بهینه‌کردن تولید شکل محلول آنزیم ال-آسپاراژیناز باکتری نمک‌دوست به‌طور نوترکیب در اشریشیا کلی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه بیوتکنولوژی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران

2 استادیار گروه بیوتکنولوژی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، ایران

10.22108/bjm.2020.121684.1278

چکیده

مقدمه: آنزیم ال-آسپاراژیناز (EC 3.5.1.1) نقش مهمی در درمان سرطان و به‌ویژه لوسمی حاد لنفوئیدی دارد. حذف سریع آنزیم‌ از جریان خون، فعالیت گلوتامینازی و همچنین ایجاد واکنش ایمنی در بدن از معایب آنزیم‌های تجاری است و ازاین‌رو، شناسایی ال-آسپاراژینازهای جدید با ویژگی‌های مطلوب ضروری است. ژن بیان‌کنندۀ ال-آسپاراژیناز مشتق‌شده از باکتری نمک‌دوست هالوموناس الانگاتا که پیش‌تر ویژگی‌های مطلوب آن به‌منظور درمان سرطان گزارش شده به‌شکل نوترکیب در اشریشیا کلی تولید شده است؛ اما بخش اعظم پروتئین نوترکیب به‌شکل نامحلول در سلول باقی می‌ماند.
مواد و روش‏‏ها: در مطالعۀ حاضر، ابتدا دو میزبان اشریشیا کلی BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) برای بیان پروتئین به‌شکل محلول مقایسه شدند. پس‌از انتخاب میزبان، اثر عوامل مختلف ازجمله محیط‌کشت، غلظت القاکننده، میزان مایۀ تلقیح، زمان و دمای القا و میزان هوادهی به روش یک فاکتور در زمان بهینه شد.
نتایج: بر اساس یافته‌ها، بیشترین مقدار تولید ال-آسپاراژیناز فعال مربوط به میزبان اشریشیا کلی BL21 (DE3) در محیط کشت LB با افزودن 1 درصد مایۀ تلقیح، 5/0 میلی‌مولار IPTG و سرعت برهم‌زدن 150 دور‌بردقیقه حاصل شد؛ همچنین بیشترین فعالیت ویژۀ ال-آسپاراژیناز به بیان در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و برای مدت زمان 9 ساعت تعلق داشت. در مرحله بعد، اثر افزودنی‌های مختلف به محیط‌کشت بررسی و مشاهده شد افزودن 2 درصد اتانول و 200 میلی‌مولار آرژینین تأثیر چشمگیری بر افزایش فعالیت ویژۀ آنزیم دارد.
بحث و نتیجه‏گیری: درنهایت، اِعمال شرایط بهینه سبب افزایش مقدار فعالیت ویژه از حالت پایۀ تقریباً 1000 واحد‌بر‌میلی‌گرم به حدود 3500 واحد‌بر‌میلی‌گرم (بیش از سه برابر) شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimizing the Production of Soluble Form of Recombinant L-asparaginase isolated from Halophilic Bacterium in Escherichia coli

نویسندگان [English]

  • Yasaman Asaadi 1
  • Reihaneh Khaleghi 1
  • Sedigheh Asad 2
1 Department of Biotechnology, College of Science, University of Tehran, Iran
2 Department of Biotechnology, College of Science, University of Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: L-asparaginase has an essential role in the treatment of cancers, especially Acute Lymphoblastic Leukemia. The rapid removal of the enzyme from the bloodstream, glutaminase activity, and also inducing an immune response in the body are disadvantages of commercial enzymes, therefore, the identification of new L-asparaginase with desirable properties is essential. Previously, the coding sequence of L-asparaginase isolated from Halomonas elongata had been cloned in E. coli and had shown to have advantageous properties as a chemotherapeutic agent. However, it was mostly expressed as inclusion bodies.
Materials and methods: In this study, soluble enzyme expression was examined in two E. coli hosts, BL21 (DE3) and ArcticExpress strains. After selecting the host, the effects of various factors such as culture media, inducer concentration, inoculum size, induction duration, temperature, and also aeration rate were optimized using the one-factor-at-a-time approach.
Results: Based on the results, the highest amount of active L-asparaginase production was related to Escherichia coli host Bl21 (DE3) strain in LB culture medium by adding 1% inoculum size, after 9 h induction with 0.5 mM IPTG at 37 ˚C, and shaking at 150 rpm. In the next step, the effect of various additives on the culture medium was investigated and it was observed that the addition of ethanol 2% (v/v) or arginine (200 mM) has a significant effect on increasing the specific activity of the enzyme.
Discussion and conclusion: Finally, the optimization could increase soluble L-asparaginase production from 1000 U/mg in the basal condition up to approximately 3500 U/mg (more than three times).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Recombinant L-asparaginase
  • Optimization
  • One-factor-at-a-time
  • Soluble protein

مقدمه

آنزیم ال-آسپاراژیناز (ال-آسپاراژین‌آمیدوهیدرولاز، EC 3.5.1.1) هیدرولیز ال-آسپاراژین به ال-آسپارتیک‌اسید و آمونیاک را کاتالیز می‌کند. رده‌های خاصی از سلول‌های سرطانی به‌علت رشد غیرعادی خود و همچنین بیان‌نشدن آنزیم آسپاراژین‌سنتتاز (1 و 2) به دریافت ال-آسپاراژین از منبع خارج‌سلولی (خون) نیاز دارند؛ درحالی‌که سلول‌های سالم به‌تنهایی ال-آسپاراژین لازم را برای خود تأمین می‌کنند (3)؛ بنابراین، آنزیم ال-آسپاراژیناز می‌تواند با حذف منبع خارج‌سلولی ال-آسپاراژین، سلول‌های سرطانی خون را به‌طور اختصاصی از بین ببرد و درنتیجه، این آنزیم به‌طور گسترده در درمان لوسمی حاد لنفوئیدی استفاده می‌شود (4). کاربرد آنزیم ال-آسپاراژیناز به مصرف‌های پزشکی محدود نمی‌شود و این آنزیم به‌علت قابلیت کاهش میزان اکریل‌آمید تا 90 درصد بدون ایجاد تغییر در طعم غذا، در تولید غذاهای سرخ‌شده در صنایع غذایی به کار ‌می‌رود (5)؛ ‌علاوه‌براین، گزارش‌هایی از عملکرد آنتی‌اکسیدانی ال-آسپاراژیناز وجود دارند (6).

تاکنون آنزیم ال-آسپاراژیناز با منشأ سویه‌های باکتریایی مختلف جداسازی و تولید شده است؛ اما در حال حاضر، ال-آسپاراژینازهای مشتق‌شده از اشریشیا کلی[i] و اروینیا کریزانتمی[ii] به‌شکل داروهای شیمی‌درمانی مؤثر در درمان لوسمی حاد لنفوئیدی در بازار وجود دارند. استفاده از آنزیم‌های یادشده با مشکلاتی همراه است؛ ازجمله اینکه این دو آنزیم در محلول نمکی با اسمولاریتۀ شبیه به خون (9/0 درصد) به‌ترتیب 40 و 80 درصد فعالیت خود را از دست می‌دهند (7)؛ این امر سبب افزایش دوز لازم دارو و بروز حساسیت‌های شدید در برخی بیماران می‌شود (8-10) و از‌این‌رو، جستجو برای یافتن ال-آسپاراژینازهای جایگزین ادامه دارد (6 و 11-16).

پیش‌ازاین، گروه پژوهشی مقالۀ حاضر آنزیم ال-آسپاراژیناز جداشده از هالوموناس الانگاتا[iii] را در اشریشیا کلی BL21 کلون و بیان کردند و نتیجه گرفتند پایداری آن در سرم خونی سه برابر بیشتر از آسپاراژیناز اشریشیا کلی است (17)؛ این پایداری زیاد در سرم خون نشان می‌دهد ال-آسپاراژیناز هالوموناس الانگاتا می‌تواند نامزد مناسبی برای پروتئین دارویی باشد و با تزریق دوز کمتر دارو، ایمنی‌زایی کمتری در بیماران داشته باشد. اگرچه فعالیت ویژۀ زیادی برای این آنزیم گزارش شده است، نتایج نشان می‌دهند بخش درخور توجهی از این آنزیم هنگام تولید در اشریشیا کلی به‌شکل نامحلول و اینکلوژن بادی[iv] باقی می‌ماند. به‌طور‌کلی، ایجاد شکل‌های نامحلول پروتئین ازجمله عوامل کاهش‌دهندۀ بهره‌وری بیان پروتئین در اشریشیا کلی است (18)؛ معمولاً این مشکل به‌علت سرعت زیاد تولید پروتئین به‌واسطۀ پروموتورهای قوی ازجمله پروموتورهای ویروسی و اشباع‌شدن سیستم چپرونی میزبان اتفاق می‌افتد؛ با افزایش غلظت موضعی پروتئین‌ها در میزبان، برهم‌کنش‌های هیدروفوب سبب مجتع‌شدن[v] پروتئین‌ها و تجمع آنها به‌شکل اینکلوژن بادی می‌شود. راهکارهای بسیاری ازجمله بهینه‌کردن کدونی، اتصال پروتئین هدف به پروتئینی با حلالیت بیشتر، تغییر شرایط فیزیکوشیمیایی محیط مانند استفاده از انواع محیط‌کشت، تغییر غلظت القاکننده، شرایط القا و ... برای حل مشکل یادشده پیشنهاد شده‌اند (18)؛ باوجوداین، راهبرد مشخص و مناسبی برای همۀ پروتئین‌های نوترکیب وجود ندارد و ازاین‌رو، مطالعۀ مجزایی باید برای بهینه‌کردن بیان هر پروتئین انجام شود (19). عوامل بسیاری بر میزان بیان پروتئین محلول اثر می‌گذارند و معمولاً از روش‌های آماری طراحی آزمایش در بهینه‌کردن استفاده می‌شود تا مقدار بهینه سریع‌تر و آسان‌‌تر محاسبه شود (20)؛ در این بین، روش یک فاکتور در زمان[vi] که در آن، اثر تنها یک متغیر با ثابت نگه‌داشتن سایر متغیرها در هر آزمایش بررسی می‌شود و از تأثیر متقابل عوامل مختلف بر یکدیگر صرف‌نظر می‌کند، همچنان روشی ساده‌ایست که برای دریافت اطلاعات کلی از عوامل مؤثر بر میزان بیان پروتئین محلول استفاده می‌شود و می‌تواند پایه‌ای برای مطالعه‌های آماری دقیق‌تر همچون روش سطح پاسخ[vii] باشد (21).

هدف پژوهش حاضر، افزایش تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز نوترکیب جداشده از هالوموناس الانگاتا به‌طور محلول در میزبان اشریشیا کلی است؛به این منظور، بیان پروتئین در میزبان اشریشیا کلی ArcticExpress علاوه‌بر اشریشیا کلی BL21 بررسی شد؛ همچنین ترکیب محیط‌کشت، دمای بیان، غلظت القاکننده، مدت زمان القا، سرعت برهم‌زدن و اثر برخی افزودنی‌ها ازجمله اتانول و آرژینین در محیط‌کشت به روش یک فاکتور در زمان بهینه شد.

 

مواد و روش‌ها

سویه‌های باکتری، محیط‌های کشت و مواد شیمیایی: در پژوهش حاضر، ژن کد‌کنندۀ ال-آسپاراژیناز سویۀ هالوموناس الانگاتا (کد Genbank: FN869568.1) که بین دو سایت برش NdeI و HindIII در ناقل بیانی pET21a کلون شده بود، به کار گرفته شد. دو سویۀ مختلف اشریشیا کلی BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) برای بیان استفاده شدند. مواد شیمیایی از شرکت مرک خریداری شدند.

گزینش سویۀ مناسب برای تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز:ناقل pET21a که پیش‌تر ژن در آن کلون شده بود، به روش شوک حرارتی به سلول‌های مستعد BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) منتقل[viii] شد. کلون‌های حاصل از انتقال روی پلیت‌های حاوی محیط LB (Luria-Bertani) جامد همراه با 100 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر آمپی‌سیلین ظاهر شدند و پس‌از تأیید با توالی‌یابی و به‌منظور مطالعه‌های بعدی، از آنها استوک تهیه شد. کلون‌های منتخب از هر دو سویه در محیط‌کشت LB (اسیدیتۀ 4/7) دارای آمپی‌سیلین (100 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر) همراه با 1 درصد حجمی مایۀ تلقیح (کشت شبانه از هر کلون) و در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد کشت شدند. پس‌از رسیدن کدورت سلولی (جذب در 600 نانومتر) به 4/0 تا 6/0، بیان ال-آسپاراژیناز در اشریشیا کلی BL21 با 5/0 میلی‌مولار IPTG برای مدت 3 ساعت در 37 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت برهم‌زدن 150 دوربردقیقه القا شد. القای بیان در اشریشیا کلی ArcticExpress با 1 میلی‌مولار IPTG برای مدت 24 ساعت در 12 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت برهم‌زدن 230 دوربردقیقه انجام شد. سنجش فعالیت آنزیمی و تعیین فعالیت ویژه در سوپ رویی حاصل از لیز سلولی به‌منظور مقایسۀ کمّی میزان پروتئین تولید‌شده به‌شکل محلول استفاده شد.

استخراج پروتئین: پس‌از القای بیان، سلول‌ها با سانتریفیوژ در سرعت 9000 دوردردقیقه به‌مدت 10 دقیقه و در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد رسوب داده شدند و در 1 میلی‌لیتر بافر لیز (50 میلی‌مولار سدیم‌فسفات، 150 میلی‌مولار سدیم‌کلرید، اسیدیتۀ 6/7) مخلوط شدند؛ سپس سلول‌ها به‌مدت 5 دقیقه (10 ثانیه پالس و 5 ثانیه استراحت) روی یخ با دستگاه SYCLON Ultra SonicCell sonicator (SKL950-IIDN) لیز شدند. لاشۀ سلولی با سانتریفیوژ در سرعت 9000 دوردردقیقه به‌مدت 30 دقیقه و در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد از محلول پروتئینی جدا شد. محلول رویی برای ادامۀ بررسی‌ها جمع‌آوری و نگهداری شد.

.سنجش فعالیت آنزیمی و به‌دست‌آوردن فعالیت ویژه: به‌منظور سنجش فعالیت آنزیمی، 50 میکرولیتر از محلول پروتئینی به 1 میلی‌لیتر بافر سنجش (50 میلی‌مولار سدیم‌فسفات و 12 میلی‌مولار ال- آسپاراژین) افزوده و به‌مدت 2 دقیقه در دمای 25 درجۀ سانتی‌گراد انکوبه شد؛ سپس، تغییرات جذب با استفاده از شناساگر نسلر (22) در طول موج 490 نانومتر با دستگاه Perkin Elmer Lambda 25 اندازه‌گیری شد. سنجش غلظت محلول پروتئینی به روش برادفورد[ix] انجام شد (23). منحنی‌های استاندارد با محلول‌های آمونیوم و سرم آلبومین گاوی رسم شدند تا غلظت آمونیوم تولیدشده و پروتئین موجود در محلول اندازه‌گیری شود. واحد فعالیت آسپاراژیناز عبارتست از: تبدیل 1 میکرومول آمونیاک در یک دقیقه در دمای محیط. تمام سنجش‌ها در سه تکرار انجام شدند.

.بهینه‌کردن شرایط کشت و بیان ال-آسپاراژیناز: به‌منظور بهینه‌کردن تولید پروتئین به‌شکل محلول، هر بار یکی از عوامل موجود ازجمله نوع محیط‌کشت شامل محیط LB (10 گرم‌بر‌لیتر تریپتون، 5 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 10 گرم‌بر‌لیتر سدیم‌کلرید، اسیدیتۀ 2/7)، محیط TB (Terrific Broth) (12 گرم‌بر‌لیتر تریپتون، 24 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌بر‌لیتر گلیسرول و بافر فسفات) و محیط 2xYT (2x Yeast Extract Tryptone) (16 گرم‌بر‌لیتر تریپتون، 10 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌بر‌لیتر سدیم‌کلرید، اسیدیتۀ 2/7)، میزان مایۀ تلقیح (5/0، 0/1 و 0/2 درصد حجمی)، کدورت لحظۀ القای بیان (4/0، 5/0 و 6/0)، غلظت‌ IPTG (2/0، 5/0 و 8/0 میلی‌مولار)، دمای بیان (25، 30 و 37 درجۀ سانتی‌گراد)، سرعت برهم‌زدن (100، 150 و 200 دوربردقیقه)، مدت زمان القا (3، 6 و 9 ساعت) و درنهایت، اثر حضور افزودنی‌ها در محیط بیان شامل اتانول (صفر، 1 و 2 درصد) و آرژینین (صفر، 100 و 200 میلی‌مولار) با ثابت نگه‌داشتن سایر شرایط تغییر داده شد و مقدار فعالیت ویژه در هر حالت تعیین شد؛ از‌این‌رو، بیان ال-آسپاراژیناز محلول در میزبان اشریشیا کلی به روش یک فاکتور در زمان با درنظرگرفتن شرایط یادشده بهینه شد.

محاسبه‌های آماری: تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند. تجزیه‌وتحلیل آماری با آزمون آنالیز واریانس (ANOVA) و نرم‌افزار MINITAB انجام شد. P valueکمتر از 05/0، سطح معناداری در نظر گرفته شد.

 

نتایج.

در پژوهش حاضر به مطالعۀ افزایش تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز به‌شکل محلول در میزبان  اشریشیا کلی پرداخته شد؛ به این منظور، دو میزبان بیانی و شرایط مختلف کشت و القا بررسی شدند. ابتدا پلازمید حاوی ژن به دو سویۀ بیانی اشریشیا کلی BL21 (DE3) و ArcticExpress (DE3) منتقل شد و کلنی‌های رشدکرده روی محیط حاوی آمپی‌سیلین تعیین توالی شدند. یک کلنی از هر میزبان برای مقایسۀ بیان انتخاب شد. نتایج مقایسۀ بیان نشان دادند فعالیت ویژۀ آنزیم محلول در سویۀ اشریشیا کلی BL21 (DE3) برابر 55±1089 واحدبرمیلی‌گرم و در سویۀ اشریشیا کلی ArcticExpress (DE3) برابر 94±850 واحدبرمیلی‌گرم است؛ بنابراین، در ادامۀ بررسی‌ها از اشریشیا کلی BL21 (DE3) برای بیان استفاده شد. مقدار بیان آنزیم در سه محیط‌کشت LB، TB و 2xYT بررسی شد و باوجود اینکه تفاوت زیادی در مقدار بیان در سه محیط یادشده مشاهده نشد (شکل 1)، بیشترین فعالیت ویژه در محیط‌کشت LB (38±1057 واحدبرمیلی‌گرم) و کمترین بیان در محیط 2xYT (35±825 واحدبرمیلی‌گرم) حاصل شد؛ ازاین‌رو، محیط‌کشت LB به‌علت فعالیت ویژۀ بیشتر، قیمت ارزان‌تر و دسترسی بهتر برای ادامۀ کار استفاده شد.

اثر مقدار هوادهی با تغییر سرعت برهم‌زدن (100، 150 و 200 دوربردقیقه)، عامل دیگری بود که اثر آن بر بیان ال-آسپاراژیناز بررسی شد و سرعت برهم‌زدن 150 دوربردقیقه بیشترین تولید آنزیم (35±1295) را به همراه داشت (بیش از دو برابر نسبت به دو حالت دیگر). اثر غلظت‌های متفاوت IPTG (2/0، 5/0 و 8/0 میلی‌مولار) به‌عنوان القاکننده مطالعه و مشاهده شد افزودن 5/0 میلی‌مولار IPTG سبب تولید آنزیم محلول و فعال بیشتری (317±1473) می‌شود (شکل 2).

اثر کدورت لحظۀ القای بیان (4/0، 5/0 و 6/0)، عامل دیگری بود که بررسی شد. بر اساس شکل 3 و باتوجه‌به اینکه مقدار فعالیت ویژه در کدورت 5/0 تقریباً سه برابر دو حالت دیگر (148±1664) بود، این مقدار کدورت برای ادامۀ آزمایش‌ها مدنظر قرار گرفت. تغییر درصد مایۀ تلقیح اثر معناداری در مقدار ال-آسپاراژیناز محلول نداشت؛ باوجوداین، 1 درصد مایۀ تلقیح (با تفاوت اندک) بیشترین فعالیت ویژۀ آنزیم (168±1678) را موجب و برای آزمایش‌های بعدی استفاده شد.

 

شکل 1- اثر سه محیط‌کشت LB (Luria-Bertani)، TB (Terrific Broth) و 2xYT (2x Yeast Extract Tryptone) بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر0001/0 محاسبه شد.

 

 

شکل 2- اثر غلظت القاکننده بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر004/0 محاسبه شد.

 

 

شکل 3- اثر کدورت لحظۀ القای بیان بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر0001/0 محاسبه شد.

میزان بیان ال-آسپاراژیناز در سه دمای 25، 30 و 37 درجۀ سانتی‌گراد بررسی و بیشترین مقدار آسپاراژیناز محلول در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد حاصل شد (شکل 4)، اما تحلیل آماری داده‌ها نشان داد این تفاوت معنادار نیست؛ باوجوداین، دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد که برای رشد و افزایش جمعیت سلولی میزبان استفاده شد، به‌منظور سهولت کار برای بیان نیز مدنظر قرار گرفت.

میزان تولید آنزیم در زمان‌های مختلف پس‌از القا (3، 6 و 9 ساعت) بررسی شد و بر اساس شکل 5، بیشترین تولید ال-آسپاراژیناز پس‌از 9 ساعت از زمان القا حاصل شد و فعالیت ویژه‌ای معادل 82±1858 واحدبرمیلی‌گرم را به همراه داشت. حضور افزودنی‌هایی مانند اتانول (صفر، 1 و 2 درصد) و آرژینین (صفر، 100 و 200 میلی‌مولار) به‌طور مجزا در محیط بیان بررسی شد. شکل‌ 6، الف و ب نشان می‌دهد افزودن 2 درصد اتانول و 200 میلی‌مولار آرژینین به محیط بیان به‌ترتیب سبب افزایش فعالیت ویژۀ آنزیم تا 35±2725 و 71±3450 واحدبرمیلی‌گرم می‌شود.

 

 

شکل 4- اثر دما بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر439/0 محاسبه شد.

 

 

شکل 5- اثر مدت زمان القا بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر0001/0 محاسبه شد.

 

 
 

شکل 6- اثر افزودنی‌های اتانول و آرژینین به محیط بیان بر فعالیت ویژۀ آنزیم؛ آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شدند و P valueبرابر 0001/0 محاسبه شد.

بحث و نتیجه‌گیری

اگرچه آنزیم ال-آسپاراژیناز تأثیر درخور توجهی در درمان سرطان‌های لنفوئیدی دارد، باتوجه‌به داشتن منشأ باکتریایی می‌تواند پاسخ‌های ایمنی شدیدی را در بسیاری از بیماران سبب ‌شود؛ یکی از راه‌های مقابله با این عارضه، کاهش دوز آنزیم و افزایش پایداری آن است. اگرچه جداسازی ال-آسپاراژیناز از باکتری نمک‌دوست هالوموناس الانگاتا توانسته است پایداری این آنزیم در سرم فیزیولوژیک را تا 3 برابر افزایش دهد، تشکیل اینکلوژن بادی‌ معضل بزرگی در مسیر تولید و تخلیص این آنزیم در مقیاس وسیع است. در پژوهش حاضر، ابتدا تغییر میزبان راه حل اولیه در نظر گرفته و بررسی شد. باتوجه‌به اهمیت کاهش دما در کاهش سرعت تولید پروتئین و بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها (24)، کیفیت بیان پروتئین در میزبان اشریشیا کلی ArcticExpress بررسی شد. سویۀ یادشده دو چپرون Cpn60 و Cpn10 را بیان می‌کند که هر دو توانایی زیادی در بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها در دمای 4 تا 12 درجۀ سانتی‌گراد دارند؛ باوجوداین، سویۀ بیانی اولیۀ BL21 پروتئین فعال بیشتری تولید می‌کند. به نظر می‌رسد بیان در ArcticExpress سبب بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها می‌شود، اما به‌علت فعالیت در دمای کم، میزان کل بیان پروتئین در آن کمتر از حدی است که با BL21 رقابت کند؛ به عبارت بهتر، اگرچه بخش زیادی از آنزیم در سویۀ BL21 مجتمع می‌شود، میزان بیان آن به حدی زیاد است که همان درصد کم پروتئین‌های فعال بیشتر از کل پروتئین‌هایی است که ArcticExpress تولید می‌کند؛ در مطالعه‌های دیگر نیز به بیان کم این سویه اشاره شده است (25). باتوجه‌به مطالب یادشده، مطالعه با سویۀ BL21 دنبال شد.

معمولاً نخستین عاملی که برای بهینه‌کردن بیان پروتئین آزمایش می‌شود، محیط‌کشت است؛ زیرا علاوه‌بر اینکه تغییر آن ارزان‌قیمت و آسان است، آثار درخور توجهی در بهبود بیان پروتئین دارد (26). در مطالعۀ حاضر، ابتدا از محیط‌های معمول کشت باکتری شامل LB، TB و 2xYT استفاده شد. محیط LB معمول‌ترین محیط‌کشت برای باکتری است؛ اما به‌علت مقدار کمتر کربوهیدرات‌ها در این محیط، محیط‌های کشت جایگزین مانند TB و 2xYT تودۀ سلولی بیشتری تولید می‌کنند و به تولید آنزیم بیشتر منجر می‌شوند (27)؛ باوجوداین، تفاوتی در فعالیت آنزیم تولید‌شده در این محیط‌ها مشاهده نشد و همچنان فعالیت پروتئین در محیط LB بیش از دو محیط دیگر بود؛ دلیل پدیدۀ یادشده می‌تواند غلظت نمک بیشتر در این محیط باشد که موجب می‌شود پروتئینی با منشأ نمک‌دوست بتواند فعالیت بیشتری در آن داشته باشد. مطالعه‌های دیگر نشان داده‌اند افزایش میزان نمک در محیط‌کشت می‌تواند مقدار بیان پروتئین‌های درون‌سلولی با منشأ نمک‌دوست را افزایش دهد (28). باتوجه‌به فعالیت بیشتر آنزیم و دسترسی راحت‌تر، محیط‌کشت LB در ادامۀ فرایند استفاده شد.

علاوه‌بر ترکیب محیط‌کشت، شرایط دیگر کشت به‌ویژه وجود اکسیژن در محیط نیز اهمیت بسزایی دارد؛ زیرا محدودیت اکسیژن سبب بیان بیش از 200 ژن مؤثر در افزایش قابلیت متابولیکی باکتری در کمبود اکسیژن می‌شود که بیان آنها بخش درخور توجهی از انرژی سلول را مصرف می‌کند و رشد سلولی را کاهش می‌دهد (29). آسان‌ترین راه برای افزایش اکسیژن موجود در محیط، افزایش سرعت به‌هم‌خوردگی محیط است؛ اما مقادیر زیاد آن می‌تواند باعث ایجاد کف شود و درنهایت، میزان اکسیژن دریافتی را کاهش دهد. در مطالعۀ حاضر، بهترین سرعت برهم‌زدن برابر 150 دوربردقیقه تعیین شد و مبنای کار قرار گرفت.

غلظت IPTG (القاکنندۀ بیان) تأثیر چشمگیری در تولید اینکلوژن بادی دارد. افزایش مقدار IPTG سبب ایجاد سمیت برای سلول می‌شود (30) یا با تولید بیش از حد پروتئین، مجتمع‌شدن آنها در اثر اشباع سیستم فولدینگ‌ پروتئین‌ها را در پی دارد (31)؛ از سوی دیگر، کاهش غلظت IPTG سبب القای ناکافی و کاهش تولید پروتئین می‌شود (32). در مطالعۀ حاضر، غلظت 5/0 میلی‌مولار IPTG بیشترین مقدار تولید آنزیم فعال را در پی داشت.

زمان القای بیان، اهمیت ویژه‌ای دارد. شرایط رشد سلولی به‌محض القای بیان تغییر می‌کند و سلول‌ها رشد بسیار کمتری نسبت به قبل خواهند داشت که سبب کاهش زیست‌توده، کاهش بیان پروتئین و کم‌شدن پایداری پلازمید می‌شود (33). در مطالعۀ حاضر، اِعمال تغییرات در لحظۀ القای بیان تأثیر چشمگیری بر فعالیت ویژۀ آسپاراژیناز داشت و کدورت 5/0 که تقریباً در اواسط فاز نمایی منحنی رشد اشریشیا کلی است (34)، بهترین لحظه برای القای بیان در نظر گرفته شد.

مقدار و عمر مایۀ تلقیح ازجمله عواملی هستند که در بیان و فعالیت آنزیم آسپاراژیناز تأثیر دارند (12، 15 و 35). افزایش میزان مایۀ تلقیح سبب تخریب ساختار آنزیم به‌علت برهم‌کنش آن با سایر اجزای محیط می‌شود (36). باوجود گزارش‌های موجود مبنی بر بیان آسپاراژیناز با تلقیح 2 (14) یا حتی 10 درصد (35)، تغییر میزان تلقیح در مطالعۀ حاضر تأثیر معناداری بر مقدار تولید آنزیم فعال نداشت؛ هرچند به‌علت مشاهدۀ بیشترین فعالیت ویژه با 1 درصد تلقیح، این مقدار برای ادامۀ کار انتخاب شد.

همان‌طور که گفته شد، دما نقش مؤثری در بهبود تاخوردگی پروتئین‌ها و افزایش فعالیت آنها دارد. احتمال برهم‌کنش‌های هیدروفوبی در دماهای بیشتر افزایش می‌یابد و فرایند مجتمع‌شدن پروتئین‌ها راحت‌تر اتفاق می‌افتد (37)؛ بنابراین، کاهش دمای بیان یکی از راه‌های متداول برای افزایش دستیابی به پروتئین فعال است؛ هرچند در مطالعۀ حاضر، کاهش دما تأثیری در افزایش فعالیت ویژۀ آسپاراژیناز نداشت. مطالعه‌های مشابهی روی سایر آسپاراژینازهای نوترکیب انجام شده‌اند که در آنها، بیشترین فعالیت آنزیمی با القای بیان در دماهای کمتر از 30 درجۀ سانتی‌گراد حاصل شده است (11 و 38). باتوجه به نتایج این بخش و به‌منظور سهولت کار، دمای بیان مشابه با دمای مناسب کشت و برابر 37 درجۀ سانتی‌گراد در نظر گرفته شد. علاوه‌بر محیط‌های معمول کشت باکتری، حضور برخی افزودنی‌ها در محیط‌کشت می‌تواند مقدار تولید پروتئین محلول را بهبود بخشد؛ به این منظور، ابتدا از آرژینین استفاده شد که یکی از معمول‌ترین و تأثیرگذارترین افزودنی‌های محیط بیان است (39 و 40) و توانست فعالیت ویژه را تا تقریباً دو برابر افزایش دهد. آرژینین از مجتمع‌شدن پروتئین‌های دخیل در فرایند تاخوردگی جلوگیری می‌کند (41) و به‌علت برهم‌کنش‌ با آمینواسیدهای دارای گروه‌های جانبی آروماتیک مانند تریپتوفان سبب پایدارشدن ساختار پروتئین می‌شود (39).

اتانول از دیگر افزودنی‌های محیط‌کشت است که در مطالعه‌های پیشین استفاده و گزارش شده است می‌تواند رفتاری همانند پاسخ سلول در برابر شوک حرارتی[x] را القا کند و افزایش پایداری پروتئین‌ها را در پی داشته باشد (42). اتانول عملکرد بهتری نسبت به اسمولیت‌هایی همچون سوربیتول و سوکروز نشان می‌دهد (43). در مطالعۀ حاضر، افزودن اتانول 2 درصد توانست مقدار فعالیت ویژه را به‌طور معناداری افزایش دهد.

بهینه‌کردن تولید و شرایط کشت و بیان به‌منظور افزایش بهره‌وری تولید از مراحل مهم در تولید پروتئین‌های نوترکیب است. در مطالعۀ حاضر، تغییر شرایط محیطی و فیزیکوشیمیایی سبب بیش از سه برابر افزایش در تولید پروتئین محلول شد (فعالیت ویژۀ حالت پایه در E. coli سویۀ Bl21 از حدود 1000 واحدبرمیلی‌گرم به مقدار تقریبی 3500 واحد‌بر‌میلی‌گرم افزایش یافت). بیشترین تأثیر به عواملی مانند کدورت لحظۀ القای بیان، مدت زمان القا و افزودن اتانول و آرژینین به محیط کشت مربوط بود.

نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند بهینه‌کردن فیزیکوشیمیایی محیط‌کشت و بیان نقش مهمی در افزایش شکل محلول ال-آسپاراژیناز نوترکیب مشتق‌شده از هالوموناس الانگاتا و جلوگیری از ایجاد اینکلوژن بادی دارد؛ ازاین‌رو، پیشنهاد می‌شود در مطالعه‌های آینده به بررسی بیشتر اثر عوامل مؤثر شناخته‌شده در پژوهش حاضر با استفاده از روش‌های آماری و طراحی آزمایش ازجمله تاگوچی[xi] و روش سطح پاسخ پرداخته شود.

(1)        Haskell CM., Canellos GP. L-asparaginase resistance in human leukemia-asparagine synthetase. Biochemical Pharmacology 1969; 18: 2578-2580.
(2)        Prager MD., Bachynsky N. Asparagine synthetase in normal and malignant tissues; correlation with tumor sensitivity to asparaginase. Archives of Biochemistry and Biophysics 1968; 127: 645-654.
(3)        Broome JD. Studies on the mechanism of tumor inhibition by L-asparaginase. Journal of Experimental Medicine 1968; 127: 1055-1072.
(4)        Verma N., Kumar K., Kaur G., Anand S. L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. Critical Reviews in Biotechnology 2007; 27: 45-62.
(5)        Mohan Kumar NS., Shimray CA., Indrani D., Manonmani HK. Reduction of acrylamide formation in sweet bread with L-asparaginase treatment. Food and Bioprocess Technology 2014; 7: 741-748.
(6)        Moharam ME., Gamal-Eldeen AM., El-Sayed ST. Production, immobilization and anti-tumor activity of L-asparaginase of Bacillus sp R36. The Journal of American Science 2010; 6: 157-165.
(7)        Werber G., Ahlke E., Nowak-Göttl U., Jürgens H., Verspohl EJ., Boos J.Asparaginase activities in vitro are highly sensitive to different buffer conditions. In: Büchner T., Schellong G., Ritter J., et al., editors. Acute Leukemias VI. Berlin, Heidelberg: Springer, Berlin, Heidelberg; 1995: 512-516.
(8)        Larson RA., Fretzin MH., Dodge RK., Schiffer CA. Hypersensitivity reactions to L-asparaginase do not impact on the remission duration of adults with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1998; 12: 660-665.
(9)        Oettgen HF., Stephenson PA., Schwartz MK., Leeper RD., Tallal L., Tan CC., et al. Toxicity of E. coli L-asparaginase in man. Cancer 1970; 25: 253-278.
 
(10)      Müller HJ., Beier R., Löning L., Blütters-Sawatzki R., Dörffel W., Maass E., et al. Pharmacokinetics of native Escherichia coli asparaginase (Asparaginase medac) and hypersensitivity reactions in ALL-BFM 95 reinduction treatment. British Journal of Haematology 2001; 114: 794-799.
(11)      Izadpanah F., Homaei A., Fernandes P., Javadpour S. Marine microbial L-asparaginase: biochemistry, molecular approaches and applications in tumor therapy and in food industry. Microbiological Research 2018; 208: 99-112
(12)      Dias FFG., Sato HH. Biocatalysis and Agricultural biotechnology sequential optimization strategy for maximum L-asparaginase production from Aspergillus oryzae CCT 3940. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 2016; 6: 33-39.
(13)      Erva RR., Goswami AN., Suman P., Vedanabhatla R., Rajulapati SB. Optimization of L-asparaginase production from novel Enterobacter sp. by submerged fermentation using response surface methodology. Preparative Biochemistry and Biotechnology 2017; 47: 219-228.
(14)      Dash C., Mohapatra SB., Maiti PK. Optimization, purification, and characterization of L-asparaginase from Actinomycetales bacterium BkSoiiA. Preparative Biochemistry and Biotechnology 2016; 46: 1-7.
(15)      Managamuri U., Vijayalakshmi M., Ganduri VSRK., Babu S., Poda S. Optimization of culture conditions by response surface methodology and unstructured kinetic modeling for L-asparaginase production by Pseudonocardia endophytica VUK-10. Journal of Applied Pharmaceutical Science 2017; 7: 042-050.
(16) Muneer F., Siddique MH., Azeem F., Rasul I., Muzammil S., Zubair M., et al. Microbial L-asparaginase: purification, characterization and applications. Archives of Microbiology 2020; 202: 967-981.
(17)      Ghasemi A., Asad S., Kabiri M., Dabirmanesh B. Cloning and characterization of Halomonas elongata L-asparaginase, a promising chemotherapeutic agent. Applied Microbiology and Biotechnology 2017; 101: 7227-7238.
(18) Gutiérrez-González M., Farías C., Tello S., Pérez-Etcheverry D., Romero A., Zúñiga R., et al. Optimization of culture conditions for the expression of three different insoluble proteins in Escherichia coli. Scientific Reports 2019; 9: 1-11.
(19)      Uhoraningoga A., Kinsella GK., Henehan GT., Ryan BJ. The goldilocks approach: a review of employing design of experiments in prokaryotic recombinant protein production. Bioengineering 2018; 5: 89.
(20)      Papaneophytou C. Design of experiments as a tool for optimization in recombinant protein biotechnology: from constructs to crystals. Molecular Biotechnology 2019; 61: 873-891.
(21)      Packiam KAR., Ramanan RN., Ooi CW., Krishnaswamy L., Tey BT. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology 2020; 104: 3253-3266.
(22)      Kanazawa S., Kiyota H., Kiyota H. Estimation of L-glutaminase and L-asparaginase activities in soils by the indophenol method. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 1995; 41: 305-311.
(23)      Pour Nouroozi R. Determination of protein concentration using bradford microplate protein quantification assay. International Electronic Journal of Medicine 2015; 4: 11-17.
(24)      De Groot NS., Ventura S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Letters 2006; 580: 6471-6476.
(25)      Jamrichová D., Godány A., Urbániková ĽU. Optimization of expression conditions of the acetylesterase CE16 from Hypocrea jecorina encoded by a synthetic gene and expressed in Escherichia coli cells.Nova Biotechnologica et Chimica 2015; 2: 201-211.
(26)      Chambers SP., Swalley SE. Designing experiments for high-throughput protein expression. Methods in Molecular Biology 2009; 498: 19-29.
(27)      Atlas RM., Atlas RM. Handbook of Microbiological Media. 3rd ed. Washington: CRC Press; 2004.
(28)      Parwata IP., Wahyuningrum D., Suhandono S., Hertadi R. Heterologous ectoine production in Escherichia coli: optimization using response surface methodology. International Journal of Medical Microbiology 2019; 2019: 1-13.
(29)      Unden G., Becker S., Bongaerts J., Holighaus G., Schirawski J., Six S. O2-Sensing and O2-dependent gene regulation in facultatively anaerobic bacteria. Archives of Microbiology 1995; 164: 81-90.
(30)      Ramírez OT., Zamora R., Espinosa G., Merino E., Bolívar F., Quintero R. Kinetic study of penicillin acylase production by recombinant E. coli in batch cultures. Process Biochemistry 1994; 29: 197-206.
(31)      Baneyx F., Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology 2004; 22: 1399-1407.
(32)      Kaur J., Kumar A., Kaur J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: roadblocks and reinforcements. International Journal of Biological Macromolecules 2018; 106: 803-822.
(33)      Zhou Y., Lu Z., Wang X., Selvaraj JN., Zhang G. Genetic engineering modification and fermentation optimization for extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology 2018; 102: 1545-1556.
(34)      Sezonov G., Le Joseleau-Petit D., Ari RD. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani Broth. Journal of Bacteriology 2007; 189: 8746-8749.
(35)      Laleh S., Kenari D., Maghsodi V. Food and bioproducts processing production of L-asparaginase from Escherichia coli ATCC 11303 : Optimization by response surface methodology. Food and Bioproducts Processing 2010; 89: 315-321.
(36)      Zhang HC., Yang J., Yang GW., Wang XJ., Fan HT. Production of recombinant protein G through high-density fermentation of engineered bacteria as well as purification. Molecular Medicine Reports 2015; 12: 3132-3138.
(37)      Sørensen H., Mortensen K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microbial Cell Factories 2005; 4: 1.
(38)      Farag AM., Hassan SW., Beltagy EA., El-Shenawy MA. Optimization of production of anti-tumor L-asparaginase by free and immobilized marine Aspergillus terreus. Egyptian Journal of Aquatic Research 2015; 41: 295-302.
(39)      Ishibashi M, Tsumoto K, Tokunaga M, Ejima D, Kita Y, Arakawa T. Is arginine a protein-denaturant? Protein Expression and Purification 2005; 42: 1-6.
(40)      Papaneophytou CP., Kontopidis G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification 2014; 94: 22-32.
(41)      Arakawa T., Ejima D., Tsumoto K., Obeyama N., Tanaka Y., Kita Y. et al. Suppression of protein interactions by arginine: a proposed mechanism of the arginine effects. Biophysical Chemistry 2007; 127: 1-8.
(42)      Thomas JG., Baneyx F. Protein misfolding and inclusion body formation in recombinant Escherichia coli cells overexpressing heat-shock proteins. Journal of Biological Chemistry 1996; 271: 11141-11147.
(43)      Chhetri G., Kalita P., Tripathi T. An efficient protocol to enhance recombinant protein expression using ethanol in Escherichia coli. MethodsX 2015; 2: 385-391.