بهره‌گیری از انگشت‌نگاری PCR-DGGE و تنفس خاک برای شناخت دگرگونی‌های باکتریایی در خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه آموزشی علوم خاک، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران

2 گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا، همذان، ایران

3 گروه آموزشی علوم پایه پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد اصفهان (خوراسگان)، ایران

چکیده

مقدمه: آلودگی خاک به فلزهای سنگین سرب و روی پیرامون کانسارهای این فلزها باعث دگرگونی ساختار، پیچیدگی، گوناگونی و کارکرد ریزجانداران خاک مانند باکتری‌ها می‌شود.‏‏
مواد و روش‏‏ها: برای بررسی پیامد آلودگی معدن سرب و روی باما در اصفهان بر گوناگونی ریزجانداران خاک‌های پیرامون خود از روش نشانگر مولکولی موسوم به انگشت‌نگاری PCR-DGGE بهره‌گیری شد. 9 نمونه از خاک‌های معدن باما با میزان آلودگی‌های کم تا زیاد برداشت شدند و پس‌از استخراج DNA هریک از خاک‌ها، ناحیۀ 468 جفت بازی درون ژن 16SrRNA با PCR تکثیر شد. سپس الکتروفورز DGGE انجام شد و اثر انگشت‌های باکتریایی روی ژل به دست آمدند و برای برآورد گوناگونی ریزجانداران بهره‌برداری شدند. همچنین با اندازه‌گیری تنفس پایه (BR) و برانگیختۀ (SIR) خاک و محاسبۀ بهرۀ متابولیک، تغییرات کارکرد ریزجانداران خاک بررسی شد.
نتایج: پیچیدگی و گوناگونی باکتری‌های خاک با افزایش مقدار در دسترس فلزهای سنگین سرب و روی کاهش می‌یابد و ساختار و گوناگونی آنها دگرگون‌ می‌شود. فراوانی نسبی باکتری‌های پایدارتر با افزایش آلودگی خاک به فلزهای یادشده افزایش می‌یابد. آلودگی خاک کارکرد باکتری‌ها را کاهش می‌دهد؛ به‌طوری‌که تنفس برانگیختۀ خاک کاهش می‌یابد. تنفس برانگیخته و بهرۀ متابولیک پاسخ نمایان‌تری به آلودگی خاک می‌دهند و برای سنجش چگونگی خاک بهتر از تنفس پایه هستند.
بحث و نتیجه‏گیری: اگرچه گوناگونی باکتریایی با افزایش آلودگی کاهش معناداری نشان می‌‌دهد در خاک‌های بسیار آلوده شاهد گوناگونی به‌‌نسبت زیادی هستیم و علت آن احتمالاً مدت زمان زیاد آلودگی خاک است؛ زیرا فرصت کافی برای باکتری‌ها وجود داشته است تا به این آلودگی سازگار شوند و باکتری‌های پایدار در خاک‌های آلوده تکثیر شوند. این توانایی سازگاری باکتری‌ها و کارکردهای مهم بوم‌شناختی که در تنش فلزهای سنگین ایفای نقش می‌کنند بسیار ارزشمند هستند و انجام پژوهش‌های بیشتر دربارۀ آنها را پیشنهاد می‌کنند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Using PCR-DGGE and Soil Respiration to Characterize Bacterial Changes in Heavy Metal Contaminated Soils

نویسندگان [English]

  • Mohammad Hossein Hemmat-Jou 1
  • Ali Akbar Safari Sanjani 1
  • Asghar Mirzaie-Asl 2
  • Arezoo Tahmourespour 3
1 Department of soil science, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina University, Hamedan, Iran
2 Department of agricultural biotechnology, Faculty of Agriculture, Bu-Ali Sina university, Hamedan, Iran
3 Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medical Sciences, Isfahan (Khorasgan) branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Soil contamination to heavy metals such as lead and zinc in and around mines causes a change in structure, complexity, diversity and activity of soil microbial communities like bacteria.
Materials and methods: In the present research, PCR-DGGE approach was used to investigate the effects of Pb and Zn-contamination in Bama mine near Isfahan city on bacterial diversity, structure and complexity. Basal Respiration (BR) and Substrate Induced Respiration (SIR) was also used to assess microbial activities. Nine samples from three locations (3 for each) with different levels of heavy metal contamination were taken (from low to high), then their DNA were directly extracted. Also a 468 base pair of their 16S rRNA genes were amplified using specific primers, and their fingerprints were obtained by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). BR and SIR were measured, and metabolic quotient was calculated. Finally, soil microbial activity in polluted conditions was achieved.
Results: Our findings illustrate that heavy metal contamination has negative effects on bacterial diversity. By increasing the bioavailability of Pb and Zn, the complexity and diversity of bacterial communities decreased and the frequency of resistant bacteria increased. By increasing Pb and Cd contamination, SIR reduced and this shows the reduction in microbial biomass. In these conditions, SIR and metabolic quotient was more sensitive than BR, so they are better ecological indicators in polluted soils.
Discussion and conclusion: Although bacterial diversity showed reduction in polluted soils, diversity is still relatively high. Bacterial ability to adapt in heavy metal contamination, bacterial resistance and their important functional roles in such conditions are valuable in soil ecosystem suggesting further researches on them.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Diversity
  • PCR-DGGE
  • Basal Respiration
  • Substrate Induced Respiration
  • Metabolic Quotient
  • Lead
  • Zinc
  • Bama mine

مقدمه.

روش‌های مولکولی شناخت گوناگونی ریزجانداران خاک را امکان‌پذیر کرده‌اند؛ کاری که زمانی حتی گمان آن نیز دشوار بود. بوم‌شناسی مولکولی خاک به‌منظور تعیین گوناگونی ریزجانداران با استخراج، جداسازی و شناسایی نوکلئیک‌اسیدها و دیگر بخش‌های یاخته مانند اسیدهای چرب فسفولیپیدی و پروتئین‌های ریزجانداران خاک انجام می‌شود. شمارش مستقیم میکروسکوپی باکتری‌های خاک تنها یک یا دو رده از رده‌های بی‌شمار باکتری‌هایی را آشکار می‌کند که با کشت‌دادن به دست می‌آیند. روش‌های مولکولی دسترسی به 90 تا 99 درصد جامعۀ زیستی شناسایی‌نشدۀ خاک را ممکن می‌کنند (1).

انگشت‌نگاری[1] PCR یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین روش‌های مولکولی برای بررسی‌گوناگونی زیستی است. برتری این روش‌ سرعت بیشتر انجام آن در مقایسه با روش‌های توالی‌یابی[2] است؛ ازاین‌رو، امکان بررسی تعداد زیاد نمونه‌ طی زمان کم وجود دارد. روش‌های الکتروفورز ژل شیب‌دار واسرشته‌ساز (DGGE) یا گرمایی (TGGE)[3] و تجزیه‌وتحلیل چندشکلی طول قطعۀ محدودشدۀ انتهایی [4](T-RFLP) از پرکاربردترین روش‌های انگشت‌نگاری PCR برای شناسایی جامعۀ ریزجانداران خاک هستند. از روش‌های یادشده برای جداسازی فراورده‌های PCR استفاده می‌شود؛ زیرا فراورده‌های PCR به‌دست‌آمده در پژوهش‌های گوناگونی زیستی دارای طول یکسان هستند. در بیشتر پژوهش‌ها جایگاه‌های بسیار متغیر ژن 16S rRNA بررسی می‌شوند زیرا تبارزایی (فیلوژنتیک) ریزجانداران را نشان می‌دهند (1 و 2). کاربرد درست انگشت‌نگاری PCR در پژوهش‌های جمعیت به تفسیر درست باندها یا الگوی لکه‌های حاصل روی ژل‌های الکتروفورز بستگی زیاد دارد. بیشتر تصویرهای ژل‌ها دیجیتالی (شماره‌ای) هستند و از نرم‌افزار شناسایی‌کنندۀ باندها روی ژل برای نشانه‌گذاری جایگاه هر باند بهره‌گیری می‌شود و الگوی حاصل با نرم‌افزار آماری بررسی می‌شود‌؛ نرم‌افزارهای گوناگونی مانند BioNumerics، GelCompar، Canoco و PHYLIP (در GenBank و RDPII) برای این کار در دسترس هستند که بیش از دیگر نرم‌افزارها کاربرد دارند (3).

در روش‌های انگشت‌نگاری PCR از ژل پلی‌اکریل‌آمید استفاده می‌شود که برای جداسازی پروتئین‌ها، DNA تک‌رشته‌ای با اندازۀ حداکثر 2 کیلوباز و DNA دو رشته‌ای با اندازۀ کمتر از 1 کیلوباز بهره‌برداری می‌شود. ژل‌های پلی‌اکریل‌آمید جداسازی درشت‌مولکول‌ها را بر پایۀ اندازه، شکل، بار الکتریکی و فراوانی G+C (بازهای آلی سیتوزین و گوانین) در ژن‌های تکثیر‌شده انجام می‌دهند. این روش جنبش مستقل از شکل DNA روی ژل پلی‌اکریل‌آمید پایۀ بسیاری از روش‌هایی است که از برهم‌کنش‌های درون‌رشته‌ای و میان‌رشته‌ای نوکلئوتیدها استفاده می‌کنند و در غربال‌گری سریع DNA تکثیر‌شده برای شناسایی ناهمانندی‌های بسیار کوچک در توالی نوکلئوتیدها به کار می‌روند (1)..

شناسه‌های اندازه‌گیری کارکرد مانند تنفس ریزجانداران که به دو روش تنفس پایه (BS)[5] و برانگیخته (SIR)[6] اندازه‌گیری می‌شود در بررسی پیامدهای آلودگی خاک بسیار سودمند هستند. تنفس خاک یکی از شناسه‌های کیفیت خاک است که بسیار سریع به دگرگونی‌های رخ‌داده در خاک واکنش نشان می‌دهد و از مهم‌ترین ویژگی‌های زیستی خاک به شمار می‌رود (4). تنفس خاک مواد خوراکی و انرژی را برای ریزجانداران و گیاهان فراهم می‌کند و سرآغاز کانی‌شدن کربن است. تنفس پایه فراوانی و زنده‌بودن جانداران و ریزجانداران هوازی، فراوانی مواد آلی سادۀ فروزینه‌شونده و بهداشت خاک، کارکرد و سرعت سوخت‌وساز مواد آلی در خاک را نشان می‌دهد. تنفس برانگیخته با افزودن مواد آلی ساده مانند گلوکز به خاک و گرماگذاری آن در شرایط بهینه طی زمان کوتاه (1 تا 3 ساعت) به دست می‌آید و فراوانی و زیتودۀ ریزجانداران خاک (SMB)[7] را نشان می‌دهد (5). تنفس برانگیخته در پژوهش‌های آلودگی برای ارزیابی مدیریت خاک و دگرگونی زودگذر فراوانی و کارکرد ریزجانداران سودمند است (5).

فلزهای سنگین در خاک به‌شکل‌ محلول، تبادلی، کمپلکس با مواد آلی، ترکیب با آنیون‌هایی مانند کربنات‌ها، فسفات‌ها و سولفیدها، ترکیب با اکسیدهای آهن، آلومینیوم و منگنز و در ساختمان کانی‌ها وجود دارند و تنها بخش کمی از آنها جذب می‌شود (6). خاستگاه فلزهای سنگین طبیعی یا انسانی است. آلودگی خاک با فلزهای سنگین دارای خاستگاه انسانی باعث آلودگی پایدار و همیشگی خاک می‌شود ولی آلودگی خاک با فلزهای سنگین دارای خاستگاه طبیعی معمولاً پدیده‌ای فصلی و گذرا و وابسته به آب‌وهوا است که آلودگی پایدار در پی ندارد (7). در معدن‌کاری به‌ازای بیرون‌کشیدن هر گرم فلز، مقدار بسیار زیادی مواد زائد سنگی حاوی فلزهای سنگین پدید می‌آید. این فلزها با فرایندهای آبشویی شیمیایی و زیستی جنبش‌پذیر می‌شوند و از زمین، خاک و آب‌ها می‌گذرند و در پایان به زنجیرۀ غذایی می‌رسند (8). سرب و روی ازجمله مهم‌ترین فلزهای سنگین هستند که آلودگی زیادی ایجاد می‌کنند. اگرچه روی از عناصر غذایی کم‌مصرف برای جانداران است که در ساختمان آنزیم‌های مهم وجود دارد هیچ کارکرد زیستی برای سرب یافت نشده است. هم‌زمانی جذب سرب و کادمیوم سمیت سرب را افزایش می‌دهد (9). روی و کادمیوم به‌شکل تبادلی درمی‌آیند و بنابراین قابلیت جذب زیادی دارند اما سرب در خاک ته‌نشین می‌شود و جذب کمتری دارد. میانگین سرب کل در خاک 15 میلی‌گرم‌بر‌کیلوگرم است و در خاک‌های آلوده تا 100 میلی‌گرم‌بر‌کیلوگرم هم می‌رسد. میانگین روی کل در خاک 120 میلی‌گرم‌بر‌کیلوگرم است و بیشتر از این مقدار نشانۀ آلودگی خاک به روی است (6).

در پژوهش حاضر پیامدهای آلودگی کانسار سرب و روی باما بر خاک‌های پیرامون آن بررسی شد و برای نخستین‌بار در کشور، پیامدهای این آلودگی با به‌کارگیری روش انگشت‌نگاری PCR-DGGE برای ارزیابی گوناگونی ریزجانداران خاکزی بررسی شدند. تنفس پایه، تنفس برانگیخته و بهرۀ متابولیک برای ارزیابی دگرگونی کارکردهای ریزجانداران اندازه‌گیری و محاسبه شدند. اهداف پژوهش حاضر عبارتند از:

1- با به‌کارگیری روش PCR-DGGE دستیابی به باکتری‌های کشت‌پذیر و کشت‌ناپذیر و بررسی آنها انجام و شناخت بهتری از گوناگونی باکتری‌ها در سطوح متفاوت آلودگی خاک‌ها حاصل شود؛

2- پیامدهای آلودگی بلندمدت (50 سال) خاک به مقادیر کم تا زیاد سرب و روی بر ساختار، گوناگونی، پیچیدگی و کارکرد ریزجانداران خاک با به‌کارگیری روش‌های یادشده بررسی شود؛

3- باکتری‌های پایدار و سازگارشده در سطوح متفاوت آلودگی خاک‌ها شناسایی شوند؛

4- توانایی روش‌های یادشده در چنین شرایطی سنجیده شود.

مواد و روش‌ها

جایگاه نمونه‌برداری از خاک: کانسار سرب و روی باما سومین کانسار سرب و روی بزرگ کشور در نزدیکی شهر اصفهان (منطقۀ ایران‌کوه) است که بیش از 50 سال از بهره‌برداری آن می‌گذرد. روش‌های برداشت خاکسارۀ این کانسار روش تونلی با کارگاه‌های استخراج و روش روباز است که باعث به‌جاماندن کانی‌های بسیار در کارگاه‌های استخراج می‌شوند‌. کانی‌های کربنات‌روی، کربنات‌سرب، همی‌مورفیت، هیدروزونیت و سنگ سرب یا گالن (PbS) بیشتر در بخش‌های رویین کانسار باما وجود دارند. زباله‌های حاصل از جداسازی کانی‌ها طی 50 سال گذشته در جایگاه‌های ویژه‌ای انباشته شده‌اند و گیاهان روییده پیرامون آنها با‌توجه‌به فراوانی زیاد سرب و روی در این جایگاه‌ها به این فلزها پایداری نشان می‌دهند (10) و شاید ریزجانداران این خاک‌ها نیز با چنین دشواری‌هایی سازگار شده باشند؛ موضوعی که در پژوهش حاضر بررسی خواهد شد.

سه جایگاه نمونه‌برداری با آلودگی کم (بیرون از جایگاه معدن‌کاری)، با آلودگی متوسط (نزدیک به کانسار تپه سرخ) و با آلودگی زیاد (نزدیک به کانسار گوشفیل) باتوجه‌به پژوهش‌های پیشین پارسادوست و همکاران (10) برای نمونه‌برداریگزینش شدند و از خاک رویین (صفر تا 10 سانتی‌متری) آنها در سه تکرار نمونه‌برداری شد (شکل 1). 9 نمونۀ خاک بی‌درنگ روی یخ گذاشته و به آزمایشگاه رسانده شدند و برای بررسی ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی و همچنین جداسازی و بیرون‌کشیدن DNA خاک در یخچال نگهداری شدند.


 

 

شکل 1- کانسار باما در بخش جنوبی شهر اصفهان و جایگاه‌های نمونه‌برداری؛ جایگاه‌های S1، S2 و S3 به‌ترتیب دارای آلودگی بسیار کم، متوسط و زیاد به فلزهای سنگین هستند. جایگاه‌های یادشده بر اساس پژوهش پارسادوست و همکاران (10) انتخاب شده‌اند.


کارهای آزمایشگاهی: نمونه‌های خاکی که برای اندازه‌گیری ویژگی‌های گوناگون خاک برداشت شده بودند هواخشک شدند و از الک 2 میلی‌متری گذارنده شدند. سپس بافت خاک به روش هیدرومتری (11)، اسیدیتۀ خاک (12)، هدایت الکتریکی خاک (13)، کربن آلی خاک (14)، نیتروژن خاک (15)، فسفر قابل‌جذب خاک (12)، پتاسیم تبادلی خاک (16)، غلظت کل (17) و غلظت قابل‌جذب فلزهای سنگین با DTPA (18) اندازه‌گیری شد. تعداد باکتری‌های کشت‌پذیر خاک در محیط‌کشت NA (نوترینت‌آگار) به روش شمارش کلنی به دست آمد (5).

برای اندازه‌گیری تنفس پایه، 100 گرم از هر نمونۀ خاک با رطوبت مناسب (55 درصد گنجایش زراعی) در ظرف‌های مخصوص (سیلندرهای دو لیتری) ریخته و به‌مدت یک هفته در انکوباتور با دمای 22 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. CO2 پدید‌آمده از تنفس ریزجانداران در محلول NaOH 1/0 نرمال که از پیش در لوله آزمایش‌های کوچک ریخته شده و درون سیلندرهای دارای خاک قرار داده شده بود گردآوری و باقیماندۀ سود سوزآور به‌وسیلۀ تیتراسیون با HCl 1/0 نرمال اندازه‌گیری شد؛ درنهایت، مقدار تنفس با یکای میلی‌گرم دی‌اکسیدکربن پدید‌آمده در هر گرم خاک خشک در روز گزارش شد (5). برای اندازه‌گیری تنفس برانگیخته نیز پیش‌ماده گلوکز به خاک افزوده و سپس CO2 پدیدآمده اندازه‌گیری شد (5).

برای ارزیابی گوناگونی، پیچیدگی و ساختار جامعۀ باکتریایی خاک از روش PCR-DGGE بهره‌گیری شد. نخست DNA خاک با بهره‌گیری از کیت توانمند استخراج DNA از خاک[8] (ساخت شرکت MO BIO) بر پایۀ دستورکار سازنده جداسازی شد. پس‌از بیرون‌کشیدن DNA هر نمونۀ خاک، کیفیت و کمیت آن با الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1 درصد وزنی/حجمی و با دستگاه اسپکتروفوتومتر NonoDrop-1000 بررسی شد. باتوجه‌به اینکه نسبت [9]OD260 (چگالی نوری در طول موج 260) به OD280 (چگالی نوری در طول موج 280 نانومتر) کمتر از 7/1 نشان از آلودگی DNA به پروتئین و نسبت OD260 به OD230 (چگالی نوری در طول موج 230 نانومتر) کمتر از 2 نشان از آلودگی DNA به اسیدهای هیومیک خاک است (3) DNA حاصل در بازۀ غلظت پاک قرار داشت. پس‌از به‌دست‌آوردن DNA خاک، ناحیۀ 468 جفت بازی ژن 16S rRNA باکتریایی با به‌کارگیری آغازگر پیش‌برنده 338 (F338) و برگشتی 805 (R805) که تکثیرکنندۀ ناحیۀ یادشده هستند و انجام PCR تکثیر شد. (19). بسیار مهم است که یک توالی پر از بازهای سیتوزین و گوانین به پایانۀ ′5 آغازگر پیش‌برنده افزوده شود که به آن گیره[10] گفته می‌شود. پیوند هیدروژنی میان این بازها نیرومندتر از آدنین و تیمین است و توالی پر از گوانین و سیتوزین دمای ذوب زیادی دارد؛ در نتیجه، طی آزمایش ذوب نمی‌شود و مانند گیره یا انبرک توالی‌های 16S rRNA ناهمانند را از هم جدا می‌کند (20). یادآوری می‌شود ناهمانندی میان گونه‌ها در روش PCR-DGGE مهم است و این ناهمانندی گاهی به‌اندازه‌ای اندک است که هیچ‌گونه گوناگونی بدون گیرۀ GC به دست نمی‌آید (21). توالی‌های به‌کار‌رفته در زیر آورده شده‌اند (19):


توالی GC (GC-clamps):

5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3′

توالی آغازگر پیش‌برنده (F338):

5′-ACT CCT ACG GGA GGC AG-3′

توالی آغازگر برگشتی (R805):

5′-GAC TAC CAG GGT ATC TAA TCC-3′

 

برای تکثیر بخش ناحیۀ 468 جفت بازی ژن 16S rRNA باکتریایی با آغازگرهای یاد‌شده از واکنشگرهای زیر بهره‌گیری شد: 1 میکرولیتر DNA الگو یا DNA جداشده از خاک، 1 میکرولیتر آغازگر پیش‌برنده، 1 میکرولیتر آغازگر برگشتی، 10 میکرولیتر مسترمیکس PCR، 12 میکرولیتر آب PCR سترون و بدون DNA (از آب مقطر پزشکی بهره‌گیری شد) (حجم نهایی 25 میکرولیتر). گام‌های انجام PCR که با دستگاه Applied Biosystems 96 well Thermal Cycler انجام شدند عبارتند از:

-                     واسرشته‌سازی نخستین: 95 درجۀ سانتی‌گراد برای 5 دقیقه؛

-                     واسرشته‌سازی: 95 درجۀ سانتی‌گراد برای 45 ثانیه؛

-                     پیوند آغازگرها: 57 درجۀ سانتی‌گراد برای 45 ثانیه؛

-                     گسترش: 72 درجۀ سانتی‌گراد برای 45 ثانیه.

این سه گام اصلی PCR در 35 چرخه تنظیم شدند و درنهایت، گسترش پایانی به‌مدت 10 دقیقه در 72 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد.

آمپلیکون‌های به‌دست‌آمده با الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1 درصد وزنی/حجمی و سپس بهره‌گیری از دستگاه اسپکتروفتومتر NonoDrop-1000 بررسی و کیفیت و کمیت‌سنجی شدند.

برای انجام الکتروفورز روی ژل شیب‌دار واسرشته‌ساز (DGGE) از دستگاه Bio-Rad; DCodeTM Universal Mutation Detection System طراحی‌شده برای این کار بهره‌گیری و از دستورکار پیشنهادی مویزر[11] و همکاران (20) پیروی شد. نخست 200 نانوگرم از آمپلیکون PCR در ژل پلی‌اکریل‌آمید بارگیری شد. ژل پلی‌اکریل‌آمید (5، 10 و 15 درصد) با نسبت 5/37 اکریل‌آمید به 1 بیس‌اکریل‌آمید با شیب چگالی 35 تا 70 درصد واسرشته‌ساز از محلول 100 درصد آن (با اورۀ 7 مولار و فرم‌آمید 40 درصد وزنی/حجمی) آماده شد. شیب غلظت بر اساس دستورکار مویزر و همکاران (20) با به‌کارگیری نسبت‌های مختلف اوره و فرم‌آمید تهیه شد. افزون بر فراوردۀ PCR از نشانگر اندازۀ DNA یا همان نردبان یا خط‌کش (ساخت شرکت Qiagen) نیز روی ژل بارگیری شد تا سنجشی برای اندازۀ هریک از باندهای به‌دست آمده روی ژل باشد. برای اجرای الکتروفورز از بافر TAE بهره‌گیری شد که با EDTA و تریس- استات ساخته می‌شود. الکتروفورز به‌مدت 17 ساعت در دمای 60 درجۀ سانتی‌گراد با ولتاژ الکتریکی 70 ولت انجام شد. پس‌از‌آن، ژل‌ها با به‌کارگیری نیترات‌نقره رنگ‌آمیزی شدند و در دستگاه SyngeneGBox Gel Documentation System ساخت شرکت Syngene با نور فرابنفش دیده شدند و تصویرهای[12] دیجیتالی آنها به دست آمد. سپس، تصویرها با نرم‌افزار Quantity-One Software 4.6.9 ساخت شرکت Bio-Rad آمریکا تجزیه‌وتحلیل شدند. این کارها دربرگیرندۀ ساخت ماتریس بود/نبودباند، حذف خطای پس‌زمینه از چاهک‌های الکتروفورز، شناسایی هر باند به‌طور جداگانه و تطبیق هر‌یک از باندها با همان موقعیت در نیم‌رخ‌های ناهمانند بودند. سپس از رابطۀ زیر شناسۀ گوناگونی شانون- وینر برای باکتر‌های خاک به دست آمد (22):

H′=−∑(ni/N)ln(ni/N)

در این رابطه، ni ارتفاع پیک باند i، i شمار هر باند در نیم‌رخ‌های DGGE و N جمع ارتفاع‌ پیک‌های همۀ باندهاست و این شناسه گوناگونی آلفا را بیان می‌کند.

تجزیه‌وتحلیل‌های آماری: ناهمانندی ویژگی‌های بررسی‌شده در میان تیمارها در پایۀ 95 درصد (P>05/0) با بهره‌گیری از تجزیه واریانس یک‌سویه[13] و به‌کارگیری نرم‌افزار SPSS 19 بررسی و آزمون شد. از همبستگی پیرسون برای نشان‌دادن روابط میان تیمارها بهره‌گیری شد؛ روابط به این ترتیب هستند: میزان کل با میزان قابل‌جذب سرب و روی، میزان کل و میزان قابل‌جذب سرب و روی با تنفس پایه، تنفس برانگیخته، باندهای DGGE و شناسۀ گوناگونی شانون.

 

نتایج

.ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی نمونه‌های خاک: جدول‌های 1 و 2 ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی خاک‌های بررسی‌شده را نشان می‌دهند. بسیاری از ویژگی‌ها همانند هستند و تنها محدودیتی که بر رشد، کارکرد و گوناگونی ریزجانداران تأثیر‌گذار است غلظت فلزهای سنگین به‌ویژه بخش قابل‌جذب آن‌هاست. همان‌طور که آشکار است ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک‌های نمونه‌برداری‌شده از سه جایگاه نمونه‌برداری همانند هستند و تنها در آلودگی به فلزهای سنگین تفاوت معنادار دارند. درکل، بر اساس استانداردهای آلودگی خاک بنیاد پژوهش‌های خاک و آب کشور، آلودگی خاک‌ها به سرب و روی زیاد و به کادمیوم متوسط است و خاک‌ها به نیکل آلودگی ندارند. جدول‌های 1 و 2 نشان می‌دهند با افزایش آلودگی خاک از S1 تا S3 فراوانی باکتری‌ها به‌طور معناداری کاهش می‌یابد؛ این کاهش فراوانی باکتریایی وابسته به افزایش آلودگی فلزهای سنگین در پژوهش‌های دیگر نیز گزارش شده است (23-25).

همبستگی پیرسون میان غلظت کل و قابل‌جذب فلزهای سنگین مثبت و معنادار است. ضریب همبستگی (R2) برای سرب، روی، کادمیوم و نیکل به‌ترتیب برابر 74/0، 77/0، 79/0و 66/0 است. هرچند همبستگی مثبت و معناداری میان مقدارهای کل و قابل‌جذب سرب و کادمیوم وجود دارد مقدار کل فلزهای سنگین تنها آگاهی اندکی از مقدار قابل‌جذب آنها ارائه می‌دهد (26). بیشتر بخش‌های محلول در آب و تبادلی فلزهای سنگین برای جانداران قابل‌جذب هستند و تأثیر معناداری بر آنها دارند (27) و دیگر بخش‌های آنها کم‌جنبش هستند و قابلیت جذب چندانی ندارند. همان‌طور که جدول 2 نشان می‌دهد مقدار قابل‌جذب فلزهای سنگین اندازه‌گیری‌شده بسیار کمتر از مقدار کل این فلزها است.

 

 

جدول 1- ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی خاک‌های کانسار باما

جایگاه نمونه‌برداری

فیزیکی

 

 

 

شیمیایی

 

 

زیستی

بافت

هدایت الکتریکی

(dS m-1)

اسیدیته

کربن آلی

(درصد)

نیتروژن کل

(درصد)

پتاسیم

(mg kg-1)

فسفر

(mg kg-1)

شمار باکتری‌ها (شمارش پرگنه)

S1

لومی

a5/0

a5/7

a12/0

a05/0

a291

a3/19

106×89/11a

S2

لومی

a5/0

a5/7

a14/0

a05/0

a279

a1/20

106×43/4b

S3

لومی

a5/0

a7/7

a15/0

a06/0

a284

a5/19

106×61/2c

حرف‌های a، b و c نشان‌دهندۀ ناهمانندی‌های معنادار آماری در در پایۀ 1 درصد (P<0.01) هستند.

جدول 2- مقدارهای کل و قابل‌جذب فلزهای سنگین در خاک‌های کانسار باما

جایگاه نمونه‌برداری

 

 

غلظت کل (mg kg-1)

 

 

 

غلظت قابل‌جذب (mg kg-1)

 

Pb

Zn

Ni

Cd

Pb

Zn

Ni

Cd

S1

c164

c69

a66

a06/4

c2/19

c33/7

a24/5

a64/0

S2

b205

b161

a68

a79/3

b7/25

b12/18

a11/5

a59/0

S3

a297

a287

a65

a91/3

a6/32

a26/31

a06/5

a61/0

جایگاه S1: دارای آلودگی بسیار کم به فلزهای سنگین

جایگاه S2: دارای آلودگی متوسط به فلزهای سنگین

جایگاه S3: دارای آلودگی زیاد به فلزهای سنگین

درکل، خاک‌ها آلودگی زیاد به سرب و روی و آلودگی متوسط به کادمیوم دارند و به نیکل آلودگی ندارند.

حرف‌های a، b و c نشان‌دهندۀ ناهمانندی‌های معنادار آماری در پایۀ 1 درصد (P<0.01) هستند.

 


نتایج تنفس ریزجانداران:جدول 3 نشان‌دهندۀ تنفس پایه و برانگیختۀ خاک است. همان‌طور که مشاهده می‌شود تنفس پایه با افزایش آلودگی خاک از S1 تا S3 افزایش می‌یابد؛ این افزایش میان خاک‌های S2 و S3 معنادار نیست ولی میان خاک‌های S1 و S2 معنادار است و علت آن اینست که با افزایش آلودگی به ریزجانداران تنش وارد می‌شود و آنها برای زنده‌ماندن تنفس بیشتری انجام می‌دهند. پژوهشگران (28 و 29) گزارش کرده‌اند تنفس خاک با افزایش بسیار زیاد غلظت فلزهای سنگین به‌شکل معناداری کاهش می‌یابد ولی غلظت‌های اندک و کمی بیشتر از معمول پیامدی بر تنفس پایۀ خاک ندارند. یافته‌ها درمورد تنفس برانگیخته و تنفس پایه یکسان نیستند؛ به‌شکلی‌که تنفس برانگیخته با افزایش آلودگی خاک از S1 تا S3 کاهش می‌یابد و این کاهش میان سه جایگاه معنادار است. پژوهشگران گزارش کرده‌اند اگرچه تنفس پایه شناسۀ بسیار خوبی از کیفیت خاک است تنفس برانگیخته شناسۀ بهتری نسبت به تنفس پایه در شرایط آلودگی خاک به فلزهای سنگین است (29-31). تنفس پایه به اندوختۀ مادۀ آلی و تودۀ زنده یا فراوانی ریزجانداران وابسته است اما تنفس برانگیخته تنها به تودۀ زنده و فراوانی ریزجانداران در خاک بستگی دارد. نسبت تنفس پایه به تنفس برانگیخته یا زیتودۀ خاک نشان‌دهندۀ بهرۀ متابولیک[14] است و میزان تنش در خاک را نشان می‌دهد. هرچه بهرۀ متابولیک خاک بیشتر باشد بخش بیشتری از کربن آلی مصرف‌شده توسط ریزجانداران برای تولید انرژی و زنده‌ماندن آنها به کار رفته است (5). جدول 3 بهرۀ متابولیک کربن آلی را در خاک‌های بررسی‌شده نشان می‌دهد.

در بررسی فراوانی باکتری‌ها نیز همبستگی زیاد، منفی و معناداری میان فراوانی باکتری‌ها و غلظت سرب (81/0-R2=) و روی (74/0-R2=) به دست آمد که نشان می‌دهد با افزایش قابلیت جذب فلزهای سنگین در خاک‌ها کاهش معناداری در فراوانی ریزجانداران به‌ویژه باکتری‌ها رخ می‌دهد؛ این یافته با گزارش‌های دیگران همخوانی دارد (31 و 32). پیامد ناگوار سرب بر فراوانی باکتری‌های خاک بیشتر از روی است و آنها پاسخ نمایان‌تری به افزایش سرب نشان می‌دهند زیرا همان‌طور که گفته شد سرب هیچ‌گونه کارکرد زیستی ندارد (9).

 

جدول 3- نتایج تنفس پایه، تنفس برانگیخته و بهرۀ متابولیک خاک‌های کانسار باما

جایگاه نمونه‌برداری

تنفس پایه

(mg CO2 g-1 dry soil d-1)

تنفس برانگیخته

(mg CO2 g-1 dry soil d-1)

بهرۀ متابولیک

S1

b019/0

a92/1

c246/0

S2

a039/0

b61/1

b601/0

S3

a043/0

b18/1

a903/0

حرف‌های a، b و c نشان‌دهندۀ ناهمانندی‌های معنادار آماری در پایۀ 1 درصد (P<0.01) هستند.

 

 

همبستگی میان تنفس پایه و غلظت قابل‌جذب سرب و روی معنادار نیست ولی همبستگی میان تنفس برانگیخته و غلظت قابل‌جذب سرب و روی، زیاد، منفی و به‌ترتیب منفی 71/0 و منفی 55/0 است که نشان‌دهندۀ تأثیرپذیری بیشتر و پاسخ‌دهندگی زیاد تنفس برانگیختۀ خاک به آلودگی آن است.

همان‌طور که بهرۀ متابولیک نشان می‌دهد این شناسه با افزایش آلودگی خاک افزایش می‌یابد و نشان‌دهندۀ تنش بیشتر است؛ در نتیجه، کربن ریزجانداری بیشتری با افزایش آلودگی خاک به‌شکل CO2 درمی‌آید. همبستگی میان بهرۀ متابولیک و غلظت قابل‌جذب سرب و روی در خاک نشان‌دهندۀ تنش فلزها بر ریزجانداران در خاک‌های آلوده است. ضریب همبستگی برای سرب و روی به‌ترتیب 73/0 و 78/0 است. شناسۀ بهرۀ متابولیک نیز برای هر سه نمونه خاک از S1 تا S3 افزایش معناداری نشان می‌دهد که پیامدی از تنش بیشتر واردشده به ریزجانداران است.

بررسی گوناگونی ژن‌های باکتریایی: ناحیۀ 468 جفت بازی ژن‌های 16S rRNA باکتری‌های نمونه‌های خاک با به‌کارگیری آغازگر پیش‌برنده GC-F338 و برگشتی R805و انجام PCR تکثیر شد. سپس نواحی تکثیرشده با انجام الکتروفورز DGGE از یکدیگر جدا شدند و اثر انگشت‌های به‌دست‌آمده از الگوی باندی روی ژل برای به‌دست‌آوردن گوناگونی باکتریایی بهره‌گیری شدند. شمار باندهای به‌دست‌آمده در هریک از نیم‌رخ‌های DGGE بازتابی از گوناگونی باکتریایی خاک‌هاست و هریک از باندها نشان‌دهندۀ یک گونه است (33). شکل 2 اثر انگشت‌های به‌دست‌آمده از بررسی گوناگونی باکتریایی را نشان می‌دهد که بازتابی از آلودگی خاک‌ها هستند. چند باند در همۀ نمونه‌ها و تکرارهای آنها یکسان و همانند هستند و به احتمال بسیار زیاد نشان‌دهندۀ باکتری‌های سازگار و پایدار نسبت به آلودگی فلزهای سنگین سرب و روی در خاک‌ها هستند که در تیمارهای غیرآلوده و آلوده یافت می‌شوند. تصویرهای DGGE نشان می‌دهند باندهای ناهمانند در هریک از نیم‌رخ‌ها وجود دارند و دگرگونی‌ گوناگونی باکتریایی هریک از خاک‌ها را نشان می‌دهند. پیچیدگی و گوناگونی نیم‌رخ‌های خاک از S1 تا S3 در اثر افزایش آلودگی سرب و روی کاهش می‌یابد. خاک جایگاه بدون آلودگی (S1) با 38 باند (یا غنای گونه‌ای 38) بیشترین گوناگونی را دارد و میانگین شناسۀ شانون برای سه تکرار آن 83/4 است (جدول 4). پس‌از‌آن، گوناگونی باکتری‌های خاک کاهش می‌یابد؛ به‌شکلی‌که خاک دارای آلودگی متوسط (S2) دارای 33 باند (غنای گونه‌ای 33) و میانگین شناسۀ گوناگونی شانون برای سه تکرار آن 27/4 است. ناهمانندی میان این دو خاک در پایۀ 1 درصد معنادار است. در خاک جایگاه دارای بیشترین آلودگی (S3) نیز غنای گونه‌ای کاهش می‌یابد و به 27 می‌رسد زیرا تنها 27 باند در نیم‌رخ آن دیده می‌شود و میانگین گوناگونی شانون برای سه تکرار آن 71/3 است که این کاهش از دیدگاه آماری معنادار است (جدول 4)؛ بنابراین، آلوده‌ترین خاک (S3) کمترین شمار باند، ساده‌ترین الگوی DGGE و کمترین مقدار شناسۀ گوناگونی شانون را دارد.

بررسی شناسۀ یکنواختی گونه‌ای پیلو[15] نشان‌ می‌دهد یکنواختی گونه‌ای باکتری‌ها با افزایش آلودگی از S1 تا S3 کاهش می‌یابد و این کاهش میان S1 و S2 معنادار نیست ولی میان S2 و S3 معنادار است؛ پس یکنواختی گونه‌ای باکتری‌ها که تا اندازه‌ای در خاک غیرآلوده وجود دارد با افزایش آلودگی کاهش می‌یابد. برخی گونه‌های باکتریایی با افزایش آلودگی چیره می‌شوند و این چیرگی و غیریکنواختی گونه‌ای به‌ویژه در خاک‌های جایگاه S3 دیده می‌شود. باکتری‌های چیره‌شده همان باکتری‌های پایدارتر نسبت به آلودگی زیاد سرب و روی هستند و بنابراین آلودگی خاک به سرب و روی پیامد بسیار آشکاری بر گوناگونی باکتریایی خاک بررسی‌شده دارد و در نیم‌رخ‌های DGGE بازتاب می‌یابد. یافته‌های پژوهش‌های لی[16] و همکاران (34) و هو[17] و همکاران (35) نیز همانند هستند. بررسی‌های آنها نشان می‌دهند با افزایش آلودگی خاک به سرب و روی باندهای ویژه‌ای به دست می‌آیند و چیرگی برخی گونه‌های باکتریایی غیریکنواختی را افزایش می‌دهد که همگی نشان از وجود باکتری‌های پایدارتر دارند.

شمار باندها با افزایش آلودگی به فلزهای سنگین در خاک کم می‌شود و فراوانی برخی باندهای ضعیف و شفاف افزایش می‌یابد که نشان‌دهندۀ کاهش گوناگونی باکتریایی است. S1 گوناگونی و پیچیدگی باندی بیشتری نسبت به S2 و S2 گوناگونی و پیچیدگی باندی بیشتری نسبت به S3 دارد زیرا باندهای شفاف و ضعیف‌تر بیشتر در S3، سپس در S2 و پس‌از‌آن، در S1 دیده می‌شوند. بر پایۀ یافته‌های والیس[18] و همکاران (36) نیز گوناگونی و پیچیدگی ژنتیکی باکتری‌ها با افزایش شمار باندها در پس‌زمینۀ نیم‌رخ‌های DGGE بیشتر می‌شود و چنین چیزی به‌ترتیب در نیم‌رخ‌های S1، S2 و S3 دیده می‌شود و نشانۀ دیگری از کاهش گوناگونی باکتری‌ها با افزایش غلظت سرب و روی است. الگوی دیگری که نشان‌دهندۀ یافتۀ یادشده است بر پایۀ گزارش دینگ[19] و همکاران (37) است «پیدایش چندین باند شفاف همراه با باندهای تیره‌تر و غالب‌تر که بسیار نزدیک به یکدیگر هستند نشان از گوناگونی بیشتر است.» از سوی دیگر، نیم‌رخ S3 دارای باندهایی است که مقدار بازهای آلی گوانین و سیتوزین (G+C) آنها بیشتر از نیم‌رخ S2 است و این نوع باندها در خاک جایگاه S2 نیز بیشتر از خاک جایگاه S1 دیده می‌شوند. باندهای دارای نوکلئوتیدهای گوانین و سیتوزین در برابر اوره و فرم‌آلدهید پایدارتر هستند و جنبش کمتری دارند. یکی از مهم‌ترین تفاوت‌های S3 با S1 و S2 وجود یک باند با جنبش کم (G+C زیاد) در نیم‌رخ S3 است که نشان‌دهندۀ وجود باکتری‌های ویژه‌ای دراین خاک است که با آلودگی زیاد سرب و روی آن سازگار شده‌اند و فراوانی زیادی دارند (شکل 2). پیدایش دیگر باندهای جدید با جنبش کمتر (گوانین و سیتوزین بیشتر) و روشن یا ضعیف‌تر در این خاک آلوده‌تر بازتابی از شمار کمتر باکتری‌های سازگارشده با آلودگی خاک است (38) که بیشتر در نیم‌رخ S3 و اندکی در نیم‌رخ S2 دیده می‌شوند. باکتری‌های دارای فراوانی کمتر با باندهای ضعیف‌تر و شفاف‌تر یا روشن‌تر نشان داده می‌شوند که ناهمانندی‌های هر‌یک از تیمارها را نشان می‌دهند و نمایندۀ باکتری‌های ویژۀ خاک هستند (39). یافته‌های یادشده نشان می‌دهند گوناگونی باکتریایی خاک با افزایش آلودگی خاک به فلزهای سنگین سرب و روی کاهش می‌یابد و این کاهش با میزان آلودگی متناسب است.

بررسی همبستگی‌های پیرسون نشان می‌دهد شناسۀ گوناگونی شانون همبستگی زیاد، منفی و معناداری با قابلیت جذب سرب (79/0-R2=) و روی (73/0-R2=) خاک‌ها دارد. همبستگی میان شناسۀ گوناگونی شانون با تنفس پایه معنادار نیست اما همبستگی میان گوناگونی شانون با تنفس برانگیخته زیاد، مثبت و معنادار (82/0R2=) است. همبستگی میان گوناگونی شانون و بهرۀ متابولیک زیاد، منفی و معنادار (77/0-R2=) است و نشان می‌دهد هنگامی که گوناگونی ریزجانداری زیاد باشد کربن کمتری به‌شکل CO2 درمی‌آید و بهرۀ متابولیک کمتر می‌شود.

 

 

 

شکل 2- الگوهای باندی به‌دست‌آمده در DGGE؛ افزون بر همۀ تفاوت‌هایی که میان خاک‌های پژوهش‌شده دیده می‌شوند و در نوشتار یاد شده‌اند باند قوی و ویژه‌ای در S3 دیده می‌شود که دارای بیشترین آلودگی به فلزهای سرب و روی است و G+C زیادی دارد. این باند با فراوانی بسیار زیادی که دارد نشان‌دهندۀ باکتری‌های پایدار و سازگارشده به آلودگی زیاد سرب و روی این خاک است. حرف R نشان‌دهندۀ تکرار برای نمونه‌ها و حرف L نشان‌دهندۀ خط‌کش (Ladder) یا نشانگر استاندارد برای DGGE است.

 

جدول 4- شناسه‌های گوناگونی جوامع باکتریایی خاک‌های کانسار سرب و روی باما که از نیم‌رخ‌های DGGE به دست آمده‌اند.

جایگاه نمونه‌برداری

 

شناسه‌های گوناگونی

 

شانون-وینر

(H′)

غنای گونه‌ای

(شمار باندها)

یکنواختی گونه‌ای

(Pielou)

S1

a83/4

a38

a656/0

S2

b27/4

b33

a534/0

S3

c71/3

c27

b311/0

حرف‌‌های a، b و c نشان‌دهندۀ ناهمانندی‌های معنادار آماری در پایۀ 1 درصد (P<0.01) هستند.


بحث

بررسی ژن‌های باکتری‌های خاک‌ها به روش DGGE نشان می‌دهد این روش در بررسی دگرگونی باکتریایی رخ‌داده در خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین بسیار سودمند است. دیگر پژوهشگران نیز کارآمدی این روش را برای شناخت تغییر گوناگونی خاک‌ها گزارش کرده‌اند. لی و همکاران (34) و هو و همکاران (35) با کاربرد روش PCR-DGGE در بررسی دگرگونی خاک‌های آلوده به فلزهای سنگین گزارش کرده‌اند این روش آگاهی‌های بیشتری در برابر روش‌های کشت ریزجانداران خاک فراهم می‌کند. این بررسی‌ها به‌خوبی نشان می‌دهند آلودگی خاک به فلزهای سنگین باعث کاهش زیتوده و گوناگونی ژنتیک باکتریایی خاک می‌شود. آنها همچنین پیدایش برخی باکتری‌های پایدار در برابر آلودگی زیاد به فلزهای سنگین را در خاک‌های آلوده گزارش کرده‌اند. در پژوهش حاضر نیز باندهای ویژه‌ای برای هر خاک در نیم‌رخ‌های آن دیده شد به‌ویژه در S3 که باندهای جدید و با مقدار G+C بیشتر و جنبش کمتر دیده شدند. این گونه باندها نشان‌دهندۀ پیدایش گونه‌های باکتریایی سازگار و پایدار در برابر آلودگی خاک به سرب و روی هستند ولی برای آگاهی بیشتر از بودن این باکتری‌های پایدار در خاک به توالی‌یابی این باندها نیاز است. ازآنجاکه خاک و ریزجانداران آن زمان بسیاری در برابر آلودگی بوده‌اند با روش به‌کاررفته می‌توان از پیدایش گونه‌های پایدار و سازگارشده آگاهی یافت. یک باند ویژه در نیم‌رخ S3 دیده شد که در دیگر نیم‌رخ‌ها وجود نداشت. بر پایۀ گزارش لی و همکاران (34) و هو و همکاران (35) پیدایش این باند در نیم‌رخ DGGE نشان‌دهندۀ باکتری ویژۀ پایدار و سازگارشده در زمان طولانی به آلودگی زیاد فلزهای سنگین سرب و روی در خاک است.

مارتینز-اینگو[xx] و همکاران (40) دریافتند استخراج DNA از باکتری‌های ریزوسفری خاک و به‌کارگیری روش PCR-DGGE شناسۀ زیستی بسیار توانمندی در پاسخ‌دهی باکترهای این زیستگاه به آلودگی فلزهای سنگین و همچنین ردیابی فرایندهای بهسازی خاک است. بهاتکا و همکاران (41) این روش را ابزار بسیار توانمندی برای پژوهش و جست‌وجوی باکتری‌های پایدار به آلودگی زیاد فلزهای سنگین در محیط‌زیست و فرایندهای زیست‌بهسازی خاک و PCR-DGGE را شناسۀ زیستی بسیار سودمندی در این زمینه دانستند. بسیاری از پژوهشگران پیامدهای آسیب‌رسان آلودگی کم فلزهای سنگین را گزارش کرده‌اند (31، 42-44). کاهش فروزینگی لاشبرگ یکی از این پیامدهای زیان‌آور است که بر چرخۀ کربن، نیتروژن و ... تأثیر می‌گذارد (45 و 46)؛ بنابراین، از کارکردهای ریزجانداران خاک مانند تنفس پایه و برانگیخته برای پی‌بردن به پیامدهای آلودگی فلزهای سنگین در زیستگاه‌ها بهره‌برداری می‌شود. تنفس خاک سرآغاز کانی‌شدن کربن و شناسۀ بسیار مهمی برای ارزیابی کیفیت خاک است (5). همان‌طور که در پژوهش‌های پیشین آمده است تنفس برانگیخته و بهرۀ متابولیک شناسه‌های بهتری هستند و نتایج پژوهش حاضر نیز با این یافته همخوانی دارند. تفاوت‌های شناسۀ بهرۀ متابولیک میان همه خاک‌ها معنادار بود ولی تنفس برانگیخته در میان دو نمونه خاک معنادار بود و نشان می‌دهد بهرۀ متابولیک شناسۀ بهتری نسبت به تنفس برانگیخته است زیرا کربن ریزجانداری را نیز در خود دارد.

پژوهش حاضر نشان می‌دهد الگوهای به‌دست‌آمده در نیم‌رخ‌های DGGE بازتابی از دگرگونی رخ‌داده در ژنتیک باکتری‌ها هستند که خود به‌علت آلودگی به فلزهای سنگین پدید آمده است. از سوی دیگر، بررسی و اندازه‌گیری تنفس برانگیخته و برآورد بهرۀ متابولیک برای نشان‌دادن کارکرد ریزجانداران خاک در چنین زیستگاه‌هایی بسیار راه‌گشا و سودمند است زیرا این ویژگی‌های خاک به تنش‌هایی مانند فلزهای سنگین خاک بسیار پاسخ‌دهنده هستند. باید به یاد داشت روش PCR-DGGE دارای محدودیت‌هایی است و با آن تنها 1/0 تا 1 درصد همۀ ژن‌ها و باکتری‌ها ارزیابی می‌شوند (47) و در نتیجه، تنها ژن‌های باکتری‌های چیرۀ خاک و نه ژن همۀ باکتری‌های خاک در این روش بررسی می‌شوند (48)؛ از‌این‌رو، در پژوهش حاضر نیز تنها باکتری‌های چیره ارزیابی شدند. در چندین پژوهش دیگر نیز پژوهشگران دریافته‌اند انگشت‌نگاری DGGE به‌اندازۀ کافی پاسخ‌دهنده است تا دگرگونی‌های ساختار و گوناگونی ریزجاندران را در پژوهش‌های آلودگی به فلزهای سنگین نشان دهد (41، 43، 44، 49).

 

نتیجه‌گیری

آلودگی به فلزهای سنگین پیامدهای منفی بر فراوانی و گوناگونی باکتریایی دارد و با افزایش مقدار قابل‌جذب فلزهای سنگین سرب و روی، پیچیدگی و گوناگونی جوامع باکتریایی خاک کاهش می‌یابد و ترکیب و ساختار جوامع باکتریایی دگرگون می‌شود. یافته‌ها نشان دادند فراوانی نسبی باکتری‌های پایدارتر با افزایش آلودگی افزایش می‌یابد. آلودگی خاک به فلزهای سنگین فراوانی باکتری‌های کشت‌پذیر و تنفس برانگیختۀ خاک را کاهش می‌دهد. پژوهش‌های بسیاری نشان داده‌اند آلودگی به فلزهای سنگین زیتودۀ ریزجانداران و کارکرد آنها را کاهش می‌دهد که با یافته‌های پژوهش حاضر هماهنگ است. در پژوهش حاضر بسته به اینکه آلودگی به فلزهای سنگین در بازۀ زمانی 50 سال رخ داده است ریزجانداران سازگاری یافته‌اند و پایدارتر شده‌اند و گوناگونی باکتری‌ها در خاک‌های بسیار آلوده همچنان زیاد است هرچند به‌طور معناداری کمتر از خاک‌های غیرآلوده است. توانایی سازگاری باکتری‌ها، پایدار‌شدن آنها و کارکردهای مهم بوم‌شناختی که در تنش فلزهای سنگین پدید می‌آید بسیار ارزشمند هستند و انجام پژوهش‌های بیشتر دربارۀ آنها را پیشنهاد می‌کند؛ بنابراین، بهره‌گیری از دیگر روش‌های مولکولی و مستقل از کشت مانند روش‌های متاآمیکسی بسیار سودمند خواهد بود. این روش‌ها از گوناگونی بسیار زیاد، ساختار و کارکرد این ریزجانداران در خاک‌ها و همۀ زیستگاه‌های دیگر پرده‌برداری می‌کنند.



[1]- Fingerprints

[2]- Sequencing

[3]- denaturing or temperature gradient gel electrophoresis (DGGE or TGGE)

[4]- terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)

[5]- Basal Respiration, BS

[6]- Substrate Induced Respiration, SIR

[7]- Soil Microbial Biomass, SMB

[8]- PowerSoil DNA Isolation Kit

[9]- Optical Density

[10]- GC-clamps

[11]- Muyzer

[12]- Images

[13]-  One-way ANOVA

[14]- metabolic quotient

[15]-  Pielou’s evenness index

[16]-  Li

[17]-  Hu

[18]- Wallis

[19]- Ding

[xx]- Martínez-Iňigo

 
(1) Thies JE. Molecular approaches to studying the soil biota. In: Paul EA., editor. Soil microbiology, ecology and biochemistry. 4th ed. USA: Academic Press, Elsevier; 2015: 151-185.
(2) Nakatsu CH. Soil microbial community analysis using denaturing gradient gel electrophoresis. Soil Science Society of America Journal 2007; 71(2): 562-571.
(3) Hemmat-Jou MH. Metagenomics; Unraveling the secrets of our microbial planet. 1st ed. Isfahan: Chapar press; 2017.
(4) Austin AT., Ahdjian LY., Stark JM., Belnap J., Porporato A., Norton U., et al. Water pulses and biogeochemical cycles in arid and semiarid ecosystems. Oecologia 2004; 141: 221-235.
(5) Safari Sinegani AA., Sharifi Z., Safari Sinegani M. Methods in applied microbiology. Hamadan: Bu-Ali Sina University press; 2010.
 
(6) Alloway BJ. Heavy Metal in Soil. NewYork: John Wiley & Sons; 1990.
(7) Alvarez A., Saez JM., Costa JSD., Colin VL., Fuentes MS., Cuozzo SA., et al. Actinobacteria: Current research and perspectives for bioremediation of pesticides and heavy metals. Chemosphere 2017; 166: 41-62.
(8) Li X., Meng D., Li J., Yin H., Liu H., Liu X., et al. Response of soil microbial communities and microbial interactions to long-term heavy metal contamination. Environmental Pollution 2017; 231: 908-917.
(9) Erfanmanesh M., Afyuni M. Environmental pollution; Water, Soil & Air. Isfahan: Arkane Danesh press; 2008.
(10)           Parsadoust F. Study of numbers and activities of some rhizosphere microflora and bioaccumulation of heavy metals in range-land plants in contaminated soils of Irankoh mountain side in Isfahan. [Dissertation]. Hamadan: Bu Ali Sina University; 2005.
(11)           Bouyoucos GJ. Hydrometer method improved for making particle size analyses of soils. Agronomy Journal 1962; 54: 464-465.
(12)           Jackson ML. Soil Chemical analysis. New Jersey: Prentice-Hall; 1958.
(13)           Richards LA. Diagnosis and improvement of saline and alkaline soils. NewYork: USDA Agricultural Handbook No. 60; 1954.
(14)           Walkley A. A critical examination of a rapid method for determining organic carbon in soils-effect of variations in digestion conditions and of inorganic soil constituents. Soil Science 1947; 63(4): 251-264.
(15)           Hinds A., Lowe LE. Application of the Berthelot reaction to the determination of Ammonium‐N in soil extracts and soil digests. Communications in Soil Science and Plant Analysis 1980; 11(5): 469-475.
(16)           Bower CA., Reitmeir RF., Fireman M. Exchangeable cation analysis of saline and alkali soils. Soil Science 1952; 73: 251-261.
(17)           Sposito G., Luud J., Change AC. Trace metal chemistry in arid zone field soils amended with sewage sludge: I. Fractionation of Ni, Cu, Zn, Cd, and Pb in solid phases. Soil Science Society of America Journal 1983; 46(2): 260-264.
(18)           Lindsay WL., Norvell WA. Development of a DTPA soil test for zinc, iron, manganese, and copper. Soil Science Society of America Journal 1978; 42(3): 421-428.
(19)           Yu Y., Lee C., Kim J., Hwang S. Group-specific primer and probe sets to detect methanogenic communities using quantitative real-time polymerase chain reaction. Biotechnology and Bioengineering 2005; 89(6): 670-679.
(20)           Muyzer G., de-Waal EC., Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 1993; 59(3): 695-700.
(21)           Rettedal EA., Clay S., Brozel VS. GC-clamp primer batches yield 16S rRNA gene amplicon pools with Variable GC-clamps, affecting denaturing gradient gel electrophoresis profiles. FEMS Microbiology Letters 2010; 312(1): 55-62.
(22)           Martínez-Iňigo MJ., Pérez-Sanz A., Ortiz I., Alonso J., Alarcόn R., García P., et al. Bulk soil and rhizosphere bacterial community PCR-DGGE profiles and β-galactosidase activity as indicators of biological quality in soils contaminated by heavy metals and cultivated with Silene vulgaris (Moench) Garcke. Chemosphere 2009; 75(10): 1376-1381.
(23)           Rajapaksha RM., Tobor-Kaplon MA., Baath E. Metal toxicity affects fungal and bacteria activities in soil differently. Apply and Environmental Microbiology 2004; 70(5): 2966-2973.
(24)           Saeki K., Kunito T., Natsumoto S. Relationships between bacterial tolerance levels and forms of copper and zinc in soils. Environmental Quality Journal 2002; 31: 1570-1575.
(25)           Touceda-Gonzalez M., Brader G., Antonielli L., Ravindran VB., Waldner G., Friesl-Hanl W., et al. Combined amendment of immobilizers and the plant growth-promoting strain Burkholderia phytofirmans PsJN favor's plant growth and reduces heavy metal uptake. Soil Biology and Biochemistry 2015; 91: 140-150.
(26)            Safari Sinegani AA., Mirahamdi Araki, H. Changes in chemical forms of lead in temperate and semiarid soils in sterile and unsterile conditions. Environmental Chemistry Letters 2010; 8(4): 323-330.
(27)           Stefanowicz AM., Kapusta P., Szarek-Łukaszewska G., Grodzińska K., Niklińska M., Vogt RD. Soil fertility and plant diversity enhance microbial performance in metal-polluted soils. Science of the Total Environment 2012; 439: 211-219.
(28)           Zalaghi R., Safari-Sinegani AA. The importance of different forms of Pb on diminishing biological activities in a calcareous soil. Chemistry and Ecology 2014; 30: 446-462.
(29)           Anderson JPE., Domsch KH. A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biology and Biochemistry 1978; 10: 214-221.
(30)           Nordgren A., Baath E., Soderstrom B. Evaluation of soil respiration characteristics to assess heavy metal effects on soil microorganisms using glutamic acid as a substrate. Soil Biology and Biochemistry 1988; 20(6): 949-954.
(31)           Bérard A., Mazzia C., Sappin-Didier V., Capowiez L., Capowiez Y. Use of the MicroRespTM method to assess Pollution-Induced Community Tolerance in the context of metal soil contamination. Ecological Indicators 2014; 40: 27-33.
(32)           Saeki K., Kunito T., Natsumoto S. Relationships between bacterial tolerance levels and forms of copper and zinc in soils. Environmental Quality Journal 2002; 31: 1570-1575.
(33)           Luca C., Daniele A., Marisa M., Carlo C., Giuseppe C. An application of PCR-DGGE analysis to profile the yeast population in raw milk. International Dairy Journal 2002; 12(5): 407-411.
(34)           Li Z., Xu J., Tang C., Wu J., Muhammad A., Wang H. Application of 16S rDNA-PCR amplification and DGGE fingerprinting for detection of shift in microbial community diversity in Cu-, Zn-, and Cd-contaminated paddy soils. Chemosphere 2006; 62(8): 1374-1380.
(35)           Hu Q., Qi H., Zeng J., Zhang H. Bacterial diversity in soils around a lead and zinc mine. Journal of Environmental Science (China) 2007; 19(1): 74-79.
(36)           Wallis PD., Haynes RJ., Hunter CH., Morris CD. Effect of land use and management on soil bacterial biodiversity as measured by PCR-DGGE. Applied Soil Ecology 2010; 46(1): 147-150.
(37)           Ding GC., Piceno YM., Heuer H., Weinert N., Dohrmann AB., Carrillo A., et al. Changes of soil bacterial diversity as a consequence of agricultural land use in a semiarid ecosystem. PLoS One 2013; 8(3): e59497.
(38)           Crecchio C., Curci M., Pizzigallo MDR., Ricciuti P., Ruggiero P. Effects of municipal solid waste compost amendments on soil enzyme activities and bacterial genetic diversity. Soil Biology and Biochemistry 2004; 36(10): 1595-1605.
(39)           Gelsomino A., Keyzer-Wolters AC., Cacco G., van-Elsas JD. Assessment of bacterial community structure in soil by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis. Journal of Microbiological Methods 1999; 38(1): 1-15.
(40)           Martínez-Iňigo MJ., Pérez-Sanz A., Ortiz I., Alonso J., Alarcόn R., García P., Lobo MC. Bulk soil and rhizosphere bacterial community PCR-DGGE profiles and β-galactosidase activity as indicators of biological quality in soils contaminated by heavy metals and cultivated with Silene vulgaris (Moench) Garcke. Chemosphere 2009; 75(10): 1376-1381.
(41)           Bhakta JN., Lahiri S., Bhuiyna FA., Rokunuzzaaman M., Ohonishi K., Iwasaki K. et al. Profiling of heavy metal(loid)-resistant bacterial community structure by metagenomic-DNA fingerprinting using PCR–DGGE for monitoring and bioremediation of contaminated environment. Energy, Ecology and Environment 2018; 3(2): 102-109.
(42)           Fulladosa E., Murat JC., Villaescusa I. Study on the toxicity of binary equitoxic mixtures of metals using the luminescent bacteria Vibrio fischeri as a biological target. Chemosphere 2005; 58(5): 551-557.
(43)           Sobolev D., Begonia MFT. Effects of heavy metal contamination upon soil microbes: Lead-induced changes in general and denitrifying microbial communities as evidenced by molecular markers. International Journal of Environmental Research and Public Health 2008; 5(5): 450-456.
(44)           Deng L., Zeng G., Fan C., Lu L., Chen X., Chen M., et al. Response of rhizosphere microbial community structure and diversity to heavy metal co-pollution in arable soil. Applied Microbiology and Biotechnology 2015; 99(19): 8259-8269.
(45)           Fritze H., Niini S., Mikkola K., Mäkinen, A. Soil microbial effects of a Cu-Ni smelter in southwestern Finland. Biology and Fertility of Soils 1989; 8(1): 87-94.
(46)           Chander K., Brookes PC., Harding SA. Microbial biomass dynamics following addition of metal-enriched sewage sludge to a sandy loam soil. Soil Biology and Biochemistry 1995; 27(11): 1409-1421.
(47)           Valášková V., Baldrian P. Denaturing gradient gel electrophoresis as a fingerprinting method for the analysis of soil microbial communities. Plant Soil and Environment 2009; 55(10): 413-423.
(48)           Ascher J., Ceccherini MT., Chronakova A., Jirout J., Borgogni F., Elhottova D., et al. Evaluation of the denaturing gradient gel electrophoresis apparatus as a parameter influencing soil microbial community fingerprinting. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2010; 26(9): 1721-1726.
(49)           Lorenz N., Hintemann T., Kramarewa T., Katayama A., Yasuta T., Marschner P., et al. Response of microbial activity and microbial community composition in soils to long-term arsenic and cadmium exposure. Soil Biology and Biochemistry 2006; 38: 1430-1437.