شناسایی مولکولی سویۀ بومی ترائوستوکیتریوم 1-71 و تعیین کمی و کیفی تولید روغن و اسکوالن در آن

مقدمه

اسکوالن، هیدروکربن تری‌ترپن غیراشباع با شش پیوند دوگانه و کلید پیش‌ساز کلسترول، اسید صفراوی و استروئیدها در گیاهان و جانوران است. این ترکیب عامل آنتی‌اکسیدانی است که سلول‌ها را در برابر رادیکال‌های آزاد و گونه‌های اکسیژن فعال محافظت می‌کند (1). اسکوالن به‌عنوان عامل مرطوب‌کننده و نرم‌کننده در صنعت آرایشی عمل می‌کند و کاربرد گسترده‌ای در بخش‌های پزشکی و داروسازی دارد. این ترکیب بازدارندۀ شیمیایی مؤثر تحریک‌کننده‌های توموری رودۀ بزرگ، شش و پوست است (2). اسکوالن عامل ضدباکتری و ضدقارچی است که عملکرد ایمنی بدن را به‌طور درخور توجهی افزایش می‌دهد و موجب کاهش سطح کلسترول خون می‌شود (3).

نتایج بررسی‌های دانشمندان نشان می‌دهند چربی‌های دارای اسیدهای چرب امگا 3 و 2 نه‌تنهابدن را در برابر بیماری‌های قلبی- عروقی حمایت می‌کنند، در کاهش دردهای آرتروزهای روماتیسمی، انواع میگرن و حفظ بدن در برابر سرطان و حتی کاهش برخی از انواع دیابت مفیدند (1). چربی‌های غیر اشباع مانع انباشته‌شدن پلاکت‌های خون در جدار شریان‌ها و مانع چسبنده‌شدن خون می‌شوند؛ درنتیجه از لخته‌شدن خون جلوگیری می‌کنند و مانع حملات قلبی می‌شوند (2). در مدل‌های حیوانی به‌نظر می‌رسد اسکوالن نقش مهمی در سلامت شبکیه بازی می‌کند.

در‌حال‌حاضر، ریزجلبک‌ها منابع بالقوۀ تولید اسکوالن شناخته می‌شوند. گزارش شده است جلبک سبز بوتریوکوکوس^[1]زمانی که در شرایط فتواوتوتروفیک کشت شود، اسکوالن تولید می‌کند (4)؛ باتوجه‌به محدودیت نور در چنین شرایطی، رسیدن به زیست‌تودۀ زیاد دشوار است و در‌نتیجه، چگالی سلولی زیاد ازنظر تجاری لازم است. از سویی، ریزجلبکی که بتواند به‌طور هتروتروفیکی رشد کند احتیاجی به نور ندارد و به چگالی زیاد سلولی می‌رسد؛ درنتیجه، زمانی که در مقیاس‌های تجاری کشت شود بهره‌وری خوبی را نشان می‌دهد.

ترائوستوکیتریدها^[2] گروهی از یوکاریوت‌های آغازین دریازی هستند که به‌طور گسترده در جنگل‌های مانگرو زندگی می‌کنند و رشد خوبی در شرایط هتروتروفیک دارند. درحال‌حاضر، چنین ریزموجوداتی برای تولید روغن‌های امگا 3 حاوی اسیدهای چرب غیراشباع استفاده می‌شوند و برخی گونه‌ها مقادیر زیادی اسکوالن تولید می‌کنند. جنس ترائوستوکیتریوم آغازی هتروتروفیکی است که به‌عنوان منبع اسکوالن بررسی شده است. مخمر‌های بررسی‌شده از جنس سودوزیما^[3] نیز برای تولید اسکوالن استفاده شده‌اند و میزان تولید اسکوالن در این سویه‌ها برابر 32/70 میلی‌گرم‌بر‌لیتر گزارش شده است (5). در پژوهش حاضر، برای نخستین‌بار در خاورمیانه به بررسی سویه‌ای ازآغازیان تک‌سلولی دریازی از خانوادۀ ترائوستوکیتریدها و جنس ترائوستوکیتریوم به‌عنوان سویه‌ای با پتانسیل زیاد تولید اسکوالن از سواحل جنوبی ایران به‌منظور تعیین میزان کمّی و کیفی تولید اسکوالن پرداخته شد.

مواد و روش‌ها

محیط‌کشت‌ها:در پژوهش حاضر، سویۀ ترائوستوکیتریوم 1-71 که فکرت^[4] و شاکری در سال 1392 آن را از سواحل جنوبی ایران نمونه‌برداری کرده‌اند (6) در محیط‌کشت جامد GYP با ترکیب 20 گرم‌برلیتر گلوکز، 10 گرم‌برلیتر پپتون، 10 گرم‌برلیتر عصارۀ مخمر، 15 گرم‌برلیتر آگار، 3/0 گرم‌برلیتر آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین و 50 درصد آب دریا فعال شد؛ سپس برای تولید روغن در محیط‌کشت مایع شامل 20 گرم‌برلیتر گلوکز، 5 گرم‌برلیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌برلیتر پپتون و 20 درصد آب دریا کشت شد (7).

بررسی ژن18S rRNA:DNA ژنومی با استفاده از کیت استخراج DNA و با‌توجه‌به دستورعمل کیت (شرکت سیناژن) استخراج شد. آغازگرهای رفت و برگشت T18S1F و T18S5R برای تکثیر ژن استفاده شدند (8) (جدول1). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در 30 چرخه با دمای اتصال 62 درجۀ سانتی‌گراد انجام و محصول آن روی ژل آگارز 1 درصد برده شد. باند مدنظر توسط دستورعمل مربوط به کیت استخراج از ژل شرکت یکتا تجهیز آزما استخراج و برای تعیین توالی فرستاده شد.

جدول 1- آغازگرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر

تعیینوزنخشکسلولی:10 میلی‎لیتر از محیط‌کشت مایع به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور‌در‌دقیقه سانتریفیوژ و سپس محلول رویی دور ریخته شد. رسوب سلولی حاصل به‌مدت 48 ساعت در آونی با دمای 80 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد تا خشک شود و درنهایت، تودۀ خشک سلولی وزن شد.

استخراجروغن ازوزنخشک:استخراج روغن از زیست‌تودۀ خشک سلولی طبق پروتکل بلایت^[5] و دایر^[6] با کمی تغییرات انجام شد (9). طبق این روش، مقدار مشخصی از زیست‌تودۀ خشک سلولی به فالکون منتقل و 2 میلی‌لیتر آب مقطر به آن افزوده شد. خرد‌شدن زیست‌تودۀ خشک سلولی با دستگاه آلتراسونیک^[7] (مدل UP200S) به‌مدت 5 دقیقه انجام شد؛ سپس، 5/2 میلی‌لیتر محلول کلروفرم و 5 میلی‌لیتر محلول متانول به لوله اضافه و خرد‌شدن دیوارۀ سلولی به‌مدت 4 دقیقه با دستگاه همگن‌ساز و آلتراسونیک انجام شد، دوباره مقدار 5/2 میلی‌لیتر آب مقطر و 5/2 میلی‌لیتر کلروفرم اضافه و به دنبال آن، همگن‌سازی و ورتکس به‌مدت 2 دقیقه انجام شد. نمونه به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 4000 دور‌در‌دقیقه سانتریفیوژ شد و به دنبال آن، دو فاز تشکیل شد. لایۀ پایین (فاز آلی) به فالکون تمیز دیگری که قبلاً وزن شده بود منتقل شد، عمل تبخیر حلال کلروفرم انجام و وزن روغن تولیدی توسط سویۀ مدنظر محاسبه شد. روغن تولیدی به‌منظور نگهداری و انجام سایر تحلیل‌ها به فریزر منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد منتقل شد (9).

.تجزیه‌وتحلیل کروماتوگرافی لایه‌نازک (TLC): کروماتوگرافی لایه‌نازک^[8] (TLC)، کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد^[9] (HPLC) و کروماتوگرافی گازی^[10] (GC) از مهم‌ترین روش‌های استفاده‌شده برای تجزیه‌وتحلیل اسیدهای چرب هستند (10)؛ ازاین‌رو در پژوهش حاضر، روش‌های کروماتوگرافی مایع باکارایی زیاد و کروماتوگرافی لایه‌نازک برای بررسی تولید اسکوالن استفاده شدند. سویه‌ در 100 میلی‌لیتر محیط‌کشت مایع GYP درون ارلنی با شرایط استریل تلقیح و به‌مدت 4 روز در شیکرانکوباتوری با دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد و 140 دور‌در‌دقیقه گرماگذاری شد و پس‌از‌آن، اسلاید میکروسکوپی از کشت مایع تهیه شد تا خلوص سویۀ کشت‌شده بررسی شود؛ سپس محیط‌کشت به‌مدت 10 دقیقه در 4000 دور‌در‌دقیقه سانتریفیوژ شد و درنهایت، فاز رویی دور ریخته شد. فاز زیرین که از زیست‌تودۀ سلولی تشکیل شده بود به‌مدت 24 ساعت درون آون 60 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد و سپس وزن خشک سلولی آن اندازه‌گیری شد؛ پس‌از‌آن، روغن سلولی با حلال‌های کلروفرم و متانول استخراج شد (7 و 9). کاغذ کروماتوگرافی لایه‌نازک (TLC) با مشخصات Spherical silica gel 60; Wako Pure Chemicals در ابعاد 5/1 در 8 سانتی‌متر بریده شد و به میزان 10 میکرولیتر روغن به‌شکل لکه‌ای گرد روی آن قرار داده شد. به‌منظور یافتن لکۀ اسکوالن از اسکوالن استاندارد (شرکت سیگما) برای شاهد استفاده شد. کاغذهای TLC به‌مدت 30 دقیقه درون بشر حاوی حلال‌های کلروفرم و متانول (1:9) قرار داده شدند (10) و در بشر با پارافیلم بسته شد تا حلال تبخیر نشود. پس‌از‌ گذشت مدت زمان یادشده، کاغذها به‌آرامی با پنس از درون بشر برداشته شدند و روی آنها سولفوریک‌اسید 20 درصد اسپری شد؛ درنهایت، کاغذها به‌مدت 30 دقیقه درون آون 60 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند تا رنگ بگیرند. لکۀ اسکوالن باکاغذ شاهد حاوی اسکوالن استاندارد شناسایی و Rf آن طبق رابطۀ زیر اندازه‌گیری شد (11).

 Retention factore=

 فاصلۀ بین باند ظاهرشده با نقطۀ شروع نمونه (میلی‌متر)

 فاصله‌ای که فاز مایع از سطح حلال پیموده است (میلی‌متر)

 فاصلۀ بین سطح حلال و نقطۀ شروع (میلی‌متر)

باتوجه‌به میزان Rf و لکۀ اسکوالن، تولید اسکوالن به‌طور کیفی بررسی و تأیید شد. Rf اسکوالن در پژوهش حاضر برابر 97/0 اندازه‌گیری شد.

صابونی‌کردن روغن استخراجی و استخراج اسکوالن برای تجزیه‌وتحلیل HPLC: ازآنجاکه اسکوالن از معدود اسیدهای چربی است که صابونی نمی‌شوند، این ویژگی برای جداسازی اسکوالن از دیگر اسیدهای چرب استفاده شد. به این منظور، 50 میلی‌گرم از روغن استخراجی با 4 میلی‌لیتر محلول KOH اتانولی (11/0گرم پتاسیم‌هیدروکسید+4 میلی‌لیتر اتانول( مخلوط شد؛ برای آماده‌سازی محلول KOH اتانولی باید ابتدا KOH با میزان بسیار اندکی آب حل و درنهایت، اتانول به آن افزوده شود. نمونه به‌مدت 30 ثانیه ورتکس و به‌مدت 1 ساعت در حمام آب 90 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد؛ پس‌از‌آن، نمونه‌ برای چند ثانیه روی یخ قرار داده شد تا سرد شود و سپس 2 میلی‌لیتر هگزان همراه با 5/0 میلی‌لیتر آب مقطر و 5/0 میلی‌لیتر اتانول به آن افزوده ‌شد. نمونه چند ثانیه با دست تکان و سپس در مکان ثابتی قرار داده شد تا دو فاز تشکیل شود. اسکوالن در حلال هگزان حل می‌شود و به همراه هگزان فاز رویی محلول را تشکیل می‌دهد؛ فاز رویی تشکیل‌شده برداشته و به لولۀ آزمایش تمیزی منتقل شد. لولۀ آزمایش حاوی هگزان به‌مدت یک روز درون آون 60 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد تا هگزان آن به‌طور کامل بخار شود و اسکوالن باقی بماند؛ سپس 1 میلی‌لیتر محلول استونیتریل‌تتراهیدروفوران (1:9) به نمونه اضافه و نمونه 30 ثانیه ورتکس شد و سپس از فیلتر 2/0 میکرون عبور داده شد. نمونه‌ها به‌منظور تزریق به HPLC در فریزر منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند (12). دستگاه HPLC استفاده‌شده در پژوهش حاضر، Agilent, 1100 Series ساخت کشورآمریکا با ستون ZOR Bax,Sb-C18 (4.6×250mm, 5-micron) بود. اسکوالن در طول موج 210 نانومتر ردیابی و میزان جریان دستگاه 1 میلی‌متر‌بر‌دقیقه با حجم تزریق 10 میکرولیتر و دمای ستون 30 درجۀ سانتی‌گراد بود. فاز متحرک ستون از محلول استونیتریل/تتراهیدروفوران (20:80) تشکیل شده بود و اسکوالن استاندارد به‌عنوان شاهد برای یافتن زمان خارج‌شدن اسکوالن از دستگاه استفاده شد.

نتایج.

.بررسی ریخت‌شناختی سویۀ ترائوستوکیتریوم 1-71: سویۀ ترائوستوکیتریوم 1-71 بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناختی و فیزیولوژیکی بررسی شد. این سویه روی محیط‌کشت تخصصی GYP حاوی آنتی‌بیوتیک کشت شد و سلول‌های کشت‌‌شده پس از 2 روز گرماگذاری با میکروسکوپ نوری بررسی شدند. نتایج مطالعه‌های میکروسکوپی نشان دادند این سویه دیوارۀ پلی‌ساکاریدی کاملاً مشخصی دارد و اندازۀ سلول‌ها بین 5 تا 25 میکرومتر است که از ویژگی‌های بارز خانوادۀ ترائوستوکیتریدها است (شکل 1).

شکل 1- A. سویۀ 1-71 در روز چهارم پس‌از کشت (a. سلول کاملاً گرد با دیوارۀ پلی‌ساکاریدی مشخص، b. گرانول‌های چربی درون‌سلولی)، B. c. سلول درحال تقسیم پی‌درپی و تشکیل کلاستر سلولی و زئوسپورانژیوم

.تولید زیست‌توده و روغن توسط سویۀ ترائوستوکیتریوم1-71:سویۀ ترائوستوکیتریومبه‌منظور تولید روغن در محیط‌کشت مایع اختصاصی کشت و زیست‌توده و روغن تولیدی آن اندازه‌گیری شد. نتایج نشان دادند سویۀ 1-71 در روز چهارم پس‌از کشت، میزان 12/4 و 25/1 گرم‌برلیتر به‌ترتیب زیست‌توده و روغن تولید می‌کند (شکل 2).

شکل 2- میزان زیست‌توده (بیومس) و روغن تولیدی توسط سویۀ 1-71

بررسی تولید زیست‌توده و روغن در زمان‌های متفاوت پس‌از کشت:تولید زیست‌توده و روغن در سویۀ 1-71 طی روزهای اول تا پنجم کشت بررسی شد. نتایج نشان دادند این سویه در روزهای اول، دوم، سوم، چهارم و پنجم به‌ترتیب 7/1، 8/2، 9/3، 12/4 و 8/3 گرم‌برلیتر زیست‌توده و 4/0، 8/0، 1، 25/1 و 22/1 گرم‌برلیتر روغن تولید می‌کند (شکل 3).

درصد روغن تولیدی به زیست‌توده در شکل 4 دیده می‌شود. نتایج نشان دادند بیشترین درصد روغن در روز پنجم پس‌از کشت و به میزان 32 درصد است.

شکل 3- میزان روغن و زیست‌تودۀ (بیومس) تولیدی توسط سویۀ 1-71 در زمان‌های متفاوت پس‌از کشت

شکل 4- درصد روغن تولیدی در روز اول تا پنجم پس‌از کشت

استخراج روغن و انجام تجزیه‌و‌تحلیل TLC: روغن استخراج‌شده در روز چهارم پس‌از کشت به‌منظور بررسی کیفی میزان تولید اسکوالن به‌وسیلۀ تجزیه‌و‌تحلیلTLC بررسی شد. لکۀ اسکوالن به‌وسیلۀ کاغذ شاهد حاوی اسکوالن استاندارد شناسایی و Rf اندازه‌گیری شد. باتوجه‌به میزان Rf و لکۀ اسکوالن، میزان تولید اسکوالن توسط سویۀ 1-71 به‌طور کیفی شناسایی و بررسی شد. Rf اسکوالن در پژوهش حاضر 97/0اندازه‌گیری شد و با مشاهدۀ لکۀ اسکوالن مشخص شد این سویه در روغن خود حاوی اسکوالن است (شکل 5).

شکل 5- کروماتوگرافی لایه‌نازک روغن استخراجی از سویۀ 1-71

تجزیه‌وتحلیل HPLC: صابونی‌کردن روغن استخراجی و آماده‌سازی نمونه برای HPLC طبق روش یادشده انجام شد. نتایج نشان دادند پیک مربوط به اسکوالن در دقیقۀ 3/12 ظاهر می‌شود (شکل 6). با استفاده از منحنی استاندارد اسکوالن که با تزریق مقادیر متفاوت (5 تا 50 میکروگرم‌در‌لیتر) اسکوالن استاندارد به دستگاه به دست آمد (شکل 7) و سطح زیر منحنی به‌دست‌آمده از پیک اسکوالن در سویۀ ترائوستوکیتریوم 1-71، مقدار اسکوالن تولیدی توسط این سویه اندازه‌گیری شد. نتایج نشان دادند سویۀ1-71 در روز چهارم پس‌از کشت 6/74 میلی‌گرم‌بر‌لیتر اسکوالن تولید می‌کند (شکل 8).

شکل 6- پیک به‌دست‌آمده از اسکوالن استاندارد که در دقیقۀ 3/12 از ستون دستگاه خارج شده است.

شکل 7- منحنی استاندارد اسکوالن

شکل 8- پیک به‌دست‌آمده از اسکوالن تولید‌شده توسط سویۀ 1-71

شناسایی مولکولی و فیلوژنتیکی سویۀ ترائوستوکیتریوم 1-71: ژن 18S rRNA تکثیر شد، توالی آن به دست آمد و درنهایت، توالی آن با داده‌های بانک ژنی بلاست شد. نتایج نشان دادند توالی این ژن بیشترین شباهت با میزان 94 درصد را به همین ژن در جنس ترائوستوکیتریوم دارد. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Neighbor-joining و نرم‌افزار مگا 4 ترسیم شد.

شکل 9- درخت فیلوژنیکی سویۀ ترائوستوکیتریوم 1-71