تولید زیستی روغن تک‌یاخته توسط باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 با استفاده از منابع کربنی ارزان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران

2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران

10.22108/bjm.2020.121878.1281

چکیده

مقدمه: ریزموجوداتی که در شرایط کمبود مواد مغذی (به‌ویژه نیتروژن) و به‌علت توقف رشد، اقدام به ذخیره‌کردن چربی می‌کنند، روغن‌های میکروبی را تولید می‌کنند. باتوجه‌به ساختار اسید چرب، روغن‌های میکروبی کاربردهای صنعتی دارند. هدف اصلی پژوهش حاضر، ارزیابی تولید روغن تک‌یاخته از باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767با استفاده از منابع خام ارزان‌قیمت است که برای نخستین‌بار در ایران انجام می‌شود.
مواد و روش‏‏ها: در مطالعۀ حاضر از باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767، از آب پنیر، ساقۀ گندم، گلوگز و گلیسرول برای منابع کربنی و از عصارۀ مخمر برای منبع نیتروژنی استفادهو باکتری در محیط MSM کشت داده شد. تحلیل FTIR به‌منظور اثبات وجود گروه‌های کربنی، تحلیل GC برای شناسایی اسید چرب و رنگ‌آمیزی با سودان سیاه و عکس‌برداری با میکروسکوپ الکترونی عبوری برای مشاهدۀ گرانول چربی ذخیره‌شده در سلول انجام شد.
نتایج: بیشترین حجم تولید چربی در تمام منابع کربنی به آب پنیر با 22/23 درصد در زمان 96 ساعت مربوط بود و بیشترین حجم چربی با استفاده از منبع کربنی ساقۀ گندم برابر 20 درصد در زمان 72 ساعت تولید شد.
بحث و نتیجه‏گیری: نتایج پژوهش حاضر نشان دادند سویۀ رودوکوکوس توانایی تبدیل زیستی منابع کربنی ارزان‌قیمت ساقۀ گندم و آب پنیر به روغن میکروبی را دارد و این امر می‌تواند به‌شکل برنامه‌ای برای فرایندهای زیست‌فناورانۀ دوستدار محیط‌زیست به کار گرفته شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Bio-production of Single-cell Oil by Rhodococcus Erythropolis PTCC 1767 Bacterial using Low-cost Carbon Sources

نویسندگان [English]

  • Alireza Rasouli 1
  • Seyyed soheil Aghaei 2
  • Mohsen Zargar 2
1 MSc in Biotechnology, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Qom Branch, Qom, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Qom Branch, Qom, Iran
چکیده [English]

Introduction: Microorganisms that store lipids due to nutrient deficiencies (especially nitrogen) produce microbial oils following inhibition of growth. Based on the structure of fatty acids, microbial oils have industrial applications. The main purpose of this study, the first in Iran, was to evaluate the production of single-cell oil from Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 using low-cost materials.
Material and Methods: In the present study, Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 as bacterial strain, whey, wheat straw, glucose, and glycerol were used for carbon sources and yeast extract was used for the nitrogen source. The bacterial strain was cultured in the MSM medium. FTIR analysis was performed to confirm the presence of carbon groups, GC analysis for identifying fatty acids, and Sudan black staining and imaging with a Transmission Electron Microscope (TEM) for observing the lipid granules stored inside the cell.
Results: The highest lipid production in the presence of carbon sources was related to whey in 96 hours with 23.22% and the maximum lipid production was obtained using wheat straw in 72 hours with 20%.
Discussion and Conclusion: The results of the present study demonstrated that Rhodococcus strains have the ability of bioconversion of low-cost carbon sources wheat straw and the whey to microbial oils and this can serve as a platform for eco-friendly biotechnological processes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • bio-production
  • Single-cell Oil
  • Low-cost Carbon Sources
  • Rhodococcus erythropolis 1767 PTCC

مقدمه

روغن‌های میکروبی، روغن تک‌سلولی نامیده می‌شوند؛ زیرا ریزموجودات ذخیره‌کنندۀ روغن این چربی را تولید می‌کنند. در چند دهۀ گذشته، ریزموجودات یادشده ازنظر توانایی منحصر‌به‌فرد و ویژگی‌های خاص خود توانسته‌اند توجه بسیاری از پژوهشگران را به خود جلب کنند (1). تولید روغن میکروبی به زمین برای کشت یا منابع دیگری که برای تولید مواد غذایی استفاده می‌شوند، نیاز ندارد و تحت‌تأثیر تغییرات اقلیمی قرار نمی‌گیرد (2). ذخیرۀ چربی زمانی اتفاق می‌افتد که ریزموجودات در محیط دارای کربن اضافی کشت شوند و رشد آنها در اثر کاهش سایر مواد مغذی به‌ویژه نیتروژن محدود شود؛ بنابراین، نسبت کربن به نیتروژن (C/N) نقش مهمی در تحریک ذخیرۀ چربی دارد (3 و 4).

طی سال‌های گذشته، توجه پژوهشگران به استفاده از باکتری‌ها برای تولید چربی به‌منظور کاربردهای زیست‌فناوری و صنعتی معطوف شده است. چربی باکتری‌ها شامل تری‌آسیل‌گلیسرول[1] (TAG- اسید چرب بلندزنجیره) و واکس استرهای[2] (WE- اسید چرب بلندزنجیرۀ اولیه و الکل بلندزنجیرۀ اولیه) است که در تولید افزودنی‌های غذایی، محصولات آرایشی، روان‌کننده‌ها، روغن‌های شیمیایی، شمع‌ها و سوخت‌های زیستی کاربرد دارد (5 و 6). بیشتر گونه‌های باکتری توانایی تولید پلی‌هیدروکسی‌آلکانوات[3] (PHA) را به‌شکل ترکیبات ذخیره‌ای دارند (7 و 8)، اما توانایی ذخیرۀ تری‌آسیل‌گلیسرول و واکس استر تنها در چند جنس باکتری گزارش شده است (9). مقدار و ساختار چربی‌های باکتری‌ها به چندین عامل شامل نوع باکتری، ساختار منبع کربنی، زمان کشت و مقدار کربن و نیتروژن موجود در محیط‌کشت بستگی دارد (7 و 10-12).

مخمرها و قارچ‌های رشته‌ای، ریزموجودات ذخیره‌کنندۀ چربی شناخته و برای تولید سوخت‌های زیستی استفاده می‌شوند (13)؛ باوجوداین، رشد مخمرها و قارچ‌های رشته‌ای ذخیره‌کنندۀ روغن بسیار آهسته است و تعداد اندکی از اعضای آنها قابلیت ذخیرۀ چربی را دارند (14 و 15).

در باکتری‌ها، ذخیرۀ تری‌آسیل‌گلیسرول در اکتینومیست‌ها[4] شامل جنس‌های مایکوباکتریوم[5]، استرپتومیسس[6]، نوکاردیا[7] و رودوکوکوس[8] بررسی شده است (9). در میان جنس‌های باکتریایی ذخیره‌کنندۀ تری‌آسیل‌گلیسرول، جنس رودوکوکوکس یکی از امیدوار‌کننده‌ترین جنس‌هاست؛ زیرا برخی از گونه‌های آن بیش از 20 درصد وزن زیست‌تودۀ خود تری‌آسیل‌گلیسرول ذخیره می‌کنند و باکتری‌های ذخیره‌کنندۀ روغن در نظر گرفته می‌شوند (16-18). رودوکوکوسها تری‌آسیل‌گلیسرول را در حضور چندین نوع پیش‌ماده (سوبسترا) کربنی و در شرایط محدودیت نیتروژن تولید و ذخیره می‌کنند که این منابع کربنی شامل گلوکز، گلیسرول، اسیدهای آلی، هیدروکربن‌ها (7، 19 و 20) و منابع کربنی پیچیدۀ حاضر در پسماندهای صنعتی می‌شوند (21 و 22).

رودوکوکوسها، باکتری‌های هوازی و غیرمتحرکی هستند که به‌وفور در محیط طبیعی یافت می‌شوند. رودوکوکوسها از محیطهای مختلف مانند خاکهای گرمسیری و استوایی، بیابانها، دریا و رسوبات دریای عمیق گزارش شدهاند؛ احتمالاً فرایند متابولیکی عظیمی در این ریزموجودات از پراکندگی آنها در طبیعت و توانایی آنها برای انطباق با طیف وسیعی از شرایط محیطی پشتیبانی می‌کند. این موجودات می‌توانند مقادیر متنوعی از گلیکوژن، پلی‌هیدروکسی‌آلکونات، رنگدانه‌های کاروتنوئید و پلی‌فسفات‌ها را از منابع مختلف کربن تولید کنند؛ باوجوداین، تری‌آسیل‌گلیسرول ترکیب ذخیره‌ای اصلی رودوکوکوس‌هاست. به نظر می‌رسد این ریزموجودات توانایی تولید و تجمع تری‌آسیل‌گلیسرول را طی رشد در منابع مختلف کربن دارند. رودوکوکوس‌ها دارای توانایی صرفه‌جویی در انرژی متابولیکی مفید طی کاتابولیسم منابع کربن هستند؛ بنابراین، بخشی از انرژی حاصل برای رشد و تقسیم استفاده می‌شود و مازاد آن به مسیرهای ذخیره‌سازی انرژی مانند تولید تری‌آسیل‌گلیسرول هدایت می‌شود. انعطاف‌پذیری متابولیسم رودوکوکوسها و توانایی آنها برای تولید ترکیبات ذخیره‌ای متنوع، ویژگی‌هایی هستند که توانایی چنین ریزموجوداتی را که در محیط‌زیست باقی می‌مانند و بازسازی می‌شوند، افزایش می‌دهد. تجمع چربی‌ها سبب استقلال باکتری از محیط‌زیست می‌شود و به بقای سلول هنگام دسترسی‌نداشتن به منابع انرژی در خاک کمک می‌کند. بررسی روند تجمع تری‌آسیل‌گلیسرول در رودوکوکوسها نه‌تنها برای فهمیدن فیزیولوژی و زیست‌شناسی آنها اهمیت دارد، در کاربرد بالقوۀ این ریزموجودات طبیعی برای تولید محصولات زیست‌فناورانه نیز مهم است. چربی‌های باکتریایی برای تولید مواد افزودنی غذایی، آرایشی و بهداشتی، روان‌کننده‌ها، روغن شیمیایی و سوخت‌های زیستی استفاده می‌شوند. مطالعه روی توانایی رودوکوکوس‌ها در بیوسنتز و تجمع تری‌آسیل‌گلیسرول و جنبه‌های اساسی آن، زمینۀ تولید روغن‌های میکروبی را فراهم می‌کند (23).

بازیافت ضایعات به کاهش آثار محیطی منفی و کاهش هزینه‌های کلی مرتبط با مدیریت زباله کمک می‌کند؛ باوجوداین، بازیافت زباله روش کافی مدیریت زباله در نظر گرفته نمی‌شود و امروزه به‌علت فشارهای محیطی، اقتصادی و دولتی، بازیافت زباله باید با تولید محصول دارای ارزش افزوده ترکیب شود. در حال حاضر، بخش بزرگی از زباله‌های تجزیه‌پذیر به‌آسانی سوزانده می‌شود (24) یا به محصولات دارای ارزش افزودۀ نسبتاً کم مانند بیوگاز (25)، انرژی زیستی و سوخت‌های زیستی (26 و 27) تبدیل می‌شود؛ باوجوداین، برخی پیشرفت‌های فناوری سبب تولید محصولات دارای ارزش افزودۀ زیاد از این مواد شده است (28-31). مطالعه‌های گسترده‌ای با تمرکز بر جستجو و یافتن مواد خام ارزان‌قیمت مانند پسماند کشاورزی، جنگل‌داری و صنایع غذایی و جایگزینی آنها به‌شکل بستری برای تولید چربی میکروبی انجام شده است (22، 32 و 33).

آب پنیر جزو پسماند صنایع لبنیات است که در مقادیر عظیمی در سطح جهان تولید می‌شود (هر 1 کیلوگرم پنیر، 9 کیلوگرم آب پنیر تولید می‌کند). ترکیب اصلی آب پنیر عبارتست از: لاکتوز (5 تا 7 درصد) به همراه مقدار کمتری گلوکز، گالاکتوز و پروتئین (8/0 تا 2/1 درصد) و چربی (06/0 تا 3 درصد) (34). دفع نهایی آب پنیر، مشکل اصلی صنایع لبنی است؛ زیرا هنگام رهاسازی در محیط‌زیست، مقدار درخور توجهی آلودگی تولید می‌کند که هزینۀ بسیار زیادی برای پاک‌سازی آن نیاز است (35). تبدیل زیستی آب پنیر به روغن میکروبی باارزش، روش جذاب و کارآمدی است که آثار زیست‌محیطی ناشی از رهاسازی پسماند صنعتی در محیط‌زیست را تا حد زیادی کاهش می‌دهد. جلوگیری از آلودگی محیط‌زیست و تولید هم‌زمان و کم‌هزینۀ چربی پرکاربرد برای تولید بیودیزل، روان‌کننده‌های زیستی، روغن‌های شیمیایی، محصولات آرایشی و دیگر تولیدات زیستی ازجمله ویژگی‌های این روش است (36-38).

علاوه‌بر آب پنیر، ضایعات کشاورزی که جزو ترکیبات لیگنوسلولزی دسته‌بندی می‌شوند، منابع ارزان‌قیمتی هستند که برای تولید چربی میکروبی استفاده می‌شوند. ضایعات کشاورزی از سلولز، همی‌سلولز، لیگنین، پروتئین و خاکستر تشکیل شده‌اند. بسیاری از ضایعات کشاورزی از لیگنوسلولز تشکیل شده‌اند که پلیمر پیچیده‌ای از سلولز، همی‌سلولز و لیگنین است. درصد سلولز، همی‌سلولز، لیگنین و سایر ترکیبات در لیگنوسلولز به‌ترتیب در محدودۀ 35 تا 50 درصد، 20 تا 35 درصد، 15 تا 20 درصد و 15 تا 20 درصد است (39). تبدیل زیستی لیگنوسلولز به چربی باکتری شامل چند مرحله است: پیش‌تیمار زیست‌تودۀ لیگنوسلولز، هیدرولیز ساختار کربوهیدارت به قند استفاده‌شونده، تولید چربی میکروبی، جداسازی و خالص‌سازی محصول (40-42).

یکی از مهم‌ترین زباله‌های زراعی، ساقۀ ذرت است که اشاره به ساقه‌ها، برگ‌ها و کوب‌هایی دارد که پس‌از برداشت در مزرعه باقی می‌مانند. ساقۀ ذرت یکی از نخستین منابع زیست‌توده است که برای تولید اتانول سلولزی در ایالات متحده استفاده می‌شود. نتایج مطالعه‌های پیشین نشان داده‌اند با استفاده از پیش‌پردازش پساب ساقۀ ذرت حاوی لیگنین، رودوکوکوس‌ها می‌توانند لیپید تولید کنند (43).

هدف اصلی پژوهش حاضر، ارزیابی توان باکتری  1767[9]Rhodococcus erythropolis PTCC در تولید روغن میکروبی از منابع خام ارزان‌قیمت موجود در پسماندهای صنعتی و کشاورزی با قابلیت استفاده در مصارف صنعتی است که برای نخستین‌بار روی این جنس در ایران انجام می‌شود.

 

مواد و روش‌ها.

آماده‌سازی و کشت باکتری: در پژوهش حاضر، باکتری رودوکوکوس خریداری‌شده از بانک میکروبی سازمان ملی صنعتی ایران با نام علمی Rhodococcus erythropolis PTCC 1767استفاده شد. ساقۀ گندم (ترکیبات لیگنوسلولزی) از مزارع کشاورزی اطراف شهر قم و آب پنیر (پسماند صنعتی) از صنایع لبنی شهر قم تهیه شد.

به‌منظور بررسی تولید چربی در باکتری از محیط‌کشت [10]MSM حاوی گلوکز (40 گرم‌برلیتر)، 2SO4(NH4) (2 گرم‌برلیتر)، KH2PO4 (7 گرم‌برلیتر)، NaH2PO4 (2 گرم‌برلیتر)، MgSO4.7H2O (5/1 گرم‌برلیتر) و عصارۀ مخمر (1 گرم‌برلیتر) (MERCK، آلمان) استفاده شد (44 و 45).

بررسی اولیۀ تولید چربی: به‌منظور بررسی اولیۀ تولید چربی، باکتری در محیط جامد تریپتیک‌سوی‌آگار[11] و محیط جامد تریپتیک‌سوی‌آگار به همراه 3 درصد (وزن/وزن) گلیسرول (منبع کربن اضافی) کشت و به‌مدت 7 شبانه‌روز در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد؛ درنهایت، به‌منظور ارزیابی تولید چربی از رنگ‌آمیزی سودان سیاه استفاده شد (46). آزمون یادشده در سه تکرار انجام شد.

آماده‌سازی مایۀ تلقیح: میزان یک لوپ از کشت جامد سویۀ Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 در ارلن 250 میلی‌لیتری حاوی 100 میلی‌لیتر محیط مایع تریپتیک‌سوی‌آگار تلقیح و به‌مدت 24 ساعت درون شیکرانکوباتور با دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت 200 دوردردقیقه نگهداری شد؛ درنهایت، کدورت رشد (چگالی نوری[12]) آن در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد (47).

ارزیابی تولید چربی با استفاده از منابع کربنی مختلف

کشت با آب پنیر: به‌منظور پیش‌تیمار، ابتدا آب پنیر از کاغذ صافی واتمن عبور داده شد تا ذرات معلق حذف شوند و سپس اسیدیتۀ آن با سدیم‌گلوکونات به 5/7 که برای رشد باکتری رودوکوکوس مناسب است، افزایش یافت؛ سپس نمونه با اتوکلاو استریل و دوباره از کاغذ صافی عبور داده شد؛ درنهایت، چهار ارلن 100 میلی‌لیتری برداشته و مقدار 50 میلی‌لیتر آب پنیر به هرکدام افزوده و باکتری آماده، تلقیح شد. نمونه‌ها به‌مدت 24، 48، 72 و 96 ساعت در شیکرانکوباتور با سرعت 150 دوردردقیقه و دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند (47).

کشت با ترکیبات لیگنوسلولزی: به‌منظور پیش‌تیمار، ابتدا ساقۀ گندم در اندازۀ 5/0 تا 1 سانتی‌متر خُرد و سپس 200 گرم از آن به‌مدت 20 دقیقه در ارلن 1000 میلی‌لیتری جوشانده شد تا مراحل پیش‌تیمار کامل شوند. به‌منظور حذف ذرات معلق، نمونه از کاغذ صافی عبور داده شد و سپس با اتوکلاو استریل شد و برابر با محیط پایه (MSM) به چهار ارلن 100 میلی‌لیتری (هرکدام 50 میلی‌لیتر) افزوده و سپس باکتری آماده، تلقیح شد. نمونه‌ها به‌مدت 24، 48، 72 و 96 ساعت در شیکرانکوباتور با سرعت 150 دوردردقیقه و دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند (47).

کشت با منابع کربنی خالص: به‌منظور تولید چربی، محیط‌کشت پایه آماده و به‌جای گلوکز، از 3 درصد (وزن/وزن) گلیسرول برای منبع کربن استفاده شد. محیط حاصل به چهار ارلن 100 میلی‌لیتری (هرکدام 50 میلی‌لیتر) افزوده و سپس باکتری آماده، تلقیح شد. نمونه‌ها به‌مدت 24، 48، 72 و 96 ساعت در شیکرانکوباتور با سرعت 150 و دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد دوردردقیقه نگهداری شدند. آزمون‌های تولید چربی در سه تکرار انجام شدند (48).

محاسبه وزن خشک و درصد چربی باکتری: محاسبۀ وزن خشک با کمی اصلاحات نسبت به روش کار (زیر هود لامینار انجام و از دمای محیط برای خشک‌کردن نمونه‌ها استفاده شد) انجام شد. به‌منظور محاسبۀ وزن خشک، ابتدا 10 میلی‌لیتر از محیط‌کشت مایع با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد، سپس محلول رویی خارج و رسوب باقیمانده سه بار با آب مقطر شتسشو شد، محتوای آن به‌مدت 24 ساعت در شرایط یادشده قرار داده شد تا خشک شود و سپس وزن آن محاسبه شد (47).

به‌منظور به‌دست‌آوردن وزن چربی از روش استخراج استاندارد فلوچ (47) استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که 30 میلی‌لیتر از محیط برداشته و درون لولۀ فالکون ریخته و به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی حذف و حجم به‌دست‌آمده دو بار با آب مقطر شستشو شد. مقدار 100 تا 1000 میلی‌گرم به 75/3 میلی‌لیتر کلروفرم-متانول (1:2) اضافه و محلول 15 دقیقه در دمای اتاق ورتکس شد، دوباره مقدار 25/1 میلی‌لیتر کلروفرم افزوده و 1 دقیقه ورتکس انجام شد؛ علاوه‌بر‌این، 25/1 میلی‌لیتر NACL 1 مولار به محلول اضافه و دوباره 1 دقیقه ورتکس انجام شد؛ درنهایت، محلول 15 دقیقه با سرعت 3000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی در پلیت ریخته و 24 ساعت زیر هود لامینار قرار داده شد تا خشک شود (به‌جای حرارت‌دادن به‌منظور جلوگیری از تغییر ساختار اسید چرب) و پس‌از خشک‌شدن، وزن آن محاسبه شد (47).

تحلیل کمّی تولید چربی به روش طیف‌سنجی [13]FTIR: به‌منظور تأیید وجود چربی در نمونه‌ها از تحلیل FTIR (مدل TNSOR27، بروکر[14]، آلمان) طبق روش استاندارد و با محدودۀ طیف تجزیه‌و‌تحلیل دستگاه از 400 تا 4000 برسانتی‌متر (cm-1) استفاده شد (46). این آزمایش برای تمام منابع کربنی انجام شد.

تحلیل کیفی تولید چربی با [15]GC: ازآنجاکه تری‌آسیل‌گلیسرول 98 درصد مجموع چربی‌های جنس رودوکوکوس را تشکیل می‌دهد، تحلیل GC (مدل 7890B، اجیلنت[16]، آمریکا) برای شناسایی نوع اسیدهای چرب نمونۀ چربی تولید‌شده با منبع کربنی ساقۀ گندم استفاده شد. این آزمایش مطابق روش استاندارد و با استفاده از ستون مویرگی به ابعاد 30 در 53/0 در 1 میکرومتر با نام InnoWAX و شعلۀ آشکارساز یونیزاسیون انجام شد. حجم تزریق نمونه 5/0 میلی‌لیتر بود و از هیدروژن برای گاز حامل (13 میلی‌لیتر‌در‌دقیقه) استفاده شد. به‌منظور جداسازی کارآمد استرهای متیل[17] از برنامۀ زمانی و دمایی (ابتدا نمونه به‌مدت 5 دقیقه در دمای 90 درجۀ سانتی‌گراد در دستگاه قرار گرفت و سپس در هر دقیقه، دما 6 درجۀ سانتی‌گراد افزایش یافت و نمونه در دمای 220 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 10 دقیقه تحلیل شد) در دستگاه استفاده شد. تحلیل یادشده با پنج تکرار انجام و نتایج با نرم‌افزار دستگاه بررسی شدند (49).

مشاهدۀ گرانول چربی با تحلیل عکس میکروسکوپ الکترونی عبوری TEM[18]: باکتری ابتدا شسته و به بافر 1/0 مولار پتاسیم‌فسفات (اسیدیتۀ 5/7) منتقل و به‌مدت 24 ساعت با گلسیرآلدئید 3 درصد ثابت شد؛ سپس با محلول ساکارز 32/0 مولار در بافر فسفات و رزین با ویسکوزیتۀ کم ثابت شد (50). تصویربرداری با میکروسکوپ الکترونی عبوری (مدل EM900، زایس[19]، آلمان) در انستیتو پاستور ایران انجام شد.

تجزیه‌وتحلیلآماری: نتایج کمّی روش‌های تولید روغن تک‌یاخته با استفاده از تحلیل عاملی واریانس (ANOVA) و نرم‌افزار SPSS (نسخۀ 25) ارزیابی شدند و زمانی که P کمتر از 05/0 بود، نتایج معنادار در نظر گرفته شدند. 

نتایج

بررسی اولیۀ تولید چربی: پساز کشت باکتری در محیط تریپتیک‌سوی‌آگار و محیط تریپتیک‌سوی‌آگار با منبع کربن اضافی به‌مدت 7 روز، عملکرد باکتری با استفاده از رنگ سودان سیاه بررسی شد. نتایج بررسی، توانایی باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 در ذخیرۀ چربی را اثبات کردند (شکل 1).

 

 

شکل 1- توانایی سویۀ Rhodococcus erythropolis PTCC 1767در تولید چربی؛ A. کشت 7 روزۀ باکتری، B. کشت 7 روزۀ باکتری به همراه منبع کربن اضافی گلیسرول

.ارزیابی تولید چربی با استفاده از منابع کربنی مختلف: عملکرد باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 در چهار منبع کربنی مختلف نشان داد میانگین تولید چربی در منبع آب پنیر به‌طور معناداری (05/0>P) بیشتر از دیگر منابع کربنی است. میانگین تولید زیست‌تودۀ سلولی در تمام بازه‌های زمانی کشت به‌طور معناداری (05/0>P) روی منبع گلیسرول بیشتر بود (جدول 1).

مقایسۀ تولید چربی در منابع کربنی مختلف: مقایسۀ میانگین درصد چربی تولید‌شده در باکتری نشان داد تولید در آب پنیر بیشتر از سایر منابع کربنی است (شکل 2).

 

 

جدول 1- مقدار عملکرد باکتری در منابع کربنی مختلف بر اساس میلی‌گرم‌برمیلی‌لیتر

96 ساعت

72 ساعت

48 ساعت

24 ساعت

Rhodococcus erythropolis PTCC 1767

ردیف

عملکرد بر حسب میلی‌گرم‌بر‌میلی‌لیتر

پیش‌ماده

1/21

4/20

8/19

9/15

وزن خشک باکتری

آب پنیر

1

9/4

7/4

9/3

4/3

میزان چربی

22/23

03/23

69/19

38/21

درصد چربی

18

14

12

10

وزن خشک باکتری

ساقۀ گندم

2

1/3

8/2

1/2

1/1

میزان چربی

22/17

20

5/17

11

درصد چربی

33

29

22

18

وزن خشک باکتری

گلوکز

3

3/6

2/5

1/4

2/3

میزان چربی

09/19

93/17

63/18

77/17

درصد چربی

36

31

24

19

وزن خشک باکتری

گلیسرول

4

7/6

3/5

3/4

4/3

میزان چربی

61/18

09/17

91/17

89/17

درصد چربی


 

شکل 2- نمودار مقایسۀ درصد چربی در منابع کربنی مختلف

 

تحلیل کمّی تولید چربی به روش طیف‌سنجی: تحلیل FTIR برای اثبات تولید چربی در نمونه‌ها استفاده و تمام نمونه‌های تحلیل‌شده نشان‌دهندۀ وجود گروه‌های کربنی و عاملی (چربی) بودند که وجود زنجیره‌های کربنی الیفاتیک (چربی) در نمونه‌ها را اثبات می‌کند. در تمام نتایج، پیوند کربن و هیدروژن مشاهده شد که پیش‌ساز ساختار چربی اولیه است و گروه متیل دیده شد که گروه عاملی آب‌گریز است و از یک مولکول متان (CH4) با حذف یک هیدروژن به دست می‌آید. گروه کربونیل، الکان‌ها، الکیل‌ها و گلیسرول از دیگر گروه‌های لیپیدی موجود در نمونه‌ها بودند که وجود آنها نشان‌دهندۀ اسید چرب غیراشباع در نمونه‌هاست و وجود تری‌آسیل‌گلیسرول در ترکیب حاصل از تحلیل چربی را اثبات می‌کند. تفسیر نتایج در جدول 2 و نتایج تحلیل در شکل 3 برای هر منبع کربنی مشخص شده است.

جدول 2- تفسیر نتایج تحلیل FTIR با منابع کربنی مختلف

گروه عاملی

طول موج (برسانتی‌متر)

منبع کربنی

ردیف

= C – H  stretch

3381.67

آب پنیر

1

-CH3

2931.27 -  2899.46

2

Carbonyl groups

1694.84

3

CH2 binding

1422.24

4

C – O – C  stretching in esters

1261.22

5

= C – H  stretch

3550. 31 - 3477.99  -3414.35 - 3235.97

ساقۀ گندم

6

Carbonyl groups

1637. 27 - 1617.98

7

CH2 binding

1402

8

C – O – C  stretching in esters

1077. 05

9

= C – H  stretch

3546.45 - 3415.31

گلوکز

10

-CH3 ( Methyl groups)

2919.7-  2848.35

11

Carbonyl groups

1723.09-  1636.3-  1614.13

12

CH2 binding

1447.31-  1374.03

13

C – O – C  stretching in esters

1667.76

14

= C – H  stretch

3433.64

گلیسرول

15

-CH3 ( Methyl groups)

2925.48 , 2843.52

16

Carbonyl groups

1717.3 , 1631.48 , 1631.48

17

CH2 binding

1406.82

18

C – O – C  stretching in esters

1226.5 , 1046.09

19

 

شکل 3- تصویر تحلیل FTIR برای باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 در منابع کربنی مختلف؛ A. منبع آب پنیر، B. منبع ساقۀ گندم، C. منبع گلوکز، D. منبع گلیسرول

 


تحلیل GC: به‌منظور شناسایی نوع اسید چرب، آزمایش GC روی نمونۀ چربی به‌دست‌آمده از کشت باکتری در منبع کربنی ساقۀ گندم انجام شد. نتایج تحلیل GC بر اساس درصد کربن موجود در نمونه (جدول 3) نشان دادند اسید چرب در ترکیب چربی به‌دست‌آمده از کشت باکتری در ترکیبات لیگنوسلولزی وجود دارد که توانایی باکتری در تبدیل ترکیبات لیگنوسلولزی به چربی طی زمان کاهش درخور توجه نیتروژن را اثبات می‌کند. ساختار کربن 14 و 15 هیدروکسی‌پنتادسیل‌گلیسرول و ساختار کربن 16 تا 19 دی‌هیدورکسیل‌گلیسرول و ساختار کربن20 تا 21 ارکیول است.

تحلیل عکس الکترونی عبوری: به‌منظور مشاهدۀ گرانول‌های ذخیره‌ای چربی از میکروسکوپ الکترونی عبوری استفاده شد (شکل 4). در شکل 4، گرانول‌های ذخیره‌ای چربی‌های تولیدشده به رنگ روشن مشاهده می‌شوند.

 

 

جدول 3- ترکیب اسید چرب تولیدشده طی کشت روی ترکیبات لیگنوسلولزی

نام سویه

مقدار کل اسید چرب

درصد نسبی اسید چرب (وزن/وزن)

C14

C15

C16

C17

C18

C19

C20

C21

Rhodococcus erythropolis PTCC 1767

22/17 درصد

3.13

1.16

5.86

13.44

6.89

7.94

23.8

37.71

 

شکل 4- عکس الکترونی از باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767که روی محیط جامد تریپتیک‌سوی‌آگار به همراه گلیسرول (منبع کربنی اضافی) کشت شده است. گرانول‌های چربی به رنگ روشن در تصاویر مشاهده می‌شوند و پیکان‌های رنگی، گرانول‌های ذخیره‌ای چربی را مشخص می‌کنند. A. تصویر با بزرگ‌نمایی 2 میکرومتر، B. تصویر با بزرگ‌نمایی 400 نانومتر

 


بحث و نتیجه‌گیری

هدف پژوهش حاضر، بررسی توان باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767در تولید روغن تک‌یاخته از منابع کربنی ارزان‌قیمت بود که باتوجه‌به تولید چربی از پسماندها محقق شد. نتایج مطالعۀ حاضر نشان دادند این سویه توانایی تولید روغن تک‌یاخته از محیط‌کشت حاوی منابع کربنی خالص گلوکز و گلیسرول و همچنین محیط‌کشت حاوی منابع کربنی پسماندها شامل آب پنیر و ساقۀ گندم را با کاهش سطح نیتروژن محیط دارد و میزان تولید چربی در منبع آب پنیر بیشتر از تمام منابع کربنی استفاده‌شده است. به‌منظور بررسی کمّی تولید روغن تک‌یاخته از تحلیل FTIR استفاده شد و نتایج تمام نمونه‌ها اثبات‌کنندۀ وجود گروه‌های کربنی و عاملی بودند که به معنای تولید و ذخیرۀ چربی است؛ همچنین به‌منظور شناسایی ترکیب چربی از تحلیل GC استفاده شد که تشکیل تری‌آسیل‌گلیسرول در نمونۀ آزمایش‌شده را اثبات کرد. به‌منظور مشاهدۀ گرانول‌های ذخیره‌ای از عکس‌برداری الکترونی عبوری استفاده شد و گرانول‌های ذخیره‌ای در تصاویر مشاهده شدند. منابع کربنی مهم‌ترین عامل برای تعیین نوع اسید چربی است که سویه‌ها تولید می‌کنند و تفاوت اسید چرب تولیدشده در نمونه‌ها طی تحلیل FTIR، باتوجه‌به تشکیل گروه‌های مختلف کربنی مشاهده می‌شود؛ همچنین سازگاری باکتری با محیط زندگی اولیه و تنوع ژنتیکی و نوع کربن مصرفی در تنوع اسیدهای چرب تأثیر می‌گذارد.

در مطالعه‌ای که آنا ریتو کاسترو[xx] و همکاران در سال 2016 به‌منظور بررسی تولید روغن میکروبی انجام دادند، دو سویۀ متفاوت باکتری رودوکوکوس اوپاکوس[xxi]روی سه منبع کربنی گلوکز، استات و هگزادکان و عصارۀ مخمر و پپتون به‌طور مشترک (منبع نیتروژن) کشت شدند و هر دو سویه توانستند بیشترین میزان چربی را طی 72 ساعت ذخیره کنند. در مطالعۀ یادشده، کاسترو برای بررسی کمّی تولید چربی از روش TLC[xxii] استفاده کرد و نتایج، وجود چربی در نمونه‌ها را نشان دادند؛ همچنین به‌منظور بررسی کیفی چربی از تحلیل GC استفاده کرد که تولید تری‌آسیل‌گلیسرول در سویه‌های آزمایش‌شده را نشان داد که ساختار اسید چرب تقریباً مشابه به هم داشتند (51). همسوبودن نتایج مطالعۀ کاسترو و یافته‌های مطالعۀ حاضر در تولید گروه‌های کربنی و اسید چرب، توانایی باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767در ذخیره و تولید تری‌آسیل‌گلیسرول با استفاده از منابع کربنی خالص و پسماندی را اثبات کرد.

در مطالعه‌ای که مارسیا و الوارز[xxiii] در سال 2016 به‌منظور بررسی تولید زیست‌توده و روغن میکروبی انجام دادند، 5 سویۀ باکتری رودوکوکوس روی آب پنیر کشت شدند و نتایج نشان دادند باکتری رودوکوکوس اوپاکوس بیش از 45 درصد چربی تولید می‌کند و سایر باکتری‌ها ازجمله یک سویۀ رودوکوکوس اریتروپولیس کمتر از 5 درصد چربی تولید می‌کنند (49). نتایج مطالعۀ مارسیا و الوارز ناتوانی همۀ باکتری‌های رودوکوکوس در استفاده از آب پنیر برای تولید چربی را نشان دادند؛ اما در مطالعۀ حاضر، باکتری Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 توانست بیشترین میزان چربی را روی بستر آب پنیر تولید کند که نشان‌دهندۀ توانایی سازگاری باکتری استفاده‌شده در پژوهش حاضر برای تولید چربی از آب پنیر است.

در مطالعه‌ای که هررو[xxiv] و همکاران در سال 2018 با استفاده از چندین سویۀ رودوکوکوس روی ضایعات لیگنوسلولزی گیاه زیتون انجام دادند، توانستند چربی را با درصدهای مختلف تولید کنند که نشان‌دهندۀ توانایی باکتری‌های یادشده در استفاده و تبدیل این نوع از منابع کربنی به چربی است؛ بررسی ترکیب چربی تولید‌شده نشان‌دهندۀ تشکیل تری‌آسیل‌گلیسرول در نمونه‌ها بود (52). باتوجه‌به ساختار نزدیک به هم زیست‌تودۀ لیگنوسلولزی منابع گیاهی که شامل سلولز، لیگنین و همی‌سلولز است و بسته به شرایط رشد و نوع گیاه درصدهای متفاوتی دارد، مقایسۀ مطالعۀ حاضر و بررسی انجام‌شده روی ضایعات گیاه زیتون نشان‌دهندۀ توانایی آنزیمی باکتری هر دو پژوهش در استفاده از ترکیبات لیگنوسلولزی برای تولید چربی است.

چربی‌های میکروبی کاربردهای بسیار زیادی ازجمله استفاده به‌شکل بیودیزل دارند که منبع دوستدار محیط‌زیستی جایگزین برای منابع هیدروکربنی آلی است؛ همچنین چربی‌های میکروبی توانایی استفاده به‌شکل مکمل‌های غذایی باتوجه‌به نوع اسید چرب تولید‌شده در آنها و استفاده به‌شکل روغن‌های شیمیایی در صنایع دارویی و آرایشی را دارند. چربی تولید‌شده در پژوهش حاضر باتوجه‌به نوع اسید چرب تولیدی، توانایی استفاده در کارهای صنعتی و به‌طور ویژه، استفاده به‌شکل بیودیزل را دارد.

نتایج مطالعۀ حاضر که برای نخستین‌بار در ایران روی این سویه انجام شد، اثبات کردند Rhodococcus erythropolis PTCC 1767 توانایی استفاده از منابع کربنی خالص و تبدیل زیستی پسماند صنعتی و کشاورزی (‌مادۀ خام ارزان‌قیمت) به چربی را دارد. نتایج پژوهش حاضر سبب افزایش دانش نظری در زمینۀ این باکتری و تولید روغن میکروبی خواهند شد.

 

سپاسگزاری

نویسندگان از کارمندان آزمایشگاه دانشگاه آزاد، واحد قم و همچنین از دکتر علی جوادی، مسئول آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد قم، برای آماده‌کردن وسایل لازم در پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌کنند؛ همچنین از استاد زند منفرد، مسئول آزمایشگاه شیمی دانشگاه آزاد قم، و خانم مهیار زینی‌وند، دانشجوی دکترای میکروبیولوژی دانشگاه آزاد قم، برای همکاری در تفسیر نتایج تحلیل‌های GC و FTIR قدردانی می‌شود. پژوهش حاضر هیچ‌گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرده است.

(1) Ratledge C. Microorganisms for lipids. Acta Biotechnologica 1991; 11(5): 429-438.
(2) Koutinas AA., Chatzifragkou A., Kopsahelis N., Papanikolaou S., Kookos IK. Design and techno-economic evaluation of microbial oil production as a renewable resource for biodiesel and oleochemical production. Fuel 2014; 116: 566-577.
(3) Beopoulos A., Nicaud J-M., Gaillardin C. An overview of lipid metabolism in yeasts and its impact on biotechnological processes. Applied Microbiology and Biotechnology 2011; 90(4): 1193-1206.
(4) Papanikolaou S., Aggelis G. Lipids of oleaginous yeasts. Part II: Technology and potential applications. European Journal of Lipid Science and Technology 2011; 113(8): 1052-1073.
(5) Röttig A., Wenning L., Bröker D., Steinbüchel A. Fatty acid alkyl esters: Perspectives for production of alternative biofuels. Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 85(6): 1713-1733.
(6) Holder JW., Ulrich JC., DeBono AC., Godfrey PA., Desjardins CA., Zucker J., et al. Comparative and functional genomics of Rhodococcus opacus PD630 for biofuels development. PLOS Genetics 2011; 7(9): 1-18.
(7) Alvarez HM., Kalscheuer R., Steinbüchel A. Accumulation of storage lipids in species of Rhodococcus and Nocardia and effect of inhibitors and polyethylene glycol. Lipid/Fett 1997; 99(7): 239-246.
(8) Steinbüchel A., Hein S. Biochemical and molecular basis of microbial synthesis of polyhydroxyalkanoates in microorganisms. Biopolyesters: Springer; 2001: 81-123.
(9) Alvarez H., Steinbüchel A. Triacylglycerols in prokaryotic microorganisms. Applied Microbiology andBiotechnology 2002; 60(4): 367-376.
 
(10)            Wältermann M., Hinz A., Robenek H., Troyer D., Reichelt R., Malkus U., et al. Mechanism of lipid‐body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up. Molecular Microbiology 2005; 55(3): 750-763.
(11)            Alvarez H., Pucci O., Steinbüchel A. Lipid storage compounds in marine bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 1997; 47(2): 132-139.
(12)            Packter NM., Olukoshi ER. Ultrastructural studies of neutral lipid localisation in Streptomyces. Archives of Microbiology 1995; 164(6): 420-427.
(13)            Ryu B-G., Kim J., Kim K., Choi Y-E., Han J-I., Yang J-W. High-cell-density cultivation of oleaginous yeast Cryptococcus curvatus for biodiesel production using organic waste from the brewery industry. Bioresource Technology 2013; 135: 357-364.
(14)            Ageitos JM., Vallejo JA., Veiga-Crespo P., Villa TG. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology 2011; 90(4): 1219-1227.
(15)            Feofilova E., Sergeeva I., Ivashechkin A. Biodiesel-fuel: Content, production, producers, contemporary biotechnology (review). Prikladnaia Biokhimiia I Mikrobiologiia 2010; 46(4): 405-415.
(16)            Heald SC., Brandão PF., Hardicre R., Bull AT. Physiology, biochemistry and taxonomy of deep-sea nitrile metabolising Rhodococcus strains. Antonie van Leeuwenhoek. 2001; 80(2): 169-183.
(17)            Luz A., Pellizari V., Whyte L., Greer C. A survey of indigenous microbial hydrocarbon degradation genes in soils from Antarctica and Brazil. Canadian Journal of Microbiology 2004; 50(5): 323-333.
(18)            Peng F., Wang Y., Sun F., Liu Z., Lai Q., Shao Z. A novel lipopeptide produced by a Pacific Ocean deep‐sea bacterium, Rhodococcus sp. TW53. Journal of Applied Microbiology 2008; 105(3): 698-705.
(19)            Alvarez HM., Mayer F., Fabritius D., Steinbüchel A. Formation of intracytoplasmic lipid inclusions by Rhodococcus opacus strain PD630. Archives of Microbiology 1996; 165(6): 377-386.
(20)            Alvarez H., Kalscheuer R., Steinbüchel A. Accumulation and mobilization of storage lipids by Rhodococcus opacus PD630 and Rhodococcus ruber NCIMB 40126. Applied Microbiology and Biotechnology 2000; 54(2): 218-223.
(21)            Voss I., Steinbüchel A. High cell density cultivation of Rhodococcus opacus for lipid production at a pilot-plant scale. Applied Microbiology and Biotechnology 2001; 55(5): 547-555.
(22)            Gouda MK., Omar SH., Aouad LM. Single cell oil production by Gordonia sp. DG using agro-industrial wastes. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2008; 24(9): 1703.
(23)            Alvarez HM., Silva RA., Herrero M., Hernández MA., Villalba MS. Metabolism of triacylglycerols in Rhodococcus species: Insights from physiology and molecular genetics. Journal of Molecular Biochemistry 2013; 2(1): 69-78.
(24)            Johnson DT., Taconi KA. The glycerin glut: Options for the value‐added conversion of crude glycerol resulting from biodiesel production. Environmental Progress 2007; 26(4): 338-348.
(25)            Kost C., Mayer JN., Thomsen J., Hartmann N., Senkpiel C., Philipps SP., et al. Levelized Cost of Electricity: PV and CPV in comparison to other technologies. Fraunhofer Institute for Solar Energy Systems 2013; 1-5.
(26)            Browne J., Nizami A-S., Thamsiriroj T., Murphy JD. Assessing the cost of biofuel production with increasing penetration of the transport fuel market: A case study of gaseous biomethane in Ireland. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2011; 15(9): 4537-4547.
(27)            Lipinsky E. Chemicals from biomass: Petrochemical substitution options. Science 1981; 212(4502): 1465-1471.
(28)            El-Bakry M., Abraham J., Cerda A., Barrena R., Ponsá S., Gea T., et al. From wastes to high value added products: novel aspects of SSF in the production of enzymes. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 2015; 45(18): 1999-2042.
(29)            Finco AMdO., Mamani LDG., Carvalho JCd., de Melo Pereira GV., Thomaz-Soccol V., Soccol CR. Technological trends and market perspectives for production of microbial oils rich in omega-3. Critical Reviews in Biotechnology 2017; 37(5): 656-671.
(30)            FitzPatrick M., Champagne P., Cunningham MF., Whitney RA. A biorefinery processing perspective: Treatment of lignocellulosic materials for the production of value-added products. Bioresource Technology 2010; 101(23): 8915-8922.
(31)             Werpy T., Petersen G. Top value added chemicals from biomass: Volume I--results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas. National Renewable Energy Laborator; 2004: 1-17.
(32)            Papanikolaou S., Chevalot I., Komaitis M., Marc I., Aggelis G. Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batch cultures. Applied Microbiology and Biotechnology 2002; 58(3): 308-312.
(33)            Cheirsilp B., Louhasakul Y. Industrial wastes as a promising renewable source for production of microbial lipid and direct transesterification of the lipid into biodiesel. Bioresource Technology 2013; 142: 329-337.
(34)            Christensen AD., Kádár Z., Oleskowicz-Popiel P., Thomsen MH. Production of bioethanol from organic whey using Kluyveromyces marxianus. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2011; 38(2): 283-289.
(35)            Ghaly A., Rushton D., Mahmoud N. Potential air and groundwater pollution from continuous high land application of cheese whey. American Journal of Applied Sciences 2007; 4(9): 619-627.
(36)            Castanha RF., Morais LASd., Mariano AP., Monteiro RTR. Comparison of two lipid extraction methods produced by yeast in cheese whey. Brazilian Archives of Biology and Technology. 2013; 56(4): 629-636.
(37)            Moon NJ., Hammond E., Glatz BA. Conversion of cheese whey and whey permeate to oil and single-cell protein. Journal of Dairy Science. 1978; 61(11): 1537-1547.
(38)            Ykema A., Verbree EC., Kater MM., Smit H. Optimization of lipid production in the oleaginous yeastApiotrichum curvatum in wheypermeate. Applied Microbiology and Biotechnology. 1988; 29(2-3): 211-218.
(39)            Mood SH., Golfeshan AH., Tabatabaei M., Jouzani GS., Najafi GH., Gholami M., et al. Lignocellulosic biomass to bioethanol, a comprehensive review with a focus on pretreatment. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2013; 27: 77-93.
(40)            Taherzadeh MJ., Karimi K. Acid-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review. BioResources 2007; 2(3): 472-499.
(41)            Taherzadeh MJ., Karimi K. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: A review. BioResources 2007; 2(4): 707-738.
(42)            Banerjee G., Car S., Scott-Craig JS., Hodge DB., Walton JD. Alkaline peroxide pretreatment of corn stover: Effects of biomass, peroxide, and enzyme loading and composition on yields of glucose and xylose. Biotechnology for Biofuels 2011; 4(1): 16.
(43)            Le RK., Wells Jr T., Das P., Meng X., Stoklosa RJ., Bhalla A., et al. Conversion of corn stover alkaline pre-treatment waste streams into biodiesel via Rhodococci. RSC Advances 2017; 7(7): 4108-15.
(44)            Pan L-X., Yang D-F., Shao L., Li W., Chen G-G., Liang Z-Q. Isolation of the oleaginous yeasts from the soil and studies of their lipid-producing capacities. Food Technology and Biotechnology. 2009; 47(2): 215-220.
(45)            Kraisintu P., Yongmanitchai W., Limtong S. Selection and optimization for lipid production of a newly isolated oleaginous yeast, Rhodosporidium toruloides DMKU3-TK16. Kasetsart Journal (Natural Science). 2010; 44(1): 436-445.
(46)            Enshaeieh M., Abdoli A., Nahvi I., Madani M. Selection and optimization of single cell oil production from Rodotorula 110 using environmental waste as substrate. Journal of Cell and Molecular Research 2013; 4(2): 68-75.
(47)            Sriwongchai S., Pokethitiyook P., Pugkaew W., Kruatrachue M., Lee H. Optimization of lipid production in the oleaginous bacterium Rhodococcus erythropolis growing on glycerol as the sole carbon source. African Journal of Biotechnology 2012; 11(79): 14440-14447.
(48)            Herrero OM., Moncalián G., Alvarez HM. Physiological and genetic differences amongst Rhodococcus species for using glycerol as a source for growth and triacylglycerol production. Microbiology 2016; 162(2): 384-397.
(49)            Herrero OM., Alvarez HM. Whey as a renewable source for lipid production by Rhodococcus strains: physiology and genomics of lactose and galactose utilization. European Journal of Lipid Science and Technology 2016; 118(2): 262-272.
(50)            Spurr AR. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Journal of Ultrastructure Research 1969; 26(1-2): 31-43.
(51)            Castro AR., Rocha I., Alves MM., Pereira MA. Rhodococcus opacus B4: A promising bacterium for production of biofuels and biobased chemicals. Amb Express 2016; 6(1): 35.
(52)            Herrero OM., Villalba MS., Lanfranconi MP., Alvarez HM. Rhodococcus bacteria as a promising source of oils from olive mill wastes. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2018; 34(8): 114.