نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 بخش زیستفناوری میکروبی، دانشکده زیستشناسی و قطب تبارزایی موجودات زنده، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشکده و پژوهشکده پدافند غیر عامل، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران
3 بخش زیستفناوری میکروبی، دانشکده زیستشناسی، دانشگاه تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Nowadays, concrete has been widely used as one of the best and most practical building materials in various types of structures. Concrete permeability is a factor that reduces its stability and decreases the service life of concrete structures. This study has been conducted with the aim of finding bacteria able to repair concrete surface in order to reduce its permeability.
Materials and Methods: Isolated bacteria from alkaline soils of north and center of Iran were subjected to primary and secondary screening for producing urease enzyme and calcium carbonate precipitation. Selected isolates were cultured in specific broth medium for calcium carbonate precipitation. Then, the rate of their growth and calcium carbonate production were compared. Produced calcium carbonate, by the premier isolate, was verified using XRD. The ability of this isolate was evaluated in the repair of the concrete surface porosity and the reduction of its permeability by Scanning Electron Microscopy (SEM).
Results: The results of primary and secondary screening showed that Bacillus sp. UTMC 2623 produces the highest amount of calcium carbonate precipitation (8.8 g/L) in three days. Its XRD analysis confirmed the presence of crystalline calcium carbonate in dried bacterial precipitate. SEM analysis showed that this bacterium creates the best coating on the concrete surface along with the calcium source.
Discussion and conclusion: The present study is a report on the repairing activity of Bacillus sp. UTMC 2623 which can be used to find other native and promising microorganisms in concrete surface repair.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
بتن، یکی از کاربردیترین مصالح ساختمانی، مخلوط ناهمگنی متشکل از سیمان، سنگدانههای درشت و ریز و آب است (1). بتن استفادهشده در هر سازۀ بتنی باید علاوهبر تأمین مقاومت مدنظر، پایایی (دوام) خود را در رویارویی با شرایط محیطی مختلف هنگام بهرهبرداری حفظ کند. نفوذپذیری بتن مهمترین عاملی است که دوام بتن را کاهش میدهد و از میزان تخلخل و ارتباط بین منافذ داخل ساختار بتن تأثیر میپذیرد (2). وجود ترک عامل دیگر مؤثر بر افزایش نفوذپذیری است (3). چنانچه بتن دوام کمی داشته باشد برای حفظ قابلیت بهرهبرداری سازۀ بتنی در مدت زمان عمر مفید آن باید هزینههای بسیار زیادی برای تعمیر و نگهداری آن صرف شود؛ این امر درحالحاضر بودجۀ درخور توجهی از کشورها را به خود اختصاص میدهد و ازاینرو، مسئلۀ دوام بتن اهمیت بسزایی در اقتصاد جهانی دارد (2).
درحالحاضر، از پوششهای متنوع شیمیایی برای ترمیم و یا حفاظت سطح بتن استفاده میشود. در سالهای اخیر بهعلت قیمت زیاد، انبساط حرارتی متفاوت با بتن و ایجاد آلودگی زیستمحیطی در روشهای غیرزیستی به روشهای ترمیم زیستی سطح بتن و مصالح ساختمانی بهویژه روشهای میکروبی بهعنوان عوامل تجدیدپذیر و سازگار با طبیعت بسیار توجه شده است (4).
ترمیم زیستی به دو شکل سطحی (هنگام بهرهبرداری از سازه) یا عمقی (هنگام ساخت) برای افزایش دوام سازه استفاده میشود (1). مادهای که خللوفرج بتن را پر میکند باید دارای بیشترین سازگاری با ساختار بتن باشد و ازاینرو باید بتواند اسیدیتۀ زیاد بتن (حدود 13 تا 14) را تحمل کند (5). در حالت ترمیم سطحی، باکتری به روش پاشیدهشدن و یا غرقاب نمونۀ بتن در ظرف حاوی باکتری در سطح بتن نفوذ میکند. هرچه عمق نفوذ باکتری بیشتر باشد تأثیرگذاری عملکرد کلسیمکربنات تولیدشده نیز بهتر خواهد بود. عوامل مختلف فیزیکی، شیمیایی و میکروبی ازجمله ساختار خللوفرج بتن، میزان چسبندگی باکتری به شبکۀ معدنی بتن و نسبت اندازۀ باکتری به اندازۀ خللوفرج بر میزان نفوذ باکتری در سطح بتن تأثیر میگذارند. از سویی، باکتریهایی هیدرولیز اوره را انجام میدهند که داخل خللوفرج هستند و به دیواره نچسبیدهاند. این باکتریها در محیط ترسیب با اتصال به یونهای کلسیم موجود بهشکل لخته درمیآیند و لختهشدن باکتریها به ماندن آنها درون خللوفرج کمک میکند. هرچه اندازۀ خللوفرج نسبت به باکتری بزرگتر باشد باکتریهای بیشتری در آن حضور دارند؛ بنابراین کلسیمکربنات بیشتری تولید میشود و تأثیر آن بر دوام بتن بیشتر خواهد شد (6)..
ترمیم زیستی از چندین مسیر فتوتروفیک و هتروتروفیک انجام میشود. مسیرهای هتروتروفیک در مقایسه با انواع اتوتروفیک و غیرزیستی رسوب بیشتری تولید میکنند و شامل تجزیۀ اوره، آمونیفیکاسیون آمینواسیدها، تنفس، اکسیداسیون متان، احیای سولفات و احیای نیترات هستند (7). مسیر اورهآز از پرکاربردترین مسیرها است که در آن به ترمیم سطحی و عمقی بتن و مصالح ساختمانی دیگر بسیار توجه شده است. در این مسیر، آنزیم اورهآز درون باکتری هتروتروف یک مول اوره را به دو مول یون آمونیوم و دو مول یون هیدروکسید تبدیل میکند و اسیدیته را افزایش میدهد. کلسیم که در محیط به حالت اشباع است به دیوارۀ باکتری دارای بار منفی جذب میشود و کربناتکلسیم تولید میکند. اگر باکتری تولیدکنندۀ کلسیمکربنات در بتن قرار گرفته باشد با تولید کلسیمکربنات و بستهشدن منافذ مانند لایهای روی بتن عمل میکند. رابطۀ نهایی واکنش بهشکل رابطۀ 1 است (8):
|
رابطۀ 1 |
CO(NH2)2+2H2O→2NH4++CO32- |
مزایای این مسیر شامل سرعت زیاد و تکآنزیمیبودن (8)، فراگیربودن آنزیم و پیشساز آن و نیازهای کم تغذیهای (5) و در نتیجه صرفۀ اقتصادی، کنترلپذیربودن و درخور توجه بودن مقدار رسوب تولیدشده طی این مسیر است (8).
ترمیم زیستی در موارد متعددی بررسی شده است و باسیلوسها بیشترین کاربری را در میان باکتریهای بررسیشده داشتهاند. حفاظت از سنگآهک با استفاده از باکتریهای تولیدکنندۀ کلسیمکربنات (9)، ترمیم سنگهای بناهای تاریخی با استفاده از گونههایی از میکروکوکوس و باسیلوس سوبتیلیس (10) و شبکۀ آلی ماکرومولکولهای گرفتهشده از میتیلوس کالیفرنیانوس[1] (11)، بررسی تأثیر باکتری باسیلوس پاستوری در ترمیم ترکهای بتن (12) و ساخت سیمان زیستی (13)، کاربرد باکتری میکسوکوکوس زانتوس در حفاظت و ترمیم سنگهای تزیینی (14)، بررسی تأثیر باکتری باسیلوس اسفریکوس بر دوام و ترمیم ترکها در بتن (15 و 16)، استفاده از گونۀ باسیوس CT-5 و گونههایی از شیوانلا برای افزایش مقاومت فشاری ملات سیمان (2 و 17) نمونههایی از پژوهشهای انجامشده در این زمینه در کشورهای مختلف هستند. همچنین پژوهشهایی در زمینۀ نقش ترمیم زیستی باکتریها در بهبود دوام بتن در ایران انجام شدهاند که به برخی از آنها اشاره میشود:
وهابی و همکاران در سال 1391 به بررسی تأثیر حضور باکتری جداسازیشده از خاک قلیایی در مخلوط ملات ماسه سیمان بر افزایش مقاومت فشاری نمونههای ملات پرداختند (18). وهابی در پژوهش دیگری اثر ترمیمی باکتری باسیلوس لیکنی فورمیسAK01را درکاهش نفوذپذیری سطح بتن نشان داد (19).نصوحیان در سال 1392 از باکتری تولیدکنندۀ اورهآز و کلسیمکلراید در ساخت نمونههای بتنی برای افزایش مقاومت فشاری و کاهش جذب آب نمونههای بتنی بهره گرفت (20). سرگزی و همکاران در سال 1393 به بررسی اثر استفاده از مخلوط اوره،کلسیمکلراید و باکتری با درصدهای مختلف در آب اختلاط بهمنظور یافتن بیشترین مقاومت فشاری و کمترین جذب آب پرداختند (21). همچنین پژوهش دیگری نشان داد کاربرد باکتری در آب اختلاط بتن با پرکردن منافذ بتن باعث زیادشدن مقاومت الکتریکی و کاهش خوردگی میلگرد و در نتیجه افزایش دوام بتن میشود (22).
پژوهشهای انجامشده امیدبخشبودن کاربرد باکتری را در بهبود ویژگیهای مربوط به دوام بتن نشان میدهند. اگرچه بیشتر یافتهها بر ترمیم عمقی بتن تمرکز دارند که برای ساخت بتن بادوام بسیار مناسب است به افزایش دوام سازههای موجود کمکی نمیکنند. باتوجهبه اهمیت بتن و هزینۀ درخور توجه تخریب و ساخت دوبارۀ سازههای درحال بهرهبرداری از یک سو و کمبود مطالعههای انجامشده در زمینۀ ارزیابی توان ریزموجودات بومی کشور ازنظر ترمیم بتن از سوی دیگر، پژوهش حاضر با هدف یافتن ریزموجودات بومی ترمیمکنندۀ بتن به بررسی ریزموجودات قلیادوست جداشده از خاکهای برخی مناطق قلیایی شمال و مرکز ایران و ارزیابی توانمندی جدایههای منتخب در ترمیم و بهبود سطحی بتن پرداخته است.
مواد و روشها
جداسازی و خالصسازی جدایههای قلیادوست و نمکقلیادوست:بهمنظور دستیابی به جدایههای باکتریایی قلیادوست و نمکقلیادوست، نمونهبرداری از برخی مناطق قلیایی کشور انجام و اسیدیتۀ هریک از خاکها سنجیده شد. اسیدیتۀ زیاد بتن علت جداسازی باکتریهای قلیادوست و دستیابی احتمالی به جدایههای بیشتر علت جداسازی باکتریهای نمکقلیادوست بود. چهار نمونه خاک با اسیدیتۀ قلیاییتر از میان خاکهای جمعآوریشده و نیز تمام خاکهای موجود در مجموعۀ ریزموجودات دانشگاه تهران انتخاب شدند. برای جداسازی و خالصسازی جدایهها از محیط جامد هوریکوشی[2] استفاده شد. ترکیبات این محیط در جدول 1 آمده است. برای جداسازی باکتریهای نمکقلیادوست، 4 درصد نمک سدیمکلراید به محیط یادشده افزوده شد. اسیدیتۀ محیط بر اساس دستور ساخت محیط بین 9 و10 تنظیم شد و سوسپانسیون هریک از خاکها با رقتهای 1-10، 2-10 و 3-10 در پلیتهای جداسازی کشت شد. پلیتها بهمدت حداکثر دو روز در دمای 28 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شدند. جدایهها پساز خالصسازی برای آزمایشهای غربالگری اولیه و ثانویه استفاده شدند (23).
جدول 1- ترکیبات محیطکشت هوریکوشی (24)
|
ردیف |
ماده |
مقدار (گرمبرلیتر) |
|
1 |
گلوکز |
10 |
|
2 |
پپتون |
5 |
|
3 |
عصاره مخمر |
5 |
|
4 |
آگار |
15 |
|
5 |
KH2PO4 |
1 |
|
6 |
MgSO4.7H2O |
2/0 |
|
7 |
Na2CO3 |
10 |
بررسی تولید آنزیم اورهآز و کلسیمکربنات: در مرحلۀ غربالگری اولیه، وجودداشتن یا نداشتن آنزیم اورهآز در جدایههای آزمایششده بررسی شد. هیدرولیز یک مول اوره توسط باکتری دارای اورهآز دو مولکول آمونیاک و یک مولکول دیاکسیدکربن تولید میکند (رابطۀ 2):
|
رابطۀ 2 |
H2N-CO-NH2+H2O→2NH3+CO2 |
آمونیاک تولیدشده اسیدیته را افزایش میدهد و باعث تغییر رنگ معرف از بیرنگ به بنفش میشود که تولید اورهآز توسط باکتری را نشان میدهد (25)؛ هرچه رنگ بنفش تولیدشده بیشتر باشد اوره بیشتری هیدرولیز شده است.
جدایههای خالصشده در محیط مایع کریستنسن (جدول 2) در لوله و در مقایسه با شاهدهای منفی، مثبت، بدون اوره و بدون باکتری کشت و بهمدت شش روز در دمای 37 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شدند. از مقایسۀ چشمی نمونهها با شاهدها تغییر رنگ محیطکشت و میزان آن بهطورکیفی بررسی شد (25).
جدول 2- ترکیبات محیطکشت کریستنسن برای آزمون تولید آنزیم اورهآز (25)
|
ردیف |
ماده |
مقدار (گرمبرلیتر) |
|
1 |
پپتون |
1 |
|
2 |
گلوکز |
1 |
|
3 |
اوره |
20 |
|
4 |
فنل رد |
012/0 |
|
5 |
KH2PO4 |
2 |
جدایههای منتخب بهمنظور بررسی تولید کلسیمکربنات روی محیط جامد ترسیب کلسیمکربنات کشت و در دمای 28 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شدند. رشد جدایهها هر پنج روز یک بار بررسی شد. ترکیبات محیط یادشده در جدول 3 آمده است. حضور بلورهای کلسیمکربنات در حاشیۀ کلنی جدایهها زیر میکروسکوپ استریو با بزرگنمایی 10× بررسی شد (26).
جدول 3- ترکیبات سازندۀ محیط ترسیب کلسیمکربنات (26)
|
ردیف |
مقدار (گرمبرلیتر) |
ماده |
|
1 |
20 |
اوره |
|
2 |
17 |
آگار |
|
3 |
12/2 |
NaHCO3 |
|
4 |
10 |
NH4Cl |
|
5 |
3 |
Nutrient Broth |
|
6 |
41/4 |
CaCl2.2H2O |
.سنجش تولید کلسیمکربنات بهوسیلۀ تیتراسیون برگشتی: جدایههای منتخب مرحلۀ پیش بهمنظور سنجش دقیقتر توانمندی تولید رسوب کلسیمکربنات در فلاسکهای 250 میلیلیتری حاوی 50 میلیلیتر محیط مایع ترسیب (جدول 3) کشت و در دمای 28 درجۀ سانتیگراد و روی شیکر با 150 دوردردقیقه گرماگذاری شدند (27). پساز 48 ساعت، مایع درون هر فلاسک به لوله فالکون 50 میلیلیتری منتقل و بهمدت 10 دقیقه در دمای اتاق و 4000 دوردردقیقه سانتریفوژ شد. مایع رویی دور ریخته شد و زیستتودۀ حاصل در کوره با دمای 130 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد تا خشک شود و به وزن ثابت برسد. مقدار کلسیمکربنات موجود در رسوب به روش تیتراسیون برگشتی اندازهگیری شد. تیتراسیون برگشتی برای تعیین حضور و مقدار رسوبات نامحلول در آب یک نمونه به کار میرود. در این روش، ابتدا رسوب کلسیمکربنات در اسید حل و سپس باقیماندۀ اسید با سدیمهیدروکسید تیتر میشود و مقدار مول و جرم کلسیمکربنات موجود در رسوب با محاسبۀ مقدار سدیمهیدروکسید تیترکننده و بر اساس دو واکنش زیر تعیین میشود ( رابطههای 3 و 4)(27).
|
رابطۀ 3
|
n(اسید کل)–n(اسید تیترشده)=n(اسید مصرفشده)
|
|
رابطۀ 4 |
CaCO3(s)+2HCl→CaCl2(aq)+CO2(g)+H2O(l) |
انتخاب سویۀ برتر بر اساس زمان رشد: ازآنجاکه تولید کلسیمکربنات بخشی از متابولیسم باکتری در نظر گرفته میشود هرچه رشد باکتری بیشتر باشد تولید محصول بیشتر میشود. سه جدایۀ منتخب در محیط مایع تولید کلسیمکربنات (جدول 3 بجز آگار) در فلاسک 1 لیتری کشت شدند و یک فلاسک شاهد برای هر فلاسک نمونهبرداری در نظر گرفته شد. میزان رشد جدایههای منتخب بهمدت سه روز در فواصل زمانی 12ساعته بررسی شد. در هر بار نمونهبرداری، 50 میلیلیتر نمونه برداشته و جذب نوری ([3]OD) و اسیدیتۀ آن اندازهگیری و ثبت شد. نمودار OD بر حسب زمان برای هر جدایه رسم و زمان رسیدن به OD بیشینه تعیین شد. شدت ویژۀ رشد برای هریک از باکتریها بر اساس رابطۀ 5 محاسبه شد. ODt و OD0 جذبهای خواندهشده در زمان رشد بیشینه (t که برای سه باکتری متفاوت است) و t0 در فاز لگاریتمی رشد باکتری هستند.
|
رابطۀ 5 |
.انتخاب سویۀ برتر بر اساس تولید بیشینه محصول: غلظت مناسب پیشسازهای کلسیمکربنات عامل دیگر مؤثر بر افزایش تولید محصول است. سه غلظت مساوی از کلسیمکلراید و اوره با مقادیر 2/0، 4/0 و 6/0 مولار برای مطالعه انتخاب شدند (28). سه جدایۀ 147، 110 و 167 در 200 میلیلیتر محیط پیشکشت (جدول 4) به فلاسکهای 1 لیتری تلقیح و پساز سه روز گرماگذاری برای نمونۀ 147 و سه روز و نیم گرماگذاری برای نمونههای 110 و 167 به محیطکشت اصلی تلقیح شدند.
جدول 4- ترکیبات سازندۀ محیط پیشکشت (26)
|
ردیف |
مقدار (گرمبرلیتر) |
ماده |
|
3 |
12/2 |
NaHCO3 |
|
4 |
10 |
NH4Cl |
|
5 |
3 |
Nutrient Broth |
نمونهبرداری برای بررسی میزان رسوب تولیدشده به روش تیتراسیون برگشتی در فواصل زمانی 2 تا 11 روز برای سه جدایه انجام شد. نمودار میزان تولید در برابر زمان برای هر باکتری در سه غلظت استفادهشده رسم شد. شدت ویژۀ تولید بر اساس رابطۀ 6 برای هر جدایه محاسبه شد که در آن μ شدت ویژۀ رشد و میانگین زیستتوده تولیدشده است.
|
رابطۀ 6 |
بازدۀ تولید کلسیمکربنات توسط باکتری از رابطۀ 7 محاسبهشد که در آن، مقدار کلسیمکربنات تولیدی بر حسب گرمدرلیتر طی زمان تولید محصول (برای هر باکتری با دیگری متفاوت است) و مقدار زیستتوده باکتری بر حسب گرمدرلیتر در همین زمان است.
|
رابطۀ 7 |
|
مشخصهیابی پراش پرتوی ایکس(XRD) [4] بهمنظور تأیید تولید کلسیمکربنات بهوسیلۀ جدایۀ برتر: از محیطکشت تولید کلسیمکربنات حاوی جدایۀ برتر با سانتریفوژ در 12000 دوردردقیقه رسوبگیری شد و رسوب حاصل در فور با دمای 130 درجۀ سانتیگراد خشک شد (27). سپس، نمونه بهمنظور تأیید ساختار بلوری کلسیمکربنات و ترکیب شیمیایی آن مشخصهیابی XRD شد. طیف پرتوهای پراشیافته با استفاده از دستگاه اکسپرت-پرو[5] و آند مسی (40 کیلوولت، 40 میلیآمپر) جذب و در زاویۀ دو تتا برابر با 20 تا 9/69 درجه اسکن شد..
ترمیم سطحی نمونۀ تیمارشده با باکتری: نمونههای بتنی با ابعاد 5×5×5 سانتیمتری با طرح اختلاط 300 کیلوگرم سیمان، 180 لیتر آب و 640 کیلوگرم ریزدانۀ ماسهای (نسبت آب به سیمان برابر با 6/0) ساخته و بهمدت 28 روز در آب خوراکی تیمار شدند. بتن 90روزه بهمدت 20 دقیقه در دمای 121 درجۀ سانتیگراد اتوکلاو شد. سه گروه بررسی ترمیم شامل 1) باکتری، محیطکشت و کلسیمکلراید، 2) باکتری و محیطکشت و 3) باکتری و کلسیمکلراید برای مقایسه در نظر گرفته شدند. بهمنظور ایجاد ترمیم سطحی، کشت یکروزۀ جدایۀ برتر در محیط جامد هوریکوشی و دمای 28 درجۀ سانتیگراد تهیه شد. پیشکشت سالم از کشت یکروزه تهیه و در دمای 28 درجۀ سانتیگراد و دور شیکر 100 دوردردقیقه گرماگذاری شد. پساز 72 ساعت، 10 میلیلیتر پیشکشت به 200 میلیلیتر محیطکشت مایع اصلی موجود در فلاسک 1 لیتری تلقیح شد. ترکیبات محیط مدنظر از تغییر مقدار برخی ترکیبات بهکاررفته در جدول 3 به دست آمد: مقدار اورۀ استفادهشده بر اساس سه غلظت بررسیشدۀ 2/0، 4/0 و 6/0 مولار بهترتیب به مقادیر 12، 24 و 36 گرمدرلیتر تغییر یافت و کلسیمکلراید و آگار از آن حذف شدند. سه تکرار برای هر سه گروه در نظر گرفته شد. محیطکشتها پساز دو روز گرماگذاری در 28 درجۀ سانتیگراد به ظروف شیشهای یکسان منتقل شدند و در شرایط استریل، نمونههای بتنی در آنها غرقاب و بهمدت 44 ساعت در دمای 28 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شدند. سپس نمونهها از محیطکشت خارج و با حوله خشک شدند و بهمدت سه روز بهمنظور ترسیب در محلول کلسیمکلراید 2/0، 4/0 و 6/0 مولار گرماگذاری شدند (29)..
.بررسی ترمیم سطحی نمونههای بتنی تیمارشده با میکروسکوپ الکترونی روبشی[6]: نمونههای مکعبی تیمارشده در ابعاد 5/0×5/0سانتیمتر و ضخامت 2 میلیمتر بریده شدند و پساز صافکردن سطح، یک نمونه از هر تکرار با طلا پوشانده شد و نمونههای آماده روی پایۀ مناسب نصب شدند. پساز رسیدن دستگاه به خلأ، تصویر سطح نمونهها با میکروسکوپ الکترونی روبشی سرنA1S2100 [7] با بزرگنماییهای 50× و 4000× مشاهده و ثبت شد.
شناسایی مولکولی جدایۀ منتخب: جدایۀ برتر در محیط BHIمایع کشت و بهمدت 24 ساعت در دمای 28 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شد. 3 تا 5 میلیلیتر از محیطکشت 24ساعته به ویال استریل منتقل و زیستتودۀ حاوی باکتری با چرخش بهمدت 1 دقیقه در میکروفیوژ با شتاب g18516 از محیطکشت جدا و DNA آن بهوسیلۀ کیت استخراج خارج شد. تکثیر ژن 16S rRNA جدایۀ برتر 167 با طول 1500 نوکلئوتید با استفاده از آغازگرهای 9F و 1541R (9F: 5’- AAG AGT TTG ATC ATG GCT CAG -3’ و .1541R: 5’- AGG AGG TGA TCC ACC CGC A -3’ ) و آنزیم امپلیکون مستر میکس[8] انجام شد. واسرشتی ابتدایی در دمای 96 درجۀ سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه، 28 چرخۀ تکثیر شامل واسرشتی 45 ثانیهای در دمای 94 درجۀ سانتیگراد، اتصال 55 ثانیهای آغازگر در دمای 57 درجۀ سانتیگراد، سنتز 75 ثانیهای در دمای 72 درجۀ سانتیگراد و باقیماندن در دمای 72 درجۀ سانتیگراد به مدت 10 دقیقه برای تکمیل فرایند سنتز انجام شد. محصول نهایی پساز خالصسازی روی ژل آگارز برای تعیین توالی استفاده شد. بهمنظور توالییابی، باند مدنظر به کمک کیت از ژل استخراج شد و به شرکت ماکروژن- کرۀ جنوبی ارسال شد. تعیین توالی براساس روش تغییریافتۀ سنگر انجام و نتایج آن در پایگاه اطلاعاتی EZtaxon و مرکز بینالمللی اطلاعات زیستفناوری[9] (NCBI) با روش همردیفی ارزیابی شد.
نتایج.
از کشت و خالصسازی چهار نمونه خاک قلیایی برگزیده روی پلیت 142 جدایۀ خالص به دست آمد.
غربالگری جدایهها بر اساس توانمندی تولید آنزیم اورهآز: از 142 جدایۀ بررسیشده، 18 جدایه انتخاب شدند که بیشترین رشد و هیدرولیز اوره را در کمترین زمان از آغاز آزمون داشتند. بررسی هیدرولیز اوره در محیط کریستنسن تنها تا 48 ساعت معتبر بود زیرا پساز این مدت، پپتون موجود در محیط تجزیه میشد و با محصولات قلیایی خود پاسخ مثبت کاذب ایجاد میکرد. 18 جدایۀ منتخب ازنظر واکنش گرم، مثبت و دارای رشد زیاد بودند (جدول 5). جدایهها بر اساس نوع رنگ تولیدشدۀ یاسی و بنفش که بهطور کیفی نشاندهندۀ میزان هیدرولیز اوره است بهترتیب به ++ و +++ تقسیمبندی شدند.
جدول 5- نتایج هیدرولیز اوره و ویژگیهای میکروسکوپی 18 جدایه پساز 48 ساعت
|
ریختشناسی سویه |
تولیدشدن یا نشدن اسپور |
میزان آنزیم تولیدشده |
شمارۀ جدایه |
ریختشناسی سویه |
تولیدشدن یا نشدن اسپور |
میزان آنزیم تولیدشده |
شمارۀ جدایه |
|
میلهای |
+ |
+++ |
167 |
میلهای |
- |
++ |
140 |
|
میلهای |
+ |
++ |
43 |
میلهای |
+ |
+++ |
46 |
|
میلهای |
+ |
++ |
110 |
میلهای |
+ |
+++ |
189 |
|
میلهای |
- |
+++ |
19 |
میلهای |
+ |
+++ |
34 |
|
میلهای کوتاه |
+ |
++ |
30 |
میلهای |
+ |
+++ |
24 |
|
میلهای |
- |
++ |
146 |
میلهای |
- |
++ |
147 |
|
میلهای |
- |
++ |
88 |
میلهای |
- |
++ |
85 |
|
میلهای |
- |
++ |
55 |
میلهای |
+ |
++ |
168 |
|
میلهای |
- |
++ |
151 |
میلهای |
- |
++ |
69 |
غربالگری جدایههای منتخب بر اساس توانمندی تولید رسوب کلسیمکربنات: نتایج کشت 18 جدایۀ مولد اورهآز روی محیط جامد تولید کلسیمکربنات نشاندهندۀ وجود رسوب کربناتکلسیم توسط جدایههای 110، 147، 167 و 168 است (شکل 1، پیکانها محل بلورهای رسوب کربناتکلسیم را در نزدیکی حاشیۀ کلنیها نشان میدهند).
رسوب حاصل از کشت مایع چهار جدایۀ منتخب در محیط مایع تولید کلسیمکربنات پساز شرکت در تیتراسیون برگشتی، تشکیل کلسیمکربنات را در جدایههای 167، 147 و 110 تأیید کرد و نشان داد به ترتیب 3/0، 1/0و 8/0گرمبرلیتر کلسیم کربنات در مدت دو روز تولید شده است.
شکل 1- تصاویر ریختشناسی کلنیهای جدایههای 167، 147، 168 و 110 در محیط جامد مناسب برای تولید کربناتکلسیم بهترتیب از چپ به راست
.نتایج شناسایی مولکولی و تعیین توالی سه جدایۀ برتر: نتیجۀ مقایسۀ توالی سه سویۀ برتر با سویههای مشابه در بانکهای ژنی و کد دسترسی ثبتشده در پایگاه اطلاعاتی NCBI برای سه جدایۀ مدنظر در جدول 6 آمده است. از میان سه جدایۀ منتخب، جدایۀ 167 کمترین درصد شباهت را به سویۀ مشابه یافتشده داشت. جدایههای یادشده در مجموعۀ ریزموجودات دانشگاه تهران نگهداری میشوند.
جدول 6- نتایج آزمون شناسایی مولکولی ژن 16S rRNAبرای سه جدایۀ منتخب 147، 167 و110
|
تعداد نوکلئوتید خوانششده |
سویه مشابه |
درصد شباهت |
کد دسترسی در NCBI |
کد مجموعۀ ریزموجودات دانشگاه تهران |
کد آزمایشگاه |
ردیف |
|
1338 |
Bacillus alkalisediminis |
01/97 |
AM051268.2 |
2623 |
167 |
1 |
|
1284 |
Bacillus horikoshi |
91/98 |
EU841500.1 |
2622 |
110 |
2 |
|
774 |
Bacillus clausii |
79/97 |
KP409413.1 |
2624 |
147 |
3 |
بررسی منحنی رشد جدایههای منتخب: در شکل 2 تراکم نوری بیشینه برای سه باکتری نشان داده شده است. تراکم نوری در هر زمان تا حد زیادی نشاندهندۀ میزان رشد در آن زمان است (شکل 2). میزان ویژۀ رشد برای سه جدایۀ برتر در بازۀ زمانی t0 (زمان شروع فاز لگاریتمی رشد) تا t (زمان رسیدن به بیشینه تراکم نوری که برای سه باکتری متفاوت است) محاسبه شده است. شدت ویژۀ رشد برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2624 در مدت زمان 48 ساعت برابر 003/0 بر ساعت، برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2622 در مدت زمان 44 ساعت برابر 003/0 بر ساعت و برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2623 در مدت زمان 44 ساعت برابر با 006/0 بر ساعت است.
بررسی غلظت بهینۀ پیشسازهای کلسیمکلراید و اوره برای تولید رسوب: در شکل 3میزان تولید سه سویۀ برتر در طول مدت آزمایش در سه غلظت مساوی اوره-کلسیمکلراید با مقادیر 2/0، 4/0، 6/0 مولبرلیتر نشان داده شده است. شدت ویژۀ تولید برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2624 در مدت زمان 48 ساعت برابر 6-10×3 گرمبرلیتر، برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2622 در مدت زمان 44 ساعت برابر 6-10×8/1 گرمبرلیتر و برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2623 در مدت زمان 44 ساعت برابر 6-10×9/2 گرمبرلیتر است.
شکل 2- نمودار تغییرات تراکم نوری سه جدایۀ برتر در طول زمان برای دستیابی به زمان رشد بیشینه
شکل 3- نمودار مقایسۀ میزان تولید رسوب کلسیمکربنات توسط سه جدایۀ برتر در سه غلظت مساوی اوره-کلسیمکلراید با مقادیر 2/0، 4/0، 6/0 مولبرلیتر در طول زمان
تجزیهوتحلیل دادهها به روش آنالیز واریانس تکمتغیره با دو فاکتور[10] در نرمافزار SPSS نسخۀ 16 انجام و وجودداشتن یا نداشتن تفاوت معنادار با سطح اطمینان 95 درصد (05/0P≤) بررسی شد. بر اساس آزمون پست هاک[11] انجامشده برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2622 تفاوت تأثیر دو غلظت 2/0 و 6/0 مولار و دو غلظت 4/0 و 6/0 مولار از اوره-کلسیمکلراید بر میزان تولید کلسیمکربنات معنادار است (05/0P≤)؛ بنابراین غلظتهای 2/0 و 4/0 مولار ازنظر تأثیر بر تولید باهم تفاوتی ندارند. باتوجهبه آزمون توکی انجامشده، اختلاف تولید کلسیمکربنات در روزهای مختلف نسبت به هم بیمعنا (05/0P>) و نسبت به لحظۀ صفر معنادار (05/0P≤) است. باتوجهبه دو آزمون انجامشده و بهمنظور صرفهجویی در مصرف مادۀ اولیه و زمان، غلظت 2/0 مولار از اوره-کلسیمکلراید و زمان پنج روز برای بهدستآوردن بیشترین تولید انتخاب شد. بر اساس آزمون پست هاک انجامشده برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2623 تأثیر سه غلظت 2/0، 4/0 و 6/0 مولار از اوره-کلسیمکلراید بر میزان تولید کلسیمکربنات اختلاف معناداری ندارد (05/0P>). باتوجهبه آزمون توکی انجامشده، اختلاف تولید کلسیمکربنات در روزهای مختلف نسبت به هم بیمعنا و نسبت به لحظۀ صفر معنادار است. باتوجهبه دو آزمون انجامشده و بهمنظور صرفهجویی در مصرف مادۀ اولیه و زمان، غلظت 2/0 مولار از اوره-کلسیمکلراید و زمان سه روز برای بهدستآوردن بیشترین تولید انتخاب شد. بر اساس آزمون پست هاک انجامشده برای باکتری Bacillus sp. UTMC 2624 تأثیر دو غلظت 4/0 و 6/0 مولار از اوره- کلسیمکلراید بر میزان کلسیمکربنات اختلاف معناداری دارد (P<0.05)؛ اما تفاوت تأثیر غلظت 2/0 مولار نسبت به دو غلظت 4/0 و 6/0 مولار بر میزان کلسیمکربنات معنادار نیست (P>0.05). از سویی باتوجهبه آزمون توکی[12] انجامشده اختلاف معناداری در میزان تولید کلسیمکربنات در روزهای مختلف وجود ندارد (05/0P>) و تنها اختلاف معنادار در مقایسۀ هریک از زمانهای بررسیشده با لحظۀ صفر مشاهده میشود (05/0P≤). باتوجهبه دو آزمون انجامشده بهمنظور دستیابی به محصول بیشتر بدون در نظرگرفتن زمان، غلظت 4/0 مولار از اوره-کلسیمکلراید انتخاب شد. باتوجهبه تحلیل اعداد بهدستآمده برای هر باکتری ازنظر میزان مصرف مادۀ اولیه، مدت زمان رسیدن به تولید و میزان تولید، باکتری Bacillus sp. UTMC 2623 بیشترین میزان تولید کلسیمکربنات را در کمترین زمان یعنی سه روز داشت و غلظت 2/0 مولار اوره-کلسیمکلراید غلظت مناسبتر انتخاب شد. بازدۀ تولید این جدایه در غلظت 2/0 مولار از اوره-کلسیمکلراید طی مدت پنج روز برابر با 16/6 بود.
باتوجهبه نتایج تحلیل آماری دادههای شکل 3 و نتایج شناسایی مولکولی آنها مبنی بر شباهت کمتر این سویه به سویۀ مشابه باسیلوس آلکالی سدیمینیس[13]، Bacillus sp. UTMC 2623 جدایۀ برتر انتخاب و بررسی ترمیم سطحی بتن و مشخصهیابی XRD تنها برای این جدایه انجام شد.
.بررسی ترمیم سطحی بتن توسط جدایۀ برتر:نمونههای تیمارشدۀ گروههای یک، دو و سه که در ابعاد 5/0 ×5/0 سانتیمتر و ضخامت 2 میلیمتر آمادهسازی شده بودند با میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی سطحی شدند. در شکل 4 میکروگراف میکروسکوپ الکترونی سطح نمونۀ تیمارشده با باکتری Bacillus sp. UTMC 2623 در سه گروه 1) باکتری، کلسیمکلراید و اوره 2) باکتری و 3) کلسیمکلراید و اوره نشان داده شده است. در شکل 4- الف سطح نمونههای تیمارشده با بزرگنمایی 500× نشان داده شده است. ضخامت و تراکم لایۀ تشکیلشده روی سطح در شکل 4-الف-1 نسبت به 4-الف-2 و 4-الف-3 کاملاً مشخص است. این لایه نشاندهندۀ پوشانندگی سطحی ناشی از تیمار باکتریایی در حضور اوره و کلسیمکلراید است. در شکل 4-ب سطح همان نمونهها با بزرگنمایی 4000× نمایش داده شده است. در شکل 4-ب-1 تعداد زیادی ساختارهای بلوری با ابعاد حدود 2 تا 5 میکرون بهشکل شبهمکعب یا چندوجهی با اضلاع متفاوت دیده میشود. تراکم و ساختار نسبتاً بلوری لایۀ تشکیلشده روی سطح بتن در شکل 4-ب-1 در مقایسه با ساختارهای پراکنده و بلورهای نامنظم شکلهای 4-ب-2 و 4-ب-3 مشاهده میشود. در شکل 4-ب-2 بیشتر ترکیبات تشکیلشده روی سطح بیشکل دیده میشوند که نشاندهندۀ هیدراتاسیون ذاتی بتن و ترکیبات محیطکشت و رسوبات سریع تشکیلشده است؛ همچنین در این قسمت پوشانندگی کمتری روی خللوفرج سطح بتن دیده میشود. در شکل 4-ب-3 نیز رسوبات بیشکل با پوشانندگی کمتری نسبت به شکل 4-ب-2 دیده میشود. همانطور که در مشخصهیابی XRD تأیید شد بیشتر رسوبات کربنات دیدهشده با شکل شبیه به مکعب از نوع کلسیت است.
مشخصهیابی پراش پرتو ایکس: پیشازاین، طبیعت بلوری رسوبات کلسیمکربنات تشکیلشده در فرایند ترمیم باکتریایی اثبات شده است (30). ازآنجاکه روش مشخصهیابی پراش پرتو ایکس ساختار بلوری را در نمونه تشخیص میدهد از آن برای تأیید یا رد حضور بلورهای کلسیمکربنات در رسوب حاصل از باکتری استفاده میشود. در شکل 5 نتیجۀ مشخصهیابی XRD رسوب خشکشدۀ باکتری باسیلوس آلکالی سدیمینیس ارائه شده است. در شکل 5-الف پیکهای مربوط به بلورهای موجود در رسوب یادشده نشان داده شده است. ازآنجاکه رسوب دارای مواد آلی باقیمانده از زیستتودۀ باکتری و سایر مواد رسوبکرده در محیط است پیکها تیز[14] نیستند و اغتشاشهایی[15] در فاصلۀ بین آنها مشاهده میشود. در شکل 5-ب مجموعه پیکهای گرفتهشده با نزدیکترین مجموعه پیکهای مرجع مقایسه شده است و همانطور که ملاحظه میشود پنج پیک مرجع کلسیمکربنات با پنج پیک بهدستآمده از مشخصهیابی رسوب هماهنگ هستند. اندیسهای میلر پیکهای مدنظر در جدول 7 آمده است. اندیسهای میلر زاویۀ هریک از وجوه یک بلور را نسبت به محورهای x، y و z در فضا نشان میدهند (31).
شکل 4- الف. تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی سطح نمونههای تیمارشده در سه گروه 1) باکتری Bacillus sp. UTMC 2623، کلسیمکلراید و اوره 2) باکتریBacillus sp. UTMC 2623 3) کلسیمکلراید و اوره (بزرگنمایی 500×)، ب. تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی سطح نمونههای تیمار شده در سه گروه 1) باکتری UTMC 2623.Bacillus sp و کلسیمکلراید و اوره 2) باکتریBacillus sp. UTMC 2623 3) کلسیمکلراید و اوره (بزرگنمایی 4000×)
شکل 5- الف. الگوی مشخصهیابی XRD رسوب خشکشدۀ باکتری Bacillus sp. UTMC 2623، ب. مقایسۀ پیکهای بهدستآمده از مشخصهیابی با پیکهای مرجع بلور های سدیمکلراید و کلسیمکربنات
جدول 7- اندیسهای میلر زوایای پراش بلور کلسیمکربنات تولیدشده توسط باکتری
|
زاویه 2تتا ( درجه) |
اندیس میلر |
|
48/29 |
104 |
|
43/39 |
113 |
|
16/47 |
024 |
|
61/48 |
116 |
|
55/56 |
211 |
بحث و نتیجهگیری
بتن یکی از مصالح ساختمانی بسیار مهم و پرکاربرد است که ماهیت متخلخل آن امکان ورود آب و انواع مواد تخریبکننده را ممکن میکند و دوام سازه را کاهش میدهد (32). امروزه برای کاهش هزینههای تولید و نگهداری بتن، محصولات جانبی بسیاری از صنایع مانند خاکستر بادی و سربارۀ کورۀ آهنگدازی بهعنوان جایگزین سیمان در مخلوط بتن استفاده میشوند (33). برای سازههای درحال بهرهبرداری نیز مواد شیمیایی متعددی ازجمله اپوکسی و سیلانها به کار میروند که هزینۀ زیاد و مشکلات زیستمحیطی آنها موجب توجه به باکتریها (عوامل تجدیدپذیر و سازگار با طبیعت) شده است (4). نتایج پژوهش حاضر نشان میدهند سویۀ Bacillus sp. UTMC 2623 با استفاده از مسیر اورهآز و منبع کلسیم میتواند 5/8 گرمدرلیتر رسوب کلسیمکربنات طی سه روز تولید کند. این مقدار در مقایسه با مقدار کلسیمکربنات تولیدشده توسط باکتریهای بهکاررفته در مطالعههای پژوهشگران دیگر درخور توجه است؛ برای نمونه، بر اساس پژوهش کنگ[xvi] و همکاران باکتری لیزینی باسیلوس اسفریکوس توانایی تولید 8/9 گرمدرلیتر رسوب کلسیمکربنات دارد (34). ازآنجاکه این جدایه در اسیدیتۀ زیاد (حدود 9 تا 10) قابلیت رشد و عملکرد دارد و باکتری ترمیمکنندۀ سطح بتن باید بتواند اسیدیتۀ زیاد بتن را تحمل کند (35) به نظر میرسد توانمندی زیادی برای ترمیم سطحی بتن داشته باشد. نتایج مشخصهیابی XRD نیز حضور بلور کلسیمکربنات را در رسوب حاصل از جدایۀ برتر تأیید میکنند. مشاهدههای میکروسکوپ الکترونی روبشی افزایش تولید بلور ناشی از وجود باکتری را نشان میدهند و این حقیقت را تأیید میکنند که حضور باکتری و منبع کلسیم نقش مهمی در میزان ترمیم خللوفرج و یا ترکهای سطحی بتن دارد. ترسیب زیستی انجامشده از مسیر اورهآز با وجود تمام مزایای برشمرده مشکلاتی دارد که تاکنون از بهکاربردن آن در مقیاس گستردۀ تجاری جلوگیری کرده است؛ برای نمونه، آمونیوم تولیدشده در مسیر اورهآز برای انسان و ریزموجودات خاک خطرناک است. باکتریها این آمونیوم را به نیتریکاسید تبدیل میکنند و با کلسیمکربنات موجود واکنش میدهند و ترکیب محلول کلسیمنیترات را تولید میکنند که بهطور خطرناکی موجب ازبینرفتن سازه میشود. گنندرا[xvii] و همکاران نوعی ترسیب زیستی را بررسی کردند که باکتری متیلوکوکوس پرووس OBBP [xviii] انجام میدهد. این باکتری از مسیر اورهآز برای تولید کلسیمکربنات استفاده نمیکند و بنابراین آمونیوم تولید نمیکند بلکه از طریق اکسیداسیون فرمات در پیشساز کلسیمفرمات داده شده به آن در محیط ترسیب، کلسیمکربنات را رسوب میدهد (36). مشکل دیگر، پیچیدگی و سرعت کم مسیر اورهآز برای ترسیب زیستی و بستگی کامل آن به شرایط محیط اطراف مانند دما، اسیدیته، غلظت دهندهها و پذیرندههای الکترون و سرعت پراکندگی مواد غذایی و محصولات است؛ بنابراین تجاریسازی ترمیم زیستی کار آسانی نیست (37). بهمنظور کاربرد تجاری ترسیب زیستی، منابع تغذیهای باکتری و پیشساز استفادهشده باید ازنظر اقتصادی به صرفه و بههمینعلت ارزان و دردسترس باشند؛ برای نمونه، کاربرد شیرابۀ ذرت که در پژوهشهای پیشین بهعنوان محیطکشت استفاده شده است گزینۀ مناسبی است (38) هرچند محصولات جانبی تولیدشدۀ ناشی از بهکاربردن این محیطها باید بررسی شوند تا برای محیطزیست خطرناک نباشند (37). تاکنون باکتریهای متعددی از جنس باسیلوس بهعلت فراگیربودن و مقاومت زیاد اسپورهایشان به عوامل فیزیکی و شیمیایی در ترمیم سطحی و عمقی بتن مطالعه شدهاند (39). باسیلوس سوبتیلیس و باسیلوس اسفریکوس ازجمله ترمیمکنندههای سطحی هستند (34) اما تاکنون گزارشی مبنی بر عملکرد ترمیمی باکتری باسیلوس آلکالی سدیمینیس ارائه نشده است. این باکتری همانطورکه اشاره شد بهطور درخور توجهی کلسیمکربنات تولید میکند و از خاک ایران جداسازی شده است. نتایج پژوهش حاضر در معرفی این گونه بهعنوان ترمیمکنندۀ زیستی بومی سطح بتن استفاده میشوند.
[1]- نوعی صدف دوکفهای خوراکی که در سواحل آمریکای جنوبی یافت میشود.
[2]- Horikoshi
[3]- Optical density
[4]- X Ray Diffraction
[5]- XPERT-PRO
[7]- serron
[8]- Amplicon Master Mix
[10]- Univariate ANOVA
[11]- Post hoc
[12]- Tukey
[13]- Bacillus alkalisediminis
[14]- sharp
[15]- noise
[xvi]- Kang
[xvii]- Ganenda
[xviii]- Methylocystis parvus OBBP
)