نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
2 استادیار گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستیدانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
3 استاد گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Endophytes are microorganisms that colonize internal tissues of plants without causing obvious symptoms. This study was conducted to isolate and identify endophytic fungi of the cowpea in Khuzestan province.
Materials and methods: During 2016, eight healthy samples of the cowpea plants were collected from the important areas under cultivation in the northern Khuzestan province. The small parts of the roots, stems, leaves and pods were deeply surface sterilized for each samples and plated on Potato-Dextrose-Agar. Sixty fungal isolates obtained in this study were purified by single spore method. Based on morphological characteristics, 21 out of 60 isolates were selected for molecular study. The isolates were grown in Potato-Dextrose-Broth and mycelial biomass was recovered by passing through filter paper. DNA extraction was performed using a phenol- and chloroform- based organic method. The parts of the nrRNA gene (ITS and 28S-D1/D2 regions) were amplified using appropriate primer pair and then sequenced.
Results: The isolates were analyzedon the basis of morphological characteristics in combination with BlASTn search algorithm and ITS sequence-based phylogeny. Accordingly, the isolates were identified as follows: Alternaria destruens, Alternaria sp., Curvularia mosaddeghii, Curvularia sp., Fusarium chlamydosporum, F. nygamai, F. falciforme, F. proliferatum, Fusarium sp. Macrophomina phaseolina and Penicillium oxalicum.
Discussion and conclusion: Alternaria, Fusarium and Curvularia genera were the most abundant fungal endophytes into cowpea plants, growing in warm climate of the Khuzestan Province. To the best of our knowledge, this is the first study to report endophytic growth of A. destruens, Alternaria sp., M. phaseolina, F. chlamydosporum, F. nygamai, F. falciforme, F. proliferatum and P. oxalicum within cowpea plants.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
لوبیا چشم‌بلبلی (Vigna unguiculata (L.)Walp.) گیاهی مخصوص مناطقگرمسیر و نیمه‌گرمسیر است که در سطح اقتصادی در استان خوزستان کشت می‌شود. اندوفیت‌ها مجموعه‌ای از ریزجانداران (قارچ یا باکتری) هستند که بدون ایجاد نشانه و با رشد درون‌سلولی یا بین‌سلولی در بافت‌های گیاهان زندگی می‌کنند و منابعی غنی از ترکیبات زیستی فعال هستند (1 و 2). قارچ‌های اندوفیت ریزجاندارانی هستند که در بافت‌های داخلی گیاهان زنده ساکن هستند و هیچ‌گونه آثار منفی فوری وآشکاری را در میزبان‌های خود ایجاد نمیکنند (3). تمام گیاهان آوندی و غیر‌آوندی خشکی‌زی و دریا‌زی زیستگاه اندوفیت‌ها هستند (4 و 5). حضور ریزجانداران اندوفیت در بافت‌های علفی و چوبی تمام اندام‌های گیاهی ازجمله بافت‌های ریشه، ساقه، شاخه، پوست، برگ، دمبرگ، گل، میوه و دانه ثابت شده است (6). فلور اندوفیتی ازنظر جمعیت و تنوع در میزبان‌های مختلف متفاوت است و به موقعیت جغرافیایی رشد میزبان بستگی دارد (7 و 8). حدود 300000 گونۀ گیاهی روی زمین وجود دارد و هر گیاه منحصراً میزبان یک تا تعداد بیشتری اندوفیت است (2).
دهقان‌پور[1] و همکاران (9) قارچ‌های اندوفیت را از غلاف برگ و بذرهای میزبان‌های گیاهی Festuca arundinaceae،F. pratensis،F. ovina،Bromus tomentellus،Lolium prenneو Melica persica جداسازی کردند. بیشتر جدایه‌های بررسی‌شده در این پژوهش ازنظر ریخت‌شناسی با توصیف عمومی جنس AcremoniumوNeotyphodiumشباهت داشتند. هاشم‌لو[2] و همکاران (10) قارچ‌های اندوفیت درختان میوۀ هسته‌دار را در استان آذربایجان غربی بررسی کردند و گونه‌های مختلفی از جنس‌های Aspergillus،Alternaria،Ulocladium،Stemphylium،Trichoderma،Penicillium،Trichothecium،Epicoccum،Phoma،Fusarim،Sordaria، Cladosporiumو Coniothyriumرا بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی شناسایی کردند. خرسندی[3] و همکاران (11) تنوع قارچ‌های اندوفیت را در شاخه و پوست درختان چنار بررسی کردند. در این مطالعه، قارچ‌های F. avenaceum،Cochliobolus victoriae،Cyclothyrium sp.، sp.Ulocladium،Chaetomium sp. و Humicola sp. دارای بیشترین فراوانی در درختان چنار بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و مولکولی بودند. هرقلی[4] و همکاران (12) 15 گونه متعلق به 10 جنس قارچی را از درختان انگور جداسازی و شناسایی کردند.
باتوجه‌به اینکه تاکنون مطالعۀ کافی روی اندوفیت‌های ساکن در گیاه لوبیا چشم‌بلبلی انجام نشده است، پژوهش حاضر می‌کوشد تنوع گونهای قارچ‌های اندوفیت را در این گیاه بررسی کند.
مواد و روشها
..نمونهبرداری و جداسازی اندوفیت‌های قارچی از گیاه لوبیا چشم‌بلبلی: بخش‌های مختلف ریشه، ساقه و برگ بوته‌های کاملاً سالم و بدون نشانۀ بیماری از هشت منطقۀ لوبیاکاری شمال استان خوزستان جمع‌آوری شدند (جدول 1). نمونه‌های گیاهی به قطعه‌های 5/0 تا 1سانتی‌متری تقسیم و به‌مدت 30 ثانیه در اتانول 70 درصد و سپس، به‌مدت 2 دقیقه در محلول هیپوکلریت‌سدیم 2 درصد غوطه‌ور شدند و درنهایت، سه مرتبه با آب مقطر سترون شستشو شدند. پس‌از خشک‌شدن قطعه‌های گیاهی روی کاغذ صافی سترون، نمونه‌ها به محیط‌غذایی سیب‌زمینی‌دکستروز‌آگار (PDA) منتقل و به‌مدت 5 تا 10 روز در انکوباتوری با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و شرایط تاریکی نگهداری شدند. قارچ‌های رشد‌کرده به تشتک‌های پتری جدید منتقل شدند. خالص‌سازی جدایه‌ها به روش تکاسپور انجام شد (13).
جدول 1- ویژگی‌های توالی‌های به‌دست‌آمده در مطالعۀ حاضر و شمارۀ دسترسی آنها در بانک ژن
|
شمارۀ توالی‌ها در بانک ژن |
محل جمع‌آوری |
نام جدایه |
نام گونه |
|
|
28S-D1/D2 |
ITS |
|||
|
MG971383 |
MG971296 |
شاوور |
SCUA-8Sd |
Alternaria destruens |
|
MG971365 |
MG971274 |
مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک |
SCUA-1Sc |
A.destruens |
|
MG971379 |
MG971290 |
صفی‌آباد، پس‌از مرکز تحقیقات |
SCUA-6Se |
A.destruens |
|
MG971372 |
MG971282 |
اکیوش |
SCUA-4Rh |
Alternaria sp.. |
|
- |
MG971295 |
شاوور |
SCUA-8Rb |
Alternaria sp. |
|
تحت ثبت |
تحت ثبت |
مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک |
SCUA-1Rb2 |
Curvularia mosaddeghii |
|
MG971373 |
MG971283 |
اکیوش |
IRAN 3121C; SCUA-4Sc |
Curvularia. sp.2 |
|
MG971361 |
MG971269 |
مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک |
IRAN 3125C; SCUA-1Ra |
Curvularia sp.2 |
|
MG971364 |
MG971272 |
مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک |
IRAN 3124C; SCUA-1Rh |
Curvularia sp.2 |
|
- |
MG971273 |
مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک |
IRAN 3120C; SCUA-1Sb |
Curvularia sp.1 |
|
MG971381 |
MG971293 |
روبه‌روی بیمارستان نظام مافی شوش |
SCUA-7Rs |
Fusarium nygamai |
|
MG971368 |
MG971277 |
روستای مراونه بیت صحین |
SCUA-2Sc |
F. chlamydosporum |
|
MG971369 |
MG971278 |
عشارۀ کوچک |
SCUA-3Ra |
F. falciforme |
|
MG971367 |
MG971276 |
روستای مراونه بیت صحین |
SCUA-2Rd |
F. proloferatum |
|
MG971363 |
MG971271 |
مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک |
SCUA-1Rc |
Fusarium sp. |
|
MG971366 |
MG971275 |
روستای مراونه بیت صحین |
SCUA-2Rc |
Fusarium sp. |
|
MG971380 |
MG971292 |
روبه‌روی بیمارستان نظام مافی شوش |
SCUA-7Rf |
Fusarium sp. |
|
- |
MG971280 |
اکیوش |
SCUA-4Rb |
Fusarium sp. |
|
MG971371 |
MG971281 |
اکیوش |
SCUA-4Rd |
Fusarium sp. |
|
MG971382 |
MG971294 |
شاوور |
SCUA-8Ra |
Macrophomina phaseonlina |
|
MG971378 |
MG971289 |
صفی‌آباد، پس‌از مرکز تحقیقات |
SCUA-6Sd |
Pecicillium oxalicum |
بررسی ریخت‌شناسی:شکل ظاهری پرگنه و رنگ آن، ویژگی‌های رشدی، ریخت‌شناسی اندام‌های تولید‌مثلی، کنیدیوم‌ها و کلامیدوسپورها به‌منظور بهره‌گیری در شناسایی جدایه‌ها بررسی شدند. تصاویر با میکروسکوپ نوری (OLYMPUS BX51) متصل به دوربین دیجیتال (OLYMPUS DP12) تهیه شدند.
بررسی مولکولی جدایه‌ها: جدایه‌های قارچی در محیط‌کشت سیب‌زمینی‌دکستروز‌براث (PDB) به‌مدت 10 روز در شرایط تاریکی مطلق و دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد درون شیکر انکوباتور رشد داده شدند. تودۀ میسیلیومی رشد‌یافته با پمپ خلأ، قیف و کاغذ صافی سترون جمع‌آوری شد و پس‌از شستشو، در لوله‌های سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری در دستگاه فریزدرایر (Freeze-Dryer, Alpha 1–2LD Plus, Christ). خشک انجمادی شد. زیستتوده در هاون چینی حاوی ازت مایع پودر و تا زمان استخراج DNA در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد. استخراج DNA به روش ریدر و برودا[5] (14) با اندکی تغییر انجام شد (15). جفت آغازگر عمومی ITS1-F و NL4-R برای تکثیر حدود 1200 جفت باز از نواحی 18S، ITS1، 5.8S، ITS2 و 28s-D1/D2 مربوط به rDNA هسته‌ای استفاده شد (16 و 17). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از ترموسایکلر مدل‌های Biometra و Biorad انجام شد. مخلوط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و برنامۀ حرارتی برای تکثیر این نواحی ژنی بر اساس روش پیشنهادی حیدری و همکاران (18) تهیه و انجام شد. پس‌از انجام الکتروفورز، باندهای با اندازۀ حدود 1200 جفت باز برش داده شدند و خالص‌سازی DNA با استفاده از کیت تجاری Vivantis GF-1 Gel DNA Recavery Kit و دستورعمل ارائه‌شده در آن انجام شد.شرکت ماکروژن محصولات PCR را با آغازگرهای استفاده‌شده در تکثیر توالی‌یابی کرد. توالی‌ها با نرم‌افزار بیوادیت نسخۀ 4.0.6.2 [6] (19) و DNA Baser نسخۀ 3.5.0 (www.DnaBaser.com) ویراستاری و مونتاژ شدند. توالی‌ها به پایگاه اطلاعات ژنوم NCBI معرفی و با استفاده از الگوریتم BLASTn برای شناسایی هیتهای بلاست و توالی‌های شناخته‌شدۀ مرتبط جستجو شدند. درختان فیلوژنتیکی با استفاده از الگوریتم درستنمایی بیشینه و با نرم‌افزار مگا نسخۀ 6[7] ترسیم شدند (20).
نتایج
در پژوهش حاضر، درمجموع 60 جدایۀ قارچی از بخش‌های مختلف (25 جدایه از ریشه، 21 جدایه از ساقه و 14 جدایه از برگ) هشت نمونه گیاه سالم لوبیا چشم‌بلبلی جمعآوریشده از هشت منطقۀ لوبیاکاری در اهواز و شمال استان خوزستان جداسازی، خالص‌سازی و بررسی شدند (شکل 1). در این طبقه‌بندی، 23 جدایه از جنس Alternaria، 22 جدایه از جنس Fusarium، 12 جدایه از جنس Curvularia، 2 جدایه از جنس Macrophomina و 1 جدایه از جنس Penicillium به دست آمد (جدول 2).
شکل 1- نمودار فراوانی جدایه‌های قارچی به‌دست‌آمده از بخش‌های ریشه، ساقه و برگ
جدول 2- گروهبندی جدایه‌ها بر اساس صفت‌های ریخت‌شناسی
|
برخی ویژگی‌های مهم ریخت‌شناسی |
تعداد جدایه |
گروه ریخت‌شناسی |
|
کنیدیوم‌ها با اندازۀ حدود 5/11-3/10×8/31-2/28 میکرومتر، تعداد دیوارۀ عرضی در آنها 1 تا 7 (بیشتر دارای 3 تا 5 دیواره) و تعداد دیوارۀ طولی 1 تا 4 |
15 |
Alternaria destruens |
|
کنیدیوم‌ها با اندازۀ حدود 15-8/13×2/39-7/33 میکرومتر، تعداد دیوارۀ عرضی در آنها 3 تا 7 و تعداد دیوارۀ طولی 1 تا 3 |
8 |
Alternaria sp. |
|
کنیدیوم‌زایی زیگزاگی (سیمپودیال)، کنیدیوم‌ها چهارحجرهای، دو سلول انتهایی کنیدی‌ها روشن و دو سلول میانی تیرهتر، حجرۀ سوم بزرگ و انحنادار و اندازۀ آنها 5/10-8/9×5/23-8/21 میکرومتر |
1 |
Curvularia mosaddeghii |
|
کنیدیوم‌زایی زیگزاگی، کنیدیوم‌ها راست و بدون انحنا، بیشتر چهارحجرهای و گاهی سه‌حجره‌ای، استوانه‌ای تا تخم‌مرغی‌شکل، قهوه‌ای روشن و اندازۀ آنها 6/9-9×3/24-2/13 میکرومتر |
6 |
Curvularia. sp.1 |
|
کنیدیوم‌زایی زیگزاگی، کنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل، بیشتر راست و به‌ندرت کمی انحنادار، چهارحجرهای و اندازۀ آنها 7/8-1/8×8/23-7/22 میکرومتر |
5 |
Curvularia sp.2 |
|
پرگنۀ کامل ارغوانی تیره، کنیدیومبرها کوتاه، سلول‌های کنیدیوم‌زایی بیشتر مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب و کنیدیوم‌ها روی آنها به‌طور مجتمع هستند، ماکروکنیدی‌ها راست یا دارای کمی خمیدگی، میکروکنیدی‌ها یک سلولی، خمیده و اندازۀ آنها 1/3-3/2×6/13-8/4 میکرومتر، کلامیدوسپورها فراوان و انفرادی یا زنجیری |
7 |
Fusarium nygamai |
|
پرگنۀ کامل قهوه‌ای روشن، کنیدیومبرها شفاف و پلی‌فیالید، ماکروکنیدیوم‌ها با 3 تا 6 دیوارۀ عرضی، خمیده یا هلالی و اندازۀ آنها 5/4-3×6/39-2/27 میکرومتر، میکروکنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل، معمولأ تک سلولی و اندازۀ آنها 6/3-1/2×18-6 میکرومتر،کلامیدوسپورها زنجیری |
2 |
F. chlamydosporum |
|
پرگنۀ کامل کرمی، سلول‌های کنیدی‌زا به‌طور انتهایی و غیرقابل‌تمیز از کنیدیوم‌بر، ماکروکنیدیوم‌ها استوانه‌ای یا بیضوی‌شکل و ابعاد آنها 8/2-5/2×69/17-56/13 میکرومتر؛ میکروکنیدیوم‌ها اکثراً یک سلولی، تخم‌مرغی و کاماشکل و اندازۀ آنها 5/2-2/2×3/7-7/6 میکرومتر |
5 |
F. falciforme |
|
پرگنۀ کامل نارنجی، سلول‌های کنیدیوم‌زا باریک و مونوفیالید یا پلی‌فیالید، ماکروکنیدیوم‌ها راست، 3 تا 4 دیوارۀ عرضی و اندازۀ آنها 9/2-3/2×19-6/13 میکرومتر، میکروکنیدیوم‌ها تخم‌مرغی یا دوکی‌شکل، صفر یا 1 دیوارۀ عرضی و ابعاد آنها 3-2×2/8-8/6 |
3 |
F. proloferatum |
|
پرگنۀ کامل نارنجی، سلول‌های کنیدیوم‌زا غالباً مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب و کنیدیوم‌ها روی آنها به‌طور مجتمع، ماکروکنیدیوم‌ها غالباً داسی‌شکل، 3 تا 6 دیوارۀ عرضی و اندازۀ آنها 3/4-5/3×8/31-5/23 میکرومتر، میکروکنیدیوم‌ها تقریبأ کلیوی تا دوکی‌شکل، اغلب یک تا دو سلولی، اندازۀ آنها 6/3-7/2×8/10-9 میکرومتر، کلامیدوسپورها انفرادی یا زنجیری |
5 |
Fusarium sp. |
|
پرگنه دارای رشد سریع، در مرکز دودی و تیره و در حاشیه سفید مایل به خاکستری، تولید سختینه‌های سیاه‌رنگ به‌طور پراکنده و به اشکال گرد، بیضوی و نیمه‌کروی |
2 |
Macrophomina phaseonlina |
|
پرگنه در مرکز سبز و در حاشیه سفید مایل به کرم، کنیدیومبرها غالباً Biverticillate، فیالیدها استوانه‌ای تا نیزه‌ای و ابعاد آنها 1/4-3×23-18 میکرومتر، کنیدیوم‌ها تخم‌مرغی‌شکل و اندازۀ آنها 3/3-9/2×6/5-7/4 میکرومتر |
1 |
Pecicillium oxalicum |
بررسی مولکولی: 21 جدایه در بررسی مولکولی استفاده شدند و توالی‌های به‌دست‌آمده در بانک ژن ثبت شدند (جدول 1). میزان شباهت توالی‌های هر ژن از هر جدایه با سویه‌های شناخته‌شده از طریق انجام جستجوی BLASTn آشکار شد. درختی تکژنی مبتنی بر ناحیۀ ITS با استفاده از الگوریتم درستنمایی بیشینه برای تمام جدایه‌های بررسی‌شده ترسیم شد (شکل 2) و جداسازی فیلوژنتیکی جدایه‌ها با نزدیکترین گونه‌های خویشاوند تجزیهوتحلیل شد. ناحیۀ 28S-D1/D2 در جستجوی BLASTn و رسم درخت فیلوژنتیکی به شناسایی گونهها کمکی نکرد و نتایج آن ارائه نشده‌اند و فقط شمارۀ دسترسی آن در بانک ژن آورده شده است (جدول 1).
شکل 2- درخت تکژنی بدون مقیاس گونه‌های بررسی‌شده در تجزیهوتحلیل درستنمایی بیشینه بر اساس توالی ITS با استفاده از مدل K2+G+I. ارتباط فیلوژنتیکی جدایه‌های بررسی‌شده (با دایرۀ توپر قرمز نشان داده شده است) فقط با گونه‌های نزدیک آنها نشان داده شده است. اعداد اعتبارسنجی زیر 50 درصد نشان داده شده است.
Alternaria destruens E.G. Simmons, Mycotaxon 68: 419 (1998) (شکل 3)
15 جدایه از این گونه (ازجمله جدایه‌های SCUA-8Sd، SCUA-6Se و SCUA-1Sc) از ریشه، ساقه و برگ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اکیوش، اهواز، اندیمشک، شاوور، شوش، صفی‌آباد و مراونه جداسازی شدند.
قطر پرگنۀ قارچ پس‌از مایه‌زنی روی محیط‌کشت PDA در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از 7 روز برابر 55 میلی‌متر و رنگ پرگنه سبز زیتونی تیره است. پرگنه دارای ظاهری مسطح و چسبیده به سطح محیط‌کشت است. کنیدیومبرها به رنگ قهوه‌ای روشن هستند و ابعاد آنها 65/4-4×5/56-33 میکرومتر است. کنیدیوم‌ها به‌شکل زنجیره‌‌های ساده و غیرمنشعب روی کنیدیومبرها تشکیل می‌شوند. کنیدیوم‌ها به شکل تخم‌مرغی یا بیضوی هستند؛ تعداد دیوارۀ عرضی در آنها بین 1 تا 7 عدد متغیر است ولی بیشتر دارای 3 تا 5 دیواره هستند و تعداد دیوارۀ طولی در آنها 1 تا 4 عدد است. کنیدیوم‌ها به رنگ قهوه‌ای روشن و دارای زایده در انتهای خود هستند. سطح کنیدیوم‌ها صاف است و هیچ‌گونه تزییناتی روی آنها دیده نمی‌شود. ابعاد کنیدیوم‌ها 5/11-3/10×8/31-2/28 میکرومتر است.
نتایج جستجوی BLASTnجدایه‌های SCUA-8Sd، SCUA-6Se و SCUA-1Sc نشان دادند توالی ITSاین جدایه‌ها با سویه‌های شناخته‌شدۀ A. destruens ازجمله سویۀ A. destruens ATCC 204363 99 تا 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‌های بررسی‌شده با سویۀ شناخته‌شدۀ A. destruensATCC 204363 و سویههایی از گونه‌های نزدیک به این گونه (ازجمله A. alstroemeriae، A. arborescens، A. angustiovoideaوA. cerealis) خوشه‌بندی شدند و کلادی با ارزش بوتاستراپ 97 درصد ایجاد کردند. این درخت تکژنی نتوانست به‌طور معتبر این گونه را ازنظر فیلوژنتیکی از سایر گونهها جداسازی کند.
شکل 3- جدایۀ A. destruens SCUA-8Sd. الف، ب، پ، ث. کنیدیوم و کنیدیوم‌برهای اولیه؛ ت، ج. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA
Alternariasp. (شکل 4)
8 جدایه از این گونه (ازجمله جدایه‌های SCUA-4Rh و SCUA-8Rb) از ریشه، ساقه و برگ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اکیوش، اهواز، اندیمشک، شاوور، شوش و صفی‌آباد جداسازی شدند.
قطر پرگنۀ قارچ پس از مایه‌زنی روی محیط‌کشت PDA در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از 7 روز برابر 68 میلی‌متر و رنگ پرگنه سبز زیتونی تیره است. کنیدیومبرها منشعب و به رنگ قهوه‌ای روشن هستند، خمیدگی زانویی در انتهای آنها دیده می‌شود و ابعاد آنها 1/4-8/3×4/76-6/41 میکرومتر است. کنیدیوم‌ها به‌شکل زنجیره‌‌های ساده و غیرمنشعب روی کنیدیومبرها تشکیل می‌شوند. کنیدیوم‌ها در انتها باریک‌شده و به اشکال تخم‌مرغی یا بیضوی دیده می‌شوند و تعداد دیوارۀ عرضی از 3 تا 7 عدد و تعداد دیوارۀ طولی بین 1 تا 3 عدد در آنها متغیر است. کنیدیوم‌ها به رنگ قهوه‌ای روشن و در انتهای خود دارای زایده هستند. سطح کنیدیوم‌ها صاف است و هیچ‌گونه تزییناتی روی آنها دیده نمی‌شود. ابعاد کنیدیوم‌ها 15-8/13×2/39-7/33 میکرومتر است.
شکل 4- جدایۀ Alternaria sp. SCUA-8Rb. الف، ب، ج، د. تولید کنیدیوم و کنیدیوم‌بر؛ ن، ی. شکل پرگنه پس‌از گذشت یک هفته روی محیط PDA
نتایج جستجوی BLASTnجدایه‌های SCUA-4Rh و SCUA-8Rb نشان دادند توالی ITSاین گونه با سویۀ شناخته‌شدۀ Alternaria ceralis CBS 119544 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‌های SCUA-4Rh و SCUA-8Rb با سایرگونههای نزدیک جنس Alternaria مانند A. eichhorniae و A. iridiaustralis همراه شدند و کلادی با ارزش بوتاستراپ 97 درصد ایجاد کردند.
Macrophomina phaseolina (شکل 5)
2 جدایۀ M. phaseolina SCUA-8Ra و M. phaseolina SCUA-3Rg از ریشۀ سالم گیاه لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری منطقۀ اکیوش جداسازی شدند.
رشد قارچ بسیار سریع و قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 3 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 80 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در مرکز دودی و تیره و در حاشیه سفید مایل به خاکستری دیده می‌شود. ریسه‌ها رشد هوایی نیز دارند و سختینه‌های سیاه‌رنگی به‌طور پراکنده روی پرگنه مشاهده می‌شوند که به اشکال گرد، بیضوی و نیمه‌کروی هستند.
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ M. phseolina SCUA-8Ra نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‌شدۀ Macrophomina phaseolina CBS 313.51 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ M. phseolina SCUA-8Ra با سویۀ شناخته‌شدۀ M. phaseolina CBS 313.51 خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوتاستراپ 100 درصد ایجاد کرد.
شکل 5- جدایۀ M. phseolina SCUA-8Ra. الف، ب، پ. ریسه‌ها و سختینه؛ ج، د. شکل پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از گذشت 4 روز
Fusarium falciforme (Carrion) Summerb. .& Schroers, Journal of Clinical Microbiology 40 (8): 2872 (2002) (شکل 6)
5 جدایه از این گونه (ازجمله F. falciforme SCUA-3Ra) از ریشه، ساقه و برگ گیاه لوبیا چشم‌بلبلی در اندیمشک، اهواز، شوش و عشارۀ کوچک جداسازی شدند.
قطر پرگنه در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از گذشت 7 روز روی محیط‌کشت PDA برابر 64 میلی‌متر است. ریسه‌ها بی‌رنگ هستند و رنگ پرگنه کرمی (نخودی‌رنگ) است. اندازۀ کنیدیومبرها 1/2-9/1×39/54-56/27 میکرومتر است. سلول‌های کنیدیوم‌زا به‌شکل انتهایی هستند و از کنیدیوم‌بر متمایز نیستند. کنیدیوم‌ها دیواره‌دار یا بدون دیواره و بی‌رنگ هستند و گاهی‌اوقات در گروه‌های کوچک مجتمع می‌شوند. ماکروکنیدیوم‌ها استوانه‌ای یا بیضوی‌شکل و ابعاد آنها 8/2-5/2×69/17-56/13 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‌ها بیشتر یک سلولی، تخم‌مرغی و کاماشکل و طول و عرض آنها 5/2-2/2×3/7-7/6 میکرومتر است.
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F. falciforme SCUA-3Raنشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‌شدۀ F. falciforme CBS 475.67 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀشناخته‌شدۀ F. falciforme CBS 475.67خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوتاستراپ ضعیف 71 درصد ایجاد کرد.
شکل 6-جدایۀ F. falciforme SCUA-3Ra. الف، ب، ج، د. ریسه، کنیدیوم، فیالید و کنیدیومبرها؛ ن، ی. شکل پرگنه پس‌از 7 روز روی محیط‌کشت PDA
Fusarium chlamydosporum Wollenw. & Reinking, Phytopathology 15 (3): 156 (1925) (شکل 7)
2 جدایه از این گونه (ازجمله F. chlamydosporum SCUA-2Sc) از ریشه و ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در مزارع لوبیاکاری شوش و مراونه جداسازی شدند.
قطر پرگنه در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس از گذشت 7 روز روی محیط‌کشت PDA برابر 52 میلی‌متر است. رنگ پرگنه ابتدا سفید تا کرمی‌رنگ است و با افزایش عمر، قهوه‌ای روشن می‌شود. کنیدیومبرها شفاف و پلی‌فیالید هستند و سلول کنیدیوم‌زا غالباً مونوفیالیدیک مشاهده می‌شود. ماکروکنیدیوم‌ها دارای 3 تا 6 دیوارۀ عرضی هستند، شکل آنها خمیده یا هلالی و در دو انتها نوک‌تیز است و اندازۀآنها 5/4-3×6/39-2/27 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل و معمولاً تک سلولی و گاهی دو سلولی یا سه سلولی هستند. اندازۀ میکروکنیدیوم‌ها 6/3-1/2×18-6 میکرومتر است. کلامیدوسپورها به‌شکل زنجیری روی ریسه تشکیل می‌شوند.
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F. chlamydosporum SCUA-2Sc نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀF. chlamydosporum CBS 635.76 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀ شناخته‌شدۀ Fusarium chlamydosporum CBS 635.76 خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوت استراپ ضعیف 68 درصد ایجاد کرد.
شکل 7- جدایۀ SCUA-2Sc F. chlamydosporum. الف، ب، پ، ت، ث. ریسه، کلامیدوسپور، کنیدیوم و کنیدیومبرها؛ ج، چ. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA
.Fusarium nygamai L.W. Burgess & Trimboli, Mycologia 78: 223 (1986)
(شکل 8)
7 جدایه از این گونه (ازجمله F. nygamai SCUA-7Rs) از ریشه، ساقه و برگ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اهواز، اندیمشک، اکیوش، شوش و مراونه جداسازی شدند.
قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 77 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در ابتدای رشد سفید است و پس‌از تولید رنگدانه به رنگ ارغوانی تیره درمی‌آید. کنیدیومبرها کوتاه هستند. سلول کنیدیوم‌زا در این گونه بیشتر مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب است و کنیدیوم‌ها روی فیالیدها به‌شکل مجتمع قرار دارند. ماکروکنیدیوم‌ها راست هستند و در برخی مواقع خمیدگی کمی در آنها دیده می‌شود. میکروکنیدیوم‌ها یک سلولی و خمیده هستند و اندازۀآنها 1/3-3/2×6/13-8/4 میکرومتر است. کلامیدوسپورها در این گونه فراوان هستند و به‌شکل انفرادی یا زنجیری در طول ریسه‌ها تشکیل می‌شوند.
شکل 8- جدایۀ F. nygamai SCUA-7Rs. الف، ب، ج، د. ریسه، کنیدیوم‌بر، فیالید، کلامیدسپور و کنیدیوم‌ها؛ ه، ی. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشتPDA
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F.nygamai SCUA-7Rs نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‌شدۀ F. nygamai CBS 749.97 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀ F. nygamai CBS 749.97 خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوتاستراپ 91 درصد ایجاد کرد.
.Fusarium proliferatum (Matsush.) .Nirenberg, Mitteilungen der Biologischen .Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft 169: 38 (1976) (شکل 9)
3 جدایه از این گونه (ازجمله F. proliferatum SCUA.2Rd) از ریشه و ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اکیوش، شوش و مراونه جداسازی شدند.
قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 55 میلی‌متر و رنگ پرگنه از روبه‌رو نارنجی کم‌رنگ و از پشت پتری نارنجی پررنگ است. سلول کنیدیوم‌زا باریک و مونوفیالید یا پلی‌فیالید است. ماکروکنیدیوم‌ها تقریباً باریک و راست و دارای 3 تا 4 دیوارۀ عرضی (بیشتر 3 دیوارۀ عرضی) هستند. اندازۀ ماکروکنیدیوم‌ها 9/2-3/2×19-6/13 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‌ها تخم‌مرغی یا دوکی‌شکل و دارای صفر تا 1 دیوارۀ عرضی هستند و گاهی اوقات در توده‌هایی کروی در انتهای فیالیدها تشکیل می‌شوند و ابعاد آنها 3-2×2/8-8/6 است. کلامیدوسپور در این گونه مشاهده نمی‌شوند.
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F. proliferatum SCUA.2Rd نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویه‌های شناخته‌شدۀ گونۀ F. proliferatum 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ F. proliferatum SCUA.2Rd با سویه‌های شناخته‌شده از این گونه و چندین گونۀ نزدیک (مانند F. dlaminii، F. equiseti، F. acutatum و F. concentricum) خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوتاستراپ 59 درصد ایجاد کرد.
شکل 9- جدایۀ F. proliferatum SCUA.2Rd. الف، ب، ج، د. ریسه، کنیدیوم‌بر، فیالید و کنیدیوم‌ها؛ ن، ی. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA.
Fusarium sp. (شکل 10)
جدایه‌های SCUA-4Rd، SCUA-4Rb، SCUA-1Rc، SCUA-7Rf و SCUA-2Rc از ریشۀ سالم گیاه لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری منطقۀ اکیوش، اهواز، شوش و مراونه جداسازی شدند..
قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 80 میلی‌متر است. پرگنه کرکی‌شکل و در ابتدا سفید‌رنگ است و پس‌از گذشت چند روز به نارنجی کم‌رنگ تغییر میکند. سلول کنیدیوم‌زا غالباً مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب است و کنیدیوم‌ها روی سلول کنیدیوم‌زا به‌شکل مجتمع هستند. ماکروکنیدیوم‌ها غالباً داسی‌شکل با انتهای مخروطیشکل دیده می‌شوند. ماکروکنیدیوم‌ها دارای 3 تا 6 دیوارۀ عرضی هستند و اندازۀ آنها 3/4-5/3×8/31-5/23 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‌ها تقریباً کلیوی تا دوکی‌شکل هستند و اغلب یک یا دو سلولی و گاهی سه سلولی دیده می‌شوند. اندازۀ میکروکنیدیوم‌ها 6/3-7/2×8/10-9 میکرومتر است. کلامیدوسپورها انفرادی یا زنجیری تشکیل می‌شوند.
شکل 10- جدایۀ SCUA-4Rd Fusarium sp.. الف، ب، پ، ت. ریسه، کلامیدوسپور، کنیدیوم‌بر و کنیدیوم‌ها. ج، پ. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA
نتایج جستجوی BLASTnجدایه‌های مطالعه‌شده از این گونه (جدایه‌های SCUA-4Rd، SCUA-4Rb-Vig-Ah، SCUA-1Rc و SCUA-2Rc) نشان دادند توالی ITSاین گونه با سویه‌های شناخته‌شده از گونه‌های F. equiseti و F. chlamydosporum99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‌های مطالعه‌شدۀ این گونه و جدایۀF. chlamydosporum SCUA-2Sc با سویه‌های شناخته‌شدۀ این دو گونه (F. chlamydosporum CBS 635.76 و F. equiseti NRRL 26419) و گونه‌های نزدیک F. incarnatum و F. sambucinum خوشه‌بندی شدند و کلادی با ارزش بوتاستراپ 85 درصد ایجاد کردند.
Penicillium oxalicum Currie & Thom, Journal of Biological Chemistry 22: 289 (1915) (شکل 11)
جدایۀ P.oxalicum SCUA-6Sd از ساقۀ سالم گیاه لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری جادۀ هفت‌تپه جداسازی شد.
قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 42 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در مرکز سبز و در حاشیه سفید مایل به کرم است و از پشت تشتک پتری کرم مایل به زرد دیده می‌شود. کنیدیومبرها بیشتر Biverticillate هستند. فیالیدها استوانه‌ای تا نیزه‌ای هستند و ابعاد آنها 1/4-3 23-18 میکرومتر است. میزان اسپوردهی فراوان، اسپورها شفاف، تخم‌مرغی‌شکل با سطح صاف و اندازۀ آنها 3/3-9/2×6/5-7/4 میکرومتر است.
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ P.oxalicum SCUA-6Sd نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀشناخته‌شدۀP. oxalicum CBS 219.30 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀ شناخته‌شدۀ P. oxalicum CBS 219.30و سویه‌ای از گونۀ P. asturianum خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوتاستراپ 94 درصد ایجاد کرد.
شکل 11- جدایۀ P.oxalicum SCUA-6Sd-Vig-Ht. الف، ب. ریسه، کنیدیوم‌بر، فیالید و کنیدیوم‌ها؛ ج، د. شکل پرگنه پس‌از 7 روز روی محیط‌کشت PDA
.Curvularia mosaddeghii M. Mehrabi-.Koushki & R. Farokhinejad, Mycosphere 9 (4): 641 (2018) (شکل 12)
جدایۀ C. mosaddeghii SCUA-1Rb2 از ریشۀ گیاه سالم لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری اهواز جداسازی شد.
ریسه‌ها منشعب و به رنگ قهوه‌ای روشن دیده می‌شوند. کنیدیومبرها قهوه‌ای‌رنگ هستند و ابعاد آنها 4/4-4×162-6/127 میکرومتر است. انتهای کنیدیومبرها زیگزاکی‌شکل دیده می‌شود و خروج کنیدیوم از کنیدیومبرها از نوع زیگزاگی است. کنیدیوم‌ها چهارحجرهای و دو سلول انتهایی کنیدیوم‌ها بسیار روشن و شفاف و دو سلول میانی تیرهتر هستند. حجرۀ سوم بزرگ و انحنادار است. طول و عرض کنیدیوم‌ها 5/10-8/9×5/23-8/21 میکرومتر است.
نتایج جستجوی BLASTn جدایۀ C. mosaddeghii SCUA-1Rb2 نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‌شدۀ C. mosaddeghii IRAN 3123C 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ C. sp. SCUA-1Rb2 با سویۀ C. mosaddeghii IRAN 3123C خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوتاستراپ 83 درصد ایجاد کرد.
شکل 12- جدایۀ C. mosaddeghii SCUA-1Rb2. الف، ب، ج. ریسه، کنیدیوم‌بر و کنیدیوم‌ها؛د. شکل پرگنه روی محیط‌کشت
Curvularia sp.1(شکل 13)
6 جدایه از این گونه (ازجمله Curvularia sp. IRAN 3120C) از ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اهواز، اندیمشک، اکیوش، صفی‌آباد و هفت‌تپه جداسازی شدند.
کنیدیومبرها به رنگ قهوه‌ای روشن با ابعاد 72/5-18/5×3/91-35/72 میکرومتر هستند. در محل جداشدن کنیدیوم از سلول کنیدیوم‌زا، کنیدیومبرها خمیدگی پیدا می‌کنند و به‌شکل زخم‌‌مانند دیده می‌شوند. کنیدیوم‌زایی به‌شکل زیگزاگ است. کنیدیوم در این جدایه‌ها بیشتر چهارحجرهای و گاهی سه‌حجره‌ای دیده می‌شود. شکل کنیدیوم‌ها راست است و هیچ انحنایی در آنها دیده نمی‌شود. کنیدیوم‌ها استوانه‌ای تا تخم‌مرغی‌شکل و در تمام طول خود به رنگ قهوه‌ای روشن هستند. اندازۀ کنیدیوم‌ها 6/9-9×3/24-2/13 میکرومتر است.
شکل 13- جدایۀ Curvularia sp. SCUA-1Sb. الف، ج، د. کنیدیوم‌بر و کنیدیوم‌ها، ب. شکل پرگنۀ پانزده‌روزه روی محیط‌کشت PDA.
نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ Curvularia sp. SCUA-1Sb نشاندادند توالی ITS این جدایه با سویه‌های شناخته‌شدهاز گونه‌های Curvularia buchloes (CBS 246.49) و Curvularia spicifera (CBS 274.52) 98 تا 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ Curvularia sp. SCUA-1Sb از سایر گونه‌های شناخته‌شدۀ نزدیک جدا شد و همراه با سایر سویه‌های Curvularia در کلادی بزرگ با ارزش بوتاستراپ 88 درصد قرار گرفت.
Curvulariasp.2 (شکل 14)
5 جدایه از این گونه (ازجمله جدایه‌های IRAN 3125C، IRAN 3124C و IRAN 3121C) از ریشه و ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اهواز و اندیمشک جداسازی شدند.
قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 65 میلی‌متر است. کنیدیومبرها به رنگ قهوه‌ای روشن، غیرمنشعب و دیواره‌دار هستند و خمیدگی زانویی‌شکل در انتهای آنها دیده می‌شود. ابعاد کنیدیومبرها 5/5-9/4×1/85-6/69 میکرومتر است. کنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل، غالباً راست و به‌ندرت انحنادار هستند و چهارحجرهای هستند. ابعاد کنیدیوم‌ها 7/8-1/8×8/23-7/22 میکرومتر است. کنیدیوم‌ها به‌شکل زیگزاگی از کنیدیومبرها جدا می‌شوند و زخم‌هایی در محل جداشدن کنیدیوم‌ها از کنیدیومبرها دیده می‌شوند.
شکل 14- جدایۀ Curvularia sp. IRAN 3121C. الف، ب، د. ریسه، کنیدیوم‌بر و کنیدیوم‌ها؛ ج. شکل پرگنه پانزده‌روزه روی محیط‌کشت PDA
نتایج جستجوی BLASTnجدایه‌های SCUA-1Ra، SCUA-1Rh و SCUA-4Sc نشاندادند توالی ITS این جدایه‌ها با سویه‌های شناخته‌شدهاز گونه‌های Curvularia buchloes (CBS 246.49) و Curvularia spicifera (CBS 274.52) 98 تا 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درستنمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‌های مطالعه‌شده با دو گونۀ نزدیک Curvularia buchloes و Curvularia spicifera خوشه‌بندی شدند و کلادی با ارزش بوتاستراپ 86 درصد ایجاد کردند.
بحث و نتیجهگیری
جدایه‌های اندوفیت شناسایی‌شده در پژوهش حاضر بر اساس بررسیهای ریخت‌شناسی و مولکولی به گونه‌های Alternaria destruens،Alternaria sp.،Curvularia mosaddeghii،Curvularia sp.،Fusarium chlamydosporum،F. nygamai،F. falciforme،F. proliferatum،Fusarium sp.،Macrophomina phaseolinaوPenicillium oxalicum تعلق داشتند. ویلسون[viii] (21) اندوفیت‌ها را قارچ‌ها یا باکتری‌هایی معرفی کرده است که در تمام یا بخشی از چرخۀ زندگی خود به بافت‌های گیاهان زنده حمله و آلودگی کاملاً غیرآشکار و بدون نشانه‌ای را داخل بافت‌های گیاهی ایجاد می‌کنند. در مطالعۀ حاضر، 60 جدایۀ اندوفیت از 12 گونۀ قارچی در گیاه لوبیا چشم‌بلبلی جداسازی و شناسایی شدند که بیشتر جدایه‌ها به سه جنس Alternaria، Fusarium و Curvularia تعلق داشتند. در مطالعه‌های پیشین نیز ثابت شده است قارچهایی که تولید کنیدیومهای چندسلولی تیره می‌کنند (مانند Alternaria و Curvularia) از مهمترین اندوفیت‌های گیاهی در مناطق گرم و معتدل هستند (22 و 23). مقایسۀ قارچ‌های اندوفیت در مناطق جغرافیایی مختلف نشان می‌دهد مناطق گرمسیری نسبت به مناطق شمالی سردسیری و یا معتدل تنوع اندوفیتی بیشتری دارند (24). در مطالعۀ حاضر نیز 12 اندوفیت قارچی در گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی منطقه‌ای گرمسیری ردیابی و شناسایی شدند که تنوع گونهای درخور توجهی را نشان میدهند. قارچ‌های اندوفیت در تمام طول عمر بافت گیاهی آلوده به اندوفیت و یا برای مدت زمان طولانی (تا زمانی که شرایط محیطی برای قارچ مساعد باشد و تکامل میزبان برای استفادۀ قارچ تغییر نکند) به‌طور نهفته داخل گیاه میزبان خود باقی می‌مانند اما ممکن است پس‌از آن به حالت بیماری‌زا تبدیل شوند (25). سیبر[ix] بیان کرده است طی مدتی که اندوفیت‌ها به‌ویژه قارچ‌ها درون گیاه زندگی می‌کنند ممکن است رابطۀ آنها از همزیست به حالت بیمارگر (عامل بیماری‌زا) و یا برعکس تغییر کند (26). بررسی قارچ‌های اندوفیت در مطالعۀ حاضر گویای اینست که تعدادی از آنها (ازجمله F. chlamydosporumوM. phaseonlina) قارچ‌های بیمارگر هستند و این نشان می‌دهد مرز زندگی اندوفیتی و بیمارگری قابل‌تفکیک نیست و شرایط محیطی و وضعیت تغذیه نوع برهم‌کنش را تغییر می‌دهد.
حضور اندوفیتی گونه‌های Alternaria در گیاهان مختلف (ازجمله گیاهان Suaeda fruticosa، S. aegyptiaca، Alhagi mannifera، Aeluropus lagopoides، Salicornia europaea، Malva parviflora، Cynodon dactylon و Polypogon monspeliensis) به‌خوبی شناخته شده است (27). گونۀ A. destruensدر ایران از گیاهان آفتابگردان (Helianthus annuus L.)، جو (Hordeum vulgare L.)، بادنجان (Solanum melongena L.) و انبه (Mangifera indica L.) گزارش شده است (28). در گذشته، این گونه به‌عنوان قارچ اندوفیت از گیاه جاتروفا (Jatropha curcas) (29) و درختان هلو (Prunus persica (L.) Batsch) (10) نیز جداسازی شده است. M. phaseolina عامل پوسیدگی ذغالی شناخته شده است و دامنۀ میزبانی وسیعی (بیش از 500 گونهی گیاهی) دارد (30)؛ لوبیا چشم‌بلبلی یکی از میزبان‌های این بیمارگر است که ایجاد بیماری در آن به مرحلۀ رشدی گیاه و شرایط محیطی بستگی دارد. جداسازی این بیمارگر از ریشۀ گیاهان سالم چالش‌برانگیز است و درنظرگرفتن آن به‌عنوان اندوفیت یا بیمارگری که مراحل اولیۀ آلودگیاش را طی میکند و هنوز به ظهور نشانه منجر نشده است محل ابهام است. چودهاری و کائوشینک[x] این گونه را به‌عنوان اندوفیت از روی ساقۀ گیاه Ocimum sanctum گزارش کرده‌اند (31). در ایران نیز حسن‌زاده[xi] آن را به‌عنوان اندوفیت از ریشۀ گیاه گاوپنبه جداسازی کرده است (32).سانگ[xii] و همکاران قارچ F. falciformeرا به‌عنوان اندوفیت از گیاه Mascarena lagenuulis جداسازی کرده‌اند (33). F. chlamydosporumیکی از عوامل پوسیدگی فوزاریومی ریشه و طوقه است (34)؛ این گونه به‌عنوان قارچ اندوفیت از گیاه Dendrobium cerumenatum گزارش شده است (35). جداسازی این قارچ به‌عنوان اندوفیت احتمالاً مرحلۀ نهفتۀ آلودگی و پیش‌از ظهور نشانه‌ها است. گونه‌های Fusarium از مهمترین اندوفیت‌های شناخته‌شده هستند (36). گونۀ F. nygamai معمولاً از روی بقایای گیاهی خاک‌های خشک گرمسیری و یا درارتباط‌با ریشه‌های غلات جداسازی شده است (37). این گونه به‌عنوان اندوفیت از ریشۀ گیاه پنبه نیز گزارش شده است (38). در گذشته،والینو[xiii] و همکاران گونۀ F. proliferatum را به‌عنوان گونۀ اندوفیت از برنج جداسازی کرده‌اند (36).لارنا[xiv] و همکاران گزارش کرده‌اند جدایه‌هایی از قارچ P. oxalicumباعث کاهش شدت بیماری پژمردگی آوندی گوجه‌فرنگی در اثر Verticillium dahlia و F. oxysporum f.sp. lycopersici در شرایط گلخانه و مزرعه می‌شوند (39). اغلب گونه‌های Curvularia ساپروفیت هستند اما تعدادی از آنها بیمارگرهای گیاهی، جانوری و انسانی هستند (40). همانند آنچه در مطالعۀ حاضر ردیابی و شناسایی شد تعدادی از گونه‌های Curvularia با گیاهان ارتباط اندوفیتی دارند (41-43).
این نخستین مطالعهای است که حضور اندوفیتی قارچ‌های Alternaria destruens،Alternaria sp.، M. phaseolina، Fusarium chlamydosporum،F. nygamai،F. falciforme،F. proliferatumوPenicillium oxalicum رادر گیاه لوبیاچشم بلبلی گزارش میکند.
سپاسگزاری
از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز برای حمایت مالی پژوهش حاضر سپاسگزاری می‌شود.
)