بررسی‌های زیست‌محاسباتی ویژگی‌های ساختاری و عملکردی پروتئین‌های Cry با هدف کنترل زیستی مالاریا

نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی، مشهد، ‌‌ایران

2 استادیار گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی، مشهد، ‌‌ایران

3 استاد گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی، مشهد، ‌‌ایران

چکیده

مقدمه: امروزه تغییرات اقلیمی و کاربرد گستردۀ حشره‌کش‌های شیمیایی ظهور گونه‌های مقاوم پشۀ آنوفل و مخاطرات زیست‌محیطی فراوانی را در پی داشته است؛ ازاین‌رو، ارائۀ راهکارهای جایگزین ازجمله روش‌های کنترل زیستی چشم‌انداز روشنی برای مبارزه با این مخاطرات فراهم کرده است و در این میان، به باکتری‌های دارای قابلیت پشه‌کشی به‌ویژه Bacillus thuringiensisو پروتئین‌های اشتقاق‌یافته از آن نظیر پروتئین‌های سمی Cry توجه ویژه شده است؛ هرچند‌ به بررسی ویژگی‌های ساختاری و عملکردی این سموم که در پژوهش حاضر با بررسی‌های in silico هدف‌گذاری شده چندان توجه نشده است.
مواد و روش‏‏ها: توالی پروتئینی Cry4، Cry11، Cry19، Cry24 و Cry 39از پایگاه داده NCBI دریافت و پایش ویژگی‌های ساختاری، عملکردی، فیزیکوشیمیایی، توپولوژیکی، ساختارهای ثانویه و الگو‌سازی سه‌بعدی آنها با برنامه‌هایی نظیر Interproscan، Protparam، TMHMM، Psipredو Modeller 9.15 انجام شد و درنهایت با تعیین گیرنده‌های مرتبط قابلیت عملکردی آنها با داکینگ مولکولی با نرم‌افزار Patchdock سنجیده شد.
نتایج: نتایج ویژگی‌های متنوع فیزیکوشیمیایی، غیرترشحی و تجمعی‌بودن سموم را نشان دادند. پایش عملکردی به ردیابی دمین‌هایی با عملکرد مشابه با سایر اعضای پروتئین‌های خانوادۀ Cry منجر شد. پیش‌بینی ساختار ثانویه وجود مارپیچ‌ها و صفحات را طبق الگوی توزیع مشابه با یکدیگر نشان داد؛ همچنین طراحی و ارزیابی کیفیت ساختار در تمام پروتئین‌های سمی در حد مطلوب حاصل شد و ارزیابی میل اتصالی مبین اتصال تمام پروتئین‌های Cry به گیرنده‌های مربوطه و اتصال قوی‌تر Cry11 و Cry24 به بیشتر گیرنده‌ها بود.
بحث و نتیجه‏ گیری: نتایج پژوهش حاضر ضمن فراهم‌آوری داده‌های عملکردی مرتبط با سموم پروتئینی Cry، الگوی عملی استفادۀ بهینه از آنها مبتنی بر تولید سموم توانا بر اساس طراحی پروتئین‌های چندعملکردی در راستای کنترل زیستی پشه‌های مالاریا را فراهم کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Biocomputational Investigations of Structural and Functional Properties of Cry Proteins for ‎Malaria Biocontrol

نویسندگان [English]

  • Mahsa Jalili-Manesh 1
  • Aliakbar Haddad-Mashadrizeh 2
  • Ali Makhdoumi 2
  • Mohammad Reza Housaindokht 3
1 M.Sc, Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
2 Assistant professor, Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Professor, Department of Chemistry, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
چکیده [English]

Introduction: Nowadays, climate changes and wide usage of chemical insecticides cause the emergence of Anopheles mosquito resistant species and environmental hazards. Therefore, biocontrol as an alternative approach provides the vivid outlook for combating these risks. Hereupon, the special attention is paid to insecticides bacteria especially Bacillus thuringiensis and protein derived from it as Cry toxins. However, scrutinizing the structural and functional characteristics of these toxins have not been much attended, so it is aimed in this study by in silico investigations.
Materials and methods: For this purpose Cry4, Cry11, Cry19, Cry24 and Cry39 protein sequences were extracted from NCBIdatabase, monitoring structural and functional, physicochemical, topological features, prediction of secondary and three-dimensional modelling were carried out with programs like Interproscan, Protparam, TMHMM, Psipred and modeller9.15. Finally, their binding affinity with relevant receptors was assessed by PatchDock molecular docking program.
Results: The results indicate various features of physicochemical, non-secretory and toxin accumulation. Functional monitoring has traced domains with similar functions of other Cry toxin family members. Secondary structure prediction shows the existence of helixes and sheets in similar distribution pattern with each other. In addition, the design and quality evaluation of 3D structure of all toxins were obtained in desirable level. The binding affinity assessment represents stronger binding of Cry11 and Cry24 to most of the receptors.
Discussion and conclusion: In general, the results of this study, in addition to provision functional data related to Cry toxin, provide optimum practical model of capable toxins production based on multimodal protein design for biocontrol of Malaria mosquitos.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Malaria
  • Biocontrol
  • Cry Proteins
  • in silico

اصل مقاله

مقدمه.

حشرات در کنار آثار مفید و مثبتی که بر محیط‌زیست و انسان دارند همواره از دو جنبۀ تهدید امنیت غذایی در حوزۀ کشاورزی و سلامت جامعه در حیطۀ پزشکی برای انسان خطرناک تلقی شده‌اند (1-3). در حوزۀ سلامت، بیماری‌های منتقل‌شونده از حشرات در دهه‌های اخیر به‌علت گرم‌‌شدن زمین و تغییرات اقلیمی با اثر‌گذاری مستقیم بر بقا، تولید‌مثل و تغذیۀ حشرات ناقل شیوع گسترده‌ای به‌ویژه در مناطق گرمسیری و استوایی یافته‌اند (4-7). مالاریا شایع‌ترین، کشنده‌ترین و گسترده‌ترین بیماری بین بیماری‌های منتقل‌شونده از حشرات با آمار 219 میلیون نمونه ابتلا و 5/1 تا 3 میلیون نفر مرگ‌‌و‌میر در سال و بیشینه شیوع در آفریقا است (8). تک‌یاخته‌ای از جنس Plasmodium عامل بیماری‌زای اصلی مالاریا است که با گزش پشۀ Anopheles gambiaeآلوده به انسان منتقل می‌شود؛ این پشه کاراترین ناقل مالاریا در جهان و آفریقا محسوب می‌شود (9 و 10). اگرچه تاکنون رویکرد‌های مختلفی برای پیشگیری، درمان و جلوگیری از انتشار مالاریا استفاده شده است، دردسترس‌نبودن واکسن مؤثر و طراحی و کشف‌نشدن داروی ضدمالاریا سبب شده است نابود‌سازی و کنترل پشۀ ناقل بیماری یکی از مؤثرترین، کارآمدترین و عمده‌ترین رویکردها باشد (11 و 12)؛ ازاین‌رو، حشره‌کش‌های شیمیایی به‌طور وسیعی طی سال‌های گذشته استفاده شده‌اند. اگرچه استفاده از این نوع ترکیبات سرکوب شدید پشۀ آنوفل را در پی داشته است، آثار مخرب و نامطلوب زیست‌محیطی و از‌هم‌گسیختگی سیستم‌های زیستی طبیعی و بروز مقاومت در پشه‌ها به اثرگذاری مقطعی این ترکیبات منجر شده است. امروزه توجه‌ها و تمایل‌‌ها به استفاده از روش‌های کنترل زیستی به‌عنوان جایگزین کارآمد و دوستدار طبیعت سوق یافته است (13 و 14) و در این راستا، کنترل زیستی پشه‌ها با باکتری‌های حشره‌کش به‌علت تولید، دستورزی و استفادۀ آسان‌تر و تنوع بیشتر نسبت به سایر منابع تولید حشره‌کش زیستی در جایگاه بالاتری قرار گرفته است (15).Bacillus thuringiensis  باکتری گرم مثبت، هوازی و تشکیل‌دهندۀ اسپور است که ویژگی اصلی آن تولید دلتا‌اندوتوکسین حشره‌کش یا سموم Cry است (16 و 17). تنوع بسیار زیاد، اختصاصیت، سمی‌نبودن برای انسان و موجودات غیرهدف و تجمع مقدار زیاد این سموم به‌شکل اجسام بلوری در فاز اسپورزایی درون سلول باعث شده است بیشترین تلاش جامعۀ علمی و صنعتی روی آن متمرکز شود (17-19). در پژوهش‌های بسیاری به بررسی انواع این سموم پروتئینی پرداخته شده و فعالیت حشره‌کشی آنها بر راسته‌های مختلف حشرات مانند Lepidoptera، Coleoptera، Diptera و سایر راسته‌ها اثبات شده است (20). ویژگی پشه‌کشی اعضای Cry4A، Cry4B، Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A علیه راستۀ Diptera شناسایی شده است (21-25)؛ به‌این‌ترتیب که این سموم ابتدا به‌شکل پیش‌پروتئین و به حالت اجسام بلوری درون سلول باکتری تولید می‌شوند و تجمع می‌یابند و سپس با بلع و ورود به دستگاه گوارش حشره بر اثر اسیدیتۀ خاص روده به‌شکل محلول درمی‌آیند و با فعالیت پروتئاز‌ها بخشی از دو انتهای پیش‌پروتئین حذف و به سم پروتئینی فعال و عملکردی تبدیل می‌شوند (26).. درکل، این پروتئین‌ها با دو سازوکار سبب مرگ سلول می‌شوند: در سازوکار نخست که بیشتر دانشمندان با آن موافق‌اند الیگومریزه‌شدن سم با اتصال شکل فعال پروتئین به گیرندۀ کادهرین سطح سلول انجام و سپس اتصال به گیرندۀ ثانویۀ آمینوپپتیداز یا آلکالین‌فسفاتاز سطح سلول برقرار می‌شود؛ درنتیجه، نفوذ به غشای سلول و تشکیل منافذ یا کانال‌ها انجام می‌شود و لیز اسمزی و مرگ سلول رخ می‌دهد (27). در سازوکار دوم، مسیر پیام‌دهی سلولی تنها با اتصال مونومر پروتئین به کادهرین فعال می‌شود و مرگ سلول بدون نیاز به تشکیل الیگومر رخ می‌دهد؛ این سازوکار همچنان موردچالش است (28). هر دو سازوکار بر اهمیت بر‌هم‌کنش سموم پروتئینی Cry و گیرندۀ سطح سلول ازنظر تعیین اختصاصیت و دامنۀ اثر روی حشرات هدف و همچنین قدرت و شدت عمل سم به‌عنوان مرحلۀ کلیدی تأکید می‌کنند (29). پژوهشی در دسترس نیست که به بررسی جامع و مقایسه‌ای قدرت و اختصاصیت انواع سموم Cry مؤثر بر A. gambiae (عضوی مهم از راستۀ Diptera) پرداخته باشد؛ ازاین‌رو، پژوهش حاضر برای نخستین‌بار به واکاوی و پایش اطلاعات در زمینۀ ویژگی‌های ساختاری و عملکردی این پروتئین‌ها با هدف بهبود ویژگی‌های پشه‌کشی آنها مبتنی بر مهندسی ژنتیک و مهندسی پروتئین در گام‌های بعدی می‌پردازد.

 

مواد و روش‌ها

گردآوری داده‌ها: مطالعۀ منابع و پژوهش‌های انجام‌شده به شناسایی و ردیابی چند عضو از پروتئین‌های Cry مؤثر بر راستۀ Diptera مانند Cry4A، Cry4B، Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A با شماره‌های شناسایی به‌ترتیب ABM97547، CAD30095، CAA60504، CAA68875، CAJ43600 و BAB72016 منجر شد. گیرنده‌های سطح سلولی این سموم که شامل AgAPN2، AgALP1، AgCad1 و AgCad2 هستند با واکاوی مقاله‌ها به‌ترتیب با شماره‌های شناسایی 835019065، AGN95448، AGH20077 و AGH20077 آشکار شدند؛ سپس از پایگاه دادۀ پروتئینی سامانۀ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term) دستیابی به توالی پروتئینی سموم Cry بررسی‌شده و گیرنده‌ها تحت قالب FASTA میسر شد.

پایش ویژگی‌های ساختاری و عملکردی پروتئین‌های پشه‌کش Cry و گیرنده‌ها: طول توالی پروتئینی گیرندۀ سموم و سموم پشه‌کش با مراجعه به پایگاه اطلاعات پروتئین NCBI طبق آدرس یادشده بررسی شد. محدودۀ پروتئین‌های فعال درخصوص سموم پشه‌کش با مراجعه به پایگاه CDsearch (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/) آشکار‌سازی و دسترسی به توالی پروتئین فعال با استفاده از پایگاه NCBI انجام شد. تعیین ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، پیش‌بینی توپولوژی، ردیابی و بررسی وجود توالی‌های پپتید نشانه احتمالی منحصراً برای سموم پروتئینی پشه‌کش به‌ترتیب توسط برنامه‌های تحت شبکۀ Protparam پایگاه Expasy (/http://web.expasy.org/protparam)، TMHMM (/http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) و Signal peptide prediction (/http://sigpep.services.came.sbg.ac.at) انجام شد. برای واکاوی تغییرات پس‌ترجمۀ گلیکوزیلاسیون، فسفوریلاسیون و سولفوریلاسیون از سه برنامۀ تحت شبکۀ NetNGlyc، NetPhos و Sulfinator به‌ترتیب به آدرس‌های (/http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc) و (/http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos) و (http://web.expasy.org/Sulfinator) استفاده شد. به‌منظور پایش عملکردی که با هدف ردیابی دمین‌های احتمالی در هر پروتئین، تعیین موقعیت و طول دمین‌ها و شناسایی عملکرد و وظیفۀ آنها انجام می‌شود از سه پایگاه Conserved domain، Motif scan و Interproscan به‌ترتیب به آدرس‌های (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)، (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) و .(http://www.ebi.ac.uk/interpro/sequence-search) استفاده شد.

..بررسی دامنۀ میزبانی و تعیین قرابت نتایج همگون‌یابی: برنامۀ تحت شبکۀ  Protein Blastطبق ماتریکس PAM250 به آدرس (http: blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) برای ردیابی سایر توالی‌های پروتئینی مشابه و دیگر ریزموجودات دارای این سموم پروتئینی استفاده شد. توالی‌های پروتئینی مشابه که دارای ارزش E پذیرفته‌شده بودند و از دیدگاه هم‌پوشانی و همسانی کیفیت مناسبی داشتند برای آزمایش‌های بعدی انتخاب شدند. سپس قرابت توالی‌ها نسبت به یکدیگر با استفاده از درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده با الگوریتم Neighbor joining برنامۀ MEGA6 مشخص شد.

پیش‌بینی ساختار ثانویۀ توالی‌های پروتئینی: برنامۀ Psipred به آدرس (/http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred) طبق روش Psipred با هدف آشکارسازی ساختار ثانویه و وضعیت هر آمینواسید برای پذیرفتن نوعی از حالت‌های ثانویه مانند مارپیچ یا صفحات و همچنین تعیین میزان و درصد وجود هریک از اجزای ساختار ثانویه استفاده شد. پایش توالی‌های پروتئینی برای ردیابی حضور ساختار Coiled-coil با برنامه‌های Paircoil2 طبق تنظیمات پیش‌فرض و COILs تحت ماتریکس MTIDK به‌ترتیب به آدرس‌های (http://paircoil2.csail.mit.edu/paircoil2.html) و (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) انجام شد..

تعیین ساختار سه‌‌بعدی: در زمینۀ سموم و گیرنده‌های پروتئینی که ساختار سه‌بعدی آنها با روش‌های تجربی تعیین شده بود، پایگاه PDB به آدرس (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) برای دریافت‌کردن ساختار طبق فرمت pdb استفاده شد. دسترسی به ساختار سه‌بعدی بخش غیر‌پروتئینی و کربوهیدراتی گیرنده با استفاده از پایگاه Pubchem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) تحت فرمت SDF ممکن شد؛ این فرمت با کمک برنامۀ تحت شبکۀ SMILESTranslator به آدرس (http://cactus.nci.nih.gov/translate) به فرمت pdb تبدیل شد. برای سایر سموم پروتئینی و گیرنده‌ها به‌علت تعیین‌نشدن ساختار سه‌بعدی با روش‌های تجربی، طراحی ساختار سه‌بعدی با نرم‌افزار MODELLER 9.15 انجام شد؛ به این منظور، ابتدا با روش BLAST pdb انتخاب ساختار الگو بر مبنای بهترین نتایج ازنظر بیشترین همسانی و هم‌پوشانی یافت‌شده انجام و سپس با فرمت pdb از پایگاه PDB طبق آدرس یادشده ذخیره شد. روش همولوژی‌مدلینگ بر پایۀ هم‌ردیف‌سازی بین توالی الگو و توالی هدف استوار است. پس‌از الگو‌سازی، بهترین الگو از میان پنج الگوی طراحی‌شده بر اساس بیشترین DOPE score در هر پروتئین سمی و گیرنده انتخاب و سپس بهینه‌سازی ساختار‌های سه‌بعدی طراحی‌شده با نرم‌افزار MOE انجام شد. ارزیابی اعتبار الگوهای طراحی‌شده با نرم‌افزار تحت شبکۀ ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php). (30) بر اساس ارزیابی شیمی‌فضایی (31) و نمودار راماچاندران برنامۀ MOE برای هر پروتئین به تفکیک انجام شد.

بررسی بر‌هم‌کنش‌های مولکولی: برنامۀ تحت شبکۀ PatchDock به آدرس (/http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock) با هدف بررسی بر‌هم‌کنش مولکولی و سنجش میل اتصال الگوهای سه‌بعدی و طراحی‌شدۀ سموم پروتئینی به گیرنده‌های یاد‌شده استفاده شد (32). این برنامه بر اساس اصول اشکال مکمل است و نتایج طبق معیار ACE (انرژی واکنش‌پذیری اتمی) و امتیاز محاسبه می‌شوند. مطلوب‌ترین نتایج بر اساس بیشترین امتیاز و منفی‌ترین ACE از میان 20 راه‌حل اول انتخاب و درستی اتصال پروتئین - گیرنده برای هر نتیجه به‌شکل مجزا با نرم‌افزار Pymol1 بررسی و تأیید شد.

 

نتایج.

.ویژگی‌های ساختاری و فیزیکوشیمیایی پروتئین‌های Cry: پایش پروتئین‌های سمی ازنظر طول زنجیرۀ آمینواسید (جدول 1) تنوع طول پیش‌پروتئین‌های Cry را نشان داد؛ به‌طوری‌که پیش‌پروتئین‌های سمی Cry4A و Cry4B دارای طول بلند و تقریباً مشابه بودند و سایر پیش‌‌پروتئین‌های Cry طول کوتاه‌تری داشتند. وضعیت تنوع طول در پروتئین‌های فعال متفاوت از پیش‌پروتئین‌ها و بسیار نزدیک و مشابه یکدیگر در محدودۀ 600 تا 700 آمینواسید (بجز در Cry11B) مشاهده شد. ارزیابی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پروتئین‌های فعال Cry به آشکارسازی وزن مولکولی تقریباً یکسان در محدودۀ 64 تا 81 کیلودالتون، بار الکتریکی منفی و مثبت، محدودۀ pH ایزوالکتریک اسیدی و خنثی و قلیایی، شاخص ناپایداری 24 تا 37 درصد و شاخص آلیفاتیک 76 تا 86 منجر شد (جدول 1). همان‌‌طور که در جدول 1 دیده می‌شود پیش‌پروتئین Cry11B بیشترین وزن مولکولی را دارد، منفی‌ترین بار الکتریکی و بیشترین شاخص آلیفاتیک به‌ترتیب به Cry39A و Cty4A، pH ایزوالکتریک خنثی و قلیایی به‌ترتیب به Cry4A و Cry4B و بیشترین شاخص ناپایداری به Cry24Ca تعلق دارد. نتایج بررسی و پیش‌بینی موقعیت سلولی بخش عملکردی پروتئین‌های سمی وجود نقاط خارج‌سلولی با طول متفاوت را در تمام پروتئین‌ها آشکار کرد؛ به‌گونه‌ای‌که موقعیت خارج‌سلولی زنجیرۀ پروتئینی در Cry4B، Cry11B، Cry24Ca و Cry39A مشخص و یک موقعیت درون‌سلولی و داخل غشایی با طول کوتاه‌تر در نمونه‌های Cry4A و Cry19A حاصل شد (جدول 2). در زمینۀ پیش‌بینی و ردیابی وجود توالی‌های پپتید نشانه در شکل فعال پروتئین‌های Cry، توالی احتمالی تنها در Cry19A با امتیاز 6/21، همسانی 35 درصد و جایگاه برش احتمالی پس‌از آمینواسید 29 پیش‌بینی شد. نتایج واکاوی تغییرات پس‌ترجمه، تغییرات گلیکوزیلاسیون و فسفریلاسیون را در تمام اعضا و سولفوریلاسیون را تنها در دو عضو Cry11B و Cry19A نشان‌ دادند. پایش عملکردی این اعضا به ردیابی چند نوع دمین با نقش‌های مختلف و نام مشابه و تکرار‌شونده در بیشتر نمونه‌ها منجر شد. نتایج این حوزه دربارۀ نمونه‌های Cry11B، Cry4A و Cry4B کمی متفاوت بود؛ به‌طوری‌که تنها دمین آشکار‌شده در Cry11B با عملکرد ورود به غشا و تشکیل منفذ حاصل شد و دمینی با نقش اتصالی به گیرنده ردیابی نشد. در دو نمونۀ دیگر نیز دمین اتصالی به کربوهیدرات علاوه‌بر دمین‌های یافت‌شده در سایر اعضا آشکار شد. اطلاعات مربوط به پایش عملکردی و موقعیت دمین‌ها در جدول 3 سازمان‌دهی شده‌اند..

 

جدول 1- ویژگی‌های ساختاری و فیزیکوشیمیایی پروتئین‌های پشه‌کش Cry بررسی‌شده (شاخص آلیفاتیک حجم نسبی زنجیرۀ آلیفاتیک در آمینواسیدهای آلانین، والین، لوسین و ایزولوسین پروتئین است که اثر مثبتی بر افزایش مقاومت حرارتی پروتئین‌های کروی دارد)

ردیف

نام پروتئین

طول پیش‌پروتئین (aa)

طول پروتئین فعال (aa)

وزن مولکولی پروتئین فعال (کیلودالتون)

بارالکتریکی

pH ایزوالکتریک

هیدروفوبیسیته

شاخص ناپایداری

شاخص آلیفاتیک

1

Cry4A

1180

609

44/69

1-

03/7

276/0-

94/33

75/86

2

Cry4B

1136

579

10/65

7

02/9

276/0-

99/24

72/85

3

Cry11B

724

148

34/81

2-

30/6

366/0-

32/30

40/76

4

Cry19A

648

578

61/66

5-

01/6

424/0-

12/27

30/81

5

Cry24Ca

686

561

09/64

6-

98/5

447/0-

26/37

49/76

6

Cry39A

660

572

53/65

14-

43/5

324/0-

62/29

14/80

 

جدول 2- توپولوژی توالی عملکردی پروتئین‌های Cry بررسی‌‌شده

ردیف

نام پروتئین

بخش داخل‌سلولی (موقعیت)

بخش خارج‌سلولی (موقعیت)

بخش داخل‌غشایی (موقعیت)

1

Cry4A

6-1

609-30

29-7

2

Cry4B

---

579-1

---

3

Cry11B

---

724-1

---

4

Cry19A

1-1

578-25

24-2

5

Cry24Ca

---

561-1

---

6

Cry39A

---

572-1

---

 

جدول 3- ویژگی‌های عملکردی توالی‌های بررسی‌شده

ردیف

نام پروتئین

دمین Endotoxin_M

(اتصال به گیرنده)

دمین Endotoxin_N

(ورود به غشا و تشکیل منفذ)

دمین Delta_endotoxin_C

(اتصال به گیرنده)

دمین CBM_4_9

(اتصال به کربوهیدرات)

1

Cry4A

528-322

317-70

678-530

1178-1053

2

Cry4B

470-283

271-45

634-471

730-710

1134-1009

3

Cry11B

---

238-1

---

---

4

Cry19A

502-300

295-71

648-504

---

5

Cry24Ca

517-297

296-101

661-521

---

6

Cry39A

492-297

292-64

635-494

---

 


.ردیابی ریزموجودات توانا در بیان سموم Cry:همگون‌یابی توالی‌های پروتئینی به آشکارسازی تعدادی همگون در محدودۀ همسانی و هم‌پوشانی 20 تا 100 درصد منجر شد. همگون‌های یافت‌شده در دستۀ باکتری‌های گرم مثبت بودند و نمونه‌ای از باکتری‌های گرم منفی در نتایج ردیابی نشد. بیشتر نتایج به باکتری Bacillus thuringiensis از سروتایپ‌های مختلف مانند Bt mogi، Bt aizawai، Bt sotto و Bt vazensis تعلق داشتند؛ با‌وجود‌این، نمونه‌های محدودی از دیگر جنس‌ها و گونه‌ها مانند Paenibacillus taiwanensis، Bacillus cereus و ... نیز در نتایج آشکار شدند. درخت فیلوژنتیک برای مطلوب‌ترین نتایج با همسانی بیش از 50 درصد به قرارگیری سموم پروتئینی Cry19A و Cry39A در یک خوشه منجر شد (شکل 1). فاصلۀ تکاملی Cry4A بسیار نزدیک به دو نمونۀ پیشین مشاهده شد.

 

 

 

شکل 1- قرابت توالی‌های بررسی‌شده و همگون‌های آشکارشده (نشانه‌ها توالی‌های مدنظر را نشان می‌دهند)

 


.ساختار دوم توالی‌های پروتئینی خانوادۀ Cry:بررسی ساختار دوم هریک از پروتئین‌های Cry به‌شکل مجزا نشان داد در تمام نمونه‌ها، هر دو نوع ساختار مارپیچ و صفحه با میزان متفاوت اما در محدودۀ بسیار نزدیک 25 تا 32 درصد در مارپیچ و 16 تا 25 درصد در صفحه وجود دارد. بیشترین و کمترین محتوای مارپیچ به‌ترتیب با 32 درصد در Cry39A و 5/25 درصد در Cry11B و بیشترین و کمترین صفحه به‌ترتیب با 6/25 درصد در Cry24Ca و 5/16 درصد در Cry11B پیش‌بینی شد. توزیع و پراکنش صفحات و مارپیچ‌ها در تمام نمونه‌ها به‌شکل منطقه‌ای بود؛ به‌طوری‌که تمام ساختار دوم در نیمۀ ابتدایی توالی وضعیت مارپیچ به خود گرفته بود اما در نیمۀ انتهایی تماماً ساختار صفحه مشاهده شد. پیش‌بینی حضور ساختار Coiled-coil در نمونه‌های Cry4A، Cry4B، Cry11B و Cry24Ca نتیجه‌ای نداشت اما در نمونه‌های Cry19A و Cry39A نتیجۀ متفاوتی داشت و این ساختار به‌ترتیب در بازه‌های 50 تا 89 و 40 تا 93 ردیابی شد.

.ساختار سوم سموم پروتئینی و گیرنده‌های بررسی‌شده: ساختار سوم پروتئین‌های Cry4A و Cry4B به‌ترتیب با کد‌های 2c9k و 1w99 و نیز گیرندۀ AgAPN1 با کد 4wz9 طبق قالب pdb دریافت شد. ساختار‌های الگو برای طراحی و الگوسازی ساختار سوم با کد‌های 1i5p، 1ji6، 4qx0 و 1ji6 طبق همگون‌یابی به‌ترتیب برای Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A آشکار و دریافت شدند. در حوزۀ طراحی ساختار سوم گیرنده‌های AgALP1، AgCad1 و AgCad2 به‌ترتیب از ساختار‌های الگو با کدهای 1kh7، 5dzv و 5dzv استفاده شد. انرژی الگو‌های طراحی‌شده بر مبنای معیار DOPE score با نرم‌افزار محاسبه و بهترین الگو بر اساس کمترین DOPE score انتخاب و ارزیابی شد. مقادیر این معیار برای پروتئین‌های Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A به‌ترتیب منفی 51/68386، منفی 52/65612، منفی 56/58157 و منفی 17/64354 و برای گیرنده‌های AgALP1، AgCad1 و AgCad2 به‌ترتیب منفی 91/55682، منفی 15/78858 و منفی 31/91746 حاصل شد. پس‌از انجام بهینه‌سازی ساختاری، ارزیابی کیفیت الگوها در پایگاه ProSA به دریافت امتیازهای منفی 58/4، منفی 97/7، منفی 94/5 و منفی 8 به‌ترتیب برای سموم Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A منجر شد. این امتیاز برای تمام نمونه‌ها بجز Cry11B که اندکی خارج از محدودۀ مجاز واقع شده بود در محدودۀ حالت طبیعی حاصل از روش‌‌ کریستالوگرافی قرار داشت (شکل 2). بررسی نمودار‌های انرژی محلی در چهار پروتئین سمی الگوشده نشان داد انرژی بیشتر ریشه‌های آمینواسیدی کمتر از صفر و منفی است؛ باوجوداین، ریشه‌های دارای انرژی مثبت نیز مشاهده شدند که این تعداد در Cry11B و Cry24Ca بیشتر بود و در نیمۀ انتهایی پروتئین‌ها قرار داشت. نمودار انرژی محلی در دو نمونۀ دیگر تقریباً در تمام ریشه‌ها با مقادیر منفی به دست آمد (شکل 2). در ساختار سه‌بعدی نمایش‌یافته در شکل 2 علاوه‌بر مشاهدۀ چگونگی تاخوردگی و موقعیت قرارگیری اجزای ساختار دوم، نقاط دارای پیک انرژی مثبت (مناطق با انرژی زیاد) به رنگ قرمز و نواحی دارای انرژی منفی به رنگ آبی مشاهده می‌شوند. مدل‌سازی سه گیرندۀ یادشده به دریافت مقادیر DOPE score منفی 91/55682، منفی 15/78858 و منفی 31/91746 به‌ترتیب برای AgAPL1، AgCad1 و AgCad2 منتج شد. ارزیابی در پایگاه ProSA به کسب امتیاز منفی 11/8، منفی 02/2 و منفی 67/1 به‌ترتیب یادشده برای گیرنده‌های الگوشده منجر شد؛ در این میان، تنها AgALP1 در محدودۀ حالت طبیعی روش کریستالوگرافی واقع شد و دو گیرندۀ دیگر با فاصلۀ درخور توجهی خارج از محدوده قرار گرفتند. نمودار‌های انرژی محلی برای دو گیرندۀ AgCad1 و AgCad2 پیک‌های انرژی مثبت و بیش از صفر را در بیشتر آمینواسیدها نشان داد؛ اما نتایج در AgALP1 به‌شکل متفاوتی مشاهده شدند و بیشتر ریشه‌ها به استثنای تعداد کمی از آمینواسیدهای انتهایی، مقادیر انرژی منفی به خود اختصاص دادند (اطلاعات نموداری نمایش داده نشده‌اند).

ارزیابی نمودار‌های راماچاندران برای تمام الگوهای طراحی‌شده ازجمله پروتئین‌های سمی و گیرنده‌ها بیان‌کنندۀ وجود تعدادی آمینواسید خارج از محدودۀ مجاز است که این تعداد برای سموم Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A به‌ترتیب 30، 14، 11 و 14 و برای گیرنده‌های AgAPL1، AgCad1 و AgCad2 به‌ترتیب 4، 77 و 81 آمینواسید است. شماره و نوع این آمینواسیدها تنها برای پروتئین‌های سمی در جدول 4 سازمان‌دهی شده است.

 

 

شکل 2- نمودار‌های ارزیابی توسط پایگاه ProSA برای چهار الگوی پروتئین سمی طراحی‌شده (ستون سمت چپ: نمودار انرژی کلی ساختار‌های طراحی‌شده؛ نقطۀ مشکی در هر نمودار امتیاز به‌دست‌آمده و جایگاه قرارگیری در محدودۀ ساختار طبیعی و غیرطبیعی زیرواحد مدنظر است. ستون وسط: نمودار انرژی محلی است. ستون سمت راست: ساختار سه‌بعدی توسط نرم‌افزار Jmol است)

 

جدول 4- موقعیت و نوع آمنواسیدهای غیرمجاز بر اساس نمودار راماچاندران

ردیف

1

2

3

4

5

6

7

Cry11B

PHE 6

THR 8

THR 9

GLU 25

GLU 247

LEU 250

SER 259

LYS 288

TYR 293

PHE 333

LYS 343

THR 365

THR 384

SER 420

PHE 470

THR 489

ASP 490

GLU 531

ALA 532

ARG 547

ALA 556

ASN 570

ASP 615

LYS 629

LYS 634

LYS 645

VAL 650

TYR 670

TYR 686

CYS 698

 

 

 

 

 

 

Cry19A

SER 15

THR 37

TYR 40

LEU 52

ALA 157

ASP 163

GLU 229

ASN 244

THR 252

ALA 267

LYS 397

GLY 416

ASN 435

ILE 564

 

Cry24Ca

LEU 39

ILE 124

SER 222

SER 263

THR 282

ASN 285

PHE 312

THR 393

HIS 410

ALA 425

GLY 498

 

 

 

 

Cry39A

ILE 20

ASP 39

GLY 153

PRO 233

PHE 266

THR 267

ARG 268

ASP 318

THR 372

ALA 374

LYS 416

ARG 471

SER 505

ALA 540


.ارزیابی میل اتصال سموم پروتئینی Cryو گیرنده‌ها: نتایج بررسی میل اتصال پروتئین‌های سمی به گیرنده‌ها چندین ناحیۀ اتصالی و بر‌هم‌کنشی دارای امتیاز‌ و ACE مختلف و قابل‌قبول را آشکار‌ کرد (جدول 5). همان‌طور که در جدول 5 دیده می‌شود بیشترین میل اتصال تمام پروتئین‌ها به گیرندۀ کادهرین حاصل شده است؛ به‌طوری‌که قوی‌ترین اتصال بین Cry4A به AgCad2، Cry4B به AgCad1، Cry11B به AgCad1، Cry19A به AgCad1، Cry24Ca به AgCad2 و Cry39A به AgCad2 اتفاق افتاده است (شکل 3). از بین تمام این اتصال‌های قوی، Cry11B محکم‌ترین اتصال را به AgCad1 با عدد منفی 30/975 به خود اختصاص داده است و ضعیف‌ترین میل اتصالی در تمام پروتئین‌ها به گیرنده‌های AgAPN2 و GalNAC تعلق دارد.

 

 

جدول 5- میل اتصالی سموم پروتئینی و گیرنده‌ها

 

GalNAc

AgAPN2

AgALP1

AgCad1

AgCad2

Cry4A

95/147-

66/52-

42/350-

54/334-

43/599-

Cry4B

71/167-

30/19-

49/174-

96/678-

10/380-

Cry11B

12/193-

67/282-

97/734-

30/975-

81/842-

Cry19A

99/92-

82/18-

22/460-

94/591-

08/421-

Cry24Ca

45/156-

30/601-

34/416-

64/621-

14/851-

Cry39A

64/145-

05/33-

17/407-

77/405-

54/621-

 

 

شکل 3- مقایسۀ ارزش انرژی تماس اتمی پروتئین‌های سمی Cry با گیرنده‌ها بر اساس   ACE

 


بحث و نتیجه‌گیری

بیماری‌های منتقل‌شونده از حشرات و مخصوصاً مالاریا همواره و به‌ویژه در دهه‌های اخیر تهدید‌کنندۀ عمدۀ سلامت بشر بوده‌اند (3) و حشره‌کش‌های شیمیایی برای کنترل این بیماری از طریق سرکوب جمعیت ناقلان به خدمت گرفته شده‌اند (11)؛ باوجوداین، آثار مخرب این مواد تلاش‌ها را به‌سوی یافتن جایگزین مناسب مانند روش کنترل زیستی سوق داده است (33) و در این میان باکتری‌ها و به‌ویژه Bacillus thuringiensis به‌علت مزایایی که دارند با اقبال بیشتری در پژوهش‌ها و صنعت رو‌به‌رو شده‌اند (17). سموم Cry تولیدی این باکتری که از طریق ایجاد منفذ در غشا باعث مرگ سلول و به‌تبع آن مرگ حشره می‌شوند تنوع بسیار زیادی دارند و سمیت اعضای Cry4A، Cry4B، Cry11B، Cry19A، Cry24Ca و Cry39A آن برای پشه‌ها به اثبات رسیده است (21-25). با‌توجه‌به اهمیت مالاریا و پشۀ آنوفل ناقل آن، تاکنون پژوهشی انجام نشده است که به بررسی مقایسه‌ای این سموم از جنبه‌های ساختاری و عملکردی و همچنین آشکارسازی ساختار ثانویه و فضایی برخی اعضا و میل اتصال به گیرنده‌های محتمل با هدف شناسایی مناسب‌ترین، پایدارترین و قوی‌ترین مورد درخصوص پشۀ یادشده و فراهم‌کردن مقدمات در راستای توسعۀ روش‌های نوین مانند پروتئین‌های نوترکیب دارای قابلیت کنترل پشۀ آنوفل پرداخته باشد؛ موارد یادشده در دستورکار پژوهش حاضر قرار دارند. نتایج پایش طولی و وزن مولکولی منعکس‌کنندۀ تنوع این دو شاخص در پیش‌پروتئین‌های Cry مؤثر بر Diptera هستند؛ نتایج یادشده با یافته‌های پژوهش‌های انجام‌شده در زمینۀ سایر سموم ‌Cryمؤثر بر دیگر راسته‌های حشرات موافق هستند (34)؛ باوجوداین، بررسی پروتئین‌های فعال تقریباً یکنواختی طول و حذف قطعه‌هایی با طول‌های مختلف از دو انتهای پیش‌پروتئین و ایجاد وزن مولکولی در محدودۀ 70 کیلودالتون را تأیید کرد (موافق با آنچه تاکنون از فعال‌سازی سموم Cry انتظار می‌رفت) (35). پروتئین Cry4B در بین سایر اعضا دارای قلیایی‌ترین pH ایزوالکتریک، کمترین هیدروفوبیسیته و شاخص ناپایداری و شاخص آلیفاتیک زیاد بود (جدول 1). در نتیجه، این ویژگی‌ها باعث عملکرد بهتر در محیط گوارشی پشه‌ها، سهولت استفاده در محیط‌ آبی و مقاومت حرارتی و پایداری زیاد در شرایط زیست‌محیطی حاکم بر مناطق مالاریا‌خیز شده است. (36-38). نتایج بررسی توپولوژی، خارج‌سلولی‌بودن پروتئین‌های فعال سمی را در تمام نمونه‌ها نشان داد (جدول 2) که با روش عملکرد خارج‌سلولی این سموم سازگار است (39). نواحی داخل سیتوپلاسمی و داخل غشایی در Cry4A و Cry19A آشکار شدند که احتمالاً به‌علت طول بسیار کوتاه دارای جایگاه پیش‌بینی‌شده در این مناطق نیستند و می‌توان از آنها صرف‌نظر کرد. ردیابی‌نشدن توالی‌های پپتید نشانه در تمام پروتئین‌های بررسی‌شده به استثنای Cry19A تأیید‌کنندۀ این موضوع است که این سموم مانند سایر اعضای خانوادۀ Cry ترشحی نیستند و درون سلول باکتری به‌شکل اجسام بلوری تجمع می‌‌کنند و تنها پس‌از لیز سلول باکتری به محیط خارج راه می‌یابند (40). آشکارسازی توالی رهبر در Cry19A دو احتمال را مطرح می‌کند: این پروتئین از طریق فرایند ترشح به خارج سلول فرستاده می‌شود؛ به‌علت اندازۀ بزرگ مانند سایر اعضا داخل سلول تجمع می‌یابد و توالی پپتید نشانه آن عملکرد ترشحی ندارد. بررسی‌ها برای آشکارسازی دمین‌های احتمالی و وظایف دمین‌ها (جدول 3) نشان دادند تمام پروتئین‌های فعال سمی دارای نواحی اتصالی و تشکیل‌دهندۀ منفذ و ورود به غشا مشابه دمین‌هایی هستند که تاکنون در سایر اعضای خانوادۀ Cry مشاهده شده‌اند (41). طبق پایش انجام‌شده، تنها دمین آشکار‌شده در Cry11B دارای عملکرد ورود به غشا و تشکیل منفذ بود و دمینی با عملکرد اتصالی آشکار نشد؛ باوجوداین، ویژگی حشره‌کشی و اتصال به گیرندۀ آن در پژوهش دیگری اثبات شده است (42). این فرضیه مطرح است که دمین اتصالی در توالی این پروتئین وجود دارد، هرچند به‌علت تشابه بسیار کم آن به سایر اعضای خانوادۀ Cry، عملکرد اتصالی و محدوده و موقعیت آن هنوز شناسایی و در پایگاه‌ها ثبت نشده است. دمین‌های متصل‌شوندۀ اضافی به کربوهیدرات‌ها در دو پروتئین Cry4A و Cry4B یافت شدند که اتصال این پروتئین‌ها به کربوهیدرات‌هایی مانند N-استیل‌گالاکتوزآمین در ساختار گیرنده‌ها را مشابه با پروتئین Cry1A مؤثر بر Lepidoptera نشان می‌دهند (43). از سوی دیگر، همگون‌‌های یافت‌شده وجود انحصاری این گروه سموم پروتئینی را در باکتری‌های گرم مثبت جنس باسیلوس نشان می‌دهند؛ باوجوداین، آشکارسازی توالی‌های دارای تنوع زیاد ولی عملکرد یکسان به‌علت قرارگرفتن ژن این پروتئین‌ها روی پلاسمید‌ها یا عناصر متحرک ژنتیکی و وقوع نوترکیبی‌های بین ژنی و مخلوط‌شدن قطعه‌های ژنی ایجادشده است (44)؛ بنابراین دسترسی به ذخایر جدید سموم حشره‌کشی Cry دارای عملکرد مشابه اما توالی‌های متفاوت میسر شده است که توانایی مقابله و سرکوب حشرات مقاوم‌شده به سموم Cry پیشین را دارند و دارای دامنۀ اثر وسیع‌تری روی چندین گونه پشه و حشره هستند. پیش‌بینی نواحی دارای مارپیچ و صفحه در تمام نمونه‌ها نشان داد نیمۀ ابتدایی و انتهایی این سموم مانند گزارش‌های پیشین دربارۀ ساختار کلی و مشترک این خانوادۀ پروتئینی مبنی بر آرایش مارپیچی دمین I و صفحه‌ای‌بودن دمین‌های II و III دارای چنین ساختاری هستند و نواحی مارپیچ به‌علت پایداری بیشتر نسبت به دما ویژگی مثبت مقاومت به دماهای زیاد را به بخش‌هایی القا می‌کند که از صفحات تشکیل شده‌اند (45-47)؛ باوجوداین، طول، توالی، موقعیت و درصد مارپیچ‌ها و صفحات در هر نمونه با نمونۀ دیگر متفاوت است و نشان می‌دهد این پروتئین‌ها با وجود داشتن تنوع زیاد در توالی، ساختار ثانویۀ واحد و مشابهی به خود می‌گیرند که از ویژگی‌های اعضای این خانواده است (45). حضور ساختار Coiled-coil که دارای موتیف تکرار هفت‌تایی از α-helical coiled-coil و احتمالاً محل بر‌هم‌کنش Coiled-coil با سایر پروتئین‌ها است (48) در موقعیت دمین اندوتوکسین N پروتئین‌های Cry19A و Cry39A ردیابی شد که احتمالاً در تسهیل برهم‌کنش با دیگر پروتئین‌ها طی تشکیل همودایمر و الیگومریزاسیون و به‌تبع آن تشکیل منفذ نقش دارد (27 و 49). ساختار سه‌بعدی طراحی‌شدۀ پروتئین‌های Cry (شکل 2، ستون راست) در تمام نمونه‌ها وجود چند مارپیچ در کنار یکدیگر و نواحی دارای تاخوردگی صفحه و نواحی لوپ‌مانند را نشان می‌دهد که با ساختار مدنظر در سایر اعضا (حاصل از روش‌های تجربی) شباهت بسیاری دارد (50 و 51). قرارگیری نقاط سیاه نشان‌دهندۀ پروتئین‌های طراحی‌شده در محدودۀ منطقۀ آبی نمودار‌های انرژی کلی (شکل 2، سمت چپ) درستی ساختار طراحی‌شده و نزدیک‌بودن آن به ساختار‌های طبیعی را نشان می‌دهد. نمودار‌های انرژی محلی (شکل 2، ستون وسط) نیز انرژی هر ریشۀ آمینواسید را در ساختار پروتئین نشان می‌دهند و بیشتر پیک‌ها در Cry19A و Cry39A عدد منفی به خود اختصاص می‌دهند که نشان‌دهندۀ کیفیت و درستی زیاد الگوهای طراحی‌شده است؛ از این نظر، نمونه‌های Cry11B و Cry24Ca در حد متوسط ارزیابی می‌شوند. ارزیابی مدل‌های طراحی شده در مورد گیرنده‌های AgCad1 و AgCad2 نتایج خوبی در پی نداشت که به دلیل عدم دسترسی به الگو مناسب و تشابه و هم‌پوشانی بسیار کم بین توالی الگو و توالی مورد نظر مدل‌های مطلوبی طراحی نشدند. آشکارسازی قرارگیری تعدادی از ریشه‌های آمینواسید خارج از محدودۀ مجاز نمودار راماچاندران (جدول 4) در محدودۀ دمین اتصال با رنگ قرمز نشان داده شده است که احتمالاً در کیفیت اتصال نقش دارد؛ تعداد این ریشه‌ها در Cry19A کم، در Cry24Ca و Cry39A متوسط و در Cry11B بسیار زیاد است؛ با‌وجود‌این، به‌علت شناسایی‌نشدن دمین اتصالی و قرارگیری آمینواسیدهای زیاد در محدودۀ غیرمجاز این ضرورت ایجاد می‌شود که ابتدا دمین اتصال و جایگاه‌های اتصالی به گیرنده در این پروتئین تعیین و سپس الگوی طراحی‌شده بر اساس این نمودار ارزیابی شوند؛ از‌این‌رو، در حال‌حاضر نمی‌توان در این زمینه نظر قطعی داد. منفی‌ترین اعداد ACE و بنابراین بیشترین میل اتصال در بر‌هم‌کنش‌های پروتئین‌های سمی با گیرنده‌های کادهرین حاصل شد و تأیید‌کنندۀ این موضوع است که احتمالاً کادهرین‌ها گیرنده‌های اصلی و اولیۀ این سموم هستند (12 و 28)؛ هرچند به‌علت کیفیت کم الگو‌های طراحی‌شدۀ کادهرین نمی‌توان نظر قطعی داد و بررسی بیشتر در این زمینه نیاز است؛ همچنین اتصال به تمام گیرنده‌ها در تمام پروتئین‌ها با شدت‌های مختلف مشاهده شد که با نتایج پژوهش‌های گذشته موافق است (42 و 52). قوی‌ترین اتصال به Cry11B با AgCad1 مربوط است که با نتایج پژوهش آدانگ[i] و همکاران متناقض است و احتمالاً این نتیجه به‌علت کیفیت کم الگوی سه‌بعدی گیرندۀ طراحی‌شده حاصل شده است و به بررسی‌های بیشتر و پیشرفته‌تر در آینده نیازمند است (42). به‌طورکلی نتایج پژوهش حاضر ضمن فراهم‌‌کردن داده‌های عملکردی مرتبط با سموم پروتئینی Cry، الگوی عملی استفادۀ بهینه از آنها مبتنی بر تولید سموم توانا بر اساس طراحی پروتئین‌های چندعملکردی در راستای کنترل زیستی پشه‌های مالاریا را فراهم آورد.


[i]- Adang

مراجع

(1)              Kumari P., Kant S., Zaman S., Mahapatro GK., Banerjee N., Sarin NB. A novel insecticidal GroEL protein from Xenorhabdus nematophila confers insect resistance in tobacco. Transgenic Research 2014; 23(1): 99-107.
(2)              Montesinos E. Development, registration and commercialization of microbial pesticides for plant protection. International Microbiology 2003; 6(4): 245-252.
(3)              Federici BA., Park H-W., Bideshi DK., Wirth MC., Johnson JJ., Sakano Y., et al. Developing recombinant bacteria for control of mosquito larvae. Journal of the American Mosquito Control Association 2007; 23(2): 164-175.
(4)              Christiansen-Jucht C., Erguler K., Shek CY., Basáñez M-G., Parham PE. Modelling anopheles gambiae ss population dynamics with temperature-and age-dependent survival. International Journal of Eenvironmental Research and Public Health 2015; 12(6): 5975-6005.
(5)              Christiansen-Jucht C., Parham PE., Saddler A., Koella JC., Basáñez M-G. Temperature during larval development and adult maintenance influences the survival of Anopheles gambiae ss. Parasites and Vectors 2014; 7(1): 1.
(6)              Gage KL., Burkot TR., Eisen RJ., Hayes EB. Climate and vectorborne diseases. American Journal of Preventive Medicine 2008; 35(5): 436-450.
 
(7)              Knight KL., Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). 2nd ed. College Park, Maryland: Entomological Society of America; 1977.
(8)              WHO. World malaria report 2013. Geneva: World Health Organization; 2014.
(9)              Walker T., Moreira LA. Can Wolbachia be used to control malaria? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 2011; 106: 212-217.
(10)          Ketseoglou I., Koekemoer L., Coetzee M., Bouwer G. The larvicidal efficacy of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis against five African Anopheles (Diptera: Culicidae) species. African Entomology 2011; 19(1): 146-150.
(11)          Killeen GF., Seyoum A., Knols BG. Rationalizing historical successes of malaria control in Africa in terms of mosquito resource availabilty management. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2004; 71(2): 87-93.
(12)          Ibrahim MA., Griko NB., Bulla LA. Cytotoxicity of the Bacillus thuringiensis Cry4B toxin is mediated by the cadherin receptor BT-R3 of Anopheles gambiae. Experimental Biology and Medicine 2013; 1535370213493719.
(13)          Brown AWA. Insecticide Resistance in Arthropods. Geneva: World Health Organisation; 1958.
(14)          Raghavendra K., Barik TK., Reddy BN., Sharma P., Dash AP. Malaria vector control: from past to future. Parasitology Research 2011; 108(4): 757-779.
(15)          Castagnola A., Stock SP. Common virulence factors and tissue targets of entomopathogenic bacteria for biological control of lepidopteran pests. Insects 2014; 5(1): 139-166.
(16)          Pérez-García A., Romero D., De Vicente A. Plant protection and growth stimulation by microorganisms: biotechnological applications of Bacilli in agriculture. Current Opinion in Biotechnology 2011; 22(2): 187-193.
(17)          Ruiu L., Satta A., Floris I. Emerging entomopathogenic bacteria for insect pest management. Bull Insectology 2013; 66:181-186.
(18)          Xavier R., Reena J., Sreeramanan S. Environmental distribution and diversity of insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis Berliner. Malaysian Journal of Microbiology 2007; 3(2): 1-6.
(19)          Van Frankenhuyzen K., Nystrom C. The Bacillus thuringiensis toxin specificity database. Retrieved from http://www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca/bacillus. On: 28 Ferbruary 2010.
(20)          Crickmore N., Zeigler D., Feitelson J., Schnepf E., Van Rie J., Lereclus D., et al. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews 1998; 62(3): 807-813.
(21)          Delécluse A., Rosso M-L., Ragni A. Cloning and expression of a novel toxin gene from Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan encoding a highly mosquitocidal protein. Applied and Environmental Microbiology 1995; 61(12): 4230-4235.
(22)          Poncet S., Delécluse A., Klier A., Rapoport G. Evaluation of synergistic interactions among the CryIVA, CryIVB, and CryIVD toxic components of B. thuringiensis subsp. israelensis crystals. Journal of Invertebrate Pathology 1995; 66(2): 131-135.
(23)          Rosso M-L., Delecluse A. Contribution of the 65-kilodalton protein encoded by the cloned gene cry19A to the mosquitocidal activity of Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan. Applied and Environmental Microbiology 1997; 63(11): 4449-4455.
(24)          Berón CM., Salerno GL. Cloning and characterization of a novel crystal protein from a native Bacillus thuringiensis isolate highly active against Aedes aegypti. Current Microbiology 2007; 54(4): 271-276.
(25)          Ito T., Sahara K., Bando H., Asano S. Cloning and expression of novel crystal protein genes cry39A and 39orf2 from Bacillus thuringiensis subsp. aizawai Bun1-14 encoding mosquitocidal proteins. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 2002; 71(3): 123-128.
(26)          Bravo A., Gómez I., Porta H., García‐Gómez BI., Rodriguez‐Almazan C., Pardo L., et al. Evolution of Bacillus thuringiensis Cry toxins insecticidal activity. Microbial biotechnology 2013; 6(1): 17-26.
(27)          Bravo A., Gomez I., Conde J., Munoz-Garay C., Sanchez J., Miranda R., et al. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringiensis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 2004; 1667(1): 38-46.
(28)          Zhang X., Candas M., Griko NB., Taussig R., Bulla LA. A mechanism of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis. Proceedings of the National Academy of Sciences 2006; 103(26): 9897-9902.
(29)          Bravo A., Likitvivatanavong S., Gill SS., Soberón M. Bacillus thuringiensis: a story of a successful bioinsecticide. Insect Biochemistry and Molecular Biology 2011; 41(7): 423-431.
(30)          Wiederstein M., Sippl MJ. ProSA-web: interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic acids Research 2007; 35(2): W407-W10.
(31)          Sudan AK., Vakhlu J. Isolation and in silico characterization of novel esterase gene with β-lactamase fold isolated from metagenome of north western Himalayas. 3 Biotech. 2015; 5(4): 553-559.
(32)          Duhovny D., Nussinov R., Wolfson HJ. Efficient unbound docking of rigid molecules. International Workshop on Algorithms in Bioinformatics 2002; 2452: 185-200.
(33)          Sharma HC., Sharma KK., Seetharama N., Ortiz R. Prospects for using transgenic resistance to insects in crop improvement. Electronic Journal of Biotechnology 2000; 3(2): 21-22.
(34)          Höfte H., Whiteley H. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiological Reviews 1989; 53(2): 242-255.
(35)          Bravo A., Sánchez J., Kouskoura T., Crickmore N. N-terminal activation is an essential early step in the mechanism of action of the Bacillus thuringiensis Cry1Ac insecticidal toxin. Journal of Biological Chemistry 2002; 277(27): 23985-23987.
(36)          Dadd R. Alkalinity within the midgut of mosquito larvae with alkaline-active digestive enzymes. Journal of Insect Physiology 1975; 21(11): 1847-1853.
(37)          Munga S., Minakawa N., Zhou G., Barrack O-OJ., Githeko AK., Yan G. Effects of larval competitors and predators on oviposition site selection of Anopheles gambiae sensu stricto. Journal of Medical Entomology 2006; 43(2): 221-224.
(38)          Chukwura E., Iheukwumere I. Larvicidal activity of Ocimum gratissimum and Solenostemon monostachyus leaves on Anopheles gambiae. Journal of Scientific & Industrial Research 2013; 72: 577-580.
(39)          Roh JY., Choi JY., Li MS., Jin BR., Je YH. Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. Journal of Microbiology and Biotechnology 2007; 17(4): 547.
(40)          Amadio AF., Navas LE., Sauka DH., Berretta MF., Benintende GB., Zandomeni RO. Identification, cloning and expression of an insecticide cry8 gene from Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 2012; 23(6): 401-409.
(41)          Li J., Carroll J., Ellar DJ. Crystal structure of insecticidal δ-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution. Nature 1991; 353: 815-821.
(42)          Hua G., Zhang Q., Zhang R., Abdullah AM., Linser PJ., Adang MJ. AgCad2 cadherin in Anopheles gambiae larvae is a putative receptor of Cry11Ba toxin of Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan. Insect Biochemistry and Molecular Biology 2013; 43(2): 153-161.
(43)          Luo K., Lu Y-J., Adang MJ. A 106 kDa form of aminopeptidase is a receptor for Bacillus thuringiensis CryIC δ-endotoxin in the brush border membrane of Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology 1996; 26(8): 783-791.
(44)          de Maagd RA., Bravo A., Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. TRENDS in Genetics 2001; 17(4): 193-199.
(45)          Chattopadhyay A., Bhatnagar N., Bhatnagar R. Bacterial insecticidal toxins. Critical Reviews in Microbiology 2004; 30(1): 33-54.
(46)          Villegas V., Viguera AR., Avilés FX., Serrano L. Stabilization of proteins by rational design of α-helix stability using helix/coil transition theory. Folding and Design 1996; 1(1): 29-34.
(47)          Guo J., Harn N., Robbins A., Dougherty R., Middaugh CR. Stability of helix-rich proteins at high concentrations. Biochemistry 2006; 45(28): 8686-8696.
(48)          Lee SC., Stoilova-Mcphie S., Baxter L., Fülöp V., Henderson J., Rodger A., et al. Structural characterisation of the insecticidal toxin XptA1, reveals a 1.15 MDa tetramer with a cage-like structure. Journal of Molecular Biology 2007; 366(5): 1558-1568.
(49)          Bravo A., Gill SS., Soberón M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon 2007; 49(4): 423-435.
(50)          Aronson AI., Wu D., Zhang C. Mutagenesis of specificity and toxicity regions of a Bacillus thuringiensis protoxin gene. Journal of Bacteriology 1995; 177(14): 4059-4065.
(51)          Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews 1998; 62(3): 775-806.
Hua G., Zhang R., Abdullah MAF., Adang MJ. Anopheles gambiae cadherin AgCad1 binds the Cry4Ba toxin of Bacillus thuringiensis israelensis and a fragment of AgCad1 synergizes toxicity. Biochemistry 2008; 47(18): 5101-5110.

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار