نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیماری‏ شناسی گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز
2 دانشیار بیماری‏ شناسی گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران؛ مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
3 استاد بیماری‏ شناسی گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Common zinnia (Zinnia elegans), canna (Canna sp.), petunia (Petunia hybrida), compacta (Dracaena Compacta), dahlia (Dahlia sp.), gazania (Gazania sp.), marigold (Tagetes sp.), rose moss (Portulaca grandiflora) and nasturtium (Tropaeolum majus) are common ornamental plants in Ahvaz. The identification of fungi associated with these plants will contribute to improving the future managment of their cultivation. Members of the genera Amesia and Chaetomium are widely distributed in soil, water, plants, animals and humans. In this study, 12 isolates from Chaetomium and Amesia genera, obtained from herbaceous ornamentals, were identified based on morphology and phylogenetic analysis.
Materials and methods: During 2017-2018, 40 symptomatic plants, showing root rot, stem canker and leaf spot, were collected and their associated fungi were isolated. Among those, 12 chaetomiaceae-like isolates were obtained, which their morphological and molecular characterizations were surveyed. Mycelial biomass of the isolates, produced into potato-dextrose-broth (PDB), was collected by passing through filter paper and freeze-dried. ITS and partial regions of the 28s-D1/D2 (for 4 isolates) and tub2 (for 9 isolates) were amplified using appropriate primers and sequenced.
Results: The isolates under survey were compared with known strains using BLASTn search and phylogenetic analysis beased on ITS, 28S and tub2 regions. Accordingly, the isolates under study were identified as follow: Amesia atrobrunnea, Chaetomium rectangulare, C. globosum, C. ascotrichoides and C. olivaceum. The morphological characteristics of these isolates were in accordance with the type strains of each species.
Discussion and conclusion: To our knowledge, this is the first record of C. ascotrichoides in Iran and the association of C. rectangulare on compacta, C. globosum on zinnia and canna, C. ascotrichoides on petunia, C. olivaceum on common zinnia, nasturtium and marigold throughout the world.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
گیاهان زینتی آهار (Zinnia elegans)، اختر (Canna sp.)، اطلسی (Petunia hybrida)، کمپکت (Dracaena Compacta)، کوکب (Dahlia sp.)، گازانیا (Gazania sp.)، گل جعفری (Tagetes sp.)، گل ناز (Portulaca grandiflora) و لادن (Tropaeolum majus) از گیاهان زینتی شهر اهواز هستند. گیاه آهار دارای گلهای جذاب و کوچک، برگهایی با بافت کاغذی و ساقههای سفتی است که در مرکز به رنگ سبز کمرنگ هستند و در ارتفاع 15 تا 100 سانتیمتر رشد میکند. اختر، گیاهی ریزومدار با ساقههای طویل و بدون انشعاب است، برگهای آن بزرگ، پهن با رگبرگهای برجسته و سبز تا مسی یا ارغوانی هستند و گلهای نامنظم آن بهشکل خوشه در انتهای ساقه قرار میگیرند. گیاه اطلسی جزو گیاهان علفی با ساقۀ نیمهچوبی است که گلهایش بهشکل قیف با دو رنگ بنفش و سفید دیده میشوند. این گیاه زینتی بهعلت داشتن گلهای فراوان، در تزیین تپهگلها و حاشیههای صاف یا شیبدار استفاده میشود. گیاه کمپکت، برگهای پهن و کشیدهای به رنگ سبز تیره دارد و نام گیاه از آرایش برگها در کنار هم گرفته شده است؛ برگها بهشکل متراکم و دستهای در انتهای شاخهها تشکیل میشوند. گیاه کوکب دارای برگهای متناوب، بیضیشکل و قدری کشیده و کرکدار و خشن و ساقههای ضخیم و منشعب و گلهای شبیه آفتابگردان با مخروطی به رنگ سیاه، قهوهای یا سبز در وسط است؛ گلها اواخر تابستان یا اوایل پاییز ظاهر میشوند. گیاه گازانیا دارای برگهای سبز تیره و صاف در سطح بالایی و نمدیشکل و سفید در پشت است، گلهای این گیاه در روشنایی آفتاب، باز و در شب و هوای ابری و مهآلود، بسته میشوند. گلها درخشان و به رنگهای نارنجی، زرد، کرم و قرمز برنزی و اغلب در قاعدۀ خود دارای هالههایی به رنگهای تیره یا روشن هستند. گل جعفری دارای برگهای مرکب است و گلهای آن به رنگ زرد لیمویی، زرد، کرم، طلایی و نارنجی قهوهای دیده میشوند. گل ناز دارای برگهای ضخیم و گوشتی و مرتب و متناوب در خوشههای کوچک است و گلها با پنج گلبرگ به رنگهای متغیر قرمز، نارنجی، صورتی، سفید و زرد دیده میشوند. گیاه لادن دارای برگهای دایرهایشکل و دمبرگهای بلند است و گلها به رنگ نارنجی پرتقالی و درشت هستند و از کنار برگها خارج میشوند و دمگل بلندی دارند.
وجود قارچهای بیمارگر و همراه در گیاهان یادشده (ازجمله گونههای Amesia و Chaetomium) روی وضعیت رشدی آنها تأثیر میگذارد و شناسایی این قارچها به مدیریت مناسبتتر پرورش این گیاهان کمک میکند. جنس Chaetomium و آرایههای وابسته به آن بهعلت داشتن توانایی تخریب سلولز و تولید انواع متابولیتهای زیستی، قادر به کلونیزهکردن بسترهای مختلف هستند. بیش از 400 گونه از جنس Chaetomium توصیف و برخی گونهها عامل حساسیتزای مهم در هوا گزارش شدهاند که به گسترش ورم غشای مخاطی بینی و آسم )بهعلت تولید مایکوتوکسینها و ترکیبات آلی فرار( کمک میکنند (1-6). جنس Chaetomium معمولاً آسکوکارپهایی با دیوارۀ غشایی تولید میکند که زیر پوشش موهای نسبتاً زیاد رشد کردهاند. این جنس دارای آسکوسپورهای تکسلولی، صاف و رنگی با منفذ تندش است (7 و 8). ابتدا کنز[1] گونۀ C. globosum را معرفی و توصیف (9) کرد و سپس چندین بار بر اساس ریختشناسی موهای اطراف آسکوکارپها توصیف شد (7، 10-16)؛ باوجوداین، فیوکل[1] (17) با کشف آسکهای استوانهای و زوف[1] (12) با کشف منافذ جوانهزنی آسکوسپورها بینش بهتری در توصیف ریختشناسی جنسChaetomiumارائه کردند. سورگل[2] (18) و دریفس[3] (19) ویژگیهای ریختشناسی آسکوسپورها، آسکها و ساختار سطح دیوارۀ آسکوکارپها را برای طبقهبندی جنس Chaetomium پیشنهاد کردند. میلنر[4] و همکاران (20) برای طبقهبندی گونههای Chaetomium با استفاده از ویژگیهای منافذ جوانهزنی آسکوسپورها و پاسخهای رشدی گونهها در درجهحرارتهای مختلف تلاش کردند. مطالعههای تکمیلی وونارکس[5] و همکاران (21) که اساس طبقهبندی معاصر جنس Chaetomium را تشکیل میدهند، مطالعههای پیشین را مدنظر قرار میدهند؛ هرچند بر ریختشناسی آسکها، آسکوسپورها، منافذ جوانهزنی و ساختار دیوارۀ آسکوکارپها تأکید میکنند و ریختشناسی موهای اطراف آسکوکارپها را مبنا قرار نمیدهند؛ بر اساس این طبقهبندی، C. globosum دارای آسکوکارپهایی با اشکال کروی تا تخممرغی یا تخممرغی معکوس، متشکل از دیوارۀ اسفنجی و پوشیده از اشکال متنوعی از موهایی صاف، انعطافپذیر یا بهطور منظم پیچخورده است. آسکوکارپها حاوی آسکهای چماقیشکل و آسکوسپورهای لیموییشکل و دوطرفه مسطحشده با اندازۀ 12-9×10-8×8-6 میکرومتر و دارای منفذ قارچی در رأس خود هستند. بر اساس توصیف یادشده، 28 گونه مترادف با C. globosum شناخته شدهاند (8 و 21).
گریف[6] و همکاران (22) ارتباط تبارشناسی جنس Chaetomium را با استفاده از دادههای توالی LSU، β-tubulin و rpb2 بررسی کردند و نتیجه گرفتند Chaetomidium چندنیایی است. عسگری[7] و زارع[8] ریختشناسی جنس Chaetomium را در ایران مطالعه کردند (23). در این مطالعه، بررسی تبارشناسی چندژنی مبتنی بر نواحی ITS، LSU-nrDNA و tub2، جایگاه طبقهبندی و جداسازی تبارشناسی پنج گروه گونۀ Chaetomium را بهطور درخور توجهی روشن کرد و این تفکیک تا حدی با ریختشناسی، ساختار پریدیم، شکل آسکوسپورها و موقعیت منافذ تندش منطبق بود. این مطالعه نشان داد ارتباط تبارشناسی دوری بین جدایههای معتبر C. globosum (CBS 148.51) و سویۀ C. coarctatum CBS 162.62 وجود دارد (23). بر اساس نتایج تبارشناسی مبتنی بر شش جایگاه ژنی، ویژگیهای ریختشناسی (24) و حدود و ثغور گونۀC. globosum بازنگری شد و شش گونه که مترادف C. globosum معرفی شده بودند (8)، احیا شدند. در مطالعۀ وونارکس و همکاران، Chaetomidium بهعنوان جنس بدون منفذ آسکوکارپ (استیول) و مترادف Chaetomium معرفی شده است (24). این جنس دارای آسکوکارپ با موهای بلند و انعطافپذیر است و آسکوسپورها بیضی تا لیموییشکل، تکسلولی با یک منفذ جوانهزنی در رأس خود هستند. در حال حاضر، این جنس شامل 12 گونه است (25-28). با مطالعۀ تبارشناسی بر اساس ژنهای SSU، LSU، tub2 وrpb2 (27)، جنسهای Amesia (با 3 گونه)، Arcopilus (با 1 گونه)، Collariella (با 4 گونه)، Dichotomopilus (با 7 گونه) و Ovatospora (با 2 گونه) برای نخستینبار معرفی و توصیف شدند. در مطالعۀ وونارکس و همکاران، جنس Amesia با تغییر نام چند گونۀ Chaetomium و توصیف گونۀ A. atrobrunnea، گونۀ نامگذاری یا تایپ معرفی شد. گونههای موجود در این جنس ازنظر ریختشناسی بهویژه شکل موهای اطراف کلیستوتسیوم و ریختشناسی آسکوسپورها متنوع هستند. گونههای توصیفشدۀ این جنس عبارتند از: Amesia atrobrunnea، Amesia cymbiformis و Amesia nigricolor. در این جنس، آسکوکارپهای سطحی، منفذدار و کروی، بیضوی یا تخممرغیشکل تشکیل میشوند. آسکها چماقی یا دوکیشکل و حاوی هشت آسکوسپور هستند که با نظم و پشتسرهم تشکیل میشوند و دیوارۀ آنها تجزیهشونده است. آسکوسپورهای قهوهایرنگ معمولاً دوکیشکل یا تخممرغی کشیده با منفذ جوانهزنی رأسی یا زیررأسی هستند. تاکنون شکل جنسی این قارچ مشاهده نشده است (27).
در مطالعۀ حاضر، 12 جدایه از جنسهای Chaetomium و Amesia که از گیاهان زینتی علفی شهر اهواز (دارای نشانههای پوسیدگی ریشه، لکهبرگی و شانکر ساقه) جداسازی شده بودند، بر اساس ریختشناسی و تجزیهوتحلیل تبارشناسی شناسایی شدند.
مواد و روشها
جمعآوری نمونههای گیاهی:طی سال زراعی 1397-1396، 40 نمونه از نه گونه گیاه زینتی علفی با نشانههای پوسیدگی ریشه، لکهبرگی و شانکر ساقه از مناظر شهری اهواز جمعآوری (جدول 1) و تا زمان جداسازی درون کیسههای کاغذی (قراردادهشده در کیسههای نایلونی) و در یخچال نگهداری شدند. بهمنظور جداسازی بیمارگرهای احتمالی، برشی از مرز مشترک بافت آلوده و سالم هر نمونۀ گیاهی (قطعههایی با اندازۀ 5×5 میلیمتر) تهیه و پساز ضدعفونی سطحی با هیپوکلریتسدیم 2 درصد بهمدت 1 تا 2دقیقه، نمونهها سه بار با آب مقطر استریل شستشو شدند. پساز خشکشدن نمونهها بهوسیلۀ کاغذ صافی استریل، قطعههای گیاهی روی محیط غذایی سیبزمینی- دکستروز- آگار (PDA) قرار گرفتند. پساز 3 تا 7 روز نگهداری تشتکهای پتری در انکوباتور 28 درجۀ سانتیگراد، پرگنههای قارچی ظاهرشده روی محیطکشت به محیطکشت جدید مایهزنی شدند.
خالصسازی جدایههای قارچی: مقدار 9 میلیلیتر محلول 1/0 درصد توئین 80 به هر شیشۀ مکارتی اضافه و بهمدت 20 دقیقه در دمای 121 درجۀ سانتیگراد استریل شد. تعدادی از آسکوکارپهای تولیدی روی سطح پرگنۀ قارچی با لوپ استریلشده جمعآوری و به لولههای مکارتی اضافه شدند؛ سپس این لولهها بهشدت با ویبراتور تکان داده شدند. سوسپانسیون حاصل از لایۀ پشمشیشۀ استریل عبور داده شد تا قطعههای ریسه، بقایای آسکوکارپ و محیطکشت از آن جدا شوند. مقدار 100 میکرولیتر از رقتهای مختلف (1/0 و 01/0) این سوسپانسیون آسکوسپور به ظروف پتری حاوی PDA اضافه و با پخشکنندۀ Lشکل بهخوبی پخش شد. ظروف پتری بهمدت 24 تا 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سانتیگراد و تاریکی مطلق نگهداری شدند و با مشاهدۀ پرگنههای مستقل قارچ در ظروف پتری، یکی از آنها بهعنوان قارچ تکاسپورشده به محیطکشت PDA جدید مایهزنی شد.
جدول 1- ویژگیهای گیاهان نمونهبرداریشده و جدایههای بهدستآمده از آنها
|
کد جدایه |
میزبان |
نام علمی |
محل جمعآوری |
تاریخ جمعآوی |
نشانههای نمونه |
|
SCUA-C1 |
گل آهار |
Zinnia elegans |
فلکۀ فرودگاه |
27/8/96 |
لکهبرگی |
|
SCUA-D1 |
گل آهار |
Zinnia elegans |
نیوساید |
27/8/96 |
لکهبرگی |
|
SCUA-D2 |
گل آهار |
Zinnia elegans |
نیوساید |
27/8/96 |
لکهبرگی |
|
SCUA-AT3 |
گل اطلسی |
Petunia hybrida |
ملت، فاز4 |
18/1/97 |
شانکر ساقه |
|
SCUA-AT10 |
گل اطلسی |
Petunia hybrida |
ملت، فاز 4 |
18/1/97 |
پژمردگی گیاه |
|
SCUA-Z9 |
گل ناز |
Portulaca grandiflora |
زیتون |
31/6/97 |
شانکر ساقه و پوسیدگی ریشه |
|
SCUA-Q1 |
گازانیا |
Gazania sp. |
کیانپارس |
20/7/96 |
لکبرگی |
|
SCUA-K3 |
کمپکت |
Dracaena Compacta |
گلخانۀ کیانپارس |
20/7/96 |
لکهبرگی |
|
SCUA-CO1 |
کوکب |
Dahlia sp. |
شهرک نفت |
12/9/96 |
لکهبرگی |
|
S8 SCUA- |
گل جعفری |
Tagetes sp. |
سایت دانشگاه |
21/9/96 |
لکهبرگی و شانکر ساقه |
|
SCUA-C3 |
اختر |
Canna sp. |
شهرک دانشگاه |
10/10/96 |
لکهبرگی |
|
SCUA-L2 |
گل لادن |
Tropaeolum majus |
نیوساید |
18/1/97 |
لکهبرگی |
|
SCUA-Neae |
- |
- |
دانشگاه |
17/8/96 |
- |
بررسی ریختشناسی و شاخصهای رشدی: شکل و اندازۀ آسکوکارپها و آسکوسپورها بررسی شد (29). یک قطره محلول رنگآمیزی لاکتوفنل یا آبیلاکتیک (لاکتوفنول+کاتنبلو) روی لام اسلاید ریخته و چند آسکوکارپ با سوزن سترون و بهآرامی به قطرۀ موجود روی لام منتقل شد؛ سپس ساختارهای قارچی با قراردادن لامل روی آنها، هواگیری و تثبیت با شعله مشاهده شدند. جدایهها به روش بینک[9] و روگرز[10] (30) روی اسلاید کشت شدند. در تشتک پتری حاوی کاغذ صافی، لام و لامل استریل، قطعههای کوچک مربعشکلی از محیطکشت PDA روی لام قرار داده شدند و مقدار کمی از پرگنۀ قارچ مدنظر با سوزن استریل برداشته و بهآرامی به چهار سوی آن منتقل شد؛ سپس لامل روی قطعههای PDA قرار داده شد و تشتک پتری در دمای 28 درجۀ سانتیگراد انکوباتور نگهداری شد. پساز رشد قارچ مدنظر روی لام و لامل، اسلاید ساختارهای قارچی با استفاده از محلول رنگآمیزی تهیه شد.
بهمنظور تعیین سرعت رشد، دیسکهای یکسانی از حاشیۀ درحال رشد پرگنۀ جدایههای قارچی تهیه و روی محیطکشتهای PDA قرار داده شدند و کشتها در دمای 28 درجۀ سانتیگراد انکوباتور و تاریکی مطلق نگهداری شدند. میزان رشد پرگنههای جدایههای بررسیشده بهطور روزانه و بهمدت هشت روز اندازهگیری شد.
.تولید زیستتودۀ جدایهها و آمادهسازی برای استخراج DNA: قطعههای 5 میلیمتری از حاشیۀ پرگنههای درحال رشد قارچ جدا و به محیطکشت مایع سیبزمینی- دکستروز- براث (PDB) (100 میلیلیتر عصارۀ سیبزمینی همراه با 1 گرم ساکارز) اضافه شدند. ظروف کشت 5 تا 15 روز در شرایط تاریکی مطلق، دمای 28 درجۀ سانتیگراد و 80 تا 120 تکان در دقیقه روی شیکر نگهداری شدند. تودۀ میسیلیومی رشدیافته در محیطکشتهای PDB با پمپ خلأ، قیف و کاغذ صافی استریل جمعآوری و با آب مقطر استریل شستشو شد. تودۀ میسیلیومی حاصل بیدرنگ به لولههای سانتریفیوژ 50 میلیلیتری منتقل و تا مرحلۀ خشک- انجمادی در فریزر منفی 80 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد. بهمنظور خشک- انجمادی، درِ لولههای سانتریفیوژ حاوی تودههای میسلیومی منجمدشده با قطعههای گاز استریل جایگزین و بهمدت 24 ساعت در دستگاه فریزدرایر (منفی 20 تا منفی 54 درجۀ سانتیگراد) قرار داده شدند. تودۀ میسیلیومی خشکشده به هاون چینی استریل منتقل و با ازت مایع بهخوبی پودر شد. پودر ایجادشده در لولۀ 2 میلیلیتری جمعآوری و با پارافیلم مسدود شد. نمونهها تا زمان استخراج DNA در دمای منفی 20 درجۀ سانتیگراد نگهداری شدند.
استخراج DNA و تکثیر نواحی ژنی: استخراج DNA به روش ریدر[11] و برودا[12] (31) با اندکی تغییر (32) انجام شد. بهمنظور تکثیر حدود 1200 جفت باز از نواحی 18S، ITS1، 5.8S، ITS2 و 28S مربوط به rDNA هستهای از آغازگرهای عمومی ITS1 (33) و NL4 (34) و برای تکثیر حدود 700 جفت باز از ژن بتاتوبولین از جفت آغازگر اختصاصی T1 (35) و tub4Rd (36) استفاده شد.
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) با استفاده از ترموسایکلر مدل Biometra و Biorad انجام شد. برای 50 میکرولیتر مخلوط واکنش زنجیرهای پلیمراز، 5 میکرولیتر بافر 10x Taq buffer، 4 میکرولیتر MgCl2 (25 میلیمولار)، 2 میکرولیتر آغازگر مستقیم (10 میکرومولار)، 2 میکرولیتر آغازگر معکوس (10 میکرومولار)، 2 میکرولیتر از مخلوط 5/2 میکرومولار هرکدام از dNTPها، 6/0 میکرولیتر آنزیم (5 واحدبرمیکرولیتر) Taq DNA Polymarase (GenBio، کرۀ جنوبی)، 5/2 میکرولیتر DNA الگو (حدود 500 نانوگرم) و 9/31 میکرولیتر آب مقطر دوبار تقطیرشده استفاده شد. در تکثیر با هر جفت آغازگر، مخلوط واحدی برای تمام نمونهها از مواد موردنیاز (بهغیراز DNA الگو) روی یخ ساخته، با ورتکس مخلوط و سپس در میکروتیوبهای استریل تقسیم شد؛ سپس، DNA الگو به هرکدام از میکروتیوبها اضافه شد. برنامۀ حرارتی واکنش زنجیرهای پلیمراز شامل یک مرحله واسرشتهسازی اولیه در دمای 94 درجۀ سانتیگراد بهمدت 3 دقیقه، 35 چرخۀ تکراری (شامل یک مرحلۀ 30 ثانیهای در دمای 94 درجۀ سانتیگراد، 30 ثانیهای در دمای 51 تا 56 درجۀ سانتیگراد برای ITS و 50 تا 55 درجۀ سانتیگراد برای tub2 و 90 ثانیهای در دمای 72 درجۀ سانتیگراد) و یک مرحلۀ طویلشدن نهایی در 72 درجۀ سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسیکلر (مدل MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler) بود. محصولات PCR با الکتروفورز روی ژل آگارز بررسی شدند.
.خالصسازی محصولات PCR، توالییابی و تجزیهوتحلیل توالیها: تعداد 9 نمونه به روش استخراج از ژل توسط شرکت ماکروژن (Humanizing Genomics, Macrogen, South Korea) خالصسازی و سپس با آغازگرهای رفت و برگشت توالییابی شدند. محصولات PCR مربوط به 8 نمونه بدون انجام خالصسازی توسط شرکت نرگس (اهواز) توالییابی شدند. توالیهای بهدستآمده از هر ژن با نرمافزار BioEdit v. 7.0.9.0 (37) ویراستاری و خوانشهای پیشرو و معکوس با نرمافزار DNA Baser Sequence Assembeler v4 (www.DnaBaser.com) مونتاژ شدند. توالیها با الگوریتم BLASTn و تجزیهوتحلیل تبارشناسی (الگوریتم درستنمایی بیشینه) با توالیهای مربوط به سویههای تیپ یا شناختهشده با نرمافزار MEGA 6 (38) مقایسه شدند.
نتایج.
در پژوهش حاضر، 40 نمونه از 9 گونه گیاه زینتی با نشانههای پوسیدگی ریشه، لکهبرگی و شانکر ساقه از مناظر شهری اهواز جمعآوری شدند و پساز کشت روی PDA، 12 جدایۀ قارچی متعلق به خانوادۀ Chaetomiaceae به دست آمدند (جدول 1). پساز بررسیهای ریختشناسی و تبارشناسی مولکولی (شکل 1)، جدایهها در سطح گونه شناسایی شدند و شامل گونههای Chaetomium olivaceum، C. ascotrichoides، C. globosum، C. rectangulareوAmesia atrobrunnea بودند. جزئیات شناسایی این گونهها و شرح ریختشناسی آنها در ادامه به تفکیک آورده شده است.
بررسی مولکولی جدایههای موردمطالعه: واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از جفت آغازگر عمومی ITS-F و NL4-Rبرای تکثیر نواحی ITS و بخشهایی از 28S(D1/D2) به تولید قطعههای تکثیری حدود 1200 جفت بازی برای تمام جدایهها منجر شد. تکثیر بخشهایی از ژن tub2 با استفاده از جفت آغازگرهای T1 و Btub4Rd به ظهور باندهای حدود 700 جفت بازی برای جدایههای ChaetomiumوAmesia در ژل آگارز منجر شد. توالیهای تولیدشده در مطالعۀ حاضر با شمارههای دسترسی یادشده در جدول 2 در بانک ژن NCBI ثبت شدند. یک بررسی تبارشناسی مبتنی بر ناحیۀ tub2 و با استفاده از الگوریتم درستنمایی بیشینه انجام شد (شکل 1) که در آن، گونههای بررسیشده با سویههای تیپ یا شناختهشدۀ خود همراه و ازنظر تبارشناسی از سایر گونهها متمایز شدند.
بررسی ریختشناسی و مولکولی گونههای بررسیشده
1- گونۀ Chaetomium olivaceum Cooke & Ellis, Grevillea 6(39): 96(1878).
1-1- ریختشناسی گونۀ C. olivaceum (جدایۀ SCUA-C1) (شکل 2): قطر پرگنه روی PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد پساز هشت روز برابر 49 میلیمتر است. در مراحل اولیۀ رشد، پرگنه در سطح رویی تشتکهای پتری به رنگ کرم روشن با حاشیۀ بیرنگ و منظم است و با افزایش سن به رنگ قهوهای تیره در مرکز و حاشیۀ منظم به رنگ کرم مشاهده میشود. میسلیومها بهشکل کرکی و بیرنگ و آسکوکارپها بهسمت مرکز بهطور فشردهتر رشد میکنند. موهای اطراف آسکوکارپها در محیط PDA به رنگ خاکستری مایل به زیتونی هستند. سطح زیرین پرگنه به رنگ قهوهای تیره با حاشیۀ روشن است.
آسکوکارپها بهشکل انفرادی یا تجمع زنجیرمانند در سطح محیط تشکیل میشوند و رنگ آنها با افزایش سن تیرهتر میشود. آسکوکارپها عمدتاً تخممرغیشکل و به رنگ قهوهای تیره با موهای فراوان در دو سمت طول خود مشاهده میشوند؛ ابعاد آسکوکارپها 304-152(-103)×(407-)347-212(-6/186) میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 43/44 ±240×29/55±85/280 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 99/252-46/227×73/296-97/246 میکرومتر قرار دارند. آسکوسپورها به رنگ قهوهای روشن، کروی تا لیموییشکل و در دو سمت تخت هستند؛ اندازۀ آنها (64/12)-24/11-62/5×33/14-83/9 میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 61/1±01/9×32/1±34/12 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 46/9-56/8×71/12-97/11 میکرومتر قرار دارند.
1-2- نتایج مولکولی گونۀ C. olivaceum: نتایج جستجویبلاست جدایۀSCUA-C1C. olivaceumنشان دادند توالی ITS این جدایه با سویههای شناختهشدهای از گونههای C. cucumericola، C. globosum و C. olivaceum دارای 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری tub2 نیز مشخص کرد جدایههای مطالعهشده (SCUA-C1، SCUA-L2 و SCUA-S8) با سویۀ شناختهشدۀ C. olivaceumCGMCC 3.12878 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارند. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایههای مطالعهشده با سویههای شناختهشدۀ C. olivaceumCGMCC 3.12878 و C. olivaceumCGMCC 3.9465 خوشهبندی شدند و شاخهای تکاملی با ارزش بوتاستراپ 100 درصد ایجاد کردند.
شکل 1- درخت تبارشناسی جدایههای بررسی و انتخابشده از بانک ژن که در تجزیهوتحلیل درستنمایی بیشینه بر اساس توالی tub2 با استفاده از مدل K2+G+I به دست آمده است. درصد تکرار شاخههای تکاملی در 1000 بار نمونهگیری کاذب (بوتاستراپ) در محل ریشۀ شاخۀ تکاملی درج شده است. نمونههای بررسیشده با دایرۀ توپر نشان داده شدهاند. درخت تبارشناسی با گونۀ Humicola grisea ریشهدار شده است.
جدول 2- شمارههای دسترسی توالیهای نوکلئوتیدی ثبتشده در بانک ژن NCBI مربوط به جدایههای بررسیشده
|
شمارۀ دسترسی توالیها در بانک ژن |
نام جدایه |
نام گونه |
||
|
tub2 |
28S |
ITS |
||
|
MN417754 |
MN402716 |
MN402762 |
SCUA-K3 |
Chaetomium rectangulare |
|
MN417746 |
- |
- |
SCUA-CO1 |
Amesia atrobrunnea |
|
MN417750 |
MN402714 |
MN402760 |
SCUA-C1 |
C. olivaceum |
|
MN417753 |
- |
- |
SCUA-S8 |
C. olivaceum |
|
MN417751 |
- |
- |
SCUA-L2 |
C. olivaceum |
|
MN417747 |
- |
- |
SCUA-C3 |
C. globosum |
|
MN417749 |
MN402717 |
MN402763 |
SCUA-Neae |
C. globosum |
|
MN417748 |
MN402715 |
MN402761 |
SCUA-D1 |
C. globosum |
|
MN417755 |
- |
- |
SCUA-AT10 |
C. ascotrichoides |
شکل 2- ریختشناسی گونۀ C. olivaceum (جدایۀ SCUA-C1)؛ A. همراه با نشانههای لکهبرگی و سوختگی مشاهدهشده در گیاه Zinnia elegans، B. پرگنۀ هشتروزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکوکارپ، D. آسکوسپورها
2- گونۀ Chaetomium ascotrichoidesCalviello, Revta Mus. argent. Cienc. nat., B. Aires, Bot.: 372 (1972).
2-1- ریختشناسی گونۀ C. ascotrichoides (جدایۀ SCUA-AT10) (شکل 3): قطر پرگنهها روی PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد بهمدت هشت روز برابر 40 میلی متر است. در مراحل اولیۀ رشد، پرگنه در سطح رویی تشتکهای پتری به رنگ کرم روشن با حاشیۀ منظم است و با افزایش سن به رنگ کرم تیره با حاشیۀ نامنظم مشاهده میشود. آسکوکارپها بهسمت مرکز بهطورفشردهتر ایجاد میشوند. موهای اطراف آسکوکارپها در محیط PDA به رنگ زیتونی هستند. پرگنه در سطح زیرین تشتک پتری به رنگ زرد با حاشیۀ بیرنگ و نامنظم مشاهده می شود. میسلیومها بهشکل کرکی و سفیدرنگ رشد میکنند.
آسکوکارپها بهشکل انفرادی یا تجمع زنجیرمانند در سطح محیطکشت تشکیل میشوند و رنگ آنها با افزایش سن تیرهتر میشود. آسکوکارپها عمدتاً تخممرغیشکل هستند، اما اشکال کروی نیز بین آنها دیده میشوند و رنگ آنها قهوهای تیره با موهای فراوان در یک انتهای خود است. ابعاد آسکوکارپها (315-)250–164(-130)×(378-)320–184(-152) میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 69/38±38/213×75/55±08/262 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 27/224–50/202×76/277–40/246 میکرومتر قرار دارند. آسکوسپورها به رنگ قهوهای روشن تا قهوهای تیره، کروی تا بیضوی با دیوارۀ ضخیم هستند و اندازۀ آنها 83/9-43/8×64/12-83/9 میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 62/0±006/9×43/0± 14/11 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 20/9-80/8×28/11-001/11 میکرومتر قرار دارند.
2-2- نتایج مولکولی گونۀ C. ascotrichoides:نتایج جستجوی بلاست جدایۀ C. ascotrichoides SCUA-AT10 نشان دادند توالی تکثیری tub2 این جدایه با سویههای تایپ شناختهشده از گونههای C. ascotrichoides و C. madrasense دارای 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایۀ C. ascotrichoides SCUA-AT10 با سویههای تایپ C. ascotrichoides CGMCC 311378، C. ascotrichoides CBS 11083 و C. madrasenseCGMCC 312880 خوشهبندی شد و یک شاخۀ تکاملی با ارزش بوتاستراپ 100 درصد ایجاد کردند. بررسیهای ریختشناسی این جدایه (داشتن موهای صاف در اطراف آسکوکارپ) مشخص کرد جدایۀ C. ascotrichoides SCUA-AT10 از سویۀ تیپ C. madrasenseCGMCC 312880 متمایز است.
3- گونۀ Chaetomium globosumKunze ex Fr., Systema Mycologicum 3: 255 (1829) .
3-1- ریختشناسی گونۀC. globosum (جدایۀSCUA-D1)(شکل 4): قطر پرگنهها روی محیط PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد بهمدت هشت روز برابر 84 میلیمتر است. در مراحل اولیۀ رشد، پرگنه در سطح رویی تشتکهای پتری به رنگ کرم روشن با حاشیۀ منظم است و با افزایش سن به رنگ قهوهای روشن تا قهوهای تیره با حاشیۀ بیرنگ و منظم مشاهده میشود. آسکوکارپها از مرکز بهسمت حاشیۀ پرگنه بهطور فشردهتر ایجاد میشوند. موهای اطراف آسکوکارپها در محیط PDA به رنگ خاکستری است. پرگنه در سطح زیرین تشتک پتری به رنگ نارنجی تا قهوهای روشن دیده میشود. میسلیومها بهشکل کرکی و بیرنگ رشد میکنند.
آسکوکارپها بهشکل انفرادی یا تجمع زنجیرمانند در سطح محیطکشت تشکیل میشوند و رنگ آنها با افزایش سن تیرهتر میشود. آسکوکارپها به رنگ قهوهای تیره و بهشکل کروی یا نیمهکروی با موهای فراوان و فنریشکل در اطراف خود مشاهده میشوند. ابعاد آسکوکارپها (233-)198-5/120(-4/81)×(281-)228-152(-6/108) میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 04/27±60/163×60/28±67/195 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 37/171–84/155×89/203–46/187 میکرومتر قرار دارند.آسکوسپورها به رنگ قهوهای روشن، کروی یا لیموییشکل با دیوارۀ ضخیم هستند و اندازۀ آنها 71/8-9/5×24/11-43/8 میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 51/0±13/8× 79/0±32/10 میکرومتر(بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 28/8-99/7×55/10-10/10 میکرومتر قرار دارند.
شکل 3- ریختشناسی گونۀ C. ascotrichoides (جدایۀ SCUA-AT10)؛ A.همراه با نشانههای پوسیدگی ساقۀ مشاهدهشده در گیاه Petunia hybrida، B. پرگنۀ هشتروزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکوکارپ. D. آسکوسپورها
3-2- نتایج مولکولی گونۀ C. globosum: نتایج جستجوی بلاست جدایۀ C. globosumSCUA-D1 نشان دادند توالی ITS این جدایه دارای 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی با سویۀ شناختهشدۀ C. globosumCBS 160.62است. جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری tub2 نیز مشخص کرد جدایههای مطالعهشده (SCUA-D1،SCUA-C3 و SCUA-Neae) با سویههای شناختهشده از گونۀ C. globosum دارای 98 تا 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، این جدایهها (SCUA-D1، SCUA-C3 و SCUA-Neae) با سویههای C. globosumCBS 160.62 و C. globosum ChL-K14 خوشهبندی شدند و شاخۀ تکاملی معتبری با ارزش بوتاستراپ 98 درصد ایجاد کردند.
شکل 4- ریختشناسی گونۀ C. globosum (جدایۀ SCUA-D1)؛ A. همراه با نشانههای لکهبرگی مشاهدهشده در گیاه Zinnia elegans، B. پرگنۀ هشتروزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکواسپورها، D. آسکوکارپ
4-گونۀChaetomium rectangulareAsgari & Zare, Mycologia 103 (4): 872 (2011).
4.-1- ریختشناسی گونۀ C. rectangulare (جدایۀSCUA-K3) (شکل 5): قطر پرگنهها روی محیطکشت PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد بهمدت هشت روز برابر 55 میلیمتر است. رنگ پرگنه در سطح رویی تشتکهای پتری زرد با حاشیۀسفید و منظم و در سطح پشتی به رنگ زرد با حاشیۀ بیرنگ و منظم مشاهده میشود. آسکوکارپها پساز حدود سه هفته در سطح محیط تشکیل میشوند.
اندامهایی که شبیه آسکوکارپ و بدون آسکوسپور هستند (شبهآسکوکارپها) بهشکل انفرادی پساز حدود سه هفته در سطح محیط تشکیل میشوند. شبهآسکوکارپها به رنگ قهوهای تیره و شکل کروی یا نیمهکروی با موهای صاف و ضخیم در اطراف خود مشاهده میشوند. ابعاد شبهآسکوکارپ (35/53-)88/41-94/20×(35/52-)88/41-41/31(-94/20) میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 87/8±72/31×1/9±42/38 میکرومتر (بر اساس 50 عدد شبهآسکوکارپ) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 24/34-20/29×02/41-82/35 میکرومتر قرار دارند. شبهآسکوکارپهای عقیم و بدون آسکوسپور تشکیل میشود..
4-2- نتایج مولکولی گونۀ C. rectangulare:نتایج جستجوی بلاست جدایۀC. rectangulare SCUA-K3 نشان دادند توالی ITS این جدایه با سویههای شناختهشدۀ C. rectangulareIRAN1641C و C. rectangulareCBS 126778 دارای 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی است. جستجوی بلاست مبتنی بر توالی تکثیری tub2 این جدایه مشخص کرد با سویۀ شناختهشدهای از گونۀ C. rectangulareChL-K17 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایۀC. rectangulare SCUA-K3 با سویههای C. rectangulareChL-A34وC. rectangulare ChL-K17خوشهبندی شدند و یک شاخۀ تکاملی معتبر با ارزش بوتاستراپ 100 درصد ایجاد کردند.
شکل 5- ریختشناسی گونۀ C. rectangulare(جدایۀ SCUA-K3)؛ A. همراه با نشانههای لکهبرگی مشاهدهشده در گیاه Dracaena Compacta، B. پرگنۀ هشتروزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C و D. آسکوکارپ
5- گونۀAmesia atrobrunnea(L.M. Ames) X. Wei Wang & Samson, Studies in Mycology 84: 158 (2016)
5-1- ریختشناسی گونۀ A. atrobrunnea (جدایۀ SCUA-CO1)(شکل 6): قطر پرگنهها روی محیطکشت PDA در شرایط تاریکی مطلق و دمای 5/0±28 درجۀ سانتیگراد بهمدت هشت روز برابر 41 میلیمتر است. در مراحل اولیۀ رشد، رنگ پرگنه در سطح رویی تشتکهای پتری سفید با حاشیۀ بیرنگ و منظم است و با افزایش سن به رنگ قهوهای مایل به زیتونی با حاشیۀ سفید و منظم مشاهده میشود.
آسکوکارپها در مرکز بهطور فشردهتر ایجاد میشوند و موهای اطراف آنها قهوهایرنگ هستند. پرگنه در سطح زیرین تشتک پتری به رنگ زیتونی دیده میشود. میسلیومها به رنگ سفید رشد میکنند. آسکوکارپها بهشکل انفرادی یا تجمع زنجیرمانند در سطح یا فرورفته در محیط تشکیل میشوند و رنگ آنها با افزایش سن تیرهتر میشود. آسکوکارپها به رنگ قهوهای تیره و بهشکل کروی یا نیمهکروی با موهای صاف و ضخیم در اطراف خود مشاهده میشوند. ابعاد آسکوکارپها 126-70(-63)×(155-)140-96(-87) میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 04/18±21/95×8/15±07/115 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوکارپ) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 34/100-09/90×51/119-62/110 میکرومتر قرار دارند. آسکوسپورها به رنگ قهوهای روشن تا قهوهای تیره و بادامیشکل با دیوارۀ ضخیم هستند و اندازۀ آنها (86/7-)62/5-21/4×24/11-7 میکرومتر و میانگین اندازهگیریها 40/0±58/5×94/0±41/9 میکرومتر (بر اساس 50 عدد آسکوسپور) است و 95 درصد اندازهگیریها در بازۀ اطمینان 69/5-47/5×67/9-16/9 میکرومتر قرار دارند.
5-2- نتایج مولکولی گونۀA. atrobrunnea: نتایج جستجوی بلاست جدایۀA. atrobrunneaSCUA-CO1 نشان دادند توالی تکثیری ناحیۀ tub2 این جدایه با سویههای شناختهشدۀ A. atrobrunneaCBS 379.66 و CBS 250.75 A. atrobrunnea بهترتیب 98 و 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت تبارشناسی ترسیمی مبتنی بر ناحیۀ tub2 (شکل 1)، جدایۀ A. atrobrunneaSCUA-CO1 با سویۀ تایپ CBS 379.66 A. atrobrunnea خوشهبندی شد و یک شاخۀ تکاملی معتبر با ارزش 100 درصد ایجاد کرد.
شکل 6- ریختشناسی گونۀ A. atrobrunnea (جدایۀ SCUA-CO1)؛ A. همراه نشانههای لکهبرگی مشاهدهشده در گیاه Dahlia sp.، B. پرگنۀ هشتروزه روی PDA (سطح رویی و پشتی)، C. آسکوکارپ، D. آسکواسپورها
بحث
در مطالعۀ حاضر، گونههای Chaetomium olivaceum، C. ascotrichoides، C. globosum، C. rectangulareو Amesia atrobrunnea از روی گیاهان زینتی علفی جداسازی و شناسایی شدند. گونۀ C. olivaceumرانخستینبار کوک[xiii] و الیس[xiv] (39) توصیف کردند؛ این گونه تاکنون از کود گاو (هند)، کود شتر، خاک (چین) (24) و کنجد (Sesamum indicum) در ایران (40) جداسازی و شناسایی شده است. گونۀ C. ascotrichoides را نخستینبار کالویلو و همکاران (1972) توصیف کردند (24)؛ پیشازآن، این گونه با نامهای C. gibberosporum، C. madrasense وC. heterosporum معرفی شده بود. گونۀ یادشده از پنبه (آرژانتین)، پشم گوسفند، گوسفند مرده (چین) و خاک (اسرائیل) گزارش شده است (24). گونۀ C. globosum را نخستینبار کنز در 1829 توصیف کرد (24). گونۀ یادشده از کمپوست (آلمان)، کتاب کپکزده (هلند)، کاغذ، خاک رس و پنبه (آمریکا)، باغ گیاهشناسی (لهستان) و ساقۀ ازبینرفتۀ گیاه هرز سازو (مجارستان) جداسازی شده است (24)؛ همچنین در ایران از گیاه زردتاغ (Haloxylon ammodendron)، سفیدتاغ (Haloxylon persicum) در گنبد و سبزوار، ذرت (Zea mays) در کرج، ساری و مغان، سویا (Glycine max) و پنبه (Gossypium hirsutum) گزارش شده است (40). گونۀ C. rectangulare را نخستینبار عسگری و زارع (23) از دانۀ گندم (Triticum aestivum) در هادیشهر (آذربایجان غربی) و برگهای جو (Hordeum vulgare) در سلماس (آذربایجان شرقی) گزارش و توصیف کردند؛ این گونه از کود حیوانی در چین نیز جداسازی شده است (24). گونۀ Amesia atrobrunnea را نخستینبار وانگ و همکاران (27) بیمارگر انسانی معرفی کردند. چندین جدایه از این گونه باعث عفونت سیستمیک و عمیق در انسان میشوند. نام پیشین این گونه، C. atrobrunneum L.M. Amesاست که از مواد و تجهیزات نظامی گزارش شده است (41)؛ همچنین، این گونه از مواد کپکزده و هوا در ایسلند و هند (27) و از گیاه جو (Hordeum vulgare) در آذربایجان شرقی ایران جداسازی شده است (40).
نتیجهگیری
همراهی گونۀ C. olivaceum روی گیاهان زینتی آهار، لادن و جعفری، گونۀ C. ascotrichoides روی گیاه زینتی اطلسی، گونۀ C. globosum روی گیاهان زینتی آهار و اختر، گونۀ C. rectangulare روی گیاه زینتی کمپکت و گونۀ A. atrobrunnea روی گیاه زینتی کوکب برای نخستینبار در مطالعۀ حاضر گزارش شد؛ همچنین بر اساس دانش ما، این نخستین گزارش از گونۀ C. ascotrichoides در ایران است. شناسایی و توصیف گونههای دو جنس Chaetomium و Amesia از روی گیاهان موردبررسی به شناسایی بیشتر میکوبیوتای ایران و میزبانهای آنها کمک میکند.
سپاسگزاری
از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز برای حمایت مالی از پژوهش حاضر سپاسگزاری میشود.
)