نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ تولید گیاهی، دانشگاه علومکشاورزی و منابعطبیعی گرگان، ایران
2 دانشیار گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ تولید گیاهی، دانشگاه علومکشاورزی و منابعطبیعی گرگان، ایران
3 استادیار مؤسسۀ تحقیقات علومباغبانی، پژوهشکدۀ مرکبات و میوههای نیمهگرمسیری، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویجکشاورزی، رامسر، ایران
4 دانشیار گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ تولیدگیاهی، دانشگاه علومکشاورزی و منابعطبیعی گرگان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Pseudomonas syringae pv. syringae is the causal agent of several bacterial diseases on a wide range of horticultural and agricultural herbaceous or woody plants. Increasing resistance to antibiotics and undesirable side effects arising from their usage, enhance the trend of finding alternative methods in controlling plant bacterial pathogens using compounds such as chitosan as a safe way.
Material and methods: In this research the effect of different dilutions of Low Molecular Weight (50-190 kDa) chitosan were evaluated on the quorum sensing system of P. syringae pv. syringae B728a biosensor. Finally the effect of the lowest selected dilution was assessed on P. syringae pv. syringae 3289 swarming motility and biofilm formation.
Results: 0.01gr/l LMW chitosan not only could control quorum sensing system in biosensor bacterium, but also decreased P. syringae pv. syringae 3289 swarming motility and biofilm formation (that plays important role in plant colonization and determine virulence severity of this bacterium).
Discussion and conclusion: According to chitosan role in controlling P. syringae pv. syringae quorum sensing system and its swarming motility and biofilm formation (that are two important factors in this bacterium virulence) and with increasing resistance to antibiotices in bacterial pathogeneses, using compounds such as chitosan can be a good replacement for controlling these pathogens.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
کشف فرایند حدّنصاب احساس[1] در سالهای اخیر، دیدگاه ما را دربارۀ نحوۀ زندگی باکتریها تغییر داده است؛ بدین معنی که در گذشته، باکتریها ریزموجوداتی منفرد به شمار میآمدند و اعتقاد بر این بود که بقای خود را ازطریق سازگارشدن با شرایط محیطی و بدون برقراری هیچگونه ارتباطی، تضمین میکنند؛ ولی امروزه پژوهشگران به وجود علامتدهی و ارتباط سلولبهسلول در باکتریها و میانکنش آنها ازطریق تبادل اطلاعات با سایر سلولها پی بردهاند؛ بنابراین وجود شبکۀ علامتدهی در باکتریها، جنبۀ ضروری و پیچیده در چرخۀ زندگی آنهاست؛ ازاینرو نیاز است پژوهش در این زمینه، بسیار پویا و فعال باشد؛ بهطوری که از سال 1996 تاکنون، پژوهش دربارۀ سیستم حدنصاب احساس گسترش پیدا کرد و پیشرفت در کشف حقایق مربوط به آن، تا به امروز ادامه یافته است. درواقع حدّنصاب احساس را میتوان مهمترین مبحث زیستشناسی مولکولی در دهۀ اخیر معرفی کرد. طی دو دهۀ اخیر، دانستههای بشر از رفتار میکروارگانیسمها بسیار افزایش یافته است و امروزه ثابت شده است موجودات تکسلولی، ظرفیت زیادی برای برقراری روابط همزیستی دارند و این برقراری ارتباط سلولی و تشکیل تیمکاری، بهاندازۀ رقابت بر سر استقرار در مناطق جدید، انتشار در مواد غذایی و مقابله با فرایند دفاعی میزبان اهمیت دارد (1). در بسیاری از باکتریهای گرممنفی، سیستم حدّنصاب احساس بهواسطۀ مولکولهای علامتده حفظشدهای عمل میکند که اثر خودالقایی دارد و اسیل هموسرین لاکتون[2] نامیده میشود (2). در جمعیتهای زیاد باکتریایی، اسیل هموسرین لاکتونها میتوانند به گیرندههای اختصاصی متصل شوند که فعالکنندههای رونویسی آبشارهای ژنی دخیل در بیماریزایی هستند؛ بنابراین ممانعت از عملکرد این سیستم میتواند روش جدید و امیدوارکنندهای در مهار بیمارگرهای باکتریایی و جایگزین مصرف آنتیبیوتیکها باشد (3).
در سالهای اخیر، مطالعات مختلفی روی پلیمرهای کیتین، کیتوزان و مشتقات آنها بهعنوانِ ترکیبات زیستی فعال صورت گرفته است (4). کیتین، پس از سلولز، فراوانترین پلیمر زیستی در طبیعت است. مهمترین مشتق کیتین، کیتوزان نام دارد که از استیلزدایی[3] کیتین به دست میآید. منابع عمدۀ کیتین، پوستۀ سختپوستان دریایی مثل خرچنگ، میگو و کریل است (5). کیتوزان و مشتقات آن کاربردهای زیادی در صنایع غذایی، آرایشی، کشاورزی و پزشکی دارند (6). با وجودِ این، وزن مولکولی زیادِ کیتوزان باعث افزایش چسبندگی و کاهش حلالیت و درنتیجه محدودیت استفاده از آن در برخی صنایع میشود (7). خواص ضدمیکروبی کیتوزان به خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن ازجمله وزن مولکولی و درصد استیلزدایی آن بستگی دارد. افزایش درصد استیلزدایی و کاهش وزن مولکولی در قالب الیگومرهای کیتوزانی باعث افزایش فعالیت ضدمیکروبی کیتوزان میشود (8). کیتوزان عامل سازگار زیستی با خاصیت ضدباکتریایی قوی است که اثر سمی ندارد (9) و میتواند بر سیستم حدّنصاب احساس باکتریها اثر مهارکنندگی داشته باشد (10). این ترکیب در مقایسه با سایر ضدعفونیکنندهها فعالیت ضدمیکروبی بیشتر و گستردهتری دارد و اثر ضدبیوفیلمی و توانایی آن در تخریب بیوفیلم که عوامل میکروبی تولید کردهاند نیز به اثبات رسیده است (11).
بررسیهای پیشین حاکی از آن است که کیتوزان با وزن مولکولی زیاد میزان بیان سیستم حدّنصاب احساس در باکتری Chromobacterium violaceumراپس از 24 ساعت تا 67درصد کاهش میدهد؛ درحالیکه اثر مهارکنندگی این ترکیب با وزن مولکولی کم پس از 24 ساعت 43درصد بوده است. از این یافتهها اینطور استنباط شد که هردو نوع کیتوزان میتوانند در غشای سلولی باکتری نفوذ کنند و از این طریق در عملکرد آن اختلال ایجاد میکنند (12). گزارش دیگر حاکی از آن است که کیتوزان با وزن مولکولی کم، بهطورِ مشخصی جلوِ تشکیل بیوفیلم بهوسیلۀ Candida parapsilosis را در شرایط آزمایشگاهی و زیستی میگیرد (13) و توانایی زیادی در کاهش تشکیل بیوفیلم توسط C. albicans وStaphylococcus epidermidisدارد (14).
در پژوهشی دیگر مشخص شد کیتوزان بهدستآمده از اسکلت خارجی میگو، به تخریب سلولهای باکتری P. syringae pv. tomato DC3000 (عامل لکۀ باکتریایی گوجهفرنگی) میانجامد؛ بهطوری که با ایجاد تغییرات بیوشیمیایی در جمعیت انبوه سلولهای باکتریایی، در رشد آنها نیز اختلال ایجاد میکند. این امر بهدلیلِ نفوذ کیتوزان به داخل غشای سلولی باکتری است که افزایش مرگ سلولهای باکتری را به همراه دارد. در نشاءهای گوجهفرنگی مایهزنیشده با کیتوزان نیز میزان وقوع بیماری ناشی از باکتری Pto DC3000 کاهش یافت. این یافته بیانگر نقش کیتوزان بهعنوانِ میکروبکش طبیعی بیخطر است (15).
باکتری Pss از باکتریهای گرممنفی بیماریزای گیاهی است که بر دامنۀ وسیعی از گیاهان زراعی و باغی علفی و چوبی با ایجاد علائمی چون لکۀ برگی، شانکر و نکروز پوستی خسارتزاست (16). این امر بیانگر نقش این باکتری بهعنوانِ یکی از عوامل تهدیدکنندۀ امنیت غذایی است. ﺑﻴﻤﺎری ﺑﻼﺳﺖ که ﻳﻜﻲ از بیماریﻫﺎی ﺷﺎﻳﻊ در ﻣﻨﺎﻃﻖ ﮔﺮﻣﺴﻴﺮی و نیمهگرﻣﺴﻴﺮی ﻛﺸﺖ ﻣﺮﻛﺒﺎت ازﺟﻤﻠﻪ ﺷﻤﺎل اﻳﺮان است، ﻋﻤـﺪﺗﺎً بهوسیلۀ ﺟﺪاﻳﻪﻫﺎی این ﺑﺎﻛﺘﺮی اﻳﺠﺎد میشود (17) که خسارت آن در سالهای مختلف بهدلیلِ تغییر شرایط اقلیمی متفاوت است و در سالهایی که شرایط آبوهوایی ازلحاظ رطوبت و دما برای فعالیت این باکتری مناسب باشد بسیار زیاد خواهد بود (18)؛ بنابراین در این بررسی، باکتری Pss نمونۀ هدف انتخاب شد و کارایی کیتوزان با وزن مولکولی کم در مهار سیستم تنظیمی حدّنصاب احساس آن بررسی شد.
مواد و روشها.
.جدایههای باکتریایی استفادهشده در این پژوهش: یک سویه از باکتری Pss با عنوان گزارشگر، PssB728 (pBQ9)، که ژن ahlI آن به ژن بدون پیشبرنده[4] کدکنندۀ رنگ سبز فلورسنت[5] وابسته به وجود اسیل هموسرین لاکتونها متصل است و از پروفسور استیون ای لیندو، بخش بیولوژی گیاهی و میکروبی دانشگاه کالیفرنیا، برکلی دریافت شده است. باکتری Pss3289 جدایۀ عامل بلاست مرکبات در مزرعه که از پژوهشکدۀ مرکبات و میوههای نیمهگرمسیری رامسر دریافت شد.
تهیۀ کیتوزان و غلظتهای مختلف آن: کیتوزان استفادهشده در این پژوهش از نوع وزن کم[6] و با درجۀ استیلزدایی[7]90-85 بود که از شرکت نانو پویا پلیمر دریافت شد. برای تهیۀ یک محلول پایۀ دو گرم بر لیتر، دو گرم از این ترکیب به یک لیتر اسید استیک گلاسیال 99درصد اضافه شد و بهمدتِ یک شبانهروز روی شیکر در دمای 40 درجۀ سلسیوس نگهداری شد تا محلول یکنواخت باهم و شفافی به دست آید (12). سپس از این محلول اولیه، غلظتهای 75/0، 5/0 ، 2/0 ، 05/0 ، 02/0 و 01/0 گرم بر لیتر و 2 ، 5/ 1 و 1 میلیگرم بر لیتر کیتوزان در محیط کشت کینگ ب[8] تهیه شد.
ارزیابی تأثیر غلظتهای مختلف کیتوزان بر سیستم حدّنصاب احساس جدایۀ گزارشگر: برای انجام این بررسی، سوسپانسیون جدایۀ گزارشگر با غلظتcfu/ml 109 تهیه شد و در سطح ظروف پتری محتوی محیط کشت کینگ ب با غلظتهای مختلف کیتوزان پخش و مایهزنی شد. برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد و ظروف پتری کشتشده بهمدتِ سه روز در دمای 27 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند و پس از آن میزان بازداری از بیان ژن کدکنندۀ رنگ سبز فلورسنت با استفاده از دستگاه ژل داک ارزیابی شد (12، 19).
بررسی کمّی توان غیرفعالسازی بیان رنگ سبز فلورسنت جدایۀ گزارشگر توسط کیتوزان: برای بررسی نقش کیتوزان در مهار سیستم تنظیمی حدّنصاب احساسباکتری Pss 3289، به هر چاهک پلیت الیزا 5/1 میکرولیتر محلول کیتوزان دو گرم بر لیتر (غلظت 01/0 گرم بر لیتر) اضافه شد. سپس 5/293 میکرولیتر محیط کشت کینگ ب مایع بدون آگار[9] به هرکدام از آنها اضافه شد و درنهایت هر چاهک با 5 میکرولیتر جدایۀ گزارشگر Pss B728a(pBQ9) با غلظت cfu/ml 105 مایهزنی شد. شاهد منفی شامل محیط کشت کینگ ب مایع و شاهد مثبت شامل جدایۀ گزارشگر در محیط کشت بالا بود. پس از این مرحله، پلیت الیزا بهمدتِ 72 ساعت روی دستگاه شیکر با دور rpm150در دمای 28 درجۀ سلسیوس نگهداری شد تا در مرحلۀ بعد میزان بیان ژن کدکنندۀ رنگ سبز فلورسنت در هرکدام از چاهکها ارزیابی شود (19 و 12). میزان رنگ سبز فلورسنت تولیدی با دستگاه فلوریمتر[10] خوانش شد. درصد کاهش نور نسبت به شاهد برای هر تیمار با استفاده از معادلۀ (۱) محاسبه شد (20). آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار انجام شد.
|
معادلۀ 1 |
100×شدت نور در شاهد مثبت/(شدت نور در تیمارـشدت نور در شاهد مثبت) ꞊ درصد کاهش شدت نور |
.ارزیابی نقش کیتوزان در ممانعت از حرکت تجمعی[11]Pss 3289:برای این بررسی ابتدا ایزولۀ باکتری Pss 3289 پس از کشت روی محیط کینگ ب بهمدتِ 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سلسیوس نگهداری شد. سپس پرگنههای تشکیلشده از سطح پتری جمعآوری شد و در مخلوط 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان در کینگ ب مایع ( cfu/ml107 ×1) بهصورتِ سوسپانسیون درآمد. پس از آن، یک قطره از این مخلوط روی دیسکهایی از کاغذ صافی سترون که در مرکز ظروف پتری محتوی کینگ ب نیمهجامد (دارای 4/0درصد آگار) قرار داشت، مایهزنی شد و این ظروف بهمدتِ 72 ساعت در دمای 26 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند. سپس قطر حرکت گروهی سلولها از مرکز هر دیسک کاغذی اندازهگیری شد. شاهد مثبت شامل یک قطره محیط کشت کینگ ب مایع مایهزنیشده با Pss 3289 بدون کیتوزان بود. این آزمایش در سه تکرار برای هر تیمار انجام گرفت (21) (با اندکی تغییر شامل افزودن کیتوزان به محیط کشت مایع برای بررسی اثر آن بر ممانعت از حرکت تجمعی).
بررسی تأثیر کیتوزان بر تشکیل بیوفیلم Pss 3289: در این بررسی از روش میکروتیترپلیت استفاده شد؛ بدین منظور ابتدا باکتری Pss 3289 روی محیط نوترینت[12] آگار کشت شد و پس از نگهداری بهمدتِ 24 ساعت در دمای 48 درجۀ سلسیوس دوباره در محیط لوریا برتانی[13] کشت شد و بهمدتِ 18 ساعت در دمای 28 درجۀ سلسیوس نگهداری شد. پس از این مدت، در محیط لوریا برتانی بهصورتِ سوسپانسیون درآمد و پس از خواندن میزان چگالی با دستگاه اسپکتروفوتومتر رقت 8/0 OD620= انتخاب شد. برای شاهد منفی فقط به هر چاهک 300 میکرولیتر محیط لوریا برتانی اضافه شد. برای شاهد مثبت هر چاهک محتوی 5/293 میکرولیتر محیط لوریا برتانی، 5/1 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال و 5 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری بود. برای کیتوزان نیز هر چاهک محتوی 5/293 میکرولیتر محیط لوریا برتانی، 5/1 میکرولیتر کیتوزان دو گرم بر لیتر و 5 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری بود. برای هر تیمار سه تکرار تعیین شد (22، 12). این میکروپلیتها بهمدتِ 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سلسیوس بدون حرکت نگهداری شدند. پس از این مدت، سلولهای پلانکتونی برداشته شدند و تعداد آنها در OD620 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (23). باکتریهای باقیمانده، با قراردادن در دمای 50 درجۀ سلسیوس بهمدتِ 20 دقیقه در چاهکها ثابت شدند و سپس بهمدتِ یک دقیقه با 150 میکرولیتر کریستال ویولۀ 1/0درصد رنگآمیزی شدند. رنگ اضافی با برگرداندن میکروپلیتها خارج شد و با افزودن 250 میکرولیتر آبمقطر استریل به هرکدام از چاهکها دو بار شستوشو شد. پس از این مرحله، میکروپلیتها در دمای اتاق خشک شدند. سپس به هر چاهک 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال 33درصد اضافه شد و چند بار با سمپلر بهخوبی هم زده شد تا رنگهای متصل به چاهک که بیانگر میزان تشکیل بیوفیلم است بهخوبی حل شود. پس از یکنواختشدن محلول هر چاهک، میزان جذب در 630 نانومتر با استفاده از دستگاه الیزا ریدر خوانده شد (25، 24، 12). وضعیت تشکیل بیوفیلم در چاهکها طبق روش براساسِ معادلۀ (۲) محاسبه شد (26) که در آن ODC میانگین جذب نوری چاهکهای شاهد منفی و ODT میانگین جذب نوری چاهکهای تیمار است.
|
معادلۀ 2 |
تشکیلنشدن بیوفیلم ODT≤ODC= |
قدرت تشکیل بیوفیلم ضعیف ODC<ODT≤(2×ODC)=
قدرت تشکیل بیوفیلم متوسط (2×ODC)<ODT≤(4×ODC)=
قدرت تشکیل بیوفیلم قوی (4×ODC)<ODT=
میزان کارایی غلظت 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان بر درصد کاهش تشکیل بیوفیلم، براساسِ معادلۀ (3 ) محاسبه شد (27).
معادلۀ 3
|
100 OD× شاهد / OD تیمار- OD شاهد =درصد کاهش بیوفیلم |
پردازش و تحلیل دادهها: پردازش و تحلیل دادهها با استفاده از آزمون t مستقل با نرمافزار SPSS 16.0 انجام گرفت. نتایج بیانشده میانگین ± انحراف معیار میانگین برای 3 تکرار است.
نتایج.
.ارزیابی غلظتهای مختلف کیتوزان روی سیستم حدّنصاب احساس جدایۀ گزارشگر: در این بررسی مشخص شد غلظتهای 2، 5/1 و 1 میلیگرم بر لیتر کیتوزان نقشی در بازداری از حدّنصاب احساس جدایۀ گزارشگر ندارند؛ ولی غلظتهای 75/0، 5/0 ، 2/0 ، 05/0 ، 02/0 و 01/0 گرم بر لیتر در بازداری مؤثرند؛ بنابراین از بین آنها کمترین غلظت برای انجام بررسیهای بعدی انتخاب شد (شکل 1).
شکل 1- تأثیر غلظتهای مختلف کیتوزان در ممانعت از بیان پروتئین سبز فلورسنت استرین گزارشگر؛ a. شاهد (محیط کینگ ب بدون کیتوزان)، b. محیط کینگ ب محتوی 1 میلیگرم بر لیتر کیتوزان، c. محیط کینگ ب محتوی 5/1 میلیگرم بر لیتر کیتوزان، d. محیط کینگ ب محتوی 2 میلیگرم بر لیتر کیتوزان، e. محیط کینگ ب محتوی 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان، f. محیط کینگ ب محتوی 02/0 گرم بر لیتر کیتوزان، g. محیط کینگ ب محتوی 05/0 گرم بر لیتر کیتوزان، h. محیط کینگ ب محتوی 2/0 گرم بر لیتر کیتوزان، i. محیط کینگ ب محتوی 5/0 گرم بر لیتر کیتوزان، j. محیط کینگ ب محتوی 75/0 گرم بر لیتر کیتوزان
.نتیجۀ کمّی میزان عملکرد کیتوزان، بازدارندۀ سیستم حدّنصاب احساس: در این بررسی، مشخص شد غلظت 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان با وزن مولکولی کم توانست از حدّنصاب احساس در باکتری Pss B728a(pBQ9) ممانعت کند که نتایج آن در جدول 1 ارائه شده است.
.نتیجۀ بررسی اثر کیتوزان با وزن کم بر حرکت تجمعی باکتری Pss 3289: در این بررسی، مشخص شد کیتوزان با وزن مولکولی کم در مقایسه با شاهد، حرکت Pss 3289 را در محیط محتوی آگار 4/0درصد کاهش میدهد (شکل 2). این مسئله بیانگر این واقعیت است که کاهش سرعت تهاجمی Pss 3289 توسط کیتوزان میتواند روش بالقوهای برای کاهش کلنیزاسیون سطح گیاه در مقایسه با سایر میکروارگانسیمها باشد.
ارزیابی کیتوزان با وزن مولکولی کم در ممانعت از تولید بیوفیلم توسط Pss 3289: میزان تشکیل بیوفیلم توسط جدایۀ Pss 3289 تیمارشده با کیتوزان در دو زمان 48 و 96 ساعت در مقایسه با شاهد کاهش یافت و با آن در سطح 01/0 تفاوت معنیداری داشت (جدول 2). تعداد سلولهای پلانکتونی این جدایه نیز در مقایسه با شاهد پس از تیمار 48 و 96ساعته با کیتوزان کاهش پیدا کرد (شکل 3).
جدول 1- بازداری از سیستم حدّنصاب احساس Pss B728a(pBQ9) با استفاده از کیتوزان با وزن مولکولی کم
|
Treatments (تیمارها) |
Means of emitted light ±SD (میانگین نور ساطعشده± انحراف معیار) |
Percent of emitted light reduction (درصد کاهش نور ساطعشده) |
|
Control(شاهد) (Pss B728a) |
29147±132a |
0 |
|
Chitosan(کیتوزان)+Pss B728a (pBQ9) |
19296±571b |
8/33 |
نتایج میانگین سه تکرار است. اعدادی که با حروف متفاوت علامتگذاری شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگینها با آزمون t مستقل در سطح 01/0 اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <).
شکل 2- کاهش حرکت تجمعی Pss 3289 بهوسیلۀ کیتوزان با وزن مولکولی کم. (a) شاهد (Pss 3289). (b) کیتوزان با وزن مولکولی پایین+ Pss 3289. اعدادی که با حروف متفاوت علامتگذاری شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگینها با آزمون t مستقل در سطح 01/0 اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <)
جدول 2- میزان تشکیل بیوفیلم توسط جدایۀ Pss 3289 در مقابله با کیتوزان با وزن مولکولی کم پس از 48 و 96 ساعت نگهداری در دمای 28 درجۀ سلسیوس
|
Incubation time(hours) (زمان نگهداری(ساعت)) |
Biofilm formation (تشکیل بیوفیلم) |
Treatments (تیمارها) |
Mean OD ±SD (میانگین چگالی± انحراف معیار) |
Percentage of biofilm inhibition (درصد بازداری از تشکیل بیوفیلم) |
|
48 |
Moderate adherent (چسبندگی متوسط) |
Control (Pss 3289) (شاهد (Pss 3289)) |
057/1±201/0a |
00/0 |
|
Weak adherent (چسبندگی ضعیف) |
Chitosan (کیتوزان) |
395/0±084/0b |
63 |
|
|
96 |
Strong adherent (چسبندگی قوی) |
Control (Pss 3289) (شاهد (Pss 3289)) |
307/2±120/0a |
00/0 |
|
Weak adherent (چسبندگی ضعیف) |
Chitosan (کیتوزان) |
801/0±041/0b |
65 |
اعدادی که با حروف متفاوت علامتگذاری شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگینها با آزمون t مستقل در سطح 01/0 اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <).
شکل 3- میانگین سلولهای پلانکتونیPss 3289 تیمارشده با کیتوزان براساسِ OD600nm پس از نگهداری بهمدتِ 48 ساعت (a) و 96 ساعت (b) در دمای oC28. علامت بار خطا نشاندهندۀ انحراف معیار (برای سه تکرار) است. در a و b ستونهایی که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگینها با آزمون t مستقل با 99درصد اطمینانْ اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <).
بحث و نتیجهگیری
گسترش سریع مقاومت به آنتیبیوتیکها در بیمارگرهای باکتریایی ضرورتِ پیداکردن جایگزینی مناسب در مهار این نوع بیمارگرها را بیشازپیش مشخص میکند و این مسئله زمانی ملموستر میشود که بیمارگر مدنظر، دامنۀ میزبانی وسیعی داشته باشد؛ ازاینرو در پژوهشهای اخیر، توجه به ترکیبات طبیعی چون کیتوزان با خاصیت آنتیباکتریایی زیاد، سطح عملکرد وسیع، سرعت کشندگی زیاد، توان زیاد در تخریب بیوفیلمهای باکتریایی و سمّیت کم بر سلولهای انسانی، بیشازپیش افزایش یافته است (11). در بررسی اخیر توان کیتوزان در مهار سیستم حدّنصاب احساس باکتری Pss 3289 که تنظیمکنندۀ حرکت، بیان
پلیساکاریدهای خارج سلولی، عوامل مرتبط با سازگاری رورستی و بیمارگری P. syringaeاست (13)، ارزیابی شد و مشخص شد این ترکیب بر سیستم حدّنصاب احساس باکتری گزارشگر Pss B728a(pBQ9) نقش مهارکنندگی دارد. این نتیجه مشابه نتایج تأثیر کیتوزان بر سیستم تنظیمی باکتریهای مرتبط با بیماریهای کلینیکی لثه است (12).
حرکت تجمعی، حرکتی وابسته به چگالی سلولی و مرتبط با سطح در باکتریهاست که بهصورتِ هماهنگ و اجتماعی رخ میدهد (28). کاربرد کیتوزان در این پژوهش میزان حرکت تجمعی باکتری Pss 3289 را تا 79درصد کاهش داد. پژوهشهای پیشین نیز حاکی از این است که کیتوزان نقش مؤثری در کاهش میزان اسیل هموسرین لاکتون، بیوفیلم، تولید پیوسیانین و حرکت باکتری P. aerouginosa دارد (29). ازسوی دیگر، ثابت شده است کیتوزان استخراجی[xiv] و کیتوزان تجاری[xv] تا حدّ زیادی در ممانعت از حرکت تجمعی باکتری P. aerouginosa PAO1 مؤثرند و مانع از تشکیل بیوفیلم توسط آن میشوند (30).
بیوفیلمها، ساختاری از مجموعۀ سلولی میکروبها هستند که بهصورتِ متصل به سطوح زنده یا غیرزنده یافت میشوند. این ساختارهای سهبعدی همواره در داخل یک ماتریکس پیچیده محصور شدهاند. تشکیل بیوفیلم در هردو ردۀ باکتریهای گرممثبت و گرممنفی مشاهده میشود. درحقیقت یکی از اصلیترین سازوکارهای بقای باکتریها در محیطهای مختلف، استفاده از همین توان تولید بیوفیلم و زندگی در آن است (31). چرخۀ سنتی تشکیل بیوفیلم در باکتریها شامل اتصال سلولهای پلانکتونیشکل باکتری به سطح، رشد، بلوغ و توزیع آنهاست؛ بنابراین هر عاملی که بتواند هر مرحله از این چرخه را تخریب کند، میتواند به مهار بیماریهای مرتبط با بیوفیلمهای باکتریایی کمک کند؛ ازاینرو بهکارگیری کیتوزان بهعنوانِ پلیساکارید طبیعی میتواند راهبردی امیدوارکننده در مهار بیماریهای باکتریایی باشد (32). میزان حساسیت بیوفیلمهای باکتریایی به عوامل ضدمیکروبی مختلف در مقایسه با باکتریهای موجود به حالت پلانکتونی 1000 بار کمتر است (33). در بررسی انجامشده، کیتوزانِ بهکاررفته میزان سلولهای پلانکتونیشکل باکتری Pss 3289 را پس از 48 ساعت 26درصد و پس از 96 ساعت 44درصد کاهش داد. بررسیهای پیشین نیز حاکی از این واقعیت است که دو حالت ریزذره و تعلیقشدۀ کیتوزان در اسید استیک 1/0 مولار میتواند بقای سلولهای پلانکتونی باکتری Streptococcus mutansرا کاهش دهد (32).
در این بررسی کیتوزانِ استفادهشده میزان تشکیل بیوفیلم توسط باکتری Pss 3289 را نیز در حدّ درخورِتوجهی کاهش داد. گزارشهای پیشین نیز همسو با این پژوهش، بیانگر این واقعیت است که ترکیب مساوی از محلول کیتوزان استخراجشده از پوستۀ میگو و خرچنگ میتواند میزان بیوفیلم در باکتریهای P. aeruginosa و Staphylococcus aureus را تا حدّ درخورِتوجهی کاهش دهد (34). به نظر میرسد اثر ضدمیکروبی کیتوزان به بار گروههای آمینوِ[xvi] آن بستگی دارد. این گروهها در برهمکنش الکترواستاتیک با گروههای بار منفی سطح باکتری نقش دارند (35). این برهمکنش ممکن است به تخریب دیوارۀ سلولی و تغییر در نفوذپذیری و خصوصیات دفاعی آن بینجامد (36). نظریۀ دیگر این است که کیتوزان به داخل غشای سلولی نفوذ میکند، با DNA یا mRNAهای موجود در سیتوپلاسم باند میشود و از سنتز پروتئین ممانعت میکند (7) یا اینکه با کلاتهکردن عناصر ضروری مانع از رشد و انجام متابولیسم در عوامل میکروبی میشود (37)؛ هرچند میزان کارایی کیتوزان به عوامل متعددی ازجمله نوع میکروارگانیسم، خصوصیات غشای سلول و خصوصیات ذاتی کیتوزان (ظرفیت کلاتهکردن، میزان استیلزدایی، وزن مولکولی و خصوصیت آبدوستی/آبگریزی و...) وابسته است (38).
درمجموع، نتایج حاصل از این پژوهش بیانگر این واقعیت است که کیتوزان میتواند سیستم تنظیمی حدّنصاب احساس در باکتری Pss را مهار کند و میزانحرکت تجمعی و تشکیل بیوفیلم در آن را که دو خصوصیت مهم در بیماریزایی این باکتری است، کاهش میدهد؛ بنابراین باتوجهبه روند افزایش مقاومت آنتیبیوتیکی در بیمارگرهای باکتریایی، بهکارگیری ترکیباتی چون کیتوزان میتواند جایگزین مناسبی در مهار بیمارگرهای باکتریایی باشد.
سپاسگزاری
در اینجا از پروفسور استیون لیندو، استاد بخش بیولوژی گیاهی دانشگاه کالیفرنیا در برکلی آمریکا برای ارسال جدایۀ گزارشگر Pss B728 (pBQ9) و شرکت نانو پویا پلیمر برای در اختیار قراردادن کیتوزان صمیمانه سپاسگزاری میشود. نگارندگان همچنین از معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای فراهمکردن اعتباراتپژوهشی این پژوهش و همچنین از پژوهشکدۀ مرکبات و میوههای نیمهگرمسیری رامسر برای در اختیار قراردادن جدایۀ Pss 3289 و فضای پژوهشی و آزمایشگاهی صمیمانه سپاسگزاری میکنند.
)