جداسازی و شناسایی میکسوباکتر تولیدکنندۀ Myxovirescins،Myxalamides و Myxochromids از دستگاه گوارش کرم خاکی منطقۀ قائم‌شهر

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی و زیست فناوری میکروبی، دانشکده علوم وفناوری زیستی ، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

2 دانشیار گروه میکروبیولوژی و زیست‌فناوری میکروبی، دانشکده علوم وفناوری زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

3 کلکسیون میکروبی مرکز هلم هولتز، برانشویگ، آلمان

چکیده

مقدمه: میکسوباکترها باکتری‌های گرم منفی متعلق به گروه دلتا‌پروتئوباکترها با سلول‌های رویشی میله‌ای‌شکل و ارگانوتروف هستند که رفتار گروهی منحصر‌به‌فردی را نشان می‌دهند و در دستۀ باکتری‌های خاک قرار می‌گیرند.
مواد و روش‏‏ها: جدایۀ میکسوباکتریایی Mx18Zk از اندام گوارشی کرم خاکی منطقۀ قائم‌شهر مازندران جداسازی شد. به‌منظور بررسی فعالیت زیستی باکتری استخراج حلالی محیط‌کشت انجام و عصارۀ متانولی حاصل برای بررسی فعالیت زیستی علیه یازده نوع بیماری‌زای مختلف انسانی به روش رقت‌سازی در میکروپلیت بررسی شد. درنهایت، باقیماندۀ عصارۀ متانولی به‌وسیلۀ HPLC فراکسیون‌گیری و دوباره علیه بیماری‌زاهای حساس آزمون شد.
نتایج: جدایۀ Mx18Zk فعالیت ضد‌میکروبی درخور توجهی علیه باکتری‌های شاخص Staphylococcus aureus، Escherichia coliوChromobacterium violaceum نشان داد. بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی، توالی ژن 16S rDNA و درخت فیلوژنی باکتری نشان داد این جدایه با 100 درصد همولوژی به گونۀ Corallococcus macrosporus تعلق دارد. عصاره‌های فعال با دستگاه LC/MSمطالعه شدند و نتایج آنها با متابولیت‌های ثانویۀ میکسوباکتریایی شناخته‌شدۀ موجود در بانک اطلاعاتی Myxobase مرکز HZI مقایسه شدند. تجزیه‌وتحلیل LC/MSعصارۀ متانولی محیط‌کشت نشان‌دهندۀ حضور یون مولکولی آنتی‌بیوتیک‌های میکسوکرومید و همچنین میکسوویریسین و میکسالامید گزارش‌نشده در این گونه بود.
بحث و نتیجه‏گیری: بر اساس نتایج مشاهده‌شده سویۀ جداسازی‌شدهفعالیت ضدمیکروبی علیه باکتری‌های شاخص Staphylococcus aureus،  Escherichia coliو Chromobacterium violaceum نشان داد و با 100 درصد همولوژی به گونۀ macrosporusCorallococcus تعلق داشت. تجزیه‌وتحلیل LC/MSنشان‌دهندۀ حضور آنتی‌بیوتیک‌های گزارش‌نشدۀ میکسوویریسین و میکسالامید و همچنین میکسوکرومید شناخته‌شده در این گونه بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and Identification of a Myxobacterium Producing Myxovirescins, Myxalamides and Myxochromids from Intestinal Tract of earth Worm of Ghaemshahr County

نویسندگان [English]

  • Zahra Khosravi babadi 1
  • Gholam hossein Ebrahimipour 2
  • Joachim Wink 3
1 Ph.D student, Department of Microbiology & Microbial Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University GC, Tehran, Iran
2 Associate professor, Department of Microbiology & Microbial Biotechnology, Faculty of Life Sciences and Biotechnology, Shahid Beheshti University GC, Tehran, Iran
3 Microbial Strain Collection, Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Inhoffenstraße 7, D-38124 Braunschweig, Germany
چکیده [English]

Introduction: Myxobacteria are Gram-negative Deltaproteobacteria with rod-shaped vegetative cells, aerobic organotrophs that exhibit unique group behavior.
Materials and Methods:The myxobacterial strain Mx18Zk was isolated from intestinal tract of earth worm of GhaemshahrCounty in Mazandaranprovince and the extraction of the fermented broth culture was prepared with organic solvent extraction method. Methanol extract tested for potential antimicrobial activity against11 various human pathogens. Finally the rest of methanol extract fractionated by HPLC and tested again against sensitive pathogens.
Results: Strain Mx18Zk significantly inhibited growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Chromobacterium violaceum, therefore was used for further characterization. Analysis of morphological, biochemical, 16S rRNA gene sequence and phylogenetic tree indicated that this strain with 100 % homology belongs to the genus Corallococcus macrosporus . The methanol extract was subjected to HPLC fractionation against sensitive pathogens. The active extracts studied by LC-MS and its results compared by previously identified myxobacterial secondary metabolites deposited in Myxobase database of HZI. LC/MS analysis resulted in the identification of Myxochromids and unknown Myxovirescins, Myxalamides antibiotics in methanol extract of the strain Mx18Zk.
Discussion and conclusion: On the basis of results, isolated strain was active against Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Chromobacterium violaceum and100 % homology was belong to the genus Corallococcus macrosporus. LC/MS analysis resulted in the identification of Myxochromids and unknown Myxovirescins, Myxalamides antibiotics in methanol extract of the strain Mx18Zk.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Myxovirescins
  • Myxalamides and Myxochromids Antibiotics
  • Antimicrobial Activity
  • Metabolite Production

مقدمه.

ریزموجودات طیف وسیعی از مولکول‌های کوچک ساختاری را تولید می‌کنند که متابولیت‌های ثانویه نامیده می‌شوند. این مولکول‌ها که بر اساس تعریف بخشی از متابولیت‌های اولیه نیستند ارزش دارویی درخور توجهی دارند؛ برای نمونه، آنتی‌‌بیوتیک‌ها بخشی از متابولیت‌های ثانویه به شمار می‌روند (1 و 2). اگرچه این ترکیبات طبیعی برای سلامتی بشر مهم هستند عملکرد فیزیولوژیکی ریزموجودات تولیدکنندۀ آنها ناشناخته است (3). در جستجو برای یافتن ترکیبات طبیعی مفید، غربال‌گری ریزموجودات کمتر مطالعه‌شده امکان یافتن متابولیت‌های جدید را افزایش می‌دهد. طبق گزارش‌ها، میکسوباکترها دارای ویژگی‌های شایان توجهی مانند تولید بسیاری از متابولیت‌های ثانویه و رفتار شکارگر هستند (4 و 5) و برخی از آنها سلولز را تجزیه می‌کنند (6).

میکسوباکترها کلاس غالب باکتری‌های گلایدینگ[1] و گروه متفاوتی از سایر ریزموجودات (ازنظر تاکسونومیکی) هستند که با هر زیستگاهی ازجمله چشمه‌های هیدروترمال[2] تا رودۀ انسان‌ها و حیوان‌ها سازگار هستند و تنوع زیادی در سراسر جهان دارند. توزیع جهانی میکسوباکترها در خاک با 1398 نمونه‌برداری از 64 کشور دنیا ثابت شده است (7 و 8). این دسته از باکتری‌ها با اگزوآنزیم‌های خود ماکرو‌مولکول‌های زیستی، باکتری‌ها و مخمرها را لیز می‌کنند و به‌محض تمام‌شدن مادۀ غذایی میکسوسپور و جسم زایشی[3] تشکیل می‌دهند. جسم زایشی مهم‌ترین و شاخص‌ترین ویژگی میکسوباکترهاست و تشکیل این ساختار چندسلولی در مواقع قحطی به اوج خود می‌رسد؛ اجسام زایشی رنگ‌های درخشانی دارند و با چشم غیرمسلح دیده می‌شوند. تاکنون از میکسوباکترها حدود 100 ساختار پایه و حدود 500 ترکیب مشتق‌شده از این ساختارها گزارش شده‌ است که این گروه میکروبی بسیاری از آنها را به‌طور خاص تولید می‌کند (9). اگرچه این ریزموجودات منابع خوبی برای ترکیبات جدید هستند در غربال‌گری‌های دارویی به‌خوبی مطالعه نشده‌اند؛ زیرا جداسازی آنها فرایندی طولانی و خالص‌سازی و نگهداری آنها دشوار است (10).

میکسوباکترها به‌طورمعمول در خاک‌های خنثی یا کمی قلیایی یافت می‌شوند و از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از جنگل‌های بارانی گرمسیری، تندراهای قطبی، استپ‌ها، بیابان‌ها، باتلاق‌ها، سطح دریا و ارتفاعات زیاد جداسازی می‌شوند؛ با‌وجود‌این، دیده‌ شده است مناطق گرم و دارای فصل‌های خشک ازنظر تنوع میکسوباکترها غنی‌تر هستند. ایران ازنظر داشتن اقلیم زمستان گرم و مرطوب و تابستان خشک استپی مکان مناسبی برای میکسوباکترها به نظر می‌رسد زیرا میکسوسپورها خشکی و دمای زیاد را تحمل می‌کنند. مطالعه‌های داوید[4] (2000) و مرادی و همکاران[5] (1395) نشان‌دهندۀ میانگین بسیار زیاد تعداد گونه‌ها بر نمونۀ خاک در ایران هستند و این مطالعه‌ها‌ نشان می‌دهند طیف گونه‌ها در ایران بسیار گسترده است (11 و 12).

هدف مطالعۀ حاضر که دومین نمونه از این مطالعه‌ها در ایران است جداسازی و بررسی تولید متابولیت‌های ثانویۀ زیست‌فعال در میکسوباکترهای بومی ایران است.

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری نمونه: جدایۀ میکسوباکتر بررسی‌شده از دستگاه گوارش نمونۀ کرم خاکی جنگل‌های قائم‌شهر واقع در استان مازندران جداسازی شد. این نمونه در دی‌ماه سال 1394 جمع‌آوری شد.

جداسازی: پس‌از انتقال نمونه به آزمایشگاه در شرایط استریل، به‌منظور افزایش دقت و اطمینان از تعلق نمونۀ جداشده به فلور میکروبی دستگاه گوارش کرم خاکی (نمونه با غذا از خاک وارد نشده باشد) نمونه مشابه روش ون هورن و همکاران[6] (2011) به مدت یک هفته در شرایط آزمایشگاهی نگهداری شد و پیش‌از تشریح، به‌مدت 10 دقیقه درون الکل 20 درصد و آب ولرم استریل شد. سپس دستگاه گوارش آن در شرایط استریل با قیچی بریده شد و نمونه با پنس به محیط‌‌کشت‌های مدنظر منتقل شد (13). دو روش برای جداسازی میکسوباکترها از نمونه استفاده شد:

در روش اول، محیط‌کشت WATآگار شامل CaCl2. 2H2O 1/0 درصد (وزنی/حجمی)، Agar 5/1 درصد (وزنی/حجمی) و HEPES 20 میلی‌مولار (6) دارای سیکلوهگزمید[7] (100 میکروگرم‌بر‌میلی‌‌لیتر) تهیه و باکتری E. coli. ATCC 25922 به‌شکل متقاطع وسط آن کشت شد؛ سپس نمونه به‌اندازۀ یک نخود به هریک از چهار انتهای خطوط کشت E. coli منتقل (شکل 1، الف) و پلیت به‌مدت یک هفته در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ پس‌ازآن، تشکیل جسم زایشی و خزش میکسوباکتر زیر لوپ دوچشمی  Olympus SZX12بررسی شد.

در روش دوم، محیط ST21آگار شامل محلول A: K2HPO4  1/0 درصد (وزنی/حجمی)، Yeast extract (Difco) 002/0 درصد (وزنی/حجمی)، Agar 5/1 درصد (وزنی/حجمی) و محلول B: KNO3 1/0 درصد (وزنی/حجمی)، MgSO4. 7H2O 2/0 درصد (وزنی/حجمی)، CaCl2. 2H2O 1/0 درصد (وزنی/حجمی)، FeCl3 02/0 درصد (وزنی/حجمی) و MnSO4. 7H2O 01/0 درصد (وزنی/حجمی) (6) دارای سیکلوهگزمید (100 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر) تهیه شد و سلولز (منبع کربن) به‌شکل چهار عدد کاغذ فیلتر استریل در ابعاد تقریباً 2×2 سانتی‌متر در چهار طرف پلیت قرار گرفت. نمونه به‌اندازۀ یک نخود به مرکز کاغذهای فیلتر منتقل (شکل 1، ب) و پلیت به‌مدت یک هفته در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ سپس تشکیل جسم زایشی و خزش میکسوباکتر بررسی شد.

 

 

الف

ب

شکل 1- نمونه‌‌گذاری از دستگاه گوارش کرم خاکی. الف. محیط WATآگار با کشت متقاطع E. coliکهنمونه به‌شکل نقاط تیره‌رنگ مشخص است، ب. ST21آگار با کاغذ فیلتر (منبع سلولز) که نمونه به رنگ قهوه‌ای دیده می‌شود.


خالص‌سازی: خالص‌سازی جدایه ابتدا با انتقال مستقیم رأس جسم زایشی جوان به محیط VY/2آگار شامل Bakers’ yeast 5/0 درصد (وزنی/حجمی)، Agar 5/1 درصد (وزنی/حجمی)، Cyanocobalamin 5/0 میلی‌گرم، CaCl2. 2H2O 1/0 درصد (وزنی/حجمی) (6) به‌وسیلۀ سرنگ انسولین و برای چند مرتبه انجام شد و سپس جسم زایشی از این محیط به چهار رأس کشت متقاطع E. coli زنده روی محیط WATآگار منتقل شد؛ این انتقال چند مرتبه تا خالص‌سازی کامل تکرار شد.

نگهداری بلندمدت: جدایه در محیط‌کشت مایع CY/H شامل casitone 3/0 درصد، yeast extract (Marcor typ 9000) 1/0 درصد، CaCl2. 2H2O 1/0 درصد، HEPES (11.8) 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 2/7) و Agar 6/1 درصد (6) کشت و به‌مدت 7 روز در 160 دوردر‌دقیقه (rpm) و 30 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد. از کشت مایع حاصل برای نگهداری بلندمدت در فریزر منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد استفاده شد.

شناسایی و رده‌بندی: لوپ دوچشمی Olympus SZX12 برای بررسی ریخت‌شناسی اجسام زایشی و میکروسکوپ نوری برای بررسی سلول‌های رویشی و میکسوسپورها استفاده شد. شناسایی ریخت‌شناختی بر اساس کلید شناسایی ریشنباخ و دورکین[8] (1992) انجام شد (14).

از آزمون ®API ZYM برای بررسی 19 واکنش آنزیمی و تعیین پروفایل آنزیمی باکتری استفاده شد و درنهایت ویژگی‌های بیوشیمیایی باکتری مشخص شدند. دمای بهینۀ رشد باکتری با کشت روی پلیت VY/2آگار در چهار دمای 22، 30، 37 و 44 درجۀ سانتی‌گراد و گرماگذاری به‌مدت حداقل یک هفته و مقایسۀ قطر رشد باکتری در چهار دما تعیین شد. برای تعیین اسیدیتۀ بهینه، محیط VY/2آگار با اسیدیته‌های 5، 6، 7، 8 ، 9 و 10 تهیه و جدایه روی آنها منتقل و به‌مدت حداقل یک هفته در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ سپس قطر رشد باکتری در اسیدیتۀ 5 اندازه‌گیری و بهترین اسیدیتۀ رشد تعیین شد. 13 پلیت VY/2آگار حاوی 13 نوع آنتی‌بیوتیک به شرح جدول 1 برای تعیین الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی باکتری استفاده شدند؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا محیط‌کشت یادشده آماده و استریل شد و پس‌از رسیدن به دمای 55 درجۀ سانتی‌گراد، غلظت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک‌ها درون پلیت فیلتر شدند و محیط‌کشت به آن اضافه شد.

 

جدول1- آنتی‌بیوتیک‌های استفاده‌شده در شناسایی و غلظت آنها

غلظت نهایی

آنتی‌بیوتیک

50 میکروگرم/میلی‌لیتر

پلی‌میسن 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/میلی‌لیتر

جنتامیسین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

10 میکروگرم/میلی‌لیتر

اکسی‌تتراسایکلین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

100 میکروگرم/میلی‌لیتر

آمپی‌سیلین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

30 میکروگرم/میلی‌لیتر

کلرامفنیکل 9 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/میلی‌لیتر

اسپکتریومایسین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/میلی‌لیتر

کانامایسین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/ میلی‌لیتر

سفالوسپورین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/ میلی‌لیتر

فوزیدیک‌اسید 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/ میلی‌لیتر

باسیتراسین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/ میلی‌لیتر

تیواسترپتون 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

50 میکروگرم/ میلی‌لیتر

تری­متوپریم 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

150 میکروگرم/میلی‌لیتر

هیگرومایسین 10 میلی‌گرم/میلی‌لیتر

 

باکتری با سوزن استریل‌شده به پلیت‌های آنتی‌بیوتیک منتقل و حداقل به‌مدت یک هفته در 30 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ پس‌از این مدت، رشدکردن یا نکردن باکتری در حضور آنتی‌بیوتیک‌های مختلف بررسی شد. پلیت کشت VY/2‌آگار بدون آنتی‌بیوتیک برای شاهد استفاده شد تا بتوان نتایج را بر اساس آن مقایسه کرد.

به‌منظور بررسی فیلوژنتیکی جدایه، DNA طبق پروتکل استاندارد باکتری‌های گرم منفی و با استفاده از کیت Invisorb Spin Plant Mini (Invitek, Germany) استخراجشد. DNA جداسازی‌شده با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای عمومی F27 و R1525 و برنامۀ دمایی جدول 2 تکثیر شد. در مرحلۀ بعد، محصول PCR با استفاده از کیت NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) خالص و با همان آغازگرها توالی‌یابی شد. توالی‌های حاصل با نرم‌افزار SeqMan II نسخۀ 6 به هم متصل شدند تا توالی کامل ژن حاصل شود؛ سپس این توالی با توالی‌های موجود در بانک اطلاعاتی EzBioCloud مقایسه شد. درخت فیلوژنی (تبارنما) با نرم‌افزار بیژین بر مبنای ناحیۀ ژنی ITS برای جدایه‌های مطالعه‌شده در پژوهش حاضر و جدایه‌های موجود در بانک ژن ترسیم شد.  تجزیه‌وتحلیل بیژین با PAUP v.4.0b10 و MrBayes v3.2.2 انجام شد (15). مناسب‌ترین الگوی تکامل با Mrmodeltest v.2.2 تخمین زده شد (16).

 

جدول 2- چرخۀ دمایی PCR

دما (درجۀ سانتی‌گراد)

زمان (دقیقه)

مرحله

95

5

واسرشت اولیه

94

5/0

34 چرخۀ واسرشت

52

5/0

اتصال آغازگر

72

2

طویل‌سازی

72

10

طویل‌سازی نهایی

 

غربال‌گری فعالیت ضدمیکروبی: پیش‌کشت جدایۀ میکسوباکتریایی Mx18Zk در چهار محیط‌کشت مختلف Myxoviresin شامل peptone casein 1 درصد، CaCl2 005/0 درصد، MgSO4 025/0 درصد، CoCl2 1 میلی‌گرم‌در‌لیتر، HEPES 100 میلی‌مولار و ویتامین B12 با غلظت نهایی 500 میکروگرم‌بر‌لیتر؛ محیط P شامل peptone 2/0 درصد، starch 8/0 درصد، Probion 4/0 درصد، yeast extract 2/0 درصد، CaCl2. 2H2O 1/0 درصد، MgSO4. 4H2O 1/0 درصد، HEPES 100 میلی‌مولار، Fe-EDTA (اسیدیتۀ 5/7) 8 میلی‌گرم‌در‌لیتر، Agar 6/1 درصد؛ E شامل glucose 2/0 درصد، starch 8/0 درصد، CaCl2. 2H2O 1/0 درصد، MgSO4. 4H2O 1/0 درصد،HEPES  50 میلی‌مولار و محیط H شامل soy flour 2/0 درصد، glucose 2/0 درصد، starch 8/0 درصد، yeast extract 2/0 درصد، CaCl2. 2H2O 1/0 درصد، 2x MgSO4. 4H2O 1/0 درصد، HEPES50 میلی‌مولار و Fe-EDTA 8 میلی‌گرم‌بر‌لیتر (6) تهیه شد و 10 میلی‌لیتر از آن به محیط‌کشت‌های Myxoviresin، P، E و H حاوی 2 درصد رزین XAD4 (Sigma, USA) تلقیح و به‌مدت 12 روز در 160 دوردردقیقه و 30 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد. پس‌از این دوره، رزین و توده‌های میکسوباکتر از محیط‌کشت جدا و پس‌از شستشو با آب دیونیزه، استخراج عصاره از رزین با 70 میلی‌لیتر استون انجام شد. عصارۀ استونی در 40 درجۀ سانتی‌گراد با روتاری (Heidolph, Germany) خشک و سپس در 1 میلی‌لیتر متانول حل شد. حداقل غلظت بازدارندگی (MIC) عصارۀ متانولی جدایۀ میکسوباکتریایی Mx18Zk به روش رقت‌سازی در میکروپلیت 96 چاهکی (BRAND, Germany) (17)علیه ریزموجودات شاخص شامل Escherichia coli DSM 116، Escherichia coli TolC، Staphylococcus aureus (Newman)، Candida albicans DSM 1665، Pseudomonas aeruginosa DSM 19882، Bacillus subtilis DSM10s،Micrococcus luteus DSM1790،Chromobacterium violaceum DSM30191، Pichia anomala DSM6766، Mycobacterium smegmatis ATCC 700084و Mucor heimalis DSM2656 مطالعه شد. محیط‌کشت مولر‌هینتون‌براث (MHB) برای باکتری‌های شاخص و محیط‌کشت MYC (18) برای مخمر و قارچ شاخص استفاده شد. کدورت باکتری‌های آزمون در محیط‌کشت MHB 05/0 مک‌فارلند و کدورت قارچ و مخمرهای آزمون در محیط‌کشت MYC 01/0 مک‌فارلند بود. چنانچه عصاره در رقت‌های بیشتر از یک‌هشتم روی هرکدام از ریزموجودات بازدارندگی ایجاد می‌کرد با HPLC و طیف‌سنجی جرمی بررسی می‌شد..

شناسایی متابولیت: عصارۀ متانولی به‌شکل خودکار و در حجم 5 میکرولیتر به دستگاه HPLC تزریق شد. HPLC Agilent 1100 مجهز به ستون X-Bridge (Waters, Milford, USA) با ذرات 5/3 میکرومتر و ابعاد 100×1/2 میلی‌متر و مجهز به آشکارساز (200 تا 400 نانومتر) DAD با سیستم حلالی A شامل بافر آمونیوم‌استات 05/0 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 5) و B شامل استونیتریل و بافر آمونیوم‌استات 05/0 میلی‌مولار در شدت جریان 3/0 میلی‌متر‌در‌دقیقه انجام شد. فراکسیون‌گیری به روش برش زمانی هر 30 ثانیه به‌طور خودکار در چاهک‌های پلیت 96 خانه‌ای انجام شد. فراکسیون‌ها با دستگاه MiniVap (Porvair Sciences, UK) در جریان نیتروژن 40 درجۀ سانتی‌گراد خشک شدند. سپس چاهک‌های پلیت با 150 میکرولیتر ریزموجود شاخص حساس به این عصاره تلقیح شد.

از عصارۀ متانولی برای انجام LC/MS استفاده شد که شامل سیستم HPLC Agilent 1100 مجهز به آشکارساز (200 تا 600 نانومتر) DAD در اتصال به اسپکترومتر جرمی maXis UHR-TOF (Bruker Daltonics, USA) بود. عصاره به‌وسیلۀ ستون ACQUITY UPLC BEH C18(Waters, Milford, USA) در ابعاد50×1/2 میلی‌متر و با ذرات 7/1 میکرومتر تجزیه‌وتحلیل شد. شرایط کروماتوگرافی برای انجام LC/MS با دمای محفظۀ ستون 40 درجۀ سانتی‌گراد، شدت جریان 6/0 میلی‌متر‌در‌دقیقه، حلال A (1/0 درصد فرمیک‌اسید)، حلال B (استونیتریل حاوی 1/0 درصد فرمیک‌اسید)، شیب غلظت 5 درصد B در دقیقه 5/0 تا 95 درصد B در دقیقه 10 و ثابت در 95 درصد B تا دقیقه 5/19. یون‌سازی به روش ESI[9] در حالت مثبت انجام شد و نتایج با نرم‌فزار Bruker Compass DataAnalysis 4.2 بررسی شدند. ترکیبات فعال بر اساس مقایسۀ نتایج LC/MS، طیف UV و زمان بازداری در HPLC با پایگاه داده‌های Myxobase شناسایی شدند.

 

نتایج

.جداسازی، خالص‌سازی و شناسایی جدایۀ Mx18Zk:جدایۀ Mx18Zk از دستگاه گوارش کرم خاکی با استفاده از پلیت حاوی کاغذ نیتروسلولزی (منبع کربن) جداسازی و به روش انتقال مستقیم از جسم زایشی روی پلیت طعمه‌گذاری‌‌شده با کشت E. coliخالص‌سازی شد. این جدایۀ میکسوباکتر گرم منفی، هوازی و دارای سلول‌های میله‌ای با دو انتهای تیز بود و اجسام زایشی کشیده و نارنجی‌رنگی تولید می‌کرد که شباهت آن با جنس Corallococcusرا نشان می‌‌دادند (شکل 2). رشد جدایۀ Mx18Zk در محدودۀ اسیدیتۀ 6 تا 10 و اسیدیتۀ بهینۀ 7 و محدودۀ دمایی20 تا 37 درجۀ سانتی‌گراد و دمای بهینۀ 37 درجۀ سانتی‌گراد مشاهده شد.

نتایج آزمون فعالیت آنزیمی API ZYM این گونه فعالیت آنزیم‌های آلکالین‌فسفاتاز، C4استراز، C8استراز‌لیپاز، C14لیپاز، لوسین‌آریل‌آمیدازی، والین‌آریل‌آمیداز، سیستئین‌آریل‌آمیداز، آلفا‌کمو‌تریپسین، نفتول‌AS-BI‌–‌فسفوهیدرولاز، آلفا‌گلوکوزیداز و بتا‌گلوکوزیداز و فعالیت‌نداشتن آنزیم‌های تریپسین، آلفا‌گالاکتوزیداز و بتا‌گالاکتوزیداز، بتا‌گلوکورونیداز، N- استیل‌بتا‌گلوکورومینیداز، آلفا‌مانوزیداز و آلفا‌فوکوزیداز را در این باکتری نشان دادند.

ب

مقاومت جدایه به آمپی‌سیلین، باسیتراسین، اسپکتینومایسین، کانامایسین، جنتامایسین، پلی‌مایسین، فوزیدیک‌اسید، تری‌متوپریل و هایگرومایسین و حساسیت آن به اکسی‌تتراسایکلین، سفالوسپورین، تیوسترپتون و کلرامفنیکل به همراه ویژگی‌های ریخت‌شناختی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایۀ Mx18Zk  نشان دادند این جدایه بر اساس کلید شناسایی ریشنباخ و دورکین (14) به گونۀ macrosporus Corallococcusتعلق دارد.

 

 

   

شکل2. جدایه Mx18Zk. الف. سلول‌های رویشی باریک و بلند با دو انتهای تیز با مقیاس 20 میکرومتر پس‌از رشد درون محیط CY/H، ب. جسم زایشی کشیده، بزرگ، سفت، بدون پایه و غالباً منفرد با مقیاس500 میکرومتر روی محیط VY2 جامد که ویژگی جنس Corallococcusاست.

 


.تجزیه‌وتحلیل توالی 16S rDNA جدایۀ Mx18Zk و تجزیه‌وتحلیلفیلوژنتیک آن: مقایسۀ توالی1210 بازی 16S rDNA جدایۀ Mx18Zk با توالی سویه‌های شاخص میکسوباکترها در پایگاه اطلاعاتی EzBioCloud نشان داد این جدایه 100 درصد به سویۀ DSM 14697T C. macrosporus شباهت دارد. درخت فیلوژنی با نرم‌افزار بیژین رسم شد. فایل رج‌بندی‌شدۀ نهایی شامل 28 آرایۀ داخلی، 880 کاراکتر و 146 الگوی مکانی منحصر‌به‌فرد بود. بر اساس نتایج نرم‌افزار مدل تست، بهترین مدل جایگزینی GTR+I+G بود. گونۀ Bdellovibrio exovorusJSS11T (NR116108) نیز به‌عنوان آرایۀ خارجی به کار گرفته شد. تجزیه‌وتحلیل بیژین به 3922 تبارنما منتهی شد. پس‌از حذف 25 درصد تبارنماهای جمع‌آوری‌شده برای مرحلۀ burn-in، تبارنماهای اجمالی و توزیع احتمال پسین خوشه‌ها از 2942 (75 درصد) تبارنمای باقیمانده محاسبه شد. نتایج نشان دادند سویۀ Mx18 در دستۀ (کلاد) مشابهی با .Corallococcus macrosporus DSM 14697T (AJ811623) قرار می‌گیرد و با اعتبارسنجی زیاد به همراه سایر جدایه‌های دریافت‌شده از بانک ژن (شکل 3) گروه‌بندی می‌شود.

 

 

شکل 3. تبارنمای اجمالی برآیند 2942 تبارنمای حاصل از استنتاج بیژین رج‌بندی توالی ناحیۀ ITS با نرم‌افزار MrBayes v.3.2.2 برای گونه های Corallococcus  مقیاس، 06/0 تغییر مورد انتظار در هر مکان را نشان می دهد. گونهBdellovibrio exovorusJSS11T (NR116108)   به عنوان آرایه خارجی در نظر گرفته شده است (15 و 16).


کشت مایع میکسوباکتر: جدایۀ Mx18Zk جدا‌شده در پژوهش حاضر در چهار محیط‌کشت مایعMyxoviresin، P، E و H تقریباً مشابه و به‌شکل توده‌ای و غیر‌هموژن رشد کرد و حتی با چندین بار انتقال در کشت مایع کشت هموژن ایجاد نشد؛ از‌این‌رو برای ادامۀ بررسی از توده‌های باکتریایی استفاده شد.

فعالیت ضدمیکروبی و ترکیبات فعال زیستی جدایۀ Mx18Zkجدا‌شده در پژوهش حاضر: نتایج نشان دادند عصارۀ متانولی جدایۀ Mx18ZK حاصل از محیط‌کشت‌های E و H دارای فعالیت ضدمیکروبی قوی‌تری نسبت به دو محیط Myxoviresin و P است و بیشترین فعالیت ضدمیکروبی خود را علیه ریزموجودات گرم منفی E. coli DSM تا رقت یک‌سی‌و‌دوم (چاهک E پلیت 96 چاهکی که دارای 8 ردیف است) و E. coli TolCتا رقت اخر (چاهک H پلیت)، علیه C. violaceum گرم مثبت تا رقت یک‌سی‌و‌دوم و باکتری شاخصS. aureus تا رقت یک‌شانزدهم نشان می‌دهد؛ بنابراین عصاره‌ها با HPLC فراکسیون‌گیری شدند و آزمون زیستی علیه این سه ریزموجود انجام شد. آزمون فعالیت ضدباکتریایی فراکسیون‌های HPLC نشان داد فراکسیون‌های دقایق 22 تا 24 و 26 تا 32 دارای فعالیت زیستی هستند. جدول 3 نتایج مربوط به بررسی LC/MS را نشان می‌دهد.

مقایسۀ نتایج به‌دست‌آمده از زمان بازداری و وزن مولکولی این پیک‌ها با پایگاه داده‌ها به‌وسیلۀ نرم‌افزار به شناسایی این پیک‌ها به‌عنوان میکسوویریسین، میکسوکرومید و میکسالامید منجر شد (شکل4).

 

 

جدول 3- نتایج تجزیه‌وتحلیل LC/MS با استفاده از زمان بازداری و وزن مولکولی پیک‌های به‌دست‌آمده از بانک اطلاعاتی Myxobase

نتایج تجزیه‌وتحلیل فراکسیون‌ها

زمان فراکسیون‌ها

ریزموجودات

Myxovirescins, Myxalamides

5/21 تا 5/22 دقیقه

C. violaceum

Myxovirescins

5/29 دقیقه

 

Myxovirescin, Myxalamides

5/21 تا 0/23 دقیقه

 

Myxovirescins

0/26 تا 5/26 دقیقه

E. coli

Myxovirescins

5/28 تا 5/30 دقیقه

 

Myxovirescins, MyxalamidesMyxochromids

5/21 تا 0/23 دقیقه

S. aureus

 

     

Myxalamid

Myxochromid

Myxovirescin

شکل 4- شناسایی متابولیت‌های فعال جدایۀ Mx18Zk جداسازی‌شده در پژوهش حاضر از چپ به راست به‌ترتیب ساختار مولکولی میکسوویریسین با فرمول شیمیایی C35H61NO8، میکسوکرومید C44H63N7O9 و میکسالامید C25H39NO3


بحث و نتیجه‏گیری

در مطالعۀ حاضر، جدایۀ میکسوباکتریایی Mx18Zk برای نخستین‌بار از دستگاه گوارش نمونۀ کرم خاکی برداشته‌شده از منطقۀ قائم‌شهر مازندران ایران جداسازی شد. به‌طور‌کلی، جداسازی میکسوباکترها به‌علت کندی رشد مشکل است زیرا احتمال آلودگی با باکتری‌های سریع‌رشد و قارچ‌ها افزایش می‌یابد؛ به‌طوری‌که حتی بازیابی کشت خالص سویه‌های جداسازی‌شده به‌علت آلودگی‌ها مشکل و زمان‌بر است (6). تاکسونومی میکسوباکترها بر پایۀ ویژگی‌های ریخت‌شناختی مانند شکل و اندازۀ سلول‌های رویشی و میکسوسپورها، رنگ و نوع اجسام زایشی و خزش باکتری است (14 و 19). بررسی این ویژگی‌ها نشان داد سویۀ Mx18Zk به گونۀ Corallococcus macrosporous تعلق دارد که نخستین‌بار کریزمینویسکی و کریزمینویسکا[x] در سال 1926 آن را شرح دادند (20). در ابتدا رده‌بندی میکسوباکترها بر اساس ریخت‌شناسی انجام می‌شد که تمایز بین گونه‌های مختلف بسیاری از جنس‌ها را مشکل می‌کرد اما به‌تازگی شناسایی فیلوژنتیکی بر اساس تجزیه‌وتحلیل توالی 16S rDNA در کنار روش‌های ریخت‌شناختی برای میکسوباکترها انجام می‌شود. توالی‌یابی ژن 16S rRNA نیز شناسایی 100 درصدی این جدایه را به‌عنوانC. macrosporousتأیید کرد. جداسازی و خالص‌سازی این گونه به‌علت اجسام زایشی‌ای که خارج از سطح آگار رشد می‌کنند و میکسوسپور فراوانی تولید می‌کنند نسبت به برخی میکسوباکترها که داخل آگار رشد می‌کنند و خزش و اجسام زایشی ضعیفی تولید می‌کنند آسان‌تر است (21).

امروزه، افزایش تعداد ‌بیماری‌زاهای مقاوم به دارو به‌ویژه شیوع سویه‌های میکروبی چند‌مقاومتی به مشکلی جدی در سراسر جهان تبدیل شده و سلامت عموم را به خطر انداخته است؛ بنابراین، نیاز به کشف مواد ضدمیکروبی و درمان بهتر برای این عفونت‌ها به‌ویژه در بیمارستان‌ها که مقاومت به‌طور تهدید‌آمیزی شیوع می‌یابد ضروری است (22 و 23). در این راستا، طی 60 سال گذشته بین 30000 تا 50000 ترکیب طبیعی از ریزموجودات به‌ویژه قارچ‌ها و باکتری‌های جدا‌شده از خاک به دست آمده است که بیش از 10000 نمونۀ آنها دارای فعالیت زیستی هستند و بیشتر آنها شامل آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد ضد‌توموری هستند و 250 مورد آنها کاربرد بالینی دارند. جستجوی منابع مختلف در سراسر دنیا به کشف عوامل ضدمیکروبی بسیاری منجر شده است که دارای ارزش درمانی بسیار برای مقابله با بیماری‌های عفونی هستند. در این میان، تمرکز اصلی روی ترکیباتی است که دارای فعالیت آنتی‌بیوتیکی با طیف وسیع هستند؛ هرچند یافتن چنین ترکیباتی بسیار دشوار است (24).

میکسوباکترها یکی از روزنه‌های امید کشف و توسعۀ عوامل ضدمیکروبی جدید در جهان محسوب می‌شوند و از 30 سال پیش تاکنون به یکی از جذاب‌ترین موضوع‌های میکروبیولوژی تبدیل شده‌اند (11). میکسوباکترها پتانسیل زیادی برای تولید متابولیت‌های ثانویه از خود نشان می‌دهند که این به‌علت وجود سازوکارهای جدید عملکرد و تولید ویژۀ این دسته از باکتری‌ها است (25). به‌منظور ارزیابی توانایی تولید متابولیت‌های ثانویۀ جدایۀ Mx18Zk فرایند کشت، استخراج و آزمون فعالیت ضدمیکروبی انجام شد که نشان می‌دهد این جدایه فعالیت ضدباکتریایی زیادی علیه E. coli، C. violaceum و S. aureusدارد. بررسی‌های HPLC و LC/MS عصاره به شناسایی آنتی‌بیوتیک میکسوکرومید که قبلاً نیز در این گونه گزارش شده است و آنتی‌بیوتیک‌های میکسوویریسین و میکسالامید که برای نخستین‌بار در این گونه گزارش می‌شوند منجر شدند. میکسوکرومید نخستین‌بار در سال 2005 از Stigmatella aurantiaca گزارش شد. این متابولیت ثانویه سازوکار مولکولی ناشناخته‌ای دارد و تاکنون از گونه‌های fulvusMyxococcus،Myxococcus virescens، Myxococcus xanthus، Nannocystis pusilla، Corallococcus macrosporousو Stigmatella aurantiaca جداسازی شده است. میکسوویریسین نخستین‌بار در سال 1982 از M. virescens گزارش شد. این آنتی‌بیوتیک متابولیت مرکبی از پلی‌کتید و پپتید غیرریبوزومی است و با عمل‌کردن در مراحل اولیۀ سنتز دیواره، قرارگیری N-استیل‌گلوکزآمین را مهار می‌کند (26). میکسوویریسین اتصالی قوی با سطوح مختلف مانند بافت دندان و پلاستیک ایجاد می‌کند و در همان حال، فعالیت آنتی‌بیوتیکی خود را نیز حفظ می‌کند. این مشاهده‌ها سبب بررسی کاربرد آن در درمان پلاک دندانی و ژنژیویتیس و عفونت‌های ادراری وابسته به کاتر شده‌اند. در‌حال‌‌حاضر، میکسوویریسین از گونه‌های Myxococcus virescens، Myxococcus xanthus و Pyxidiococcus fallaxگزارش شده است که نخستین گزارش ازCorallococcus macrosporousجداسازی‌شده در پژوهش حاضراست (27). میکسالامید ضدقارچی است که نخستین‌بار در سال 1983 از M. xanthus و سپس از S. aurantiaca گزارش شد. میکسالامید از گونه‌های Corallococcus exiguous، Myxococcus fulvusوPyxidiococcus fallaxنیز گزارش شده است اما برای نخستین‌بار است که از macrosporous Corallococcusجداسازی‌شده در پژوهشحاضر گزارش می‌شود (28).

جدایۀ Mx18Zk جداسازی‌شده در پژوهش حاضر نتایج امیدبخشی در آزمون‌های ابتدایی نشان داد که اهمیت این منبع جدید و بالقوه را برای تولید آنتی‌بیوتیک‌ها نشان می‌دهد. همچنین با استناد به این نمونه، موجودات زنده مانند کرم خاکی علاوه‌بر نمونه‌های خاک، چوب پوسیده و ... که قبلاً وجود میکسوباکترها در آنها اثبات شده است منبع جدیدی از این نوع باکتری‌ها و طبعاً منبع جدیدی از وجود متابولیت‌های ثانویه مانند آنتی‌بیوتیک‌ها معرفی می‌شوند. امید است در آینده ترکیبات جدید و فعالی از این منابع به دست آید.

 

سپاسگزاری

نویسنده از مؤسسۀ (HZI) Helmholtz Centre for Infection Research شهر برانشوایگ آلمان برای فراهم‌کردن تجهیزات و حصول نتایج سپاسگزاری می‌کند.



[1]- Gliding

[2]- Hydrothermal

[3]- Fruiting body

[4]- Dawid

[5]- Moradi et al.

[6]- Van horn et al.

[7]- Cycloheximide

[8]- Reichenbach & Dworkin

[9]- Electrospray Inoziation

[x]- Krzemieniewski  & Krzemieniewska   

 
(1)              Li JW., Vederas JC. Drug discovery and natural products: end of an era or an endless frontier? Science 2009; 325: 161-165.
(2)              Walsh C. Where will new antibiotics come from? Nature Reviews Microbiology 2003; 1: 65-70.
(3)              Davies J. Are antibiotics naturally antibiotics? Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2006; 33: 496-499.
(4)              Berleman JE., Kirby JR. Deciphering the hunting strategy of a bacterial wolfpack. FEMS Microbiology Reviews 2009; 33: 942-957.
(5)              Weissman KJ., Muller RA. Brief tour of myxobacterial secondary metabolism. Bioorganic and Medicinal Chemistry 2009; 17: 2121-2136.
(6)              Shimkets LJ., Dworkin M., Reichenbach H. The myxobacteria. In: The prokaryotes. New York: Springer NY; 2006.
(7)              Cascaval D., Galaction AI. New extraction techniques on bioseparations: 1. Reactive extraction. Hemijska industrija 2004; 58(9): 375-386.
(8)              Rokem JS., Lantz AE. Systems biology of antibiotic production by microorganisms. Natural Product Reports 2007; 24(6): 1262.
(9)              Weissman KJ., Müller R. Myxobacterial secondary metabolites: and modes-of-action. Natural Product Reports 2010; 27(9): 1276-1295.
(10)          Reichenbach H., Höfle G. Myxobacteria as producers of secondary metabolites. Drug Discovery from Nature 1999; 79-149.
(11)          Dawid W. Biology and global distribution of myxobacteria in soils. FEMS Microbiology Reviews 2000; 24(4): 403-427.
(12)          Moradi A., Ebrahimipour GH., Mohr KI., Kämpfer P., Glaeser SP., Hennessen F., et al. Racemic cystis iranensis sp. nov., a novel myxobacterium from Iranian soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2017; 67: 472-478.
(13)          Van Horn D., Garcia JR., Loker ES., Mitchell KR., Mkoji GM., Adema CM., et al. Complex intestinal bacterial communities in three species of planorbid snails. Journal of Molluscan Studies 2011; 78(1): 74-80.
(14)          Reichenbach H., Dworkin M. The myxobacteria. In: The prokaryotes. New York: Springer NY; 1992.
(15)          Ronquist F., Huelsenbeck JP. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics 2003; 19: 1572-1574.
(16)          Nylander JAA. MrModeltest v2. Program distributed by the author. Uppsala: Evolutionary Biology Centre; 2004.
(17)          Wiegand I., Hilpert K., Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature protocols 2008; 3(2): 163-175.
(18)          Cazin J., Wiemer DF., Howard, JJ. Isolation, growth characteristics, and long-term storage of fungi cultivated by attine ants. Applied and environmental microbiology 1989; 55(6): 1346-1350.
(19)          Spröer C., Reichenbach H., Stackebrandt E. The correlation between morphological and phylogenetic classification of myxobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 1999; 49(3): 1255-1262.
(20)          Krzemieniewska H., Krzemieniewski S. Miksobakterje Polski (Die Myxobakterien von Polen). Acta Societatis Botanicorum Poloniae 1926; 4: 1-54.
(21)          Zhang L., Wang H., Fang X., Stackebrandt E., Ding Y. Improved methods of isolation and purification of myxobacteria and development of fruiting body formation of two strains. Journal of Microbiological Methods 2003; 54(1): 7-21.
(22)          Darabpour E., Ardakani MR., Motamedi H., Ghezelbash G., Ronagh MT. Isolation of an antibiotic producer Pseudomonas sp. from the Persian Gulf. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2010; 3(4): 318-321.
(23)          Shlaes DM., Projan SJ., Edwards JE. Antibiotic discovery: state of the state. ASM News-American Society for Microbiology 2004; 70(6): 275-281.
(24)          Schmitz A., Felder S., Hِver T., Kehraus S., Neu E., Lohr F., et al. Antibiotics from gliding bacteria. Phytochemistry Reviews 2012; 1-10.
(25)          Reichenbach H. Myxobacteria, producers of novel bioactive substances. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2001; 27(3): 149-156.
(26)          van Pée KH., Ligon JM. Biosynthesis of pyrrolnitrin and other phenylpyrrole derivatives by bacteria. Natural Product Reports 2000; 17(2): 157-164.
(27)          Simhi E., van der Mei HC., Ron EZ., Rosenberg E., Busscher HJ. Effect of the adhesive antibiotic ta on adhesion and initial growth of E. coli on silicone rubber. FEMS Microbiology Letters 2000; 192(1): 97-100.
(28)          DeLong EF., Lory S., Stackebrandt E., Thompson F., Rosenberg E. Proteobacteria: Deltaproteobacteria and Epsilonproteobacteria. In: The prokaryotes. 4th ed. Berlin: Springer; 2014.