جداسازی و شناسایی اندوفیت‏های قارچی لوبیا چشم‏ بلبلی در استان خوزستان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ‌‌ایران

2 استادیار گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی و علوم زیستیدانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

3 استاد گروه گیاهپزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ‌‌ایران

چکیده

مقدمه: اندوفیت‌ها ریزجاندارانی هستند که بدون هیچ‌گونه نشانۀ آشکاری در بافت‌های داخلی گیاهان ساکن می‏شوند. مطالعۀ حاضر با هدف شناسایی و جداسازی قارچ‌های اندوفیت لوبیا چشم‌بلبلی (Vigna unguiculata (L.) Walp.) در استان خوزستان انجام شد.
مواد و روش‏‏ها: در سال 1395، هشت نمونۀ گیاهی سالم از مناطق مهم زیرکشت لوبیا چشم‏بلبلی در شمال استان خوزستان جمع‌آوری شدند. قطعه‌های کوچکی از ریشه، ساقه، برگ و غلاف هر نمونه ضدعفونی سطحی عمیق  و روی محیط‌غذایی سیب‌زمینی‌دکستروز‌آگار کشت شدند. 60 جدایۀ قارچی حاصل به روش تک‏اسپور خالص‏سازی و 21 جدایه بر اساس ویژگی‌های ریخت‏شناسی برای بررسی‏های مولکولی انتخاب شدند. جدایه‏ها در محیط سیب‌زمینی‌دکستروز‌براث رشد کردند و زیست‏تودۀ میسیلیومی با کاغذ صافی جمع‏آوری شد. استخراج DNA با استفاده از روش ارگانیک مبتنی بر فنل و کلروفرم انجام شد. بخش‏هایی از ژن nrRNA (نواحی ITS و 28S-D1/D2) با استفاده از آغازگرهای مناسب تکثیر و سپس توالی‌یابی شدند.
نتایج: جدایه‏های بررسی‌شده بر اساس ویژگی‌های ریخت‏شناسی، نتایج جستجوی BLASTn و فیلوژنی مبتنی بر ناحیۀ ITS تجزیه‌وتحلیل شدند و بر اساس آن گونه‏های Alternaria destruens،Alternaria sp.،Curvularia mosaddeghii،Curvularia sp.، Fusarium chlamydosporum،F. nygamai، F. falciforme،F. proliferatum،Fusarium sp.،Macrophomina phaseolinaوPenicillium oxalicum شناسایی شدند.
بحث و نتیجه‏گیری: جنس‏های Alternaria، Fusarium و Curvularia فراوان‏ترین اندوفیت‏های قارچی در گیاه لوبیاچشم‏بلبلی در زیست‏بوم گرم استان خوزستان هستند. بر اساس دانش ما، این نخستین مطالعه‏ای است که حضور اندوفیتی قارچ‏های Alternaria destruens،Alternaria sp.، M. phaseolina، Fusarium chlamydosporum،F. nygamai،F. falciforme،F. proliferatumوPenicillium oxalicum رادر گیاه لوبیا‏چشم بلبلی گزارش می‏کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and Identification of Fungal Endophytes of the Cowpea in Khuzestan Province

نویسندگان [English]

  • Sahar Jonbozorgi 1
  • Mehdi Mehrabi-Koushki 2
  • Reza Farokhinejad 3
1 M.Sc. Student, Plant Protection Department, Shahid Chamran University of Ahvaz, Iran
2 Assistant professor, Department of Plant Protection, Agriculture Faculty, Biotechnology and Life Sciences Research Center, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
3 Professor, Plant Protection Department, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
چکیده [English]

Introduction: Endophytes are microorganisms that colonize internal tissues of plants without causing obvious symptoms. This study was conducted to isolate and identify endophytic fungi of the cowpea in Khuzestan province.
Materials and methods: During 2016, eight healthy samples of the cowpea plants were collected from the important areas under cultivation in the northern Khuzestan province. The small parts of the roots, stems, leaves and pods were deeply surface sterilized for each samples and plated on Potato-Dextrose-Agar. Sixty fungal isolates obtained in this study were purified by single spore method. Based on morphological characteristics, 21 out of 60 isolates were selected for molecular study. The isolates were grown in Potato-Dextrose-Broth and mycelial biomass was recovered by passing through filter paper. DNA extraction was performed using a phenol- and chloroform- based organic method. The parts of the nrRNA gene (ITS and 28S-D1/D2 regions) were amplified using appropriate primer pair and then sequenced.
Results: The isolates were analyzedon the basis of morphological characteristics in combination with BlASTn search algorithm and ITS sequence-based phylogeny. Accordingly, the isolates were identified as follows: Alternaria destruens, Alternaria sp., Curvularia mosaddeghii, Curvularia sp., Fusarium chlamydosporum, F. nygamai, F. falciforme, F. proliferatum, Fusarium sp. Macrophomina phaseolina and Penicillium oxalicum.
Discussion and conclusion: Alternaria, Fusarium and Curvularia genera were the most abundant fungal endophytes into cowpea plants, growing in warm climate of the Khuzestan Province. To the best of our knowledge, this is the first study to report endophytic growth of A. destruens, Alternaria sp., M. phaseolina, F. chlamydosporum, F. nygamai, F. falciforme, F. proliferatum and P. oxalicum within cowpea plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Fungal Endophyte
  • Cowpea
  • Alternaria
  • Fusarium
  • Curvularia
  • Macrophomina
  • Penicillium

مقدمه

لوبیا چشم‌بلبلی (Vigna unguiculata (L.)Walp.) گیاهی مخصوص مناطقگرمسیر و نیمه‌گرمسیر است که در سطح اقتصادی در استان خوزستان کشت می‌شود. اندوفیت‌ها مجموعه‌ای از ریزجانداران (قارچ یا باکتری) هستند که بدون ایجاد نشانه و با رشد درون‌سلولی یا بین‌سلولی در بافت‌های گیاهان زندگی می‌کنند و منابعی غنی از ترکیبات زیستی فعال هستند (1 و 2). قارچ‌های اندوفیت ریزجاندارانی هستند که در بافت‌های داخلی گیاهان زنده ساکن هستند و هیچ‌گونه آثار منفی فوری وآشکاری را در میزبان‌های خود ایجاد نمی‏کنند (3). تمام گیاهان آوندی و غیر‌آوندی خشکی‌زی و دریا‌زی زیستگاه اندوفیت‏ها هستند (4 و 5). حضور ریزجانداران اندوفیت در بافت‌های علفی و چوبی تمام اندام‌های گیاهی ازجمله بافت‌های ریشه، ساقه، شاخه، پوست، برگ، دمبرگ، گل، میوه و دانه ثابت شده است (6). فلور اندوفیتی ازنظر جمعیت و تنوع در میزبان‌های مختلف متفاوت است و به موقعیت جغرافیایی رشد میزبان بستگی دارد (7 و 8). حدود 300000 گونۀ گیاهی روی زمین وجود دارد و هر گیاه منحصراً میزبان یک تا تعداد بیشتری اندوفیت است (2).

دهقان‌پور[1] و همکاران (9) قارچ‌های اندوفیت را از غلاف برگ و بذرهای میزبان‌های گیاهی Festuca arundinaceae،F. pratensis،F. ovina،Bromus tomentellus،Lolium prenneو Melica persica جدا‌سازی کردند. بیشتر جدایه‌های بررسی‌شده در این پژوهش از‌نظر ریخت‌شناسی با توصیف عمومی جنس AcremoniumوNeotyphodiumشباهت داشتند. هاشم‌لو[2] و همکاران (10) قارچ‌های اندوفیت درختان میوۀ هسته‌دار را در استان آذربایجان غربی بررسی کردند و گونه‌های مختلفی از جنس‌های Aspergillus،Alternaria،Ulocladium،Stemphylium،Trichoderma،Penicillium،Trichothecium،Epicoccum،Phoma،Fusarim،Sordaria، Cladosporiumو Coniothyriumرا بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی شناسایی کردند. خرسندی[3] و همکاران (11) تنوع قارچ‌های اندوفیت را در شاخه و پوست درختان چنار بررسی کردند. در این مطالعه، قارچ‏های F. avenaceum،Cochliobolus victoriae،Cyclothyrium sp.، sp.Ulocladium،Chaetomium sp. و Humicola sp. دارای بیشترین فراوانی در درختان چنار بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و مولکولی بودند. هرقلی[4] و همکاران (12) 15 گونه متعلق به 10 جنس قارچی را از درختان انگور جداسازی و شناسایی کردند.

باتوجه‌به اینکه تاکنون مطالعۀ کافی روی اندوفیت‌های ساکن در گیاه لوبیا چشم‌بلبلی انجام نشده است، پژوهش حاضر می‌کوشد تنوع گونه‏ای قارچ‏های اندوفیت را در این گیاه بررسی کند.

 

مواد و روش‏ها

..نمونه‏برداری و جداسازی اندوفیت‏های قارچی از گیاه لوبیا چشم‏بلبلی: بخش‌های مختلف ریشه، ساقه و برگ بوته‌های کاملاً سالم و بدون نشانۀ بیماری از هشت منطقۀ لوبیاکاری شمال استان خوزستان جمع‏آوری شدند (جدول 1). نمونه‌های گیاهی به قطعه‌های 5/0 تا 1سانتی‌متری تقسیم و به‌مدت 30 ثانیه در اتانول 70 درصد و سپس، به‌مدت 2 دقیقه در محلول هیپوکلریت‌سدیم 2 درصد غوطه‌ور شدند و درنهایت، سه مرتبه با آب مقطر سترون شستشو شدند. پس‌از خشک‌شدن قطعه‌های گیاهی روی کاغذ صافی سترون، نمونه‌ها به محیط‌غذایی سیب‌زمینی‌دکستروز‌آگار (PDA) منتقل و به‌مدت 5 تا 10 روز در انکوباتوری با دمای 28 درجۀ سانتی‏گراد و شرایط تاریکی نگهداری شدند. قارچ‌های رشد‌کرده به تشتک‌های پتری جدید منتقل شدند. خالص‏سازی جدایه‏ها به روش تک‏اسپور انجام شد (13).

 

 

جدول 1- ویژگی‌های توالی‏های به‌دست‏آمده در مطالعۀ حاضر و شمارۀ دسترسی آنها در بانک ژن

شمارۀ توالی‌ها در بانک ژن

محل جمع‌آوری

نام جدایه

نام گونه

28S-D1/D2

ITS

MG971383

MG971296

شاوور

SCUA-8Sd

Alternaria destruens

MG971365

MG971274

مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک

SCUA-1Sc

A.destruens

MG971379

MG971290

صفی‌آباد، پس‌از مرکز تحقیقات

SCUA-6Se

A.destruens

MG971372

MG971282

اکیوش

SCUA-4Rh

Alternaria sp..

-

MG971295

شاوور

SCUA-8Rb

Alternaria sp.

تحت ثبت

تحت ثبت

مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک

SCUA-1Rb2

Curvularia mosaddeghii

MG971373

MG971283

اکیوش

IRAN 3121C; SCUA-4Sc

Curvularia. sp.2

MG971361

MG971269

مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک

IRAN 3125C; SCUA-1Ra

Curvularia sp.2

MG971364

MG971272

مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک

IRAN 3124C; SCUA-1Rh

Curvularia sp.2

-

MG971273

مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک

IRAN 3120C; SCUA-1Sb

Curvularia sp.1

MG971381

MG971293

روبه‌روی بیمارستان نظام مافی شوش

SCUA-7Rs

Fusarium nygamai

MG971368

MG971277

روستای مراونه بیت صحین

SCUA-2Sc

F. chlamydosporum

MG971369

MG971278

عشارۀ کوچک

SCUA-3Ra

F. falciforme

MG971367

MG971276

روستای مراونه بیت صحین

SCUA-2Rd

F. proloferatum

MG971363

MG971271

مزارع پس‌از پلیس‌راه اهواز، اندیمشک

SCUA-1Rc

Fusarium sp.

MG971366

MG971275

روستای مراونه بیت صحین

SCUA-2Rc

Fusarium sp.

MG971380

MG971292

روبه‌روی بیمارستان نظام مافی شوش

SCUA-7Rf

Fusarium sp.

-

MG971280

اکیوش

SCUA-4Rb

Fusarium sp.

MG971371

MG971281

اکیوش

SCUA-4Rd

Fusarium sp.

MG971382

MG971294

شاوور

SCUA-8Ra

Macrophomina phaseonlina

MG971378

MG971289

صفی‌آباد، پس‌از مرکز تحقیقات

SCUA-6Sd

Pecicillium oxalicum

 


بررسی ریخت‌شناسی:شکل ظاهری پرگنه و رنگ آن، ویژگی‌های رشدی، ریخت‌شناسی اندام‌های تولید‌مثلی، کنیدیوم‏‌ها و کلامیدوسپورها به‌منظور بهره‌گیری در شناسایی جدایه‌ها بررسی شدند. تصاویر با میکروسکوپ نوری (OLYMPUS BX51) متصل به دوربین دیجیتال (OLYMPUS DP12) تهیه شدند.

بررسی مولکولی جدایه‌ها: جدایه‌های قارچی در محیط‌کشت سیب‌زمینی‌دکستروز‌براث (PDB) به‌مدت 10 روز در شرایط تاریکی مطلق و دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد درون شیکر انکوباتور رشد داده شدند. تودۀ میسیلیومی رشد‌یافته با پمپ خلأ، قیف و کاغذ صافی سترون جمع‌آوری شد و پس‌از شستشو، در لوله‌های سانتریفیوژ 50 میلی‌لیتری در دستگاه فریزدرایر (Freeze-Dryer, Alpha 1–2LD Plus, Christ). خشک انجمادی شد. زیست‏توده در هاون چینی حاوی ازت مایع پودر و تا زمان استخراج DNA در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‏گراد نگهداری شد. استخراج DNA به روش ریدر و برودا[5] (14) با اندکی تغییر انجام شد (15). جفت آغازگر عمومی ITS1-F و NL4-R برای تکثیر حدود 1200 جفت باز از نواحی 18S، ITS1، 5.8S، ITS2 و 28s-D1/D2 مربوط به rDNA هسته‌ای استفاده شد (16 و 17). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از ترموسایکلر مدل‌های Biometra و Biorad انجام شد. مخلوط واکنش زنجیره‏ای پلیمراز و برنامۀ حرارتی برای تکثیر این نواحی ژنی بر اساس روش پیشنهادی حیدری و همکاران (18) تهیه و انجام شد. پس‌از انجام الکتروفورز، باندهای با اندازۀ حدود 1200 جفت باز برش داده شدند و خالص‌سازی DNA با استفاده از کیت تجاری Vivantis GF-1 Gel DNA Recavery Kit و دستورعمل ارائه‌شده در آن انجام شد.شرکت ماکروژن محصولات PCR را با آغازگرهای استفاده‌شده در تکثیر توالی‏یابی کرد. توالی‌ها با نرم‌افزار بیوادیت نسخۀ 4.0.6.2 [6] (19) و DNA Baser نسخۀ 3.5.0 (www.DnaBaser.com) ویراستاری و مونتاژ شدند. توالی‏ها به پایگاه اطلاعات ژنوم NCBI معرفی و با استفاده از الگوریتم BLASTn برای شناسایی هیت‏های بلاست و توالی‏های شناخته‌شدۀ مرتبط جستجو شدند. درختان فیلوژنتیکی با استفاده از الگوریتم درست‏نمایی بیشینه و با نرم‌افزار مگا نسخۀ 6[7] ترسیم شدند (20).

 

نتایج

در پژوهش حاضر، درمجموع 60 جدایۀ قارچی از بخش‌های مختلف (25 جدایه از ریشه، 21 جدایه از ساقه و 14 جدایه از برگ) هشت نمونه گیاه سالم لوبیا چشم‌بلبلی جمع‏آوری‌شده از هشت منطقۀ لوبیا‌کاری در اهواز و شمال استان خوزستان جداسازی، خالص‌سازی و بررسی شدند (شکل 1). در این طبقه‌بندی، 23 جدایه از جنس Alternaria، 22 جدایه از جنس Fusarium، 12 جدایه از جنس Curvularia، 2 جدایه از جنس Macrophomina و 1 جدایه از جنس Penicillium به دست آمد (جدول 2).

 

 

 

شکل 1- نمودار فراوانی جدایه‌های قارچی به‌دست‌آمده از بخش‌های ریشه، ساقه و برگ

جدول 2- گروه‏بندی جدایه‏ها بر اساس صفت‌های ریخت‏شناسی

برخی ویژگی‌های مهم ریخت‏شناسی

تعداد جدایه

گروه ریخت‌شناسی

کنیدیوم‏ها با اندازۀ حدود 5/11-3/10×8/31-2/28 میکرومتر، تعداد دیوارۀ عرضی در آنها 1 تا 7 (بیشتر دارای 3 تا 5 دیواره) و تعداد دیوارۀ طولی 1 تا 4

15

Alternaria destruens

کنیدیوم‏ها با اندازۀ حدود 15-8/13×2/39-7/33 میکرومتر، تعداد دیوارۀ عرضی در آنها 3 تا 7 و تعداد دیوارۀ طولی 1 تا 3

8

Alternaria sp.

کنیدیوم‏زایی زیگزاگی (سیمپودیال)، کنیدیوم‌ها چهار‌حجره‌ای، دو سلول انتهایی کنیدی‌ها روشن و دو سلول میانی تیره‏تر، حجرۀ سوم بزرگ و انحنادار و اندازۀ آنها 5/10-8/9×5/23-8/21 میکرومتر

1

Curvularia mosaddeghii

کنیدیوم‏زایی زیگزاگی، کنیدیوم‌ها راست و بدون انحنا، بیشتر چهار‏حجره‌ای و گاهی سه‏حجره‌ای، استوانه‌ای تا تخم‌مرغی‌شکل، قهوه‌ای روشن و اندازۀ آنها 6/9-9×3/24-2/13 میکرومتر

6

Curvularia. sp.1

کنیدیوم‏زایی زیگزاگی، کنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل، بیشتر راست و به‌ندرت کمی انحنادار، چهار‌حجره‏ای و ‏اندازۀ آنها 7/8-1/8×8/23-7/22 میکرومتر

5

Curvularia sp.2

پرگنۀ کامل ارغوانی تیره، کنیدیوم‌برها کوتاه، سلول‏های کنیدیوم‌زایی بیشتر مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب و کنیدیوم‌ها روی آنها به‌طور مجتمع هستند، ماکروکنیدی‌ها راست یا دارای کمی خمیدگی، میکروکنیدی‌ها یک سلولی، خمیده و اندازۀ آنها 1/3-3/2×6/13-8/4 میکرومتر، کلامیدوسپورها فراوان و انفرادی یا زنجیری

7

Fusarium nygamai

پرگنۀ کامل قهوه‌ای روشن، کنیدیوم‌برها شفاف و پلی‌فیالید، ماکروکنیدیوم‌ها با 3 تا 6 دیوارۀ عرضی، خمیده یا هلالی و اندازۀ آنها 5/4-3×6/39-2/27 میکرومتر، میکروکنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل، معمولأ تک سلولی و اندازۀ آنها 6/3-1/2×18-6 میکرومتر،کلامیدوسپورها زنجیری

2

F. chlamydosporum

پرگنۀ کامل کرمی، سلول‌های کنیدی‌زا به‌طور انتهایی و غیرقابل‌تمیز از کنیدیوم‌بر، ماکروکنیدیوم‌ها استوانه‌ای یا بیضوی‌شکل و ابعاد آنها 8/2-5/2×69/17-56/13 میکرومتر؛ میکروکنیدیوم‌ها اکثراً یک سلولی، تخم‌مرغی و کاماشکل و اندازۀ آنها 5/2-2/2×3/7-7/6 میکرومتر

5

F. falciforme

پرگنۀ کامل نارنجی، سلول‏های کنیدیوم‌زا باریک و مونوفیالید یا پلی‌فیالید، ماکروکنیدیوم‌ها راست، 3 تا 4 دیوارۀ عرضی و اندازۀ آنها 9/2-3/2×19-6/13 میکرومتر، میکروکنیدیوم‌ها تخم‌مرغی یا دوکی‏شکل، صفر یا 1 دیوارۀ عرضی و ابعاد آنها 3-2×2/8-8/6

3

F. proloferatum

پرگنۀ کامل نارنجی، سلول‏های کنیدیوم‌زا غالباً مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب و کنیدیوم‌ها روی آنها به‌طور مجتمع، ماکروکنیدیوم‌ها غالباً داسی‌شکل‏، 3 تا 6 دیوارۀ عرضی و اندازۀ آنها 3/4-5/3×8/31-5/23 میکرومتر، میکروکنیدیوم‌ها تقریبأ کلیوی تا دوکی‌شکل، اغلب یک تا دو سلولی، اندازۀ آنها 6/3-7/2×8/10-9 میکرومتر، کلامیدوسپورها انفرادی یا زنجیری

5

Fusarium sp.

پرگنه دارای رشد سریع، در مرکز دودی و تیره و در حاشیه سفید مایل به خاکستری، تولید سختینه‌های سیاه‌رنگ به‌طور پراکنده و به اشکال گرد، بیضوی و نیمه‌کروی

2

Macrophomina phaseonlina

پرگنه در مرکز سبز و در حاشیه سفید مایل به کرم، کنیدیوم‌برها غالباً Biverticillate، فیالیدها استوانه‌ای تا نیزه‌ای و ابعاد آنها 1/4-3×23-18 میکرومتر، کنیدیوم‏ها تخم‌مرغی‌شکل و اندازۀ آنها 3/3-9/2×6/5-7/4 میکرومتر

1

Pecicillium oxalicum

 


بررسی مولکولی: 21 جدایه در بررسی مولکولی استفاده شدند و توالی‌های به‌دست‌آمده در بانک ژن ثبت شدند (جدول 1). میزان شباهت توالی‌های هر ژن از هر جدایه با سویه‌های شناخته‌شده از طریق انجام جستجوی BLASTn آشکار شد. درختی تک‏ژنی مبتنی بر ناحیۀ ITS با استفاده از الگوریتم درست‏نمایی بیشینه برای تمام جدایه‏های بررسی‌شده ترسیم شد (شکل 2) و جداسازی فیلوژنتیکی جدایه‏ها با نزدیک‏ترین گونه‏های خویشاوند تجزیه‌و‌تحلیل شد. ناحیۀ 28S-D1/D2 در جستجوی BLASTn و رسم درخت فیلوژنتیکی به شناسایی گونه‏ها کمکی نکرد و نتایج آن ارائه نشده‌اند و فقط شمارۀ دسترسی آن در بانک ژن آورده شده است (جدول 1).

 

 

شکل 2- درخت تک‏ژنی بدون مقیاس گونه‏های بررسی‌شده در تجزیه‌وتحلیل درست‏نمایی بیشینه بر اساس توالی ITS با استفاده از مدل K2+G+I. ارتباط فیلوژنتیکی جدایه‏های بررسی‌شده (با دایرۀ توپر قرمز نشان داده شده است) فقط با گونه‏های نزدیک آنها نشان داده شده است. اعداد اعتبار‏سنجی زیر 50 درصد نشان داده شده است.


Alternaria destruens E.G. Simmons, Mycotaxon 68: 419 (1998) (شکل 3)

15 جدایه از این گونه (ازجمله جدایه‌های SCUA-8Sd، SCUA-6Se و SCUA-1Sc) از ریشه، ساقه‌ و برگ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اکیوش، اهواز، اندیمشک، شاوور، شوش، صفی‌آباد و مراونه جداسازی شدند.

قطر پرگنۀ قارچ پس‌از مایه‌زنی روی محیط‌کشت PDA در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از 7 روز برابر 55 میلی‌متر و رنگ پرگنه سبز زیتونی تیره است. پرگنه دارای ظاهری مسطح و چسبیده به سطح محیط‌کشت است. کنیدیوم‌برها به رنگ قهوه‌ای روشن هستند و ابعاد آنها 65/4-4×5/56-33 میکرومتر است. کنیدیوم‏‌ها به‌شکل زنجیره‌‌های ساده و غیرمنشعب روی کنیدیوم‌برها تشکیل می‌شوند. کنیدیوم‏‌ها به شکل تخم‌مرغی یا بیضوی هستند؛ تعداد دیوارۀ عرضی در آنها بین 1 تا 7 عدد متغیر است ولی بیشتر دارای 3 تا 5 دیواره هستند و تعداد دیوارۀ طولی در آنها 1 تا 4 عدد است. کنیدیوم‏‌ها به رنگ قهوه‌ای روشن و دارای زایده در انتهای خود هستند. سطح کنیدیوم‏‌ها صاف است و هیچ‌گونه تزییناتی روی آنها دیده نمی‌شود. ابعاد کنیدیوم‏‌ها 5/11-3/10×8/31-2/28 میکرومتر است.

نتایج جستجوی BLASTnجدایه‌های SCUA-8Sd، SCUA-6Se و SCUA-1Sc نشان دادند توالی ITSاین جدایه‌ها با سویه‌های شناخته‏شدۀ A. destruens ازجمله سویۀ A. destruens ATCC 204363 99 تا 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‏های بررسی‌شده با سویۀ‏ شناخته‌شدۀ A. destruensATCC 204363 و سویه‏‏هایی از گونه‏های نزدیک به این گونه (ازجمله A. alstroemeriae، A. arborescens، A. angustiovoideaوA. cerealis) خوشه‏بندی شدند و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 97 درصد ایجاد کردند. این درخت تک‏ژنی نتوانست به‌طور معتبر این گونه را ازنظر فیلوژنتیکی از سایر گونه‏ها جداسازی کند.

 

 

شکل 3- جدایۀ A. destruens SCUA-8Sd. الف، ب، پ، ث. کنیدیوم‏ و کنیدیوم‌برهای اولیه؛ ت، ج. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA

 

Alternariasp. (شکل 4)

8 جدایه از این گونه (ازجمله جدایه‏های SCUA-4Rh و SCUA-8Rb) از ریشه‌، ساقه و برگ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اکیوش، اهواز، اندیمشک، شاوور، شوش و صفی‌آباد جداسازی شدند.

قطر پرگنۀ قارچ پس از مایه‌زنی روی محیط‌کشت PDA در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از 7 روز برابر 68 میلی‌متر و رنگ پرگنه سبز زیتونی تیره است. کنیدیوم‏برها منشعب و به رنگ قهوه‌ای روشن هستند، خمیدگی زانویی در انتهای آنها دیده می‌شود و ابعاد آنها 1/4-8/3×4/76-6/41 میکرومتر است. کنیدیوم‏‌ها به‌شکل زنجیره‌‌های ساده و غیرمنشعب روی کنیدیوم‏برها تشکیل می‌شوند. کنیدیوم‏‌ها در انتها باریک‌شده و به اشکال تخم‌مرغی یا بیضوی دیده می‌شوند و تعداد دیوارۀ عرضی از 3 تا 7 عدد و تعداد دیوارۀ طولی بین 1 تا 3 عدد در آنها متغیر است. کنیدیوم‏‌ها به رنگ قهوه‌ای روشن و در انتهای خود دارای زایده هستند. سطح کنیدیوم‏‌ها صاف است و هیچ‌گونه تزییناتی روی آنها دیده نمی‌شود. ابعاد کنیدیوم‏‌ها 15-8/13×2/39-7/33 میکرومتر است.

 

 

شکل 4- جدایۀ Alternaria sp. SCUA-8Rb. الف، ب، ج، د. تولید کنیدیوم و کنیدیوم‏بر؛ ن، ی. شکل پرگنه پس‌از گذشت یک هفته روی محیط PDA

نتایج جستجوی BLASTnجدایه‏های SCUA-4Rh و SCUA-8Rb نشان دادند توالی ITSاین گونه با سویۀ شناخته‌شدۀ Alternaria ceralis CBS 119544 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‏های SCUA-4Rh و SCUA-8Rb با سایرگونه‏های نزدیک جنس Alternaria مانند A. eichhorniae و A. iridiaustralis همراه شدند و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 97 درصد ایجاد کردند.

 

Macrophomina phaseolina (شکل 5)

2 جدایۀ M. phaseolina SCUA-8Ra و M. phaseolina SCUA-3Rg از ریشۀ سالم گیاه لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری منطقۀ اکیوش جداسازی شدند.

رشد قارچ بسیار سریع و قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 3 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 80 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در مرکز دودی و تیره و در حاشیه سفید مایل به خاکستری دیده می‌شود. ریسه‌ها رشد هوایی نیز دارند و سختینه‌های سیاه‌رنگی به‌طور ‌پراکنده روی پرگنه مشاهده می‌شوند که به اشکال گرد، بیضوی و نیمه‌کروی هستند.

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ M. phseolina SCUA-8Ra نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‏شدۀ Macrophomina phaseolina CBS 313.51 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ M. phseolina SCUA-8Ra با سویۀ شناخته‌شدۀ M. phaseolina CBS 313.51 خوشه‏بندی شد و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 100 درصد ایجاد کرد.

 

شکل 5- جدایۀ M. phseolina SCUA-8Ra. الف، ب، پ. ریسه‏ها و سختینه؛ ج، د. شکل پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از گذشت 4 روز

 

Fusarium falciforme (Carrion) Summerb. .& Schroers, Journal of Clinical Microbiology 40 (8): 2872 (2002) (شکل 6)

5 جدایه از این گونه (ازجمله F. falciforme SCUA-3Ra) از ریشه، ساقه و برگ گیاه لوبیا‌ چشم‌بلبلی در اندیمشک، اهواز، شوش و عشارۀ کوچک جداسازی شدند.

قطر پرگنه در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس‌از گذشت 7 روز روی محیط‌کشت PDA برابر 64 میلی‌متر است. ریسه‏ها بی‌رنگ هستند و رنگ پرگنه کرمی (نخودی‌رنگ) است. اندازۀ کنیدیوم‌برها 1/2-9/1×39/54-56/27 میکرومتر است. سلول‌های کنیدیوم‏‌زا به‌شکل انتهایی هستند و از کنیدیوم‌بر متمایز نیستند. کنیدیوم‏‌ها دیواره‌دار یا بدون دیواره و بی‌رنگ هستند و گاهی‌اوقات در گروه‌های کوچک مجتمع می‌شوند. ماکروکنیدیوم‏‌ها استوانه‌ای یا بیضوی‌شکل و ابعاد آنها 8/2-5/2×69/17-56/13 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‏‌ها بیشتر یک سلولی، تخم‌مرغی و کاماشکل و طول و عرض آنها 5/2-2/2×3/7-7/6 میکرومتر است.

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F. falciforme SCUA-3Raنشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‏شدۀ F. falciforme CBS 475.67 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀشناخته‌شدۀ F. falciforme CBS 475.67خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوت‏استراپ ضعیف 71 درصد ایجاد کرد.

 

 

شکل 6-جدایۀ F. falciforme SCUA-3Ra. الف، ب، ج، د. ریسه، کنیدیوم، فیالید و کنیدیوم‏برها؛ ن، ی. شکل پرگنه پس‌از 7 روز روی محیط‌کشت PDA

 

Fusarium chlamydosporum Wollenw. & Reinking, Phytopathology 15 (3): 156 (1925) (شکل 7)

2 جدایه از این گونه (ازجمله F. chlamydosporum SCUA-2Sc) از ریشه و ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در مزارع لوبیاکاری شوش و مراونه جداسازی شدند.

قطر پرگنه در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد پس از گذشت 7 روز روی محیط‌کشت PDA برابر 52 میلی‌متر است. رنگ پرگنه ابتدا سفید تا کرمی‌رنگ است و با افزایش عمر، قهوه‌ای روشن می‌شود. کنیدیوم‌برها شفاف و پلی‌فیالید هستند و سلول کنیدیوم‏‌زا غالباً مونوفیالیدیک مشاهده می‌شود. ماکروکنیدیوم‌ها دارای 3 تا 6 دیوارۀ عرضی هستند، شکل آنها خمیده یا هلالی و در دو انتها نوک‌تیز است و اندازۀآنها 5/4-3×6/39-2/27 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‌ها بیضوی‌شکل و معمولاً تک سلولی و گاهی دو سلولی یا سه سلولی هستند. اندازۀ میکروکنیدیوم‌ها 6/3-1/2×18-6 میکرومتر است. کلامیدوسپورها به‌شکل زنجیری روی ریسه تشکیل می‌شوند.

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F. chlamydosporum SCUA-2Sc نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀF. chlamydosporum CBS 635.76 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀ شناخته‏شدۀ Fusarium chlamydosporum CBS 635.76 خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوت استراپ ضعیف 68 درصد ایجاد کرد.

 

شکل 7- جدایۀ SCUA-2Sc F. chlamydosporum. الف، ب، پ، ت، ث. ریسه، کلامیدوسپور، کنیدیوم و کنیدیوم‏برها؛ ج، چ. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA

 

.Fusarium nygamai L.W. Burgess & Trimboli, Mycologia 78: 223 (1986)
 
(شکل 8)

7 جدایه از این گونه (ازجمله F. nygamai SCUA-7Rs) از ریشه، ساقه و برگ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اهواز، اندیمشک، اکیوش، شوش و مراونه جداسازی شدند.

قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 77 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در ابتدای رشد سفید است و پس‌از تولید رنگدانه به رنگ ارغوانی تیره درمی‌آید. کنیدیوم‌برها کوتاه هستند. سلول کنیدیوم‏‌زا در این گونه بیشتر مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب است و کنیدیوم‏‌ها روی فیالیدها به‌شکل مجتمع قرار دارند. ماکروکنیدیوم‏‌ها راست هستند و در برخی مواقع خمیدگی کمی در آنها دیده می‌شود. میکروکنیدیوم‏‌ها یک سلولی و خمیده هستند و اندازۀآنها 1/3-3/2×6/13-8/4 میکرومتر است. کلامیدوسپورها در این گونه فراوان هستند و به‌شکل انفرادی یا زنجیری در طول ریسه‌ها تشکیل می‌شوند.

 

 

شکل 8- جدایۀ F. nygamai SCUA-7Rs. الف، ب، ج، د. ریسه، کنیدیوم‏بر، فیالید، کلامیدسپور و کنیدیوم‏ها؛ ه، ی. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشتPDA

 

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F.nygamai SCUA-7Rs نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‌شدۀ F. nygamai CBS 749.97 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀ F. nygamai CBS 749.97 خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 91 درصد ایجاد کرد.

 

.Fusarium proliferatum (Matsush.) .Nirenberg, Mitteilungen der Biologischen .Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft 169: 38 (1976) (شکل 9)

3 جدایه از این گونه (ازجمله F. proliferatum SCUA.2Rd) از ریشه و ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اکیوش، شوش و مراونه جداسازی شدند.

قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 55 میلی‌متر و رنگ پرگنه از روبه‌رو نارنجی کم‌رنگ و از پشت پتری نارنجی پررنگ است. سلول کنیدیوم‏‌زا باریک و مونوفیالید یا پلی‌فیالید است. ماکروکنیدیوم‏‌ها تقریباً باریک و راست و دارای 3 تا 4 دیوارۀ عرضی (بیشتر 3 دیوارۀ عرضی) هستند. اندازۀ ماکروکنیدیوم‏‏ها 9/2-3/2×19-6/13 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‏‌ها تخم‌مرغی یا دوکی‌شکل و دارای صفر تا 1 دیوارۀ عرضی هستند و گاهی ‌اوقات در توده‌هایی کروی در انتهای فیالیدها تشکیل می‌شوند و ابعاد آنها 3-2×2/8-8/6 است. کلامیدوسپور در این گونه مشاهده نمی‌شوند.

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ F. proliferatum SCUA.2Rd نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویه‏ها‏ی شناخته‌شدۀ گونۀ F. proliferatum 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ F. proliferatum SCUA.2Rd با سویه‏های شناخته‌شده از این گونه و چندین گونۀ ‏نزدیک (مانند F. dlaminii، F. equiseti، F. acutatum و F. concentricum) خوشه‌بندی شد و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 59 درصد ایجاد کرد.

 

شکل 9- جدایۀ F. proliferatum SCUA.2Rd. الف، ب، ج، د. ریسه، کنیدیوم‏بر، فیالید و کنیدیوم‏ها؛ ن، ی. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA.

 

Fusarium sp. (شکل 10)

جدایه‌های SCUA-4Rd، SCUA-4Rb، SCUA-1Rc، SCUA-7Rf و SCUA-2Rc از ریشۀ سالم گیاه لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری منطقۀ اکیوش، اهواز، شوش و مراونه جداسازی شدند..

قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 80 میلی‌متر است. پرگنه کرکی‌شکل و در ابتدا سفید‌رنگ است و پس‌از گذشت چند روز به نارنجی کم‌رنگ تغییر می‏کند. سلول کنیدیوم‏‌زا غالباً مونوفیالید، کوتاه و غیرمنشعب است و کنیدیوم‏‌ها روی سلول کنیدیوم‏‌زا به‌شکل مجتمع هستند. ماکروکنیدیوم‏‌ها غالباً داسی‌شکل با انتهای مخروطی‏شکل دیده می‏شوند. ماکروکنیدیوم‌ها دارای 3 تا 6 دیوارۀ عرضی هستند و اندازۀ آنها 3/4-5/3×8/31-5/23 میکرومتر است. میکروکنیدیوم‌ها تقریباً کلیوی تا دوکی‌شکل هستند و اغلب یک یا دو سلولی و گاهی سه سلولی دیده می‏شوند. اندازۀ میکروکنیدیوم‌ها 6/3-7/2×8/10-9 میکرومتر ‏است. کلامیدوسپورها انفرادی یا زنجیری تشکیل می‏شوند.

 

 

شکل 10- جدایۀ SCUA-4Rd Fusarium sp.. الف، ب، پ، ت. ریسه‏، کلامیدوسپور، کنیدیوم‏بر و کنیدیوم‏ها. ج، پ. شکل پرگنۀ هفت‌روزه روی محیط‌کشت PDA

 

نتایج جستجوی BLASTnجدایه‌های مطالعه‌شده از این گونه (جدایه‏های SCUA-4Rd، SCUA-4Rb-Vig-Ah، SCUA-1Rc و SCUA-2Rc) نشان دادند توالی ITSاین گونه با سویه‌های شناخته‌شده از گونه‏های F. equiseti و F. chlamydosporum99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‌های مطالعه‌شدۀ این گونه و جدایۀF. chlamydosporum SCUA-2Sc با سویه‏های شناخته‌شدۀ این دو گونه (F. chlamydosporum CBS 635.76 و F. equiseti NRRL 26419) و گونه‏های نزدیک F. incarnatum و F. sambucinum خوشه‌بندی شدند و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 85 درصد ایجاد کردند.

 

Penicillium oxalicum Currie & Thom, Journal of Biological Chemistry 22: 289 (1915) (شکل 11)

جدایۀ P.oxalicum SCUA-6Sd از ساقۀ سالم گیاه لوبیا چشم‏بلبلی از مزارع لوبیاکاری جادۀ هفت‌تپه جداسازی شد.

قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 42 میلی‌متر است. رنگ پرگنه در مرکز سبز و در حاشیه سفید مایل به کرم است و از پشت تشتک پتری کرم مایل به زرد دیده می‌شود. کنیدیوم‌برها بیشتر Biverticillate هستند. فیالیدها استوانه‌ای تا نیزه‌ای هستند و ابعاد آنها 1/4-3 23-18 میکرومتر است. میزان اسپوردهی فراوان، اسپورها شفاف، تخم‌مرغی‌شکل با سطح صاف و اندازۀ آنها 3/3-9/2×6/5-7/4 میکرومتر است.

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ P.oxalicum SCUA-6Sd نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀشناخته‌شدۀP. oxalicum CBS 219.30 99 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ مطالعه‌شده با سویۀ شناخته‌شدۀ P. oxalicum CBS 219.30و سویه‌ای از گونۀ P. asturianum خوشه‏بندی شد و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 94 درصد ایجاد کرد.

 

شکل 11- جدایۀ P.oxalicum SCUA-6Sd-Vig-Ht. الف، ب. ریسه، کنیدیوم‏بر، فیالید و کنیدیوم‏ها؛ ج، د. شکل پرگنه پس‌از 7 روز روی محیط‌کشت PDA

 

.Curvularia mosaddeghii M. Mehrabi-.Koushki & R. Farokhinejad, Mycosphere 9 (4): 641 (2018) (شکل 12)

جدایۀ C. mosaddeghii SCUA-1Rb2 از ریشۀ گیاه سالم لوبیا چشم‌بلبلی از مزارع لوبیاکاری اهواز جداسازی شد.

ریسه‌ها منشعب و به رنگ قهوه‌ای روشن دیده می‌شوند. کنیدیوم‌برها قهوه‌ای‌رنگ هستند و ابعاد آنها 4/4-4×162-6/127 میکرومتر است. انتهای کنیدیوم‌برها زیگزاکی‌شکل دیده می‌شود و خروج کنیدیوم‏‌ از کنیدیوم‌برها از نوع زیگزاگی است. کنیدیوم‏‌ها چهار‌حجره‌ای و دو سلول انتهایی کنیدیوم‏‌ها بسیار روشن و شفاف و دو سلول میانی تیره‏تر هستند. حجرۀ سوم بزرگ و انحنادار است. طول و عرض کنیدیوم‏‌ها 5/10-8/9×5/23-8/21 میکرومتر است.

نتایج جستجوی BLASTn جدایۀ C. mosaddeghii SCUA-1Rb2 نشان دادند توالی ITSاین جدایه با سویۀ شناخته‌شدۀ C. mosaddeghii IRAN 3123C 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2) جدایۀ‏ C. sp. SCUA-1Rb2 با سویۀ C. mosaddeghii IRAN 3123C خوشه‏بندی شد و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 83 درصد ایجاد کرد.

 

 

شکل 12- جدایۀ C. mosaddeghii SCUA-1Rb2. الف، ب، ج. ریسه، کنیدیوم‏بر و کنیدیوم‏ها؛د. شکل پرگنه روی محیط‌کشت

 

Curvularia sp.1(شکل 13)

6 جدایه از این گونه (ازجمله Curvularia sp. IRAN 3120C) از ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی در اهواز، اندیمشک، اکیوش، صفی‏آباد و هفت‏تپه جداسازی شدند.

کنیدیوم‌برها به رنگ قهوه‌ای روشن با ابعاد 72/5-18/5×3/91-35/72 میکرومتر هستند. در محل جداشدن کنیدیوم‏ از سلول کنیدیوم‏‌زا، کنیدیوم‌برها خمیدگی پیدا می‌کنند و به‌شکل زخم‌‌مانند دیده می‌شوند. کنیدیوم‌زایی به‌شکل زیگزاگ است. کنیدیوم در این جدایه‌‏‌ها بیشتر چهار‌حجره‌ای و گاهی سه‌حجره‌ای دیده می‌شود. شکل کنیدیوم‏‌ها راست است و هیچ انحنایی در آنها دیده نمی‌شود. کنیدیوم‏‌ها استوانه‌ای تا تخم‌مرغی‌شکل و در تمام طول خود به رنگ قهوه‌ای روشن ‌هستند. اندازۀ کنیدیوم‏‌ها 6/9-9×3/24-2/13 میکرومتر است.

 

 

شکل 13- جدایۀ Curvularia sp. SCUA-1Sb. الف، ج، د. کنیدیوم‏بر و کنیدیوم‏ها، ب. شکل پرگنۀ پانزده‌روزه روی محیط‌کشت PDA.

 

نتایج جستجوی BLASTnجدایۀ Curvularia sp. SCUA-1Sb‏ نشاندادند توالی ITS این جدایه با سویه‏های شناخته‌شدهاز گونه‏های Curvularia buchloes (CBS 246.49) و Curvularia spicifera (CBS 274.52) 98 تا 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایۀ Curvularia sp. SCUA-1Sb از سایر گونه‏های شناخته‏شدۀ نزدیک جدا شد و همراه با سایر سویه‏های Curvularia در کلادی بزرگ با ارزش بوت‏استراپ 88 درصد قرار گرفت.

 

Curvulariasp.2 (شکل 14)

5 جدایه از این گونه (ازجمله جدایه‏های IRAN 3125C، IRAN 3124C و IRAN 3121C) از ریشه و ساقۀ گیاهان سالم لوبیا چشم‏بلبلی در اهواز و اندیمشک جداسازی شدند.

قطر پرگنه روی محیط‌کشت PDA پس‌از 7 روز در شرایط دمایی 5/0±28 درجۀ سانتی‌گراد برابر 65 میلی‌متر است. کنیدیوم‌بر‌ها به رنگ قهوه‌ای روشن، غیرمنشعب و دیواره‌دار هستند و خمیدگی زانویی‌شکل در انتهای آنها دیده می‌شود. ابعاد کنیدیوم‌برها 5/5-9/4×1/85-6/69 میکرومتر است. کنیدیوم‏‌ها بیضوی‌شکل، غالباً راست و به‌ندرت انحنادار هستند و چهارحجره‌ای هستند. ابعاد کنیدیوم‏‌ها 7/8-1/8×8/23-7/22 میکرومتر است. کنیدیوم‏‌ها به‌شکل زیگزاگی از کنیدیوم‌بر‏ها جدا می‌شوند و زخم‌هایی در محل جداشدن کنیدیوم‏‌ها از کنیدیوم‌برها دیده می‌شوند.

 

 

شکل 14- جدایۀ Curvularia sp. IRAN 3121C. الف، ب، د. ریسه، کنیدیوم‏بر و کنیدیوم‏ها؛ ج. شکل پرگنه پانزده‌روزه روی محیط‌کشت PDA

نتایج جستجوی BLASTnجدایه‏های SCUA-1Ra، SCUA-1Rh و SCUA-4Sc نشاندادند توالی ITS این جدایه‏ها با سویه‏های شناخته‌شدهاز گونه‏های Curvularia buchloes (CBS 246.49) و Curvularia spicifera (CBS 274.52) 98 تا 100 درصد شباهت نوکلئوتیدی دارد. در درخت فیلوژنتیکی ترسیمی درست‏نمایی بیشینۀ مبتنی بر ناحیۀ ITS (شکل 2)، جدایه‏های مطالعه‌شده با دو گونۀ نزدیک Curvularia buchloes و Curvularia spicifera خوشه‏بندی شدند و کلادی با ارزش بوت‏استراپ 86 درصد ایجاد کردند.

 

بحث و نتیجه‏گیری

جدایه‌های اندوفیت شناسایی‌شده در پژوهش حاضر بر اساس بررسی‏های ریخت‏شناسی و مولکولی به گونه‌های Alternaria destruens،Alternaria sp.،Curvularia mosaddeghii،Curvularia sp.،Fusarium chlamydosporum،F. nygamai،F. falciforme،F. proliferatum،Fusarium sp.،Macrophomina phaseolinaوPenicillium oxalicum تعلق داشتند. ویلسون[viii] (21) اندوفیت‌ها را قارچ‌ها یا باکتری‌هایی معرفی کرده است که در تمام یا بخشی از چرخۀ زندگی خود به بافت‌های گیاهان زنده حمله و آلودگی کاملاً غیرآشکار و بدون نشانه‌ای را داخل بافت‌های گیاهی ایجاد می‌کنند. در مطالعۀ حاضر، 60 جدایۀ اندوفیت از 12 گونۀ قارچی در گیاه لوبیا چشم‏بلبلی جداسازی و شناسایی شدند که بیشتر جدایه‏ها به سه ‏جنس Alternaria، Fusarium و Curvularia تعلق داشتند. در مطالعه‌های پیشین نیز ثابت شده است قارچ‏هایی که تولید کنیدیوم‏های چندسلولی تیره می‏کنند (مانند Alternaria و Curvularia) از مهم‏ترین اندوفیت‏های گیاهی در مناطق گرم و معتدل هستند (22 و 23). مقایسۀ قارچ‌های اندوفیت در مناطق جغرافیایی مختلف نشان می‌دهد مناطق گرمسیری نسبت به مناطق شمالی سردسیری و یا معتدل تنوع اندوفیتی بیشتری دارند (24). در مطالعۀ حاضر نیز 12 اندوفیت قارچی در گیاهان سالم لوبیا چشم‌بلبلی منطقه‌ای گرمسیری ردیابی و شناسایی شدند که تنوع گونه‏ای درخور توجهی را نشان می‏دهند. قارچ‌های اندوفیت در تمام طول عمر بافت گیاهی آلوده به اندوفیت و یا برای مدت زمان طولانی (تا زمانی که شرایط محیطی برای قارچ مساعد باشد و تکامل میزبان برای استفادۀ قارچ تغییر نکند) به‌طور نهفته داخل گیاه میزبان خود باقی می‌مانند اما ممکن است پس‌از آن به حالت بیماری‌زا تبدیل شوند (25). سیبر[ix] بیان کرده است طی مدتی که اندوفیت‌ها به‌ویژه قارچ‌ها درون گیاه زندگی می‌کنند ممکن است رابطۀ آنها از همزیست به حالت بیمارگر (عامل بیماری‌زا) و یا برعکس تغییر کند (26). بررسی قارچ‏های اندوفیت در مطالعۀ حاضر گویای اینست که تعدادی از آنها (ازجمله F. chlamydosporumوM. phaseonlina) قارچ‏های بیمارگر هستند و این نشان می‌دهد مرز زندگی اندوفیتی و بیمارگری قابل‌تفکیک نیست و شرایط محیطی و وضعیت تغذیه نوع برهم‌کنش را تغییر می‌دهد.

حضور اندوفیتی گونه‏های Alternaria در گیاهان مختلف (ازجمله گیاهان Suaeda fruticosa، S. aegyptiaca، Alhagi mannifera، Aeluropus lagopoides، Salicornia europaea، Malva parviflora، Cynodon dactylon و Polypogon monspeliensis) به‌خوبی شناخته شده است (27). گونۀ‏ A. destruensدر ایران از گیاهان آفتابگردان (Helianthus annuus L.)، جو (Hordeum vulgare L.)، بادنجان (Solanum melongena L.) و انبه (Mangifera indica L.) گزارش شده است (28). در گذشته، این گونه به‌عنوان قارچ اندوفیت از گیاه جاتروفا (Jatropha curcas) (29) و درختان هلو (Prunus persica (L.) Batsch) (10) نیز جداسازی شده است. M. phaseolina عامل پوسیدگی ذغالی شناخته شده است و دامنۀ میزبانی وسیعی (بیش از 500 گونه‏ی گیاهی) دارد (30)؛ لوبیا چشم‌بلبلی یکی از میزبان‌های این بیمارگر است که ایجاد بیماری در آن به مرحلۀ رشدی گیاه و شرایط محیطی بستگی دارد. جداسازی این بیمارگر از ریشۀ گیاهان سالم چالش‌برانگیز است و درنظرگرفتن آن به‌عنوان اندوفیت یا بیمارگری که مراحل اولیۀ آلودگی‏اش را طی می‏کند و هنوز به ظهور نشانه منجر نشده است محل ابهام است. چودهاری و کائوشینک[x] این گونه را به‌عنوان اندوفیت از روی ساقۀ گیاه Ocimum sanctum گزارش کرده‌اند (31). در ایران نیز حسن‌زاده[xi] آن را به‌عنوان اندوفیت از ریشۀ گیاه گاوپنبه جداسازی کرده است (32).سانگ[xii] و همکاران قارچ F. falciformeرا به‌عنوان اندوفیت از گیاه Mascarena lagenuulis جداسازی کرده‌اند (33). F. chlamydosporumیکی از عوامل پوسیدگی فوزاریومی ریشه و طوقه است (34)؛ این گونه به‌عنوان قارچ اندوفیت از گیاه Dendrobium cerumenatum گزارش شده است (35). جداسازی این قارچ به‌عنوان اندوفیت احتمالاً مرحلۀ نهفتۀ آلودگی و پیش‌از ظهور نشانه‌ها است. گونه‏های Fusarium از مهم‏ترین اندوفیت‏های شناخته‌شده هستند (36). گونۀ F. nygamai معمولاً از روی بقایای گیاهی خاک‌های خشک گرمسیری و یا درارتباط‌با ریشه‌های غلات جداسازی شده است (37). این گونه به‌عنوان اندوفیت از ریشۀ گیاه پنبه نیز گزارش شده‌ است (38). در گذشته،والینو[xiii] و همکاران گونۀ F. proliferatum را به‌عنوان گونۀ اندوفیت از برنج جداسازی کرده‌اند (36).لارنا[xiv] و همکاران گزارش کرده‌اند جدایه‌هایی از قارچ P. oxalicumباعث کاهش شدت بیماری پژمردگی آوندی گوجه‌فرنگی در اثر Verticillium dahlia و F. oxysporum f.sp. lycopersici در شرایط گلخانه و مزرعه می‌شوند (39). اغلب گونه‏های Curvularia ساپروفیت هستند اما تعدادی از آنها بیمارگرهای گیاهی، جانوری و انسانی هستند (40). همانند آنچه در مطالعۀ حاضر ردیابی و شناسایی شد تعدادی از گونه‏های Curvularia با گیاهان ارتباط اندوفیتی دارند (41-43).

این نخستین مطالعه‏ای است که حضور اندوفیتی قارچ‏های Alternaria destruens،Alternaria sp.، M. phaseolina، Fusarium chlamydosporum،F. nygamai،F. falciforme،F. proliferatumوPenicillium oxalicum رادر گیاه لوبیا‏چشم بلبلی گزارش می‏کند.

 

سپاسگزاری

از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز برای حمایت مالی پژوهش حاضر سپاسگزاری می‏شود.



[1]- Dehghanpour

[2]- Hashemloo

[3]- Khorsandi

[4]- Heroghly

[5]- Raeder & Broda

[6]- BioEdit ver 4.0.6.2

[7]- MEGA Ver. 6

[viii]- Wilson

[ix]- Sieber

[x]- Chowdhary and Kaushik

[xi]- Hasanzadeh

[xii]- Song

[xiii]- Vallino

[xiv]- Larena

 
(1) Liu X., Dong M., Chen X. Antimicrobial activity of an endophytic Xylaria sp. YX 28 and identification of itꞌs antimicrobial compound methylcoimarin. Applied Micribiology and Biotechnology 2008; 78: 241-247.
(2) Tan RX., Zou WX. Endophytes: a rich source of functional metabobite. Natural Product Reports 2001; 18: 448-459.
(3) Aly AH., Debbab A., Proksch P. Fungal endophytes: unique plant inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology 2011;90(6): 1829-1845.
(4) Weber D. Endophytic fungi, occurrence and metabolites. In: Anke T., Weber D., editors. Physiology and Genetics. Berlin: Springer; 2009: 153-196.
(5) Li HY., Wei DQ., Shen M., Zhou ZP. Endophytes and their role in phytoremediation. Fungal Diversity 2012; 54(1): 11-18.
(6) Surette MA., Sturz AV., Lada RR., Nowak J. Bacterial endophytes in processing carrots (Daucus carota L. var. sativus): their localization, population density, biodiversity and their effects on plant growth. PlantSoil 2003; 253: 381-390.
(7) Gange AC., Dey S., Currie AF., Sutton BVC. Site- and species-species differences in endophyte accurrence in two herbaceous plants. Ecology 2007; 95: 614-622.
(8) Arnold AE., Herre EA. Canopy cover and leaf age affect colonization by tropical fungal endophytes: ecological pattern and process in Theobroma cacao (Malvaceae). Mycologia 2003; 95: 388-398.
(9) Dehghanpour-Farshah S., Sharifnabi B., Mirlohi AF. Endophytic species of Neotyphodium on some gramineous species in Iran. Rostaniha 2005; 6: 131-150.
(10) Hashemloo E., Jamali Zavareh AH., Ghosta Y. Taxonomicstudy of endophytic species of Alternaria from Prunus trees in Urmia and Miandoab in W Azarbaijan province (NW Iran). Rostaniha 2015; 16(1): 88-100.
(11) Khorsandi S., Nikbakht A., Sabzalian MR., Sharifnabi B. Effect of age and tree tissue on endophytic fungi presence, nutrient content and morphological characteristics of plane trees. Iranian Journal of Horticultural Science and Technology 2014; 15(3): 317-330.
(12) Hergholi N., Ghosta Y., Javan-Nikkhah M., Campisano A., Pancher M. New species of endophytic fungi from grapevine (Vitis vinifera) in Iran. Rostaniha 2015; 16(1): 17-35.
 
(13) Babaahmadi G., Mehrabi-Koushki M., Hayati J. Allophoma hayatii sp. nov., an undescribed pathogenic fungus causing dieback of Lantana camarain Iran. Mycological Progress 2018; 17(3): 365-379.
(14) Raeder U., Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology 1985; 1: 17-20.
(15) Ahmadpour SA., Mehrabi-Koushki M., Farokhinejad R. Neodidymelliopsis farokhinejadii, a new fungal species from dead branches of trees in Iran. Sydowia 2017; 69: 171-182.
(16) White TJ., Bruns T., Lee S., Taylor JL. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA., Gelfand DH., Sninsky JJ., White TJ., editors. PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego: Academic Press; 1990: 315-322.
(17) O’Donnell K. Fusarium and Its near relatives. In: Reynolds DR., Taylor JW., editors. The fungal holomorph: mitotic, meiotic and pleomorphic speciation in fungal systematics. Wallingford: CABI Publishing; 1993: 225-233.
(18) Heidari K., Mehrabi-Koushki M., Farokhinejad R. Curvularia mosaddeghii sp. nov., a novel species from the family Pleosporaceae. Mycosphere 2018; 9: 635-646.
(19) Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 1999; 41: 95-98.
(20) Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 2013; 30: 2725-2729.
(21) Wilson D. Endophyte: the evolution of a term, and clarification of its use and definition. Oikos 1995: 73: 274-276.
(22) Morakotkarn D., Kawasaki H., Seki T. Molecular diversity of bamboo-associated fungi isolated from Japan. FEMS Microbiology Letter 2006; 266: 10-19.
(23) Wang B., Priest MJ., Davidson A., Brubaker CL., Woods MJ., Burdon JJ. Fungal endophytes of native Gossypium species in Australia. Mycological Research 2007; 111: 347-354.
(24) Gonzalez V., Tello ML. The endophytic mycota associated with Vitis vinifera in central Spain. Fungal Diversity 2011; 47(1): 29-42.
(25) Debbab A., Aly AH., Proksch P. Bioactive secondary metabolites from endophytes and associatedmarine derived fungi. Fungal Diversity 2011; 49 (1): 1-12.
(26) Sieber TN. Endophytic fungi in forest trees: are they mutualists? Fungal Biology Reviews 2007; 21(2): 75-89.
(27) Mehrabi-Koushki M., Khodadadi-Pourarpanahi S., Jounbozorgi S. Fungal endophytes associated with some thermo-tolerant plants in salt-stress ecosystem. Mikologiya I Fitopatologiya 2018; 52(3): 187-195.
(28) Ershad D. Fungi of Iran. 3rd ed. Tehran: Iranian Research Institute of Plant Protection; 2009.
(29) Kumar S., Kaushink N. Endophytic fungi isolated from oil-seed crop Jatropha curcas produces oil and exhibit antifungal activity. Plos One 2013; 8: e56202.
(30) Sinclair JB. Compendium of soybean disease. USA: American phytopathology Society; 1982.
(31) Chowdhary K., Kaushik N. Fungal endophyte diversity and bioactivity in the Indian medicinal plant Ocimum sanctum Linn. Plos One 2015; 10(11): 141-144.
(32) Hassanzadeh A., Tajick Qanbari MA., Aldaghi M., Babaeizad V. First report of Macrophomina phaseolina from Abutilon theophrasti roots in Iran. 3rd Iranian Mycological Congress, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran; 2017.
(33) Song JJ., Pongank W., Soytong K. Antifungal activity of endophytic fungi from palm trees against Coffi Anthracnose coused by Colletotichum coffeanum. International Journal of Agricultural Technology 2016; 12(3): 623-635.
(34) Khorshidi kashani K., Mirabolfathy M., Rezaee danesh Y. Fusarium root and crown rot disease of turfgrass. Forest and Range Protection Research 2014; 11(1): 31-45.
(35) Siddiquee S., Yusuf UK., Izzati-Mohd-Zainudin NA. Morphological and molecular detection of Fusarium chlamydosporum from root endophytes of Dendrobium crumenatum. African Journal of Biotechnology 2010; 9(26): 4081-4090.
(36) Vallino M., Greppi D., Novero M., Bonfant P., Luppoto E. Rice root colonization by mycorrhizal and endophytic fungi in aerobic soil. Annals of Applied Biology 2009; 154: 195-204.
(37) Burgess LW., Trimboli D. Characterization and distribution of Fusarium nygamai, sp. nov. Mycologia 1986; 78: 223-229.
(38) Zhang J., Howell CR., Wheeler MH. Frequency of isolation and the pathogenicity of Fusariumspecies associated with roots of healthy cotton seedlings. Mycologial Research 1995; 100: 747-752.
(39) Larena I., Sabuquillo P., Melgarejo P., De cal A. Biocontrol of Fusarium and Verticillium wilt of tomato Penicillium oxalicum under green houseand field condition. Journal of Phytopathology 2003; 151: 507-512.
(40) Manamgoda DS., Rossman AY., Castlebury LA., Chukeatirote E., Hyde KD. Taxonomic and phylogenetic re-appraisal of the genus Curvularia (Pleosporaceae): human and plant pathogens. Phytotaxa 2015; 212: 175-198.
(41) Tadych M., Bergen M., Johnson JC., Polashock J., Vorsa N. Endophytic and pathogenic fungi of developing cranberry ovaries from flower to mature fruit: diversity and succession. Fungal Diversity 2012; 54: 101-116.
(42) Gautam AK., Kant M., Thakur Y. Isolation of endophytic fungi from Cannabis sativa and study their antifungal potential. Archive of Phytopathology and Plant Protection 2013; 46: 627-635.
(43) Jena SK., Tayung K. Endophytic fungal communities associated with two ethno-medicinal plants of Similipal Biosphere Reserve, India and their antimicrobial prospective. Journal of Applied Pharmaceutical Science 2013; 3: 7.