندۀ طبیعی در مواد غذایی استفاده شود و تأثیر خوب نایسین در کنترل باکتری‌های بیماری‌زا به‌ویژه باکتری‌های گرم مثبت آشکار شد.



[1]- Antimicrobial Peptides

[2]- www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

[3]- http:// www. ebi. ac. Uk/Tools/msa/tcoffee/

[4]- Basic Local Alignment Search Tool

[5]- www. Allermatch.org

[6]- expasy.org/tools/peptidecutter/ 

[7]- PTCC

[8]- M. I. C

[9]- Minimum Bactericidal Concentration

[10]- Substitution model selection

[11]- Disparity index test

[12]- Global Model Quality Estimation

[13]- Native structure

[14]- http://mordred .bioc.com.ac.uk/~rapper/rampage.php

[15]- Protein Structure Analysis

[16]- tripsine

[17]- pepsine

[18]- chimoteripsine

[xix]- Shafeghat

[xx]- Amiri

(1) Brogden KA., Ackermann M., McCray PB., Tack BF. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences. The International Journal of Antimicrobial Agents 2003; 22(5): 465-478.
(2) Bulet P., Stocklin R., Menin L. Antimicrobial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunological Reviews 2004; 198: 169-184.
(3) Chen H., Xu Z., Peng L., Fang X., Yin X., Xu N., et al. Recent advances in the research and development of human defensins. Peptides 2006; 27: 931-940.
(4) Reddy KV., Yedery RD., Aranha C. Antimicrobial peptides: Premises and promises. The International Journal of Antimicrobial Agents 2005; 25(5): 448-449.
(5) Shetty K., Paliyath G., Pometto A., E Levin R. Food Biotechnology. New York: CRC Press; 2005.
(6) Cheikhyoussef A., Pogori N., Chen W., Zhang H. Antimicrobial proteinaceous compounds obtained from bifidobacteria: From production to their application. International Journal of Food Microbiology 2008; 125: 215-222.
(7) Brown AK., Sridharan S., Kremer L., Lindenberg S., Dover LG., Sacchettini JC., Besra GS. Probing the mechanism of the Mycobacterium tuberculosis beta- ketoacyl- acyl carrier protein synthase III mtFabH: factors influencing catalysis and substrate specificity. The Journal of Biological Chemistry 2005; 18: 54-63.
(8) Ferguson AA., Jiang N., Pack M. Recycline and reshaping genes through GC- biased acquisition. Mobile Genetic Elements 2011; 15: 2134-2141.
(9) Schwede T., Kopp J., Guex N., Peitsch MC. SWISS- MODEL: An automated protein homology- modeling server. Nucleic Acids Research 2003; 31: 3381-3385.
(10)            Ali S., Morteza R., Mansour E. Designing predictive models to determine the structure of the acyl carrier protein enzyme. Journal of Qom University of Medical Sciences 2014; 13-20.
(11)Thereza Christina VP., Angela FJ., Letícia Celia de LN., Olivia MC. Production of nisin by Lactococcus lactis in media with skimmed milk. Applied Biochemistry and Biotechnology 2005; 121-124(1): 619-37.
(12)            Rasoul N., Mohammad M. Investigation of antibacterial properties of ethanolic extracts of four native medicinal plants of Ardebil province by two methods of disk and well diffusion. The Quarterly Journal of School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences 2016; 40(3): 149-154.
 
(13)            Lovell SC., Davis IW., Arendall WB., de Bakker PI., Word JM., Prisant MG., et al. Structure validation by Cα geometry: ϕ, ψ and Cβ deviation. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 2003; 50(3): 437-450.
(14)            De gray G., Rajasekaran K., Smith F., Sanford J., Daniell H. Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology 2001; 127: 852-862.
(15)            Pettersen EF., Goddard TD., Huang CC., Couch GS., Greenblatt DM., Meng EC., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry 2004; 25(13): 1605-1612.
(16)            Guex N., Peitsch MC. Swiss‐Model and the Swiss‐Pdb Viewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 1997; 18(15): 2714-2723.
(17)            Gelhaye E., Rouhier N., Jacquot JP. The thioredoxin h system of higher plants. Plant Physiology and Biochemistry 2004; 42: 265-271.
(18)            Fallah ziarani M., Tohidfar M., Aminfar Z. Bioinformatic analysis of Acyl Carier Protein (ACP) in eukaryotes and prokaryotes. Crop Biotechnology 2017;17: 15-29.
(19)            Burge C., Karlin S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. Journal of Molecular Biology 1997; 268: 78-94.
(20)            Carlson CS., Thomas DJ., Eberle MA., Swanson JE., Livingston RJ., Rieder MJ., et al. Genomic regions exhibiting positive selection identified from dense genotype data. Genome Research 2005; 13: 120-131.
(21)Hamblin MT., Thompson EE., Rienzo D. Complex signatures of natural selection at the Duffy blood group locus. A. The American Journal of Human Genetics 2002; 25: 1605-1612.
(22)            Liang Z., Auke J., van H., Manuel ML., Oscar PK. Potentiating the activity of nisin against Escherichia coli. Frontiers in Cell and Developmental Biology 2016; 4: 7.
(23)            Kim JS., Kuk E., Yu KN., Kim JH., Park SJ., Lee HJ. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 2007; 3(1): 95-101.
(24)            Shafeghat M., Sharifi-Mood B., Metanat M., Saeidi S., Sepehri- Rad N. The Antibacterial Activity of the Ajowan Extract. IJIDTM Journal 2014; 19(67): 37-40.
(25)            Amiri A., Jomehpour N. Evaluation the Effect of Anti bacterialof Ferula assa-foetida L, Carum copticum, Mentha piperita L Hydroalcoholic Extract on Standard Sensitive andMethicillin- Resistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157H7 and Salmonella typhimurium. Journal of Ilam University of Medical Sciences 2016; 24(2): 72-79.
(26)            Shafeghat M., Najafi S., Razavi-zadeh R. Essential oil composition and antimicrobial activity of oil, from ajowan (carum copticum) grown in sistan- iran. Ijidtm Journal 2015; 20(68): 37-40.
(27)            Marius BT., Thureyah M., Mervin M., Ashley P. Antibacterial activity of rationally designed antimicrobial peptides. International Journal of Microbiology 2020; 24(2): 72-79.
(28)            Alysha GE., Johnny XH., Søren N., Johannes Z., Ingrid AE., Amy KC., et al. An amphipathic peptide with antibiotic activity against multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Nature Communications 2020; 19(67): 37-40.
(29)            Renee MF., Luis AM., Jennifer SB., Bryan WD. Defining principles that influence antimicrobial peptide activity against capsulated Klebsiella pneumoniae. PNAS 2020; 117(44): 27620-27626.
(30)            Narimani R., Moghaddam M. Investigation of antibacterial properties of ethanolic extracts of four native medicinal plants of Ardebil province by two methods of disk and well diffusion. Research on Medicine 2016; 40(3): 149-154.