بررسی آثار سینرژیستی نانوذرات نقره و نایسین روی ژنوم باکتری اشریشیا کلی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گروه زیست شناسی، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران

2 استادیار گروه زیست شناسی، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران

چکیده

مقدمه: باتوجه‌به نگرانی روزافزون مقاومت عفونت‌های میکروبی به آنتی‌بیوتیک‌ها و کاهش اثر پپتید (AMP)نایسین به علت افزایش مقاومت سویه‌های باکتریایی، پژوهش‌های گسترده‌ای طی سال‌های اخیر با محوریت نانوفناوری انجام شده است. هدف پژوهش حاضر، بررسی آثار سینرژیستی نانوذرات نقرة متصل به نایسین روی ژنوم باکتری اشریشیا کلی (مدلی از باکتری‌های گرم منفی) است.
مواد و روش‏‏ها: پس‌از کشت باکتری در محیط مایع NutrientBroth، تیمار با غلظت‌های50، 75 ،100 و 125 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانو‌ذرات نقره، غلظت‌های 25، 50، 75، 100، 150 و 200 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نایسین و غلظت‌های 30،50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقرة متصل به نایسین انجام شد. پس‌از خواندن جذب نوری در طول موج 600 نانومتر، DNA نمونه‌های شاهد و تیمارشده با غلظت‌های 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین، نانوذرات نقرة متصل به نایسین استخراج و از RAPD-PCR برای بررسی اثر ژنومی استفاده شد. نتایج RAPD-PCR با نرم‌افزار NTSYS-PC بر مبنای ضریب Dice برای محاسبة ماتریکس تشابه و UPGMA تجزیه‌و‌تحلیل شد.
نتایج: نتایجنشان دادند اثر مهارکنندگی رشد نانوذرات نقرة متصل به نایسین بیشتر از کاربرد انفرادی نایسین و نانوذرات نقره و اثر ژنومی اتصالات یادشده نسبت به نایسین و نانوذرات نقره به‌ترتیب بیشتر و کمتر است؛ بنابراین نانوذرات یادشده و نایسین به‌طور متصل باهم اثر سینرژیستی روی ژنوم باکتری ندارند.
بحث و نتیجه‏گیری: امکان استفاده از نانوذرات نقره در حالت متصل به نایسین به‌عنوان مادة ضدباکتری مناسب و قوی با کمترین اثر ژنومی و جهش‌زایی وجود دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigating Synergistic Effect of Silver Nanoparticles and Nisin on Escherichia coli Genome

نویسندگان [English]

  • Samrand Karkon 1
  • Bahram Golestani Eimani 2
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Islamic Azad University Branch Urmia, Urmia, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, Islamic Azad University Branch Urmia, Urmia, Iran.
چکیده [English]

Introduction: Considering increasing concern about the resistance of microbial infections to antibiotics and nisin peptide reducing effect (AMP) due to resistance growth in bacterial strains; extensive researches were implemented based on nanotechnology. The aim of current research was to investigate synergistic effect of silver nanoparticles conjugated with nisin on genome of Escherichia coli as a gram negative bacteria model.
Materials and method: After culturing the bacteria in a Nutrient Broth medium; treatments were performed at concentrations of 50, 75, 100, 125 μg/ml of silver nanoparticles; concentrations of 25, 50, 75, 100 ,150, 200μg/ml of nisin and concentrations of 30, 50, 75 μg/ml of silver nanoparticles conjugated with nisin solution. After reading the optical density at 600 nm of  control samples and treated at concentrations of 50 and 75 μg/ml of silver nanoparticles; 50 and 75 μg/ml  of nisin, 50 and 75 μg/ml of silver nanoparticles conjugated with nisin, DNA was extracted and RAPD-PCR was used to investigate genomic effect. Analysis of the results of RAPD-PCR was performed by NTSYS-PC software based on Dice coefficient to calculate the similarity matrix and UPGMA.
Results: The results showed that the growth inhibitory effect of silver nanoparticles conjugated with nisin was higher than of individual application of nisin and  silvernanoparticles and the genomic effect of the above mentioned conjugates was higher and lower than nisin and silver nanoparticles, respectively. Therefore, the mentioned conjugated nanoparticles and nisin had no synergistic effect on the bacterial genome.
Discussion and conclusion: these conjugated nanoparticles with nisin can be used as proper and strong antibacterial with the least genomic and mutation effect.

کلیدواژه‌ها [English]

  • AgNPs
  • Nisin
  • Escherichia coli
  • Chain Reaction (RAPD-PCR) ‎

مقدمه

ظهور و گسترش سویه‌های مقاوم باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک‌ها اغلب از ویژگی‌های ژنتیکی باکتری‌‌ها، افزایش جمعیت، مسافرت و مصرف زیاد آنتی‌بیوتیک‌ها ناشی می‌شود (1). پپتیدهای ضدمیکروبی تکثیر عوامل بیماری‌زای مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های متعارف را مهار می‌کنند و ازاین‌رو، توجه پژوهشگران را به‌عنوان جایگزین آنتی‌بیوتیک‌های یادشده به خود معطوف کرده‌اند. نایسین پپتید آمفی‌فیلیک کوچکی (3510 دالتون و حاوی 34 آمینواسید) است که سویه‌های ویژه‌ای از لاکتوکوکوس لاکتیس[1] آن را تولید می‌کنند. اثر نایسین در صنایع غذایی به‌علت افزایش مقاومت باکتری‌هایی مانند استافیلوکوکوس اورئوس[2]، استرپتوکوکوس بوویس[3] و لاکتوباسیلوس[4] کاهش و مقاومت مبتنی بر آنزیم در باکتری‌ها به‌علت حضور آنزیم نایسیناز افزایش یافته است. نایسین در غلظت‌های نانومولار فعالیت ناچیزی در برابر باکتری‌های گرم منفی (به‌علت وجود لایة لیپوپلی‌ساکاریدی اضافی در این باکتری‌ها) نشان می‌دهد. مقاومت مبتنی بر غشا به‌وسیلة اتخاذ فرمولاسیون بر اساس نانوذرات بی‌اثر می‌شود (2). نایسین فعالیت ضدباکتریایی خود را از طریق اتصال به غشای باکتریایی، ورود به درون غشا، تشکیل منفذ موقتی و برهم‌کنش با لیپید II اعمال می‌کند (3). نانوذرات نقره خوشه‌هایی از اتم‌های نقره در اندازه‌های 1 تا 100 نانومتر هستند که به‌علت ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی منحصر‌به‌فرد به‌طور گسترده در زمینه‌های مختلف استفاده می‌شوند (4). فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره تابعی از اندازة آنهاست اما ویژگی‌های دیگری مانند نسبت سطح به حجم زیاد، اشکال بلوری غیرمعمول و محل‌های واکنش نیز مهم هستند. اندازة کوچک و سطح بزرگ این ذرات موجب واکنشی می‌شود که حساسیت را افزایش می‌دهد و نانوذرات به‌علت مطلوب‌بودن شکل با ریزموجودات واکنش می‌دهند (5). سازوکارهای کلی و مهم برای عملکرد نانوذرة نقره شامل ناپایدارکردن پتانسیل غشا، کاهش سطح ATP و ایجاد اختلال در عملکرد پروتئین‌ها و تغییر در توالی ژنوم هستند (6). اثر ضدمیکروبی نانوذرات نقره و نانوذرات نقرۀ متصل به نایسین در ریزموجودات عامل فساد غذایی مانند لیستریا مونوسیتوژنز[5]، استافیلوکوکوس اورئوس، پسودوموناس فلورسنس[6]، آسپرژیلوس نیگر[7] و فوزاریوم مونیلیفورم[8] در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی و مشخص شده است پتانسیل ضدمیکروبی نایسین پس‌از اتصال به نانوذرات نقره افزایش می‌یابد (7). یافتن درمان‌های ترکیبی و داروهای ضدباکتریایی جدید جایگزین به شرط نداشتن سمیت و ویژگی جهش‌زایی برای انسان و سایر جانوران به‌علت مقاومت آنتی‌بیوتیکی باکتری‌های بیماری‌زای شایع دارای اهمیت است. پژوهش حاضر با هدف بررسیفعالیت ضدباکتریایی و اثر ژنومی سینرژیک نانوذرات نقره و نایسین روی باکتری اشریشیا کلی[9] انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

تهیة محلول‌های استوک: برای تهیة محلول استوک نانوذرات نقره، 01/0 گرم از آن در 10 میلی‌لیتر بافر فسفات با اسیدیتۀ 7 (حلال نانوذرات نقره) ریخته و به غلظت 1000 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر رسانده شد؛ سپس به‌مدت 5 دقیقه با جریان 70 ولت و فرکانس 20 کیلوهرتز در دمای 25 درجة سانتی‌گراد سونیکه شد. محلول استوک نایسین هم طبق روش یادشده تهیه شد. برای تهیة محلول استوک نانوذرات نقرة متصل به نایسین، 5 میلی‌لیتر محلول استوک نقره با 5 میلی‌لیتر محلول استوک نایسین مخلوط و به‌مدت یک شب در انکوباتور شیکردار با 170 دوردردقیقه و دمای 37 درجة سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ سپس به‌منظور خارج‌کردن نانوذرات متصل‌نشده سه مرتبه با بافر فسفات شستشو و در 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد و غلظت نهایی آن مشابه دو محلول یادشده تعیین شد.

کشت باکتری و تیمار آن: باکتری اشریشیا کلی سوش O157:H7 ابتدا در محیط جامد Nutrient Agar کشت و سپس یک کلنی تک به محیط مایع Nutrient Broth پاساژ داده شد. پس‌از 24 ساعت گرماگذاری در دمای 37 درجة سانتی‌گراد، جذب نوری (OD) محیط در طول موج 600 نانومتر به 4/0 رسید. در ادامه، باکتری‌ها با غلظت‌های 50، 75، 100 و 125 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، غلظت‌های 25، 50، 75، 150، 100 و 200 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نایسین و غلظت‌های 30، 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات متصل به نایسین تیمار شدند و جذب نوری آنها در زمان‌های 2، 4، 6 و 24 ساعت پس‌از تیمار در طول موج 600 نانومتر خوانده و ثبت شد. بر اساس نتایج این مرحله، قدرت مهارکنندگی رشد و اثر ژنومی سه محلول یادشده در غلظت‌های مشترک 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر به‌منظور ارزیابی اثر سینرژیستی نانوذرات نقرة متصل به نایسین مقایسه شد.

استخراج  DNAو انجام RAPD-PCR: DNA باکتری‌های شاهد و تیمار‌شده با غلظت‌های50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر محلول‌های یادشده با استفاده از کیت GeNet Bio استخراج و با الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد و اسپکتروفتومتری ازنظر کیفی و کمّی تجزیه‌وتحلیل شد.. اثر ژنومی سه محلول آزمایش‌شده به روش RAPD-PCR با استفاده از 8 آغازگر 10 جفت بازی تصادفی RAPD بررسی شد (ویژگی‌های آغازگرها در جدول 1 آمده است). برای انجام واکنش 25 میکرولیتری RAPD-PCR مقدار 1 میکرولیتر آغازگر، 1 میکرولیتر DNA ژنومی، 5/12 میکرولیتر مسترمیکس (سیناژن) و 5/10 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه استفاده شد. برنامۀ دمایی PCR شامل واسرشت‌شدن اولیۀ DNA الگو در دمای 95 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه و 40 چرخه در دماهای 95 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 35 ثانیه، 30 درجة سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه برای اتصال آغازگرها به رشته‌های الگو، 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه برای سنتز رشتة جدید و 7 دقیقه گسترش نهایی رشته‌های ناقص در دمای 72 درجة سانتی‌گراد انجام شد.

 

جدول 1- آغازگرهای تصادفی به‌کار‌رفته در RAPD-PCR

توالی نوکلئوتید آغازگر

نام آغازگر

CTCACCGTCC

AATGCCGCAG

GTCGTTCCTG

GTGATCGCAG

TTTGGGGCCT

CAATCGCCGT

GGTGACGCAG

GGGTAACGCC

OPC-09

OPT-14

OPS-13

OPA-10

OPS-05

OPA-11

OPB-07

OPA-09

 

تجزیه‌وتحلیل نتایج RAPD-PCR: پس‌از انجام PCR، محصولات آن روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز شدند؛ سپس داده‌های حاصل از 8 آغازگر استفاده‌شده بر اساس الگوی بانددهی و عدم آن روی ژل به‌ترتیب با یک و صفر امتیازدهی شدند، ماتریکس تشابه بین ژنوم‌ها با نرم‌افزار NTSYS-PC محاسبه و دندروگرام مربوط به تفاوت ژنومی رسم شد.

نتایج

نتایج میکروسکوپ‌های الکترونی TEM، SEM و همچنین تجزیه‌وتحلیل XRD برای بررسی ریخت‌شناسی و تعیین اندازة نانوذرات نقره و نانوذرات نقرۀ متصل به نایسین در شکل‌های 1 تا 4 آورده شده است و نشان می‌دهند اندازة نانوذرات کمتر از 20 نانومتر است.

اثر مهارکنندگی رشد توسط نانوذرات نقره در غلظت 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر و بیشتر، نایسین در غلظت 50 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر و بیشتر در فواصل زمانی 4 تا 24 ساعت پس‌از تیمار و نانوذرات نقرة متصل به نایسین در غلظت‌های 50 و 75 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر در فواصل 6 تا 24 ساعت پس‌از تیمار مشاهده شد (جذب نوری مربوط به آنها در طول موج 600 نانومتر در جدول‌های 2 تا 4 آمده است). در مقایسة آثار ضدمیکروبی غلظت‌های 50 و 75 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین بر اساس جذب نوری خوانده‌شده در فواصل زمانی 6 تا 24 ساعت پس‌از تیمار، اثر مهارکنندگی رشد توسط نانوذرات متصل به نایسین بیشتر از دو مادة دیگر بود و در بین آن دو نیز اثر نقره از نایسین بیشتر بود (اطلاعات جامع آنها در جدول‌های 5 و 6 و شکل های 6 و 7 آمده است).

نتایج الکتروفورز محصولات RAPD-PCR برای 8 آغازگر روی ژل آگارز 2 درصد در شکل‌های 8 و 9 مشاهده می‌شوند که بر اساس الگوی بانددهی و عدم آن به‌ترتیب با یک و صفر امتیازبندی و با نرم‌افزار NTSYS-PC تجزیه‌وتحلیل شده‌اند.

 

شکل 1- عکس TEM (Transmission Electron Microscopy) مربوط به نانوذرات نقره

 

 

شکل 2- عکس SEM (Scanning Electron Microscopy) مربوط به نانوذرات نقره

 

 

شکل 3- عکس TEM (Transmission Electron Microscopy) مربوط به  نانوذرات نقرة متصل به نایسین

 

 

شکل 4- تجزیه‌وتحلیل XRD نانوذرات نقره (تأییدکنندة وجود نانوذرات نقره با‌توجه‌به پیک‌های موجود در 2θ)

 

 

 

شکل 5- نمودار کالیبراسیون جذب نوری باکتری‌های تیمار‌شده با نانوذرات نقره در غلظت‌های50، 75، 100 و 125 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر در طول موج 600 نانومتر

 

جدول 2- میانگین جذب نوری باکتری‌های تیمارشده با نانوذرات نقره در طول موج 600 نانومتر

غلظت (µg/ml)

پیش‌از تیمار

پس‌از 2 ساعت

پس‌از 4 ساعت

پس‌از 6 ساعت

پس‌از 24 ساعت

شاهد

54/0

95/0

48/1

53/1

37/1

50

38/0

1

47/1

2/1

41/1

75

41/0

97/0

35/1

34/1

3/1

100

38/0

96/0

51/1

36/1

25/1

125

48/0

1

46/1

32/1

2/1

جدول 3- میانگین جذب نوری باکتری‌های تیمار‌شده با نایسین در طول موج 600 نانومتر

غلظت (µg/ml)

پیش‌از تیمار

پس‌از 2 ساعت

پس‌از 4 ساعت

پس‌از 6 ساعت

پس‌از 24ساعت

شاهد

67/0

05/1

49/1

37/1

33/1

25

52/0

65/0

89/0

96/0

59/1

50

4/0

1

4/1

4/1

4/1

75

4/0

1

4/1

4/1

4/1

100

47/0

15/1

47/1

36/1

19/1

150

4/0

86/0

43/1

33/1

15/1

200

4/0

84/0

42/1

35/1

2/1

 

جدول 4- میانگین جذب نوری باکتری‌های تیمار‌شده با نانوذرات نقرة متصل به نایسین در طول موج 600 نانومتر

غلظت (µg/ml)

پیش‌از تیمار

پس‌از 2 ساعت

پس‌از 4 ساعت

پس‌از 6 ساعت

پس‌از 24 ساعت

شاهد

33/0

1

37/1

57/1

75/1

30

41/0

9/0

56/1

6/1

75/1

50

4/0

8/0

3/1

3/1

2/1

75

4/0

1/1

45/1

6/1

4/1

 

جدول 5- مقایسة جذب نوری باکتری‌های تیمار‌شده با غلظت‌های 50 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین

غلظت (µg/ml)

پیش‌از تیمار

پس‌از 2 ساعت

پس‌از4 ساعت

پس‌از 6 ساعت

پس‌از 24 ساعت

شاهد

4/0

1

4/1

6/1

8/1

نایسین

4/0

1

4/1

4/1

4/1

نانوذرات نقره

4/0

1

45/1

2/1

4/1

نانوذرات نقرة متصل به نایسین

4/0

8/0

3/1

3/1

2/1

 

جدول 6- مقایسة جذب نوری باکتری‌های تیمار‌شده با غلظت‌های 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین

غلظت (µg/ml)

پیش‌از تیمار

پس‌از 2 ساعت

پس‌از 4 ساعت

پس‌از 6 ساعت

پس‌از 24 ساعت

شاهد

4/0

1

4/1

6/1

8/1

نایسین

4/0

1

4/1

4/1

4/1

نانوذرات نقره

4/0

9/0

3/1

3/1

3/1

نانوذرات نقرة متصل به نایسین

4/0

1/1

45/1

6/1

4/1

 

 

شکل 6- مقایسة میزان مهار رشد باکتری‌های تیمار‌شده با نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین در غلظت 50 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر بر اساس جذب نوری در طول موج 600 نانومتر (Con. شاهد، N50. نایسین، Ag50. نانوذرات نقره، AgN50. نانوذرات نقرة متصل به نایسین)

 

 

شکل 7- مقایسة میزان مهار رشد باکتری‌های تیمار‌شده با نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین در غلظت‌ 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر بر اساس جذب نوری در طول موج 600 نانومتر (Con. شاهد، N75. نایسین، Ag75. نانوذرات نقره، AgN75. نانوذرات نقرة متصل به نایسین)

 

شکل 8- نتایج الکتروفورز محصولات غیرکانژوگۀ حاصل از RAPD؛ ستون‌های 1. نشانگر، 2 تا 5. آغازگر OPC09، 6. نشانگر، 7 تا 10. آغازگر OPT14، 11. نشانگر، 12 تا ۱5. آغازگر OPS13، ۱6. نشانگر، ۱7 تا 20. آغازگر OPA10، 21. نشانگر، 22 تا 25. آغازگر OPS05، 26. نشانگر، 27 تا 30. آغازگر OPA11، 31. نشانگر، 32 تا 35: آغازگر OPB07، 36. نشانگر، 37 تا 40. آغازگر OPA09

 

 

شکل 9- نتایج الکتروفورز محصولات کانژوگۀ حاصل از RAPD؛ ستون‌های 1. نشانگر، 2 تا 4. آغازگر OPC09، 5. نشانگر، 6 تا 8. آغازگر OPT14، 9. نشانگر، 10 تا ۱2. آغازگر OPS13، ۱3. نشانگر، ۱4 تا 16. آغازگر OPA10، 17. نشانگر، 18 تا 20. آغازگر OPS05، 21. نشانگر،22 تا 24. آغازگر OPA11، 25. نشانگر، 26 تا 28: آغازگر OPB07، 29. نشانگر، 30 تا 32. آغازگر OPA09

 

 

بر اساس نتایج محاسبه‌های ماتریکس تشابه (جدول‌های 7 تا 9) و دندروگرام‌های حاصل (شکل‌های 10 تا 12)، هر سه ماده (نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین) در غلظت 50 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر کمترین و در غلظت 75 میکروگرم‌برمیلی‌لیتر بیشترین اثر ژنومی را دارند. نتایج مقایسة آثار ژنومی سه محلول در غلظت‌های یکسان 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر که ماتریکس تشابه و دندروگرام آنها به‌ترتیب در جدول‌های 10 و 11 و شکل‌های 13 و 14 دیده می‌شود نشان می‌دهند در هر دو غلظت یادشده بیشترین و کمترین فاصلة ژنتیکی ایجاد‌شده نسبت به شاهد به‌ترتیب به باکتری‌های تیمارشده با نانوذرات نقره و نایسین تعلق دارد و اثر ژنومی حاصل از نانوذرات نقرة متصل به نایسین در حدفاصل آن دو قرار دارد؛ بنابراین، نانوذرات نقرة متصل به نایسین نسبت به نانوذرات نقره اثر ضدباکتریایی بیشتر و اثر ژنومی کمتری از خود نشان می‌دهند.

 

جدول 7- ماتریکس تشابه برای نمونه‌های شاهد و تیمارشده با نانوذرات نقره

Proximity Matrix

Case

Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

C

T1

T2

C

1.0000000

 

 

T1

0.5217391

1.0000000

 

T2

0.2352941

0.1481481

1.0000000

This is a similarity matrix

C.شاهد, T1. 50 µg/ml, T2. 75 µg/ml

 

 

 

C.شاهد, T1. 50 µg/ml, T2. 75 µg/ml

شکل 10- دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون رپید با روش UPGMA با نرم‌افزار NTSYS-PC

 

جدول 8- ماتریکس تشابه برای نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با نایسین

Proximity Matrix

Case

Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

C

T1

T2

C

1.0000000

 

 

T1

0.9333333

1.0000000

 

T2

0.8571429

0.9333333

1.0000000

This is a similarity matrix

C.شاهد, T1. 50 µg/ml, T2. 75 µg/ml

 

 

 

C.شاهد, T1. 50 µg/ml, T2. 75 µg/ml

شکل 11- دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون رپید به روش UPGMA با نرم افزارNTSYS-PC

جدول 9- ماتریکس تشابه برای نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با نانوذرات نقرة متصل به نایسین

Proximity Matrix

Case

Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

C

T1

T2

C

1.0000000

 

 

T1

0.7272727

1.0000000

 

T2

0.6666667

0.9333333

1.0000000

This is a similarity matrix

C.شاهد, T1. 50 µg/ml, T2. 75 µg/ml

 

 

 

C.شاهد, T1. 50 µg/ml, T2. 75 µg/ml

شکل 12- دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون رپید به روش UPGMA با نرم‌افزار NTSYS-PC

 

جدول10- ماتریکس تشابه برای نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با غلظت 50 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین

Proximity Matrix

Case

Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

C

T1

T2

T3

C

1.0000000

 

 

 

T1

0.4615385

1.0000000

 

 

T2

0.8484848

0.4347826

1.0000000

 

T3

0.6206897

0.3157895

0.4615385

1.0000000

This is a similarity matrix

C. شاهد, T1. Ag, T2. Nisin, T3. Ag+Nisin

 

 

 

 

C. شاهد, T1. Ag, T2. Nisin, T3. Ag+Nisin

شکل 13- دندروگرام نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با غلظت 50 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین

جدول 11- ماتریکس تشابه برای نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده با غلظت 75 میکروگرم‌بر میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین

Proximity Matrix

Case

Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

C

T1

T2

T3

C

1.0000000

 

 

 

T1

0.2162162

1.0000000

 

 

T2

0.7741935

0.3125000

1.0000000

 

T3

0.5714286

0.2068966

0.4347826

1.0000000

This is a similarity matrix

C. شاهد, T1. Ag, T2. Nisin, T3. Ag+Nisin

 

 

 

 

 

C. شاهد, T1. Ag, T2. Nisin, T3. Ag+Nisin

شکل 14- دندروگرام نمونه‌های شاهد و تیمار‌شده باغلظت 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین

 


بحث و نتیجه‌گیری

مقایسة فعالیت ضدمیکروبی غلظت‌های 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین در زمان‌های مختلف نشان داد مقدار جذب نوری تیمارشده‌ها 6 تا 24 ساعت پس‌از تیمار غلظت‌های 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی‌لیتر نانوذرات نقرة متصل به نایسین به‌ترتیب 1/0 و 2/0 کاهش می‌یابد و در تیمارهای نانوذرات نقره و نایسین ثابت می‌ماند. این یافته نشان می‌دهد فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقرة متصل به نایسین بیشتر از دو مادة دیگر است و با برخی یافته‌های پیشین دربارۀ وجود آثار سینرژیستی نانوذرات نقره با آنتی‌بیوتیک‌ها همسو است. زرینا و ناندا[x] در سال 2014 نشان دادند اتصال نانوذرات نقرة سنتزشدة زیستی غیرسمی با اندازۀ 40 تا 60 نانومتر به آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین، ازیترومایسین و سفه‌تاکسیم از توسعة مقاومت میکروب‌ها جلوگیری می‌کند، ویژگی ضدمیکروبی آنتی‌بیوتیک را افزایش می‌دهد و دوز مصرفی آنتی‌بیوتیک علیه عوامل بیماری‌زای مقاوم به چند دارو را به حداقل می‌رساند (8). جماران و رحیمیان ظریف[xi] در سال 2016 در ترکیبی از نانوذرات نقره با جنتامایسین یا نئومایسین ویژگی هم‌افزایی ضدباکتریایی را در جدایه‌های استافیلوکوکوس اورئوس عامل ورم پستان نشان دادند (9). پژوهش‌های پیشین نشان دادند نانوذرات نقره به‌طور متصل با پپتیدهای مختلف ضدباکتریایی آثار سینرژیستی بالقوه‌ایی در برابر بیماری‌زاها ایجاد می‌کنند (2، 10-15). نتایج پژوهش حاضر مشابه مطالعه‌های اخیر است؛ باوجوداین، پاناچک و همکاران[xii] ضمن پژوهش مشابهی در سال 2015، آثار سینرژیستی آنتی‌بیوتیک‌های دارای عملکردها و ساختارهای شیمیایی مختلف را در ترکیب با نانوذرات نقره مشاهده نکردند که نشان‌دهندة آثار سینرژیستی غیراختصاصی است (16). دنگ و همکاران[xiii] نیز در سال 2016 نشان دادند در ترکیب نانوذرات نقره و آنتی‌بیوتیک‌های آمپی‌سیلین و پنی‌سیلین آثار سینرژیستی وجود ندارد (17). آللهوردیف و همکاران[xiv] نیز در سال 2011 نشان دادند در ترکیب نانوذرات نقره و آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین در برابر سه بیماری‌زای شایع انسانی استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و سودوموناس آئروژینوزا[xv] آثار سینرژیستی وجود ندارد (18). با‌توجه‌به نتایج پژوهش حاضر استدلال می‌شود اثر نایسین متصل به نانوذرات نقره در برابر مقاومت غشایی و نایسیناز نسبت به کاربرد انفرادی آن افزایش می‌یابد و برهم‌کنش با غشا باعث نفوذپذیری اتصالات و گسیختگی غشا می‌شود و تنش اکسیداتیو به افزایش اثر ضدباکتریایی اتصالات منجر می‌شود؛ در نتیجه، آثار نانوذرات نقره و نایسین متصل به آن سینرژیستی محسوب می‌شود. بر اساس داده‌های PCR-RAPD در همة باکتری‌های تیمارشده با نانوذرات نقره، نایسین و نانوذرات نقرة متصل به نایسین، اثر ژنومی با افزایش غلظت افزایش می‌یابد. با‌توجه به مقایسة اثر ژنومی این سه ماده در غلظت‌های یکسان 50 و 75 میکروگرم‌بر‌میلی لیتر مشخص شد بیشترین و کمترین اثر ژنومی به‌ترتیب به نانوذرات نقره و نایسین مربوط است و این یافته با نتایج مطالعه‌های پیشین مطابقت دارد. فیاض و همکاران[xvi] در سال 2010 نشان دادند کمپلکس ترکیبی مولکول‌های آمپی‌سیلین با نانو‌ذرات نقره وارد واکنش با DNA می‌شود و از بازشدن آن جلوگیری می‌کند که به آسیب جدی سلول منجر می‌شود (19). سوو- هاون و همکاران[xvii] نیز در سال 2011 نشان دادند یون‌های Ag+ ترجیحاً با بازهای DNA به‌جای گروه‌های فسفات واکنش می‌دهند (20). در زمینۀ اثر نانوذرات نقرۀ متصل به نایسین روی توالی ژنوم چنین استدلال می‌شود که پایداری اتصالات نانوذرات نقره و نایسین به‌علت برهم‌کنش الکترواستاتیک به رهاسازی کمتر یون‌های Ag+ نسبت به کاربرد انفرادی نانوذرات نقره منجر می‌شود و به‌همین‌علت، آثار ژنومی اتصالات یادشده در حدفاصل کاربرد انفرادی نانوذرات نقره و نایسین قرار می‌گیرد؛ در نتیجه، اتصالات یادشده موجب ایجاد اختلال در همانندسازی و سازوکارهای ترمیمی DNA و رخ‌دادن جهش‌های متعدد و بروز تغییراتی در توالی ژنوم باکتری اشریشیا کلی می‌شود که سبب بروز فاصلة ژنتیکی نسبت به نمونه‌های شاهد را می‌شود.

باتوجه‌به نتایج پژوهش حاضر نانوذرات نقرة متصل به نایسین نسبت به نقره بیشترین اثر ضد‌باکتریایی با کمترین اثر ژنومی را دارند و ازنظر میزان کم سمیت و جهش‌زایی می‌تواند به‌عنوان مادة ضدباکتریایی ایمن استفاده شود.



[1]- Lactococcus lactis

[2]- Staphylococcus aureus

[3]- Streptococcus bovis

[4]- Lactobacillus

[5]- Listeria monocytogenes

[6]- Pseudomonas fluorescens

[7]- Aspergillus niger

[8]- Fusarium moniliforme

[9]- Escherichia coli

[x]- Zarina and Nanda.

[xi]- Jamaran and Rahimian  Zarif. 

[xii]- Panacek et al. 

[xiii]- Deng et al. 

[xiv]- Allahverdiyev et al.  

[xv]- Pseudomonas aeruginosa

[xvi]- Fayaz et al. 

[xvii]- Soo-Hwan et al.

(1)              Molaabaszadeh H., HajisheikhzadehB., Mollazadeh M., Eslami K., Mohammadzadeh Gheshlaghi N. The study of sensibility and antimicrobial resistance in Escherichia coli isolated from urinary tract infection in Tabriz city. Journal of Fasa University of Medical Sciences 2013; 2(3):149-154.
(2)              Arakha M., M. Borah S., Saleem M., N. Jha A., Jha S. Interfacial assembly at silver nanoparticle enhances the antibacterial efficacy of nisin. Free Radical Biology and Medicine 2016; 101:434-445.
 
(3)              Karam L., Jama C., Dhulster P., Chihib N-E. Study of surface interactions between peptides, materials and bacteria for setting up antimicrobial surfaces and active food packaging. Journal of Materials and Environmental Science 2013; 4(5): 798-821.
(4)              Tabrizi S., Golestani Emani B., Karimi F. Investigation of the effect of different doses of silver nanoparticles on the genome of Escherichia coli by using molecular markers. Journal of Biotechnology and Applied Microbiology 1393; 1(2): 37-47.
(5)              Santos CL., Albuquerque AJR., Sampaio FC., Keyson D. Nanomaterials with antimicrobial properties: Applications in health sciences. Microbial Pathogens and Strategies for Combating them: Science, Technology and Education (A. Méndez-Vilas, Ed.)2013; 1: 143-154.
(6)              Zargar M., Mohammadi Bandari N. Silver nanoparticles and their applications. Journal of Applied Biology 1392; 3(3): 13-31.
(7)              Pandit R., Rai M., Santos CA. Enhanced antimicrobial activity of the food-protecting nisin peptide by bioconjugation with silver nanoparticles. Environmental Chemistry Letters 2017; 3(15): 443-452.
(8)              Zarina A., Nanda A. Combined efficacy of antibiotics and biosynthesised silver nanoparticles from Streptomyces Albaduncus. International Journal of PharmTech Research 2014; 6(6): 1862-1869.
(9)              Jamaran S., Rahimian Zarif B. Synergistic effect of silver nanoparticles with neomycin or gentamicin antibiotics on mastitis-causing Staphylococcus aureus. Open Journal of Ecology 2016; 7(6): 452-459.
(10)          Golubeva O. Yu., Shamova OV., Orlov DS., Pazina T. Yu., Boldina AS., Drozdova IA. et al. Synthesis and study of antimicrobial activity of bioconjugates of Silver nanoparticles and endogenous antibiotics. Glass Physics and Chemistry 2011; 1(37): 78-84.
(11)          Singh P., Raja RB. Synergistic effect of silver nanoparticles with the cephalexin antibiotic against the test strains. Bioresearch Bulletin 2012; 4: 171-179.
(12)          Ruden S., Hilpert K., Berditsch M., Parvesh W., S. Ulrich A. Synergistic Interaction between Silver Nanoparticles and Membrane-Permeabilizing Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2009; 8(53): 3538-3540.
(13)          McShan D., Zhang Y., Deng H., Ray PC., Yu H. Synergistic antibacterial effect of silver nanoparticles combined with ineffective antibiotics on drug resistant Salmonella typhimurium DT104. Journal of Environmental Science and Health, C: Environmental Carcinogenesis and Ecotoxicology Reviews 2015; 3(33): 369-384.
(14)          Singh R., Wagh P., Wadhwani S., Gaidhani S., Kumbhar A., Bellare J. et al. Synthesis, optimization, and characterization of silver nanoparticles from Acinetobacter calcoaceticus and their enhanced antibacterial activity when combined with antibiotics. International Journal of Nanomedicine 2013; 1(8): 4277-4290.
(15)          Elzahraa AF., El-Tayeb T., Abou-Aisha K., El-Azizi MA. Combination of silver nanoparticles and visible blue light enhances the antibacterial efficacy of ineffective antibiotics against methicillin‑resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 2016; 48(15): 1-13.
(16)          Panacek A., Smekalova M., Kilianova M., Prucek R., Bogdanova K., Vecerova R. et al. Strong and nonspecific synergistic antibacterial efficiency of antibiotics combined with silver nanoparticles at very low concentrations showing no cytotoxic effect. Molecules 2016; 26(21): 1-17.
(17)          Deng H., McShan D., Zhang Y., S. Sinha S., Aswan Z., C. Ray P. et al .Mechanistic study of the synergistic antibacterial activity of combined silver nanoparticles and common antibiotics. Environmental Science and Technology 2016; 16(50): 8840-8848.
(18)          M. Allahverdiyev A., Volodymyrivna Kon K., Sefik Abamor E., Bagirova M., Rafailovich M. Coping with antibiotic resistance: Combining nanoparticles with antibiotics and other antimicrobial agents. Expert Review of Anti-infective Therapy 2011; 11(9): 1035-1052.
(19)          Fayaz AM., Balaji K., Girilal M., Yadav R., Kalaichelvan PT., Venketesan R. Biogenic synthesis of silver nanoparticles and their synergistic effect with antibiotics: a study against gram- positive and gram-negative bacteria. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 2010; 6:103-109.
Soo-Hwan K., Lee H-S., Ryu D-S., Choi S-J., Lee D-S. Antibacterial activity of silver-nanoparticles against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology 2011; 1(39): 77-85.