نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 پژوهشکده زیستفناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
2 استادیار گروه زیستفناوری صنعتی و محیطزیست، پژوهشکدۀ زیستفناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
3 استاد گروه زیستفناوری صنعتی و محیطزیست، پژوهشکدۀ زیستفناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران
4 دانشیار دانشکدۀ پیراپزشکی- علوم آزمایشگاهی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
5 استاد گروه علوم خاک، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Pollution caused by oil extraction processing stimulates the growth of petroleum hydrocarbon-degrading bacteria. Bioremediation, a process that utilizes the capability of microorganisms to degrade petroleum hydrocarbon compounds, is emerging as a promising technology for the treatment of soil and groundwater contamination. This paper aimed to separate petroleum-degrading bacteria and to investigate their applicability in the bioremediation of petroleum-contaminated soils.
Materials and methods: Sampling was done from the soil of a refinery area. A mineral culture-medium environment containing n-hexane was used for isolation. Isolated bacteria were identified by biochemical methods and 16S rRNA sequencing. Phytotoxicity test was performed by measuring the percentage of Lepidium sativumm seed germination. Contaminated soil bioremediation was performed using the selected strains in the laboratory and the environment over three months.
Results: A total of 19 bacteria isolates capable of growing on mineral medium containing n-hexane were isolated. Among the isolated strains, four strains had the highest ability to biodegrade the petroleum compounds of anthracene, naphthalene, and phenanthrene. By the molecular identification method, the selected strains were identified as Stenotrophomonas maltophilia (SB10), Bacillus subtilis subsp.spizizenii (SB7), Streptomyces ambofaciens (SB14), andCupriavidus respiraculi (SB16). The treatment of petroleum-contaminated soils using S. maltophilia (SB10) increased the population of petroleum-degrading bacteria from 5.2×103 to 1.4×104 at the end of the third month. The rate of biodegradation of the total petroleum hydrocarbons reached 80% and the germination power of Lepidium sativumm reached 68% at the end of the third month.
Discussion and conclusion: The addition of the selected bacterial strains to soil contaminated with petroleum compounds increased the population of degrading bacteria. The use of degrading bacteria along with sawdust improved the purification of petroleum-contaminated soils.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
آلودگیهای نفتی تقریباً پیامد اجتنابناپذیر افزایش مصرف انرژی و فعالیتهای صنعتیای است که برپایۀ مصرف نفت قرار گرفتهاند. امروزه فناوری زیستپالایی میکروبی بهسرعت توسعه یافته و به دستاوردهای بزرگی رسیده است؛ بااینحال، این فناوری متأثر از عوامل محیطی زیادی است که مانع کاربرد عملی آن میشوند و استفادۀ گستردۀ آن را محدود میکنند (1). بهعلاوه، فعالیتهای بشر برای تأمین نیازهای انرژی خود به نفت متکی است و همین امر باعث شکوفایی صنعت پتروشیمی شده است؛ بااینحال، استفاده از نفت به وخیمشدن وضع محیطزیست میانجامد (2). توسعۀ زیستفناوری میکروبی و فناوری تعیین توالی با توان بالا مانند روشهای میکروسیالی برای غربالگری و شناسایی میکروارگانیسمهای عملگرا از محیطهای آلوده به هیدروکربنهای نفتی مفید است. بسیاری از پژوهشها نشان دادهاند تعداد زیادی از باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنی در محیطهای غنیشدۀ نفتی، مانند مناطق نشت نفتی و مخازن نفتی وجود دارد (3). فراوانی و نوع میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنی تا حد زیادی به نوع هیدروکربنهای نفتی و عوامل محیطی اطراف آن بستگی دارد. لی[1] و همکارانش تجزیۀ هگزان و سایر ترکیبات هیدروکربنهای نفتی را با استفاده از یک سویۀ جدید Rhodococcus sp. EH831 بررسی کردند. این باکتری که از محیط کنسرسیوم تجزیهکنندۀ هگزان جداسازی شده است، میتواند هگزان و انواع هیدروکربنها شامل الکلها، هیدروکربنهای کلردار، آلکانهای حلقوی و هیدروکربنهای نفتی را تجزیه کند (4). بررسیِ اثرِ غلظت مواد، دما، pH و غلظت نفت خام موجود در محیط بر تخریب زیستی هیدروکربنهای نفتی در Pseudomonas aeruginosa ثابت کرده است که بیشترین میزان تخریب (5/91درصد) در 8=pH، دمای 28 و غلظت 2-1/0درصد نفت خام صورت گرفته است و بیشترین فعالیت این باکتری برروی روغنموتور، نفت خام، سوخت دیزل، کروسن، نفتالین، آنتراسن و گزیلن است (5). سانجت[2] و همکارانش در پژوهش خود در مقیاس واقعی و میدانی با افزودن میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی موجود در خاکهای شهری آلوده به نفت در مدت ۱۲۰ روز مشاهده کردند این تلقیح باعث تخریب هیدروکربنهای کل نفتی در حدود 7/89 تا 92درصد و بهخصوص آلکانها 2/94درصد و ترکیبات آروماتیک در حدود 9/91درصد میشود و حتی ترکیبات آسفالتن در حد 2/85درصد در مدت یک سال تخریب شد (6). در پژوهشهای انجامشده بر پاکسازی مجتمعهای آلوده به مازوت با استفاده از کمپلکس باکتریهای موجود در مناطق آلوده، نشان داده شده است درصورتِ مناسببودن شرایط جوّی در عرض ۵۳ روز، میزان پاکسازی مفید به 95درصد خواهد رسید. معلوم شد در طی پاکسازی اراضی مجتمعهای صنعتی کاغذ و سلولز، استفاده از پسماند این مجتمع میتواند بهعنوانِ تثبیتکننده در تجزیۀ ترکیبات نفتی به کار رود (7). ماین[3] و همکارانش در پژوهش خود از باکتریهای مناطق آلوده، کمپوست تهیه کردند و با استفاده از مواد حجیم (تثبیتکننده) مانند کاه جو، مواد مغذی، رطوبت و کوسوبستراها ترکیب مناسبی برای زیستپالایی تهیه کردند. با سنجش میزان دیاکسید کربن و کاهش هیدروکربن باقیمانده (هیدروکربن کل تا 30درصد شامل C15-C30 و هیدروکربنهای اشباعشدۀ آروماتیک تا دوسومِ میزان اولیه) توانستند حضور فعال میکروبهای دارای قابلیت تخریب را در خاکهای آلودۀ شهری اثبات کنند (8).
در یکی از پالایشگاههای اسپانیا پیشنهاد شده است از کنسرسیوم باکتریهای مناطق آلوده به ترکیبات نفتی در شهر بهعنوانِ روشی کمهزینه برای افزایش زیستپالایی خاکهای آلوده به نفت استفاده شود. این طرح در خاکهای با میزان آلودگی هیدروکربن زیاد (250 تا300 گرم در کیلوگرم خاک) در شرایط نیمهخشک انجام شده است و طی سه ماه با استفاده از خاکاره، تراشههای چوب و کود آلی مایع و فضولات خوک، موفق شدند هیدروکربنهای اولیه را ۶۰درصد پاکسازی کنند (9).
پژوهشها نشان میدهد برای پاکسازی زیستی آلودگیهای نفتی، استفاده از جمعیت میکروبی جداشده از خاکهای آلوده و صنعتی اهمیت بهسزایی دارد. پژوهشگران به تثبیت میکروارگانیسمهای روی حاملهای مناسب مانند خاکاره برای انجام فرایند بهتر پاکسازی زیستی توجه کردهاند (10).
هدف از این پژوهش، جداسازی باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی از خاکهای آلوده به مواد نفتی و انتخاب و شناسایی سویههای با ظرفیت بیشتر برای تجزیه است تا بتوان از آن در آزمایشهای زیستپالایی خاکهای آلوده استفاده کرد.
مواد و روشها
غربالگری و شمارش باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی: برای غربالگری و تعیین تعداد باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربن از محیط کشت ریموند[4] استفاده شد که یک محیط کشت معدنی حاوی n-هگزان (1درصد v/v) بهعنوانِ تنها منبع انرژی و کربن است. هگزان ترکیبی شاخص از ترکیبات آلی فرّار است که از اجزای تشکیلدهندۀ گازوئیل محسوب میشود. برای تهیۀ یک لیتر محیط کشت جامد از ترکیبات زیر (بر حسب گرم) استفاده شد:
CaCl2,6H2O)0.01( Na2HPO4)0.7( MgSO4)0.2( NH4Cl)2( MnSO4,5 H2O )0.02( KH2PO4)0.5( Na2CO3 )0.1) آگار آگار (15)
برای جداسازی باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنها، پس از تهیۀ رقتهای 5-10- 4-10 از سوسپانسیون خاک آلوده از پالایشگاه نفت شهر تبریز در پلیتهای حاوی محیط کشت معدنی و n-هگزان (بهعنوان تنها منبع کربن و انرژی) تلقیح انجام شد. کشت در مدت ۷ روز و دمای ۲۸ درجۀ سانتیگراد صورت گرفت. پس از شمارش تعداد کلنیهای رشدیافته، جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ n-هگزان محاسبه شد.
شمارش تعداد کل باکتریها در نمونههای خاک: با تهیۀ رقتهای متوالی از نمونههای خاک در آبمقطر، مقدار 1/0 میلیلیتر از هر رقت در پلیت استریل ریخته شد و برروی آن از محیط کشت آگار غذایی[5] ذوبشده ریخته شد (برای جلوگیری از رشد قارچها از سیکلوهگزامید استفاده شد). پلیتهای کشتشده در انکوباتور ۲۸ درجۀ سانتیگراد برای رشد میکروارگانیسمها قرار داده شدند. پس از رشد کلنیهای میکروبی، در پلیتی که دارای200-30 کلنی باکتریایی بود، شمارش انجام گرفت و تعداد کل میکروارگانیسمها باتوجهبه ضریب رقت محاسبه شد (11).
بررسی تأثیر تجزیهکنندگی جدایهها بر انواع هیدروکربنهای زنجیرهای و آروماتیک: به 100 میلیلیتر محیط کشت معدنی مایع، 5درصد ترکیبات نفتی (آنتراسن، فنانترن و نفتالین بهصورتِ جداگانه) و دو میلیلیتر سوسپانسیون میکروبی با کدورتی برابر با استاندارد نیم مکفارلند[6] از باکتریهای تجزیهکنندۀ جداشده در مرحلۀ پیش اضافه شد. این محیط کشت مایع بهمدتِ یک هفته در دمای ۲۸ درجۀ سانتیگراد در داخل انکوباتور شیکردار با سرعت 130 دور در دقیقه قرار گرفت و در ساعات مشخص، یک میلیلیتر از محلولْ نمونهبرداری شد و میزان جذب نوری آن با روش نفلومتری و کدورتسنجی در طول موج ۶۲۵ نانومتر برای مشخصشدن رشد میکروارگانیسمها اندازهگیری شد (12).
برای مقایسۀ میانگین نتایج بهدستآمده، از آزمون تحلیل واریانس استفاده شد. فاصلۀ اطمینان برای آنالیز واریانس، 95درصد در نظر گرفته شد. تمام اعداد P با 05/0 مقایسه شدند و نتایج کمتر از 05/0 عامل مؤثر بر افزایش زیستپالایی هیدروکربنهای نفتی در نظر گرفته شد.
.تیمار خاکهای آلوده به نفت با باکتریهای منتخب در شرایط آزمایشگاهی و محیطی: بهمنظورِ ارزیابی حذف آلودگی نفتی از خاک آلوده، باتوجهبه میزان قابلیت تجزیهکنندگی باکتریهای غربالشده، از سویههایی استفاده شد که در مقایسه با سایر جدایهها کارآمدتر بودند.
برای بررسی و مقایسۀ شرایط محیط آزمایشگاهی (استفاده از گرمخانۀ 28 درجۀ سانتیگراد) بر روند زیستپالایی، با استفاده از ظروف آزمایشگاهی حاوی یک کیلوگرم خاک آلوده از پالایشگاه نفت شهر تبریز، مقدار ۱۰۰ میلیلیتر سوسپانسیون نمکهای معدنی[7] حاوی 1×107 cfu/ml هریک از سویههای منتخب بهطورِ جداگانه اضافه شد. از دو گلدان حاویِ فقط خاک، بدون مکمل باکتریایی (با و بدون افزودن مواد معدنی تقویتکنندۀ رشد میکروارگانیسمهای موجود در خاک اولیه) بهعنوانِ کنترل و شاهد استفاده شد. شش گلدان مربوط به هریک از باکتریها در انکوباتور در دمای 28 درجۀ سانتیگراد بهمدتِ ۹۰ روز قرار گرفت. به فاصلۀ هر ۳۰ روز، ۱۰۰ میلیلیتر محلول گلوکز (1/0 گرم در لیتر) به آن اضافه شد. تمامی گلدانها هر یک هفته یک بار با آب شهری آبیاری شدند. برای بررسی و مقایسۀ شرایط محیط طبیعی (دمای محیط) بر روند زیستپالایی، تعداد چهار سبد پلاستیکی آماده شد و به هرکدام ۱۰ کیلوگرم خاک آلودۀ پالایشگاه نفت اضافه شد. یک لیتر محیط حاوی نمکهای معدنی و cfu/mL 107×1 از هریک از سویههای باکتریایی منتخب بهطورِ مجزا به ظروف آزمایش اضافه شد. در یک سبد دیگر۱۰ کیلوگرم خاک و یک لیتر محلول معدنی بدون باکتری برای تقویت رشد باکتریهای موجود در خاک اولیه و در سبد آخر فقط ۱۰ کیلوگرم خاک بدون باکتری و بدون محلول معدنی صرفاً بهعنوانِ شاهد آماده شد. تمامی نمونهها در شرایط محیطی و محوطۀ پالایشگاه نگهداری شدند. برای افزایش تکثیر و قدرت میکروارگانیسمها به فاصلۀ هر ۳۰ روز، یک لیتر از محلول گلوکز (1/0 گرم در لیتر) اضافه شد. در هردو حالت آزمایشگاهی و محیطی، میزان رطوبت با آبیاری منظم و هوادهی (با بههمزدن خاک هر ۱۵ روز یک بار) در محدودۀ بهینه (تقریباً 50درصد ) تنظیم شد (جدول 1) (13).
.تاثیر افزودن خاکاره در زیستپالایی خاک آلوده به ترکیبات هیدروکربن نفتی: برای بررسی اثر استفاده از خاکاره در سرعت و میزان زیستپالایی، مطابق روش ذکرشده در بالا، به همان تعداد گلدان و سبد برای شرایط آزمایشگاهی و محیطی محوطۀ پالایشگاه تهیه شد. در نمونۀ گلدانهای آزمایشگاهی، مقدار ۱۰۰ گرم و در سبدهای محیطی، مقدار یک کیلوگرم خاکاره اضافه شد و در شرایط مشابه در آزمایشگاه و محیط بیرون قرار داده شدند (جدول 1) (12).
جدول 1- تیمار خاک آلوده به نفت با استفاده از سویههای منتخب در شرایط آزمایشگاهی و محیطی
|
ردیف |
کد نمونه |
سویۀ باکتری آزمایششده |
شرایط تیمار |
مقدار خاک (kg) |
مواد معدنی (ml) |
خاک اره (g) |
|
1 |
A1 |
SB10 |
آزمایشگاهی |
1 |
100 |
------ |
|
2 |
A2 |
SB10 |
100 |
|||
|
3 |
B1 |
SB16 |
------ |
|||
|
4 |
B2 |
SB16 |
100 |
|||
|
5 |
C1 |
SB14 |
------ |
|||
|
6 |
C2 |
SB14 |
100 |
|||
|
7 |
D1 |
SB7 |
------ |
|||
|
8 |
D2 |
SB7 |
100 |
|||
|
9 |
E1 |
----- |
------ |
|||
|
10 |
E2 |
------ |
100 |
|||
|
11 |
E3 |
------ |
------ |
------ |
||
|
12 |
E4 |
------ |
------ |
100 |
||
|
13 |
a1 |
SB10 |
محیطی |
10 |
1000 |
------ |
|
14 |
a2 |
SB10 |
1000 |
|||
|
15 |
b1 |
SB16 |
------ |
|||
|
16 |
b2 |
SB16 |
1000 |
|||
|
17 |
c1 |
SB14 |
------ |
|||
|
18 |
c2 |
SB14 |
1000 |
|||
|
19 |
d1 |
SB7 |
------ |
|||
|
20 |
d2 |
SB7 |
1000 |
|||
|
21 |
e1 |
------ |
------ |
|||
|
22 |
e2 |
------ |
1000 |
|||
|
23 |
e3 |
------ |
------ |
------ |
||
|
24 |
e4 |
------ |
------ |
1000 |
.بررسی جمعیت باکتریایی، وضعیت شیمیایی و سمّیت خاکهای تیمارشده: بهمنظورِ بررسی جمعیت باکتریایی، وضعیت شیمیایی و سمّیت خاکهای تیمارشده، با نمونهبرداری در نخستین روز انجام آزمایش، پایان ماه اول، دوم و سوم پژوهش، شمارش جمعیت باکتریهای کل و باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتیْ میزان هیدروکربن کل باقیمانده و درصد جوانهزنی گیاه شاهی[8] در تمامی نمونهها اندازهگیری شد (12).
شناسایی فیلوژنیک جدایههای منتخب ازطریقِ تعیین توالی ژن 16S rRNA:پس از شناسایی مقدماتی جدایهها براساسِ ویژگیهای مورفولوژیک و بیوشیمیایی، شناسایی براساسِ تعیین توالی ژن 16S rRNAانجام گرفت. بدینمنظور، ژنوم جدایههای منتخب استخراج شد (کیت استخراج شرکت سینا کلون) و سپس ناحیۀ 16S rRNA ژنومی آنها با انجام واکنش PCR تکثیر شد. محصول واکنش تعیینِتوالیشده (شــرکت Bioneer) با اطلاعات موجود در بانک ژنومی باکتریها مقایسه شد و هویت باکتریها مشخص شد.
نتایج
جداسازی باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی: در این پژوهش، جداسازی باکتریهای تجزیهکنندۀ ترکیبات نفتی و قابلیت استفاده از آن در زیستپالایی خاکهای آلوده به ترکیبات نفتی در شرایط آزمایشگاهی و محیطی بررسی شده است. از خاک آلوده به ترکیبات نفتی، 19 سویۀ باکتریایی با قابلیت رشد برروی محیط کشت معدنی حاوی n-هگزان بهعنوان تنها منبع کربن و انرژی جداسازی شد. از میان این باکتریهای جداشده، چهار سویۀ باکتریایی SB10، SB7، SB14 و SB16 که توانایی بیشتری در تجزیۀ ترکیبات نفتی و رشد برروی برخی از ترکیبات شامل نفت خام، بنزین، کروسین، گازوئیل، مخلوط پارافینها، تولوئن و پاراگزیلول داشتند، برای بررسی قابلیت استفاده در زیستپالایی خاکهای آلوده به ترکیبات نفتی در شرایط آزمایشگاهی و محیطی استفاده شد (جدول 2).
با استفاده از روش مولکولی مبتنی بر توالی ژن16S rRNA سویههای منتخب با عنوان Stenotrophomonas maltophilia (SB10)، Bacillus subtilis subsp. spizizenii (SB7)، Streptomyces ambofaciens (SB14) و Cupriavidus respiraculi (SB16) شناسایی شدند.
جدول 2- میزان درصد تخریب هیدروکربنهای آنتراسن، فنانترن و نفتالین توسط جدایههای منتخب
|
ردیف |
سویههای منتخب |
درصد تخریب آنتراسن |
درصد تخریب فنانترن |
درصد تخریب نفتالین |
|
1 |
SB7 |
7/37 |
1/40 |
4/32 |
|
2 |
SB10 |
6/82 |
7/52 |
6/63 |
|
3 |
SB14 |
9/20 |
8/39 |
4/41 |
|
4 |
SB16 |
7/71 |
7/43 |
6/61 |
زیستپالایی خاک آلوده به هیدروکربنهای نفتی با تلقیح باکتریهای تجزیهکننده: بهمنظورِ بررسی پایش میکروبی خاکهای آلوده به مواد نفتی از چهار جدایۀ منتخب استفاده شد. در شکل 1 نتایج تیمار میکروبی پس از گذشت زمانهای یک، دو و سه ماه برحسبِ تغییرات جمعت کل باکتریها و باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی نشان داده شده است. شکل 2 میزان درصد تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای نفتی را برحسب گذشت زمان تیمار نشان میدهد. تأثیر کاهش هیدروکربنهای نفتی خاک بر کاهش سمّیت خاک و افزایش میزان قدرت جوانهزنی گیاه شاهی، در شکلهای 3 و 4 نشان داده شده است.
تیمار خاک آلودۀ نفتی پالایشگاه با استفاده از جدایۀ Stenotrophomonas maltophilia (SB10) با شرایط آزمایشگاهی، نشاندهندۀ افزایش شمار باکتریهای خاک از 105×1/3 در شروع آزمایش به 105×3/7 در پایان ماه سوم است. میزان جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی از 103×3/5 در شروع آزمایش به تعداد 104×4/1 در پایان ماه سوم، افزایش یافت. میزان تجزیۀ زیستی کل هیدروکربنهای خاک در پایان ماه سوم به میزان 56درصد رسید. با کاهشِ هیدروکربنهای خاک، قدرت جوانهزنی بذر گیاه شاهی بهدلیلِ کاهش اثر سمّی ترکیبات نفتی موجود در خاک، به 42 درصد افزایش یافت. در نمونۀ خاک تیمارشده با خاکاره و باکتری Stenotrophomonas maltophilia (SB10) میزان شمار باکتریهای خاک در شروع آزمایش از 105×8/3 به 105×6/9 در پایان ماه سوم رسید. در این مدت، باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربن نفتی از 103×1/6 به 104×7/1 افزایش یافتند. آنالیز هیدروکربنهای باقیمانده در پایان ماه سوم، نشاندهندۀ تجزیۀ زیستی آن به میزانِ 80درصد بود. نتایج آزمایشهای قدرت جوانهزنی گیاه شاهی، نشاندهندۀ بهبود نسبی کیفیت خاک تیمارشده و قابلیت جوانهزنی تا میزان 68 درصد بود.
تیمار خاک آلودۀ نفتی پالایشگاه با استفاده از جدایۀ Cupriavidus respiraculi (SB16) با شرایط آزمایشگاهی، موجب افزایش جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی در پایان ماه سوم شد. میزان تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای خاک در پایان ماه سوم به میزان 45 درصد رسید. با کاهش میزان هیدروکربنهای خاک، قدرت جوانهزنی گیاه شاهی به 37 درصد افزایش یافت. در نمونۀ خاک تیمارشده با خاکاره و باکتری Cupriavidus respiraculi (SB16) نیز جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربن نفتی در پایان ماه سوم افزایش یافت. آنالیز هیدروکربنهای باقیمانده در پایان ماه سوم، نشاندهندۀ تجزیۀ زیستی آن به میزانِ 83 درصد بود. نتایج آزمایشهای قدرت جوانهزنی گیاه شاهی، نشاندهندۀ بهبود نسبی کیفیت خاک تیمارشده و قابلیت جوانهزنی تا میزان 71 درصد بود.
تیمار خاک آلودۀ نفتی پالایشگاه با استفاده از جدایۀ Streptomyces ambofaciens (SB14) با شرایط آزمایشگاهی، نشاندهندۀ افزایش جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی در پایان ماه سوم بود. میزان تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای خاک در پایان ماه سوم به میزان 47درصد رسید. با کاهش میزان هیدروکربنهای خاک، قدرت جوانهزنی گیاه شاهی به 38درصد افزایش یافت. در نمونۀ خاک تیمارشده با خاکاره و باکتریStreptomyces ambofaciens (SB14) نیز تعداد باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربن نفتی افزایش یافت. آنالیز هیدروکربنهای باقیمانده در پایان ماه سوم، نشاندهندۀ تجزیۀ زیستی آن بهمیزانِ 66درصد بود. نتایج آزمایشهای قدرت جوانهزنی گیاه شاهی، نشاندهندۀ بهبود نسبی کیفیت خاک تیمارشده و قابلیت جوانهزنی تا میزان 46 درصد بود.
تیمار خاک آلودۀ نفتی پالایشگاه با استفاده از جدایۀ Bacillus subtilis subsp. spizizenii (SB7) با شرایط آزمایشگاهی، نشاندهندۀ افزایش جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای باقیمانده در پایان ماه سوم بود. میزان تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای خاک در پایان ماه سوم، به میزان 55درصد رسید. با کاهشِ میزان هیدروکربنهای خاک، قدرت جوانهزنی گیاه شاهی به 36درصد افزایش یافت. در نمونۀ خاک تیمارشده با خاکاره و باکتریBacillus subtilis susp. spizizenii (SB7) نیز میزان شمار باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربن نفتی خاک افزایش یافت. آنالیز هیدروکربنهای باقیمانده در پایان ماه سوم، نشاندهندۀ تجزیۀ زیستی آن به میزانِ 82درصد بود. نتایج آزمایشهای قدرت جوانهزنی گیاه شاهی، نشاندهندۀ بهبود نسبی کیفیت خاک تیمارشده و قابلیت جوانهزنی تا میزان 72 درصد بود.
در نمونۀ کنترل تیمار خاک آلودۀ نفتی پالایشگاه بدون استفاده از جدایه و تنها با استفاده از مکمل معدنی، با شرایط آزمایشگاهی تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای خاک در پایان ماه سوم 21درصد بود و قدرت جوانهزنی گیاه شاهی تنها 24درصد بود. در نمونۀ خاک تیمارشده با خاکاره نیز تجزیۀ زیستی به 29درصد رسید و قدرت جوانهزنی گیاه شاهی نشاندهندۀ کمی بهبود کیفیت خاک تیمارشده و قابلیت جوانهزنی تا میزان 37 درصد بود.
در نمونۀ کنترل تیمار خاک آلودۀ نفتی پالایشگاه بدون استفاده از جدایه و مکمل معدنی با شرایط آزمایشگاهی، میزان تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای خاک در پایان ماه سوم 5درصد بود و بهدلیلِ کمنشدنِ درخورِتوجه میزان هیدروکربنهای خاک، قدرت جوانهزنی گیاه شاهی تنها 14درصد افزایش داشت. در نمونۀ خاک تیمارشدۀ فوق با خاکاره افزایش کمی در شمار باکتریها وجود داشت و آنالیز هیدروکربنهای باقیمانده در پایان ماه سوم نیز نشاندهندۀ تجزیۀ زیستی آن به میزانِ 18درصد بود. نتایج آزمایشهای قدرت جوانهزنی گیاه شاهی، نشاندهندۀ بهبود کمتر کیفیت خاک تیمارشده و قابلیت جوانهزنی تا میزان 26درصد بود که نسبت به نمونههای مشابه با باکتری، کمتر است.
نتایج این پژوهش نشان میدهد تیمار، در شرایط محیطی نیز با افزودن سویههای باکتریایی منتخب همراه با مکملهای معدنی و خاکاره موجب افزایش بیشتر جمعیت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنها در نمونهها و افزایش میزان زیستپالایی خاک و درصد جوانهزنی میشود.
با افزودن محیط مواد معدنی حاوی سویههای میکروبی S. maltophilia (SB10)، B. subtilis subsp. spizizenii (SB7)، S. ambofaciens (SB14) و C. respiraculi (SB16) در اکوسیستم طبیعی، در مقایسه با نمونههای شاهد E (بدون سویۀ میکروبی اضافی) تعداد کل میکروارگانیسمها و میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ ترکیبات نفتی افزایش یافته و بهدنبالِ آن، در میزان تجزیۀ زیستی مواد نفتی و افزایش درصد جوانههای بذر شاهی، افزایشْ مشاهده شده است.
در نمونههای آزمایششده در محوطۀ پالایشگاه نیز با افزودن سویههای کارآمد، خاکاره و عناصر معدنی، میزان فعالیت خاک افزایش یافته و به افزایش سرعت تجزیۀ زیستی ترکیبات نفتی انجامیده؛ درنتیجه، شرایط خاک بهبود یافته و میزان درصد جوانهزنی گیاه شاهی با نسبتهای متفاوتی افزایش یافته است.
نتایج حاصل از تیمار در آزمایشگاه بهطورِ درخورِتوجه و وسیع، بهتر از نتایج تیمار در محیط طبیعی (محوطۀ پالایشگاه) است. علت این موضوع را میتوان ثابتبودن شرایط دمایی و رطوبت در آزمایشگاه و نوسان این فاکتورها در محیط طبیعی دانست. همچنین، در زمان استفاده از خاکاره بهعنوانِ تثبیتکنندۀ میکروبی و بهبود فرایند هوارسانی به میکروارگانیسمهای تجزیهکننده در خاک، نتایج زیستپالایی هیدروکربنهای نفتی و درصد جوانهزنی گیاهی بسیار بهتر از حالت استفادهنکردن از خاکاره بود.
در طول مدت تیمار نمونههای خاک در شرایط آزمایشگاه، با اضافهکردن مواد معدنی و سویههای میکروبی SB7، SB10، SB14 و SB16 در مقایسه با نمونههای شاهد E (بدون افزودن سویۀ باکتری) تعداد کل باکتریها و باکتریهای تجزیهکنندۀ ترکیبات نفتی از ابتدای آزمایش افزایش یافت و بهطورِ مرتب با نسبتهای متفاوتی در نمونههای خاک باتوجهبه سویۀ خاص اضافهشده، سیر صعودی داشت. همچنین در نمونههای دارای خاکاره، در مقایسه با نمونههای بدونِ آن، شمار جمعیت باکتریهای تجزیهکننده بیشتر بود.
افزایش تعداد کل باکتریها، بهخصوص باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی، باعث افزایش نسبت تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای کل نفتی و کاهش میزان ترکیبات نفتی در نمونههای خاک شد. درنتیجۀ کاهش مقدار ترکیبات نفتی در نمونههای خاک، خاصیت سمّی و گیاهسوزی خاک کاهش یافت و تعداد جوانههای بذر گیاه شاهی در نمونهها با درصدهای متفاوت افزایش پیدا کرد. باتوجهبه نتایج، مشخص شد در نمونههای حاوی خاکاره، جمعیت باکتریهای عمومی و تجزیهکننده در مقایسه با نمونههای بدون خاکاره، افزایش معناداری داشت و به دنبالِ آن، درصد تجزیۀ زیستی ترکیبات نفتی افزایش یافت و درصد جوانههای بذر شاهی نیز افزایش پیدا کرد.
باتوجهبه نتایج، دربارۀ نمونۀ تیمار E میتوان مشخص کرد اگر خاک پالایشگاه در حالت اولیۀ خود و بدون افزودن سویههای میکروبی تجزیهکننده تیمار شود، درکل قابلیت چندانی در تجزیۀ زیستی آلایندهها و زیستپالایی نخواهد داشت.
نمونۀ تیمار E1 که محتوی خاک پالایشگاه و محیط معدنی اضافهشده است، 24درصد جوانۀ بذر داشت. نمونۀ تیمار E2 که نمونۀ خاک پالایشگاه و محیط معدنی و خاکاره دارد، 37درصد جوانۀ بذر داشت. نمونۀ تیمار E3 که فقط حاوی نمونۀ خاک پالایشگاه است، فقط 14درصد جوانۀ بذر داشت و نمونۀ تیمار E4 که محتوی نمونۀ خاک پالایشگاه و خاکاره است و فقط با آب معمولی آبیاری شده است، 26درصد جوانۀ بذر شاهی داشت؛ بنابراین، مشخص شد که با افزودن مواد معدنی و خاکاره به نمونۀ خاک پالایشگاه با همان میکروارگانیسمهای موجود اولیه، میتوان تاحدودی روند زیستپالایی در خاک را افزایش داد.
شکل 1- مقایسۀ جمعیت میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی در نمونههای خاک پس از سه ماه، طی تجزیۀ زیستی در شرایط تیمار با S. maltophilia (SB10) (حروف A و a)، C. respiraculi (SB16) (حروف B و b)،S. ambofaciens (SB14) (حروف C و c)، B. subtilis subsp. spizizenii (SB7) (حروف D و d) و بدون سویۀ میکروبی (حروف E و e).
*- حروف بزرگْ تیمار در شرایط آزمایشگاه و حروف کوچک تیمار در شرایط محیط طبیعی است.
شکل 2- مقایسۀ میزان درصد تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای خاک، پس از سه ماه تیمار با S. maltophilia (SB10) (حروف A و a)،C. respiraculi (SB16) (حروف B و b)، S. ambofaciens (SB14) (حروف C و c)، B. subtilis subsp. spizizenii (SB7) (حروف D و d) و بدون سویۀ میکروبی (حروف E و e).
*- حروف بزرگْ تیمار در شرایط آزمایشگاه و حروف کوچک تیمار در شرایط محیط طبیعی است.
شکل 3- مقایسۀ میزان هیدروکربنهای باقیمانده پس از سه ماه تیمار با S. maltophilia (SB10) (حروف A و a)،C. respiraculi (SB16) (حروف B و b)، S. ambofaciens (SB14) (حروف C و c)، B. subtilis subsp. spizizenii (SB7) (حروف D و d) و بدون سویۀ میکروبی (حروف E و e).
*- حروف بزرگْ تیمار در شرایط آزمایشگاه و حروف کوچک تیمار در شرایط محیط طبیعی است.
شکل 4- مقایسۀ میزان درصد جوانهزنی برروی خاکهای تیمارشدۀ سهماهه با S. maltophilia (SB10) (حروف A و a)،C. respiraculi (SB16) (حروف B و b)، S. ambofaciens (SB14) (حروف C و c)، B. subtilis subsp. spizizenii (SB7) (حروف D و d) و بدون سویۀ میکروبی (حروف E و e).
*- حروف بزرگْ تیمار در شرایط آزمایشگاه و حروف کوچک تیمار در شرایط محیط طبیعی است.
بحث و نتیجهگیری
آلودهشدن خاک به مواد نفتی، موجب تحریک فعالیت گروهی از باکتریهای دارای ظرفیت تجزیهکنندگی میشود. نمونۀ خاک آلودۀ پالایشگاه حاوی مقادیری از ترکیبات نفتی است؛ ازاینرو، میزان کربن خاک در مقایسه با سایر عناصرْ بیشتر است. افزودن مواد معدنی موجب افزایش نسبت عناصر معدنی و ضروری مانند نیتروژن، فسفر و سایر مواد مغذی میشود و تناسب نسبی میان کربن و نیتروژن برقرار میکند که موجب افزایش ظرفیت تکثیر و فعالیت میکروارگانیسمهای تجزیهکننده در خاک میشود. ماهیت فناوری زیستپالایی استفاده از مواد زیستی و تودۀ زندۀ میکروارگانیسم به تجزیۀ هیدروکربنها میانجامد. هیدروکربنها منبع انرژی و غذایی برای برخی از میکروارگانیسمها هستند؛ بنابراین، با افزایش جمعیت آنها بهتدریج میزان هیدروکربنها کاهش مییابد. در دهۀ اخیر، با استفاده از زیستپالاییْ گامهای بزرگی برای حل و رفع مشکل آلودگی برداشته شده است. برای سرعتبخشیدن به این فرایند، استفاده از قابلیت بالقوۀ جمعیت میکروارگانیسمهای موجود در خاک مناطق آلوده اهمیت ویژهای پیدا کرده است.
در این پژوهش، 19 سویۀ باکتری تجزیهکنندۀ ترکیبات نفتی جداسازی شد. از میان این سویهها، چهار سویۀ باکتریایی SB10، SB7، SB14 و SB16 توانایی نسبی بیشتری در تجزیۀ زیستی داشتند.
سویۀ SB10 ازنظرِ توالی دارای میزان تشابه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA با ژن مشابه سویۀ Stenotrophomonas maltophilia MTCC 434T، 8/99درصد است. این جدایه توانست ترکیبات نفتی خاک پالایشگاه تبریز را به میزانِ 80 درصد در مدت 3 ماه تجزیۀ زیستی کند. این باکتری، باکتری گرممنفی هوازی غیرتخمیری است و در محیطهای آبی، خاک و گیاهان یافت میشود. از این سویه در برنامههای کاربردی زیستفناوری استفاده شده است؛ مثلاً سویۀ جداشده از خاک مناطق آلوده به ترکیبات نفتی، توانسته است مواد سمّی نفتی ازقبیلِ بنزوپیرن را تجزیۀ زیستی کند. گزارش شده سویهای دیگر جداده از نمونۀ خاکهای آلودۀ کارخانۀ استحصال نفت در کاستاریکا نیز توانسته است فلورن را تخریب زیستی کند. ابراهیمی و همکاران در سال 2012 در خاکهای آلوده به نفت استان بوشهر توانستند چندین سویۀ کارآمد از این باکتری را جدا کنند. این سویه توانِ تجزیۀ زیستی تولوئن و نفتالین در شرایط تیمار با درصدهای مختلف را داشت. باتوجهبه نتایج تجزیۀ زیستی ترکیبات پلیسیکلیکآروماتیک همانند تولوئن، نفتالین، فلورن و بنزوپیرن در پژوهشهای مطرحشده و باتوجهبه میزان زیستپالایی (80درصد) سویۀ جداشدۀ Stenotrophomonas maltophilia در این پژوهش که به تخریب زیستی ترکیبات سنگین با وزن مولکولی بالا انجامیده است، نتایج همخوانی دارد (14).
سویۀ SB16 ازنظرِ توالی دارای میزان تشابه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA با ژن مشابه سویۀ Cupriavidus respiraculi CCUG 46809T 38/99درصد است. این جدایه توانست ترکیبات نفتی خاک پالایشگاه تبریز را به میزانِ 83درصد در مدت 3 ماه تجزیۀ زیستی کند. این باکتری کوکوباسیل گرم منفی است که بهصورتِ تکی، دوتایی و یا زنجیرهای کوتاه دیده میشود و در محیطزیست، آب، خاک، گیاهان، میوهها و سبزیجات یافت میشود و میتواند در محیط مرطوب زندگی کند. گزارشهایی از جداسازی سویههای این باکتری از مناطق آلوده صورت گرفته است.
در مناطق شمال شرقی چین جداسازی Cupriavidus انجام شده است که توانایی تجزیۀ زیستی آلایندههای خاک با تثبیت نیتروژن در مدت هشت هفته را داشته است. توانایی این باکتری در تبدیل انواع مختلف ترکیبات سمّی مانند آلکیلفنلها و هیدروکربنهای آروماتیک منو و پلیسیکلیک به پلیهیدروکسیبوتیرات (PHB) گزارش شده است. این سویه سبب تجزیۀ زیستی نفتالین (100-94درصد)، فنل(96-89درصد) و کلروفنل (62-56درصد) در طی مدت 3 ماه میشود (16).
سویۀ SB14 ازنظرِ توالی دارای میزان تشابه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA با ژن مشابه سویۀ Streptomyces ambofaciens NBRC 12836T 72/99درصد است. این جدایه میتواند ترکیبات نفتی خاک پالایشگاه تبریز را به میزانِ 66درصد در مدت 3 ماه تجزیۀ زیستی کند.
جنس استرپتومایسسْ هوازی، گرم مثبت و باکتری رشتهای و دارای ژنوم GC با محتوای بالاست. عمدتاً در خاک و پوشش گیاهی پوسیده وجود دارد. بیشترِ استرپتومایسسها اسیدوفیل هستند، تولید هاگ میکنند و بوی مخصوص خاک از تولید یک متابولیت فرّار به نامِ ژئوسمین، حاصلِ آنهاست. سه جدایۀ استرپتومایسسAB1, AH4, AM2 را شناسایی کردند که این سویهها توانستند نفتالین 36/82، 23/85 و 03/81درصد را در طی 12 روز گرمخانهگذاری، تجزیۀ زیستی کنند. این سویهها با تولید بیوسورفکتانت، توانایی حذف نفت خام 1درصد ((v/v در محیط کشت معدنی را بهترتیب با 83/75، 71/78 و 66/86درصد در مدت 30 روز نشان دادهاند (17).
در بررسیهای صورتگرفته در خاک آلوده به نفت در هندوستان، سویه از Streptomyces شناسایی شده است که توانایی تجزیۀ 25/98درصد روغن دیزل، 14/99درصد نفتالین و 5/17درصد فنانترن در 7 روز در 30 درجۀ سانتیگراد (با غلظت 1/0درصد) را دارد. سویۀ QWE گزارششده از این باکتری، در دمای 35 درجۀ سانتیگراد و pH برابر با 7 میتواند از هیدروکربن نفتالین بهعنوان تنها منبع انرژی و کربن استفاده کند. این سویه باعث حذف این ترکیب با مقادیر 10، 20، 50، 80 و100 میلیگرم در یک لیتر در مدت 32، 56، 96، 120 و 144 ساعت شده است (1).
سویۀ SB7ازنظرِ توالی دارای میزان تشابه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA با ژن مشابه سویۀ Bacillus subtilis subsp. spizizenii NBRC 101239T 99 درصد است. با استفاده از این جدایه، تجزیۀ زیستی ترکیبات نفتی خاک پالایشگاه تبریز بهمیزانِ 82درصد در مدت 3 ماه مشاهده شد. نواگو[ix] و همکارنش از نمونۀ خاک آلوده به گازوئیل که مدت شش ماه در آزمایشگاه نگهداری شده بود، یک سویۀ B. subtilis جدا کردند. استفاده از این باکتری برای تجزیۀ خاک آلوده به گازوئیل (5درصد v/w) (نفت به خاک) نشان داده است بدون افزودن هیچ مکمل نیتروژن و فسفری، توانایی تجزیۀ نفت خام در مدت 1، 12 و 27 ساعت به میزانِ 4-10×8/5، 3-10×05/1 و 3-10×83/1 گرم در ساعت را دارد (18). در پژوهشی که بر تجزیۀ خاک آلوده به نفت در نیجریه صورت گرفته، مشاهده شده است سویۀ Bacillus sp. 28A توانایی حذف 4/50درصد وزن نفت خام را پس از 20 روز گرمخانهگذاری دارد. افزودن منابع ازت آلی نظیر اوره به محیط نمکهای معدنی حاوی نفت خام موجب افزایش تجزیۀ زیستی شده است. توانایی تجزیۀ زیستی ترکیبات نفتی در سایر گونههای باسیلوس نیز گزارش شده است. در باکتری Bacillus cereus BN66 توانایی همزمان تجزیۀ زیستی نفت خام و ساخت سورفاکتانت زیستی گزارش شده است. این سویه توانایی تجزیۀ 93درصد از بخش جزئی خطی نفت خام را طی 48 ساعت دارد (19).
باتوجهبه نتایج ارائهشده میتوان چنین جمعبندی کرد که افزودن سویههای باکتریایی Stenotrophomonas maltophilia (SB10)، Bacillus subtilis subsp. spizizenii (SB7)، Streptomyces ambofaciens (SB14) و Cupriavidus respiraculi (SB16) به خاک آلوده میتواند موجب افزایش جمعیت باکتریایی تجزیهکنندۀ مواد آلایندۀ نفتی شود؛ علاوهبر این، افزودن خاکاره به میزانِ 10درصد، بهدلیلِ افزایش قابلیت هوادهی خاک، موجب افزایش تجزیۀ زیستی ترکیبات نفتی میشود؛ ازاینرو، پیشنهاد میشود از باکتریهای با قدرت تجزیهکنندگی به همراهِ پسماندهای صنعتی و کشاورزی استفاده شود که روشی مناسب و اقتصادی برای پاکسازی خاکهای آلودۀ نفتی است.
)