بررسی توکسین‌زایی قارچ‌های جدا شده از خوراک دام و طیورشهرستان خرم‎آباد

مقدمه

آلودگی مواد غذایی به قارچ‌ها خسارت‌های عمدۀ تولیدات غذایی را در پی دارد که با‌توجه‌به شیوۀ تهیه و نگهداری مواد غذایی، احتمال آلودگی این مواد به انواع قارچ‎ها و درنتیجه، تولید میکوتوکسین‎ها و آفلاتوکسین‌ها زیاد است (1). دانۀ ذرت ازنظر چربی، پروتئین، کربوهیدرات، نمک‌ها و برخی عناصر به‌گونه‌ای است که در دما و رطوبت مناسب محیط، بستر‌ی بسیار مطلوب برای رشد قارچ Aspergillus و تولید آفلاتوکسین‎ها محسوب می‌شود (2). پودر ماهی و کنجالۀ سویا به‌علت خردشدن و نداشتن پوستۀ محافظ، به‌آسانی در دسترس قارچ‌ها قرار می‌گیرند و قارچ‌ها به‌سهولت روی آنها رشد می‌کنند (3). طیف وسیعی از انواع قارچ‎های کپکی مانند Aspergillus‎، Penicillium، Fusarium و دیگر قارچ‎ها مقادیر درخور توجهی از میکوتوکسین‎های خطرناک را تولید می‌کنند (4). میکوتوکسین‎ها معمولاً در اجزای مادۀ خوراکی مانند ذرت، جو، گندم و بادام‌زمینی دیده می‌شوند و مشکل‌ آنها تنها در خوراک حیوان یا کاهش عملکرد دام و طیور نیست؛ آنها در گوشت، شیر و تخم‌مرغ وجود دارند و تهدیدی برای سلامت انسان محسوب می‌شوند. قارچ‎های Aspergillus، Fusariumو ‎Penicillium اهمیت بیشتری در تولید میکوتوکسین‎های مضر دارند. میکوتوکسین مهمی که قارچ Aspergillusتولید می‌کند، آفلاتوکسین است (5). آفلاتوکسین‎های B₁، B₂، G₁ و G₂ متابولیت‌های قارچی‌اند که گونه‎های خاصی مانند Aspergillus parasiticusو Aspergillus flavusآنها را تولید می‎کنند. غلات و حبوبات در مناطق گرم و مرطوب به آفلاتوکسین و عمدتاً آفلاتوکسین B₁ آلوده می‎شوند (6). آفلاتوکسین‌های M₁ و M₂ مشتقات مونوهیدروکسیلۀ آفلاتوکسین‌های‌ B₁ و B₂ هستند که در شیر انسان و حیوانات شیردۀ تغذیه‌شده با جیره‌های آلوده به آفلاتوکسین‌های B₁ و B₂ تشکیل و ترشح ‌می‎شوند. آفلاتوکسین‌ M₁ به‌طور گسترده‌ در محصولات لبنی مانند شیرخشک، پنیر و ماست یافت می‌شود (7 و 8).

گروهی از میکوتوکسین‌ها به‌طور مستقیم یا پس‌از تغییر ساختمان شیمیایی و سیستم‎های متابولیکی با مولکول DNA واکنش می‌دهند. نتیجۀ واکنش‌ بین میکوتوکسین‌ها و DNA، ایجاد تغییرات اساسی در توالی اطلاعاتی DNA است که با بروز آثار جهش‌زایی و سرطان‌زایی همراه است. اتصال میکوتوکسین‌ها به DNA سبب مهار همانند‌سازی DNA و ممانعت از تولید RNA می‌شود (9). تمام جدایه‌های سمی A. parasiticus آفلاتوکسین‌های گروه B و G را تولید می‌کنند؛ درحالی‌که بیشتر جدایه‌های گونة A. flavus صرفاً آفلاتوکسین‌های گروه B را تولید می‌کنند. آفلاتوکسین‌های گروه G به میزان کمتری نسبت به انواع B تولید می‌شوند (10). جهش‎‏زایی و سرطان‎زایی ناشی از آفلاتوکسین در حیوانات به‌طور گسترده بررسی و در انسان نیز ارتباط آفلاتوکسین‎ها با سرطان کبد تأیید شده است (11). فومونیسین‌ که گونه‌های خاصی از قارچ Fusariumشامل F. verticillioides، F. proliferatum، F. oxysporum، F. globosum و چندین گونۀ دیگرآن را تولید می‌کنند و بیشتر در ذرت و فرآورده‌های مربوط به آن یافت می‌شود، در سال ۱۹۸۸ در جنوب آفریقا کشف شد (12) و توانایی F. verticillioides، F. proliferatumو برخی جدایه‌‌‌های F. oxysporum در تولید فومونیسین به‌ویژه فومونیسین B₁ و B₂ گزارش شده است (13 و 14). آلودگی خوراک دام به فومونیسین سبب بیماری و مرگ دام می‌شود و زیان‌‌های اقتصادی را به همراه دارد. بر اساس تشخیص انجمن آزمایشگاه دامپزشکی آمریکا، مقدار ۵ میکروگرم‌در‌گرم فومونیسین برای اسب‌‌‌ها مضر است. پوست برنج که گاهی دام از آن تغذیه می‎کند، حاوی غلظت بیش از ۵ میکروگرم‌در‌گرم فومونیسین است. فومونیسین‌ها نسبت به حرارت مقاومند و با پخت‌‌وپز نابود نمی‌شوند (15). در ایران، آلودگی ذرت به آفلاتوکسین‎ها در سال 1372 گزارش و در سال 1380، آلودگی بذرهای ذرت به قارچ Aspergillus برابر با 47 درصد اعلام شد؛ آلودگی دانه‎های ذرت به این قارچ در مزارع مازندران و روی دانه‌ها گزارش شده است (16 و 17). در پژوهشی، تمام نمونه‌های ذرت وارداتی و داخلی گرفته‌شده از انبارهای استان اصفهان به آفلاتوکسین نوع B₁ آلوده بودند؛ در این مطالعه، بیشترین میزان آلودگی برابر با 9/9 میکروگرم‌در‌کیلوگرم اعلام شد (18). در پژوهشی، نتایج بررسی میزان تولید توکسین‎های قارچی زیرالئون و داکسی‎نیوالنول تولیدشده از قارچ Fusariumروی پیش‌ماده‌های مختلف نشان داد این قارچ بیشترین توکسین‎زایی را روی کلش برنج دارد (19). در بررسی انجام‌شده روی میزان توکسین‎زایی دو گونۀ A. flavusو Aspergillus ochraceus در شرایط محیطی مختلف مشاهده شد رشد بهینۀ Aspergillus ochraceus در دمای 31 درجة ‌سلسیوس، اسیدیتۀ 5، رطوبت بذری 27 درصد و رشد بهینۀ A. flavus در دمای 28 درجة ‌سلسیوس، اسیدیتۀ 6 و رطوبت بذری 27 درصد است و هر دو گونه قابلیت تولید آفلاتوکسین را دارند (20). نتایج مطالعه‎ای با عنوان تأثیر اسیدیته و فشار اسمزی بر تولید آفلاتوکسین در قارچ A. parasiticus نشان دادند بیشترین توکسین‌زایی و رشد به‌ترتیب در تیمارهای اسیدیتۀ 6 و 5 و در تیمار کلرورسدیم با غلظت 3 و صفر درصد است (21). آفلاتوکسین در خوراک و بذرهایی مانند برنج، بادام‎زمینی، ذرت، سویا و سایر دانه‌های ذخیره‌شده در انبار با شرایط دمایی و رطوبتی زیاد تولید می‌شود (22). نتایج پژوهشی روی قارچ A. parasiticus نشان دادند این قارچ بیشترین میزان آفلاتوکسین را در شرایط تاریکی و دمای 30 درجة سلسیوس تولید می‌کند (23) و نتایج پژوهش دیگری نشان دادند فومونیسین B در بیش از ۹۷ درصد سویه‌‌های F. moniliformeجداشده از خوراک مرغ و ۸۹ درصد نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از مناطق مختلف کاستاریکا یافت می‌شود (24). فومونیسین‌ها مهم‌ترین عامل آلودگی مواد غذایی در شرق و جنوب آفریقا به شمار می‌آیند (25) و از 95 نمونه مادۀ غذایی ارزیابی‌شده به روش TLC^[1] طی سال ۱۹۹۰ در مصر، 2/44 درصد نمونه‌های ذرت، انواع برنج، انواع پنبه‌دانه و بادام‌زمینی به انواع آفلاتوکسین آلوده بودند (26). هدف پژوهش حاضر، بررسی میزان آلودگی خوراک دام و طیور به آلودگی‎های قارچی و توکسین‏زایی آنها روی خوراک دام و طیور در شهرستان خرم‏آباد است.

مواد و روش‎ها

جداسازی، خالص‎سازی و شناسایی: به‌منظور شناسایی عوامل قارچی موجود در خوراک دام و طیور شهرستان خرم‌آباد، درمجموع 100 نمونه خوراک و اجزای آن طی سال‌های 97-96 از ده مرغ‎داری و گاو‌داری فعال واقع در بخش‌های مختلف حومۀ این شهرستان جمع‌آوری شدند. حدود 100 گرم از هر نمونه‎ درون کیسه‌های پلاستیکی تمیز ریخته شد و پس‌از انتقال به آزمایشگاه، بخش‎های مختلف نمونه‎های مواد خوراکی دام و طیور به‌طور تصادفی برداشته و روی محیط‌کشت معمولی سیب‌زمینی دکستروز آگار^[2] ‌و محیط‌کشت اختصاصی تغییر‌یافتۀ ناش اسنیدر^[3] کشت شدند. پس‌از رشد قارچ، زیرکشت‌هایی^[4] از حاشیۀ جوان پرگنۀ (کلنی) قارچ تهیه شدند و قارچ جداسازی شد؛ سپس قارچ‎ها خالص‌سازی و با مراجعه به کلیدهای معتبر و مقاله‌های منتشرشده شناسایی شدند.

تعیین توکسین‎زایی اولیۀ قارچ:محیط‌کشت نارگیل ‌آگار^[5] برای بررسی اولیۀ توکسین‎زایی قارچ استفاده شد. روش دیویس و همکاران^[6] (1987) با تغییرات جزئی برای تهیۀ محیط‌کشت به کار برده شد؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا مقدار 100 گرم پودر نارگیل در 200 میلی‏لیتر آب جوش ریخته شد و پس‌از ۵ دقیقه و چند نوبت به‌هم‌زدن، زمانی که عصارة نارگیل کاملاً خارج شد، مایع حاصل از چهار لایه پارچۀ ململ عبور داده شد؛ سپس ۲۰ گرم‌در‌لیتر پودر آگار و 10 گرم‌در‌لیتر عصارۀ مخمر به آن اضافه شد و به‌‌مدت 15 دقیقه دراتوکلاوی با فشار 1/1 اتمسفر و دمای ۱۲۱ درجة سلسیوس استریل و در تشتک‌های پتری 8 سانتی‌متری ریخته شد. قارچ روی این محیط‌کشت و در دمای 25 درجة سلسیوس نگهداری شد. پس‌از سه تا چهار روز از رشد قارچ، پتری‌های حاوی پرگنۀ قارچ رشدکرده به اتاقک TLC منتقل و برای رؤیت هالة آبی‌رنگ یا سبزرنگ اطراف پرگنۀ قارچ، زیر نور UV با طول موج 245 تا 366 نانومتر بررسی شدند (27-29).

کشت قارچ روی بستر ذرت:تعدادی ارلن 500 میلی‎لیتری فراهم شدند و در هریک، 100 گرم ذرت قرار داده شد؛ سپس به‌ازای هر 100 گرم بذر ذرت، 32 میلی‎لیتر آب مقطر استریل به ارلن‌ها افزوده و در ارلن‌ها با پنبه و فویل آلومینیومی محکم‌ شد. ارلن‌ها به‌مدت 24 ساعت در همین حالت نگهداری شدند تا رطوبت کافی جذب کنند و سپس به‌مدت 15 دقیقه در اتوکلاوی با دمای 121 درجة سلسیوس و فشار 1/1 اتمسفر قرار داده شدند تا تمام عوامل میکروبی آنها از بین بروند و 24 ساعت بعد، دوباره در همین شرایط استریل شدند. پس‌از اتوکلاو دوم و سردشدن ارلن‎های حاوی بذرهای ذرت، 5 عدد قرص میسلیومی 1 سانتی‎متری به‌ازای هر 100 گرم بذر ذرت از کشت 3 تا 4 روزة قارچ در کنار شعله و زیر هود لامینار درون هرکدام از ارلن‌های حاوی ذرت مرطوب قرار داده شدند و در آنها کاملاً محکم بسته شد. ارلن‌ها تکان داده شدند تا اسپورها درون ارلن‎های حاوی بذرهای ذرت به‌طور یکنواخت پخش شوند. ارلن‌ها در اتاق تاریک قرار داده شدند و از روز سوم به بعد، روزی دو بار با احتیاط تکان داده شدند؛ این کار سبب شکسته‌شدن میسلیوم درون هر ارلن شد تا بستر را بهتر پوشش دهد. پس‌از روز هفتم، ارلن‎های حاوی بذرهای آلوده به قارچ آمادۀ استخراج و تعیین توکسین بودند.

روش تولید توکسین: بسترهایی مانند ذرت، دانۀ گندم یا ارزن یا شلتوک برنج استریل‌شده برای تولید توکسین از جدایه‎های قارچی و محیط‌کشت نارگیل آگار برای بررسی توکسین‎زابودن جدایه‎های قارچی استفاده شدند. به‌منظور تهیۀ این محیط، مقدار ۲۰۰ گرم نارگیل در یک لیتر آب جوش ریخته شد و پس‌از ۵ دقیقه و چند نوبت هم‌زدن، زمانی که عصارة نارگیل کاملاً خارج شد، مایع حاصل از چهار لایه پارچۀ ململ عبور داده شد و ۲۰ گرم آگار به آن اضافه شد. نمونه‌ به‌مدت 15 دقیقه در اتوکلاوی با فشار 1/1 اتمسفر و دمای ۱۲۱ درجة ‌سلسیوس استریل و به تشتک‌های پتری 8 سانتی‌متری منتقل و زیر نور UV با طول موج 245 تا 366 نانومتر ارزیابی شد (27).

استخراج توکسین: به‌منظور استخراج توکسین‌های قارچی، ابتدا محتویات ارلن‌های حاوی بذرهای آلوده به قارچ به‌مدت 24 ساعت در دمای 70 درجۀ سلسیوس قرار داده شدند؛ سپس بذرهای ذرت آسیاب شدند و روی 15 گرم از هر نمونۀ آسیاب‌شده، 48 میلی‌لیتر استونیتریل، 9 میلی‌لیتر متانول و 3 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد و مواد به‌مدت 3 ساعت روی شیکری با سرعت 170 دوردردقیقه قرار داده شدند. مخلوط حاصل با کاغذ صافی واتمن صاف شد و عصارة حاصل از ستون تصفیۀ حاوی رزین کاتیونی و مخلوط آلومینا- کربن عبور داده شد؛ به این منظور، ابتدا و انتهای ستون با یک لایه پشم‌ شیشه مسدود شد، روی آن 1 گرم مخلوط آلومینا- کربن اضافه شد و دوباره یک لایه پشم ‌شیشه روی آن قرار داده شد. رزین کاتیونی که به‌مدت یک ساعت در آب مقطر قرار گرفته بود، در ستون ریخته شد و پس‌از‌آن، عصارة نمونه‎ها از ستون عبور داده شدند. عصارة عبور‌داده‌شدة ستون اول دوباره با استفاده از ستون تصفیة دوم به‌ترتیب شامل پشم شیشه، آلومینا- کربن و پشم شیشه خالص شد و عصارة عبور‌داده‌شده از ستون تصفیة دوم برای تبخیر حلال به آون 70 درجة سلسیوس منتقل شد. پس‌از خشک‌شدن عصارة استخراج‌شده، 2 میلی‌لیتر محلول متانول- آب (10 به 90) به آن اضافه و به‌مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار داده شد؛ سپس 2 میلی‌لیتر محلول متانول- آب (5 به 95) و 2 میلی‌لیتر محلول استونیتریل- متانول (3 به 1) به آن افزوده شد و به‌منظور تبخیر حلال، دوباره در آونی با دمای 70 درجۀ سلسیوس قرار داده شد؛ درنهایت، 2 میلی‌لیتر محلول متانول- آب (5 به 95) به عصارة خشک‌شده اضافه شد و عصاره‎های استخراج‌شده در دمای منفی 20 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند (شکل 1).

شکل 1- مراحل استخراج توکسین؛ a. ‌آماده‌سازی بستر ذرت در ارلن مایر، b. رشد قارچ روی بستر ذرت و شلتوک برنج، c. خشک‌کردن قارچ در آون 70 درجۀ سلسیوس، d. آسیاب‌کردن قارچ خشک‌شده، e. توکسن‌های ناخالص قارچی، f. خالص‌سازی توکسین قارچی

.سنجش کلی سم‎های تولیدی قارچ‎هابه روشTLC^[7]:روش موسویان و همکاران (21) برای سنجش TLC استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که پس‌از استخراج سموم، محلول‎های نمونه و استاندارد روی صفحۀ Thin Layer Chromatography (TLC) )صفحه‌ای آلومینیومی همراه با سیلیکاژل) در یک راستا نقطه‌گذاری شدند. پس‌از اینکه صفحه در مخزن TLC قرار داده شد و محلول متانول-استونیتریل (88 به 12) از آن بالا رفت و صفحه شسته شد، صفحه در هوا خشک و زیر نور UV با طول موج 365 نانومتر ارزیابی و شدت نقطۀ فلورسانس آبی نمونه با نقطۀ‎ ‎فلورسانس استاندارد مقایسه شد.

.ارزیابی کمّی توکسین‎های موجود در عصاره به روش ^[8]HPLC: دستگاه تحلیل‌گر HPLC موجود در آزمایشگاه مرکزی دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه لرستان و دانشگاه خوارزمی تهران برای ارزیابی کمّی توکسین‌های موجود در عصاره به روش HPLC استفاده شد. به‌منظور تجمیع بیشتر توکسین‏ها، عصارة به‌دست‌آمده به ستون ایمونوافینیتی^[9] (Biopharm Rhone Ltd, UK(R- با قطر ذرات داخلی 5/0 میلی‌متر وارد شد که به‌علت وجودداشتن آنتی‌بادی‎های سطحی روی ذرات، ابتدا توکسین‎ها نگهداری شدند و سپس با عبور متانول، از ستون خارج شدند و آب دیونیزه اضافه شد. دستگاه HPLC برای سنجش کمّی توکسین‎ها استفاده شد؛ به این‌ منظور، 20 میکرولیتر عصاره به ستون کروماتوگرافی فاز معکوس C18-Supelco Discovery به طول 25 سانتی‌متر، قطر داخلی 5/4 میلی‎متر و قطر ذرات 5 میکرومتر متصل به دستگاه Unicam-Crystal-200 (Brand Kinesis, UK) تزریق شد. فاز متحرک شامل مخلوط استونیتریل (20 درصد)، متانول (20 درصد) و آب دیونیزه (60 درصد) بود و با سرعت 1 میلی‌لیتربردقیقه از ستون عبور کرد. آشکارساز از نوع فلورسانس در طول موج تحریکی 365 نانومتر و طول موج خروجی 445 نانومتر تنظیم و به‌منظور تقویت فلورسانس توکسین‎ها از ستون مشتق‌ساز تولیدکنندة بر PB. PB با قطر ذرات داخلی 5/0 میلی‌متر (R-Biopharm Rhone Ltd, UK) استفاده شد. هرکدام از انواع توکسین‎ها بر اساس مطابقت پیک خروجی با زمان بازداری پیک استاندارد و بر اساس غلظت نمونة استاندارد تعیین هویت و غلظت شد (30 و 31).

نتایج.

نتایج نشان دادند جیره‌های غذایی شامل ذرت، سویا، کنسانتره، دان مخلوط در خوراک طیور و همچنین جیره‌های غذایی ذرت و جو، یونجه، کاه و کلش، کنسانتره و ذرت علوفه‌ای در خوراک دام به قارچ‎های مختلفی ازجمله Aspergillus، Rhizopus، Rhizomocur، Penicillium، Alternaria، Absidia، Trichotecium، Mucor و Fusarium آلوده‌اند.

از 40 جدایۀ قارچی شناسایی‌شده در خوراک طیور، 27 جدایه در روش TLC زیر نور فرابنفش، پرتو‌های فلورسانس آبی‌رنگ از خود ساطع کردند و 13 جدایۀ دیگر پرتو‌های فلورسانس نداشتند. بیشترین جدایه‎ها به قارچ‎های Fusarium با تعداد 11 جدایه (35 درصد)، Rhizomocur و Absidia با تعداد 6 جدایه (5/12 و 7/11 درصد) مربوط بودند که باتوجه‌به توکسین‌زایی قارچ Fusarium و اهمیت فومونیسین‎ها، این قارچ یکی از عوامل اصلی در بحث توکسین‌زایی در نظر گرفته شد. جنس‌‌های Alternaria و Trichotecium با 1 جدایه (7 درصد)، کمترین جدایه‌های قارچی و درصد فراوانی را به ‌خود اختصاص دادند. فراوانی آلودگی خوراک طیور به جدایه‌های قارچی شامل دان مخلوط (14 جدایه)، سویا (13 جدایه)، ذرت (10 جدایه) و کنسانتره (3 جدایه) بود (جدول 1). فراوانی توکسین‌زایی قارچ‎ها به‌ترتیب شامل Fusarium با 11 جدایه (35 درصد)، Penicilliumبا 5 جدایه (16 درصد)، Rhizomucor و Absidiaهریکبا 6 جدایه (5/12 و 7/11 درصد)، Aspergillus و Rhizopusهرکدام با 4 جدایه (7 و 10 درصد) و Alternariana و Trichotecium هریکبا 1 جدایه (5/2 و 8/1 درصد) بود؛ همچنین از این تعداد قارچ توکسین‌زا، 11 جدایه سویا، 10 جدایه دان مخلوط، 4 جدایه ذرت و 2 جدایه کنسانتره را آلوده کردند.

از 37 جدایۀ مربوط به خوراک دام، 17 جدایۀ قارچی در روش TLC زیر نور فرابنفش، پرتو‌های فلورسانس آبی‌رنگ از خود ساطع کردند و 20 جدایۀ دیگر پرتو‌های فلورسانس نداشتند. بیشتر جدایه‎ها به قارچ‌ Fusarium مربوط بودند که گونه‌های F. prolifratum و F. verticillioides به‌ترتیب با 23 جدایه (61 درصد) و 10 جدایه (26 درصد) بیشترین جدایه‎ها و درصد فراوانی را به‌ خود اختصاص دادند؛ همچنین کمترین درصد فراوانی به جنس‌ Alternaria و گونة F. concentericum هریک با 1 جدایه (6/6 و 4/1 درصد) مربوط بود. فراوانی آلودگی خوراک دام به جدایه‎های قارچی شامل کنسانتره (15 جدایه)، ذرت و جو (8 جدایه)، ذرت علوفه‌ای (7 جدایه)، کاه و کلش (4 جدایه) و یونجه (3 جدایه) بود (جدول 2). فراوانی توکسین‌زایی قارچ‎ها به‌ترتیب شامل F. verticillioides با 8 جدایه (6/21 درصد)،F. prolifratum با 8 جدایه (6/21 درصد) و F. fujikuoroi با 1 جدایه (7/2 درصد) بود؛ همچنین از این تعداد قارچ توکسین‌زا، فراوانی آلودگی خوراک به‌ترتیب شامل کنسانتره با 9 جدایه، ذرت و جو با 6 جدایه، کاه و کلش با 2 جدایه و یونجه و ذرت علوفه‌ای بدون نمونۀ توکسین‌زا بود.

جدول 1- تعداد نمونه و درصد آلودگی جیره غذایی آلوده به قارچ در خوراک طیور

جدول 2- تعداد نمونه و درصد آلودگی جیرۀ غذایی آلوده به قارچ در خوراک دام

.نتایج مطالعه روی محیط‌کشت نارگیل‌ آگار: این روش برای تشخیص جدایه‌های توکسین‎زای Aspergillus پیش از عملیات استخراج توکسین و TLC استفاده شد. نتایج نشان دادند گونه‎های Aspergillus فلورسانس آبی از خود نشان می‌دهند و گونه‎های دیگر فلورسانس نشان نمی‌دهند (شکل 2).

شکل 2- نتایج مطالعه روی محیط نارگیل آگار (Aspergiluus flavus)؛ a. قارچ بدون توکسین در محیط PDA، b. قارچ بدون توکسین در محیط نارگیل آگار، c. قارچ دارای توکسین در محیط PDA، d. قارچ دارای توکسین در محیط نارگیل آگار

نتایج آزمایش‌های TLC و HPLC: تجزیه‌و‌تحلیل آزمایش‌های TLC و HPLC نشان داد قارچ‌های F. prolifratum و F. verticillioidesبیشترین نور را از خود ساطع می‌کنند و این در حالیست که قارچ Rhizomucor کمترین نور و درنتیجه، کمترین توکسین‌زایی را به خود اختصاص می‌دهد. باتوجه‌به خاصیت فلورسانس آفلاتوکسین زیر نور UV و با درنظرگرفتن اینکه هرچه غلظت سم بیشتر باشد، انتظار می‎رود شدت نور فلورسانس بازتابیده از آن نیز بیشتر باشد، جدایه‎هایی که توکسین بیشتری داشتند، فلورسانس بیشتری نیز تولید کردند (شکل 3).

شکل 3- نقطه‌گذاری فومونیسین‎های استاندارد و نمونه‌های استخراجی تیمارهای مختلف روی صفحۀ TLC و زیر نور UV

نتایج آزمایش‌های HPLC سه جدایه از قارچ Fusarium: پس‌از انجام آزمایش TLC مربوط به گونه‎های F. prolifratum، F. verticillioides و F .fujikouri، کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا برای دستیابی به نوع و میزان توکسین استخراج‌شده انجام شد (شکل 4، a، b، c و d). نتایج HPLC اولیه برای جدایه‌های Fusarium نشان دادند قارچ F. verticillioidesبیشترین توانایی تولید فومونیسین B₁ را نسبت به F. proliferatum و F. fujikuroi دارد. بر اساس این یافته‌‌‌ها، غلظت فومونیسین جدایه‌های F. verticillioide که بیشترین توانایی توکسین‌زایی را بین جدایه‌ها داشتند، 332/0 میکروگرم‌برمیلی‎لیتر بود (جدول 3).

جدول 3- غلظت فومونیسین B1 در آزمایش HPLC

کروماتوگرام حاصل از HPLC نمونۀ استاندارد قارچ Fusarium و گونه‎های F. verticillioides، F. proliferatum و F. fujikuroi نشان داد گونه‎های مطالعه‌شده توکسین فومونیسین B₁ را دارند (شکل 4، a، b، c و d).

.نتایج آزمایش‌های HPLC قارچ Aspergillus: پس‌از انجام آزمایش TLC، دو نمونه از توکسین‎های تولیدی مربوط به گونه‎های A. niger و A. flavusبرای تعیین نوع و میزان توکسین استخراج‌شده به روش کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا ارزیابی شدند و نتایج HPLC اولیه برای جدایه‌های Aspergillus  نشان دادند گونة A. flavus بیشترین میزان تولید آفلاتوکسین B₁ و گونۀ A. niger بیشترین میزان آفلاتوکسین G₁ را دارد (شکل 4، e و f). گونۀ A. flavus با غلظت 19/17 میکروگرم‌بر‌میکرولیتر بیشترین میزان تولید آفلاتوکسین B₁ و گونۀ A. nigerبا غلظت 25/12 میکروگرم‌برمیلی‎لیتر بیشترین میزان آفلاتوکسین G₁ را دارد (جدول 4).

شکل 4- کروماتوگرام HPLC فومونیسین B₁؛ a. تولیدی از نمونة استاندارد Fusarium، b. تولیدی از قارچ F. verticillioides، c. تولیدی از F. proliferatum، d. تولیدی از F. fujikuroi، e. تولیدی از Aspergillus niger، f. تولیدی از A. flavus