مطالعه دینامیک گونه‌های باسیلوس طی حذف آلودگی‌های نفتی با روش PCR-DGGE

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشکده محیط‌‌زیست و بیوتکنولوژی، پژوهشگاه صنعت نفت، تهران، ایران

2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، کرج، ایران

3 استادیار میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: پاکسازی زیستی راهی مؤثر، ارزان و سازگار با محیط‌زیست برای حذف آلودگی خاک و آب است و بررسی تنوع ریزموجودات بومی و تعیین نقش آنها اهمیت بسیاری در موفقیت این روش دارد. هدف پژوهش حاضر، بررسی نقش گونه‌های باسیلوس در پاکسازی زیستی نمونه خاک آلوده به گازوئیل است.
مواد و روش‏‏ها: دو میکروکازم با افزودن میزان 2 و 4 درصد گازوئیل به خاک تهیه شدند و یک میکروکازم، شاهد و بدون آلودگی در نظر گرفته شد. میزان تجزیه گازوئیل، تغییرات جمعیت باکتری‌های هتروتروف و تغییرات تنوع باسیلوس‌ها پس از افزودن منابع کربن، نیتروژن و فسفات با نسبت 100:10:1 و آب به میزان 20 درصد با روش
16S rRNA PCR-DGGE طی دوره شش‌ماهه بررسی شد.
نتایج: در میکروکازم‌های 2 و 4 درصد به‌ترتیب 50 و 44/44 درصد گازوئیل اولیه طی دوره شش‌ماهه تجزیه شد. روند افزایش تعداد باکتری‌های هتروتروف و بیشترین تعداد باکتری‌ها با سرعت تجزیه گازوئیل منطبق بود و تعداد باکتری‌ها در میکروکازم‌های 2 و 4 درصد از 108×2 باکتری در هر گرم خاک به‌ترتیب به 1011×2 و 1012×2 باکتری در هر گرم خاک در بیشترین میزان رسید. بنابراین، ورود آلودگی سبب تحریک جمعیت میکروبی خاک می‌شود و میزان آلودگی در کارآیی پاکسازی زیستی مؤثر است
بحث و نتیجه‏گیری: مقایسه تنوع باندهای DGGE نشان داد که با واردشدن آلاینده به خاک، تنوع گونه‌های باسیلوس افزایش می‌یابد و نقش مؤثر گونه‌های باسیلوس در پاکسازی زیستی خاک‌های آلوده به هیدروکربن‌های نفتی را نشان می‌دهد. هم‌زمان با کاهش میزان گازوئیل و تعداد باکتری‌ها، تنوع باندها در ژل DGGE نیز کمتر می‌شود. بنابراین، با ورود آلاینده به‌عنوان منبع کربن، تنوع گونه‌های باسیلوس در ابتدای فرآیند تجزیه افزایش و به‌تدریج با حذف ترکیب هیدروکربنی دوباره کاهش می‌یابد و ترکیب جمعیت به شرایط پیش از حضور آلاینده نزدیک می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Study of the dynamic of Bacillus species during of oil contaminated soil by PCR-DGGE

نویسندگان [English]

  • Mahmoud Shavandi 1
  • Nima Zamanian 2
  • Azam Haddadi 3
1 Assistant Professor of Molecular Genetics, Environment and Biotechnology Research Division, Research Institute of Petroleum Industry, Tehran, Iran
2 M.Sc. of Microbiology, Department of Microbiology, Karaj Branch, Islamic Azad University, Karaj, Iran
3 Assistant Professor of Microbiology, Department of Microbiology, Karaj Branch, Islamic Azad University, Karaj, Iran
چکیده [English]

Introduction: Bioremediation is an effective, inexpensive and environmental friendly manner for removing oil pollutions. Studding the biodiversity of indigenous microorganisms and their function is very important for bioremediation strategy selection and performance. This study was aimed to investigate the rule of Bacillus species in bioremediation of diesel contaminated soil.
Materials and Methods: Soil microcosms were prepared by adding 2 and 4% (W/W) of diesel to the soil. A control microcosm without diesel contamination was also set up. Microcosms were amended with nitrogen and phosphate sources and water (20%) and in a six month study period and parameters includingdiesel degradation, heterotrophic bacterial count and Bacillus spp. diversity by 16S rRNA PCR-DGGE were studied.
Results: The results showed that in 2% microcosm up to 50% and in 4% microcosm up to 44.44% of diesel were degraded after six months. The increase of bacterial count was completely coincided with the highest diesel removal rate. The count of heterotrophic bacteria in 2 and 4% microcosms was elevated from 2Í108 to 2Í1011 and 2Í1012 at the highest point, respectively. Accordingly, introduction of the diesel stimulated the native soil bacteria and the amount of pollution was determinative in bioremediation efficiency.
Discussion and conclusion: Comparison of the pattern of DGGE bands variation between the microcosms showed that by entry of the contaminant into the soil, the diversity of Bacillus species was increased, indicating that Bacillus species has a particular role in diesel degradation. Simultaneous with decline of the pollution and microbial count of the soil, diversity of DGGE bands was decreased. Out of these findings we may conclude that addition of diesel as a carbon source to the soil increases the Bacillus spp. diversity at the beginning of bioremediation and afterwards by elimination of the pollutant, the diversity decreases gradually and shifts back to its original structure.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Soil bioremediation
  • Oil pollution
  • Microbial Diversity
  • Bacillus spp
  • 16S rRNA gene
  • PCR-DGGE

مقدمه.

امروزه به علت استفاده گسترده از ترکیبات نفتی، خطر آلودگی با ترکیبات هیدروکربنی رو به افزایش است و این آلودگی‌ها، سلامت اکوسیستم‌های طبیعی، انسان و سایر موجودات را تهدید می‌کنند. راهکار مناسب برای رویارویی با آلودگی، حذف کامل آلاینده‌ها در صورت امکان و یا تبدیل این مواد به ترکیبات بی‌خطر است (1 و 2).

پاکسازی زیستی[1]، استفاده از موجودات زنده یا اجزای آنها برای حذف آلاینده‌ها و ترکیبات آلاینده از محیط‌های آب، خاک و هواست. اصول تمام روش‌های پاکسازی زیستی یکسان و فراهم‌کردن شرایط لازم برای فعال‌شدن موجودات زنده به‌ویژه باکتری‌های تجزیه‌کننده هیدروکربن‌هاست. این باکتری‌ها، ترکیبات نفتی را طی متابولیسم سلولی به دی‌اکسیدکربن، زیست‌توده و یا محصولات دیگر تبدیل می‌کنند. مهم‌ترین عامل در بهینه‌سازی و تسریع روند پاکسازی زیستی، تأمین نیاز‌های باکتری‌های مؤثر در حذف آلودگی است و شناسایی باکتری‌های کلیدی در حذف آلودگی‌ها به بهبود شرایط برای فعالیت آنها کمک شایانی می‌کند (2). پاکسازی زیستی آلاینده‌ها به دو روش انجام می‌شود:

1- تلقیح زیستی[2]: استفاده از این فرآیندها برای پاکسازی خاک‌های آلوده به ترکیبات نفتی به‌شکل واردکردن ریزموجودات کشت‌شده با توانایی تجزیه زنجیره‌های مختلف هیدروکربنی به اکوسیستم‌ خاک است. این کشت‌ ممکن است به ریزموجوداتی متعلق باشد که از همان خاک آلوده حاصل شده‌اند یا به گونه‌های میکروبی تعلق داشته باشد که از منابع دیگر جدا شده‌اند و توانایی آنها در تجزیه هیدروکربن‌ها اثبات شده است. هنگامی که این ریزموجودات وارد خاک شوند، ترکیبات هیدروکربنی را به‌شکل انتخابی استفاده می‌کنند (3).

2- تحریک زیستی[3]: در این فرآیندها، مواد مغذی لازم برای باکتری‌های تجزیه‌کننده به‌شکل مواد آلی یا معدنی به خاک افزوده می‌شوند تا جمعیت بومی خاک با استفاده از این کودها افزایش یابد. این ریزموجودات بومی، آلاینده‌های‌ هیدروکربنی را به‌عنوان منبع غذایی استفاده می‌کنند و فرض بر این است که افزایش تعداد ریزموجودات سبب افزایش سرعت تجزیه هیدروکربن در مقایسه با پاکسازی طبیعی ‌شود و علت آن نیز افزایش میزان مواد مغذی است (3).

پژوهشگران همواره به تنوع میکروبی خاک به‌عنوان یکی از عوامل اصلی و مؤثر بر تجزیه و پاکسازی زیستی آلاینده‌‌های نفتی توجه کرده‌اند (4). گروه‌های گسترده‌ای از باکتری‌ها همانند گونه‌های
 Bacillus، Pseudomonas،Acinetobacter،Alcaligenes،Nocardiaو Rhodococcusتوان تجزیه زیستی هوازی ترکیبات نفتی را دارند (5 و 6). تاکنون مطالعه‌های گسترده‌ای درباره تغییرات تنوع میکروبی طی پاکسازی ترکیبات نفتی انجام شده و اثر متغیرهای مختلف مانند نوع آلاینده، افزودنی‌ها و مواد حجم‌دهنده مختلف و همچنین نوع خاک بر تنوع زیستی باکتری‌ها طی پاکسازی آلاینده‌های نفتی بررسی شده است. در مطالعه‌ همورا[4] و همکاران، اثر ترکیبات آلاینده مختلف شامل نفت خام، نفت سفید و گازوئیل بر تنوع میکروبی سه نوع خاک مختلف بررسی و مشخص شد که پس از 50 روز، حدود 30 تا 70 درصد هیدروکربن‌های آلاینده تجزیه شده‌اند. مقایسه تنوع زیستی نشان داد که آلوده‌شدن خاک‌ها با آلاینده‌های مختلف سبب انتخاب جمعیت‌های میکروبی مشترک و در عین حال منحصر‌به‌فرد در هر یک از خاک‌ها می‌شود. در مقابل، چنانچه خاک‌‌های مختلف با یک نوع آلاینده مواجه شوند، جمعیت‌های میکروبی مختلفی در آنها مشاهده می‌شوند (7). در مطالعه دیگری، آبد[5] و همکاران اثر غلظت‌های مختلف آلودگی نفتی را بر تنوع میکروبی پنج خاک مختلف بررسی کردند و نتایج نشان دادند که کمتر از 20 درصد شباهت بین جمعیت میکروبی پنج خاک مختلف وجود دارد و جمعیت غالب به شاخه‌های Gammaproteobacteria، Bacilli Betaproteobacteria وActinobacteriaتعلق دارد (8).  مصداقی‌نیا[6] و همکاران در مطالعه‌ای که در سال 2005 انجام دادند، باکتری‌های تجزیه‌کننده PAH را از خاک‌های آلوده به نفت ایران جداسازی کردند و باکتری‌های جداشده با توجه به آزمون‌های انجام‌‌شده عبارت بودند از: Pseudomonas fluorescence، Serratia liquefaciens، Bacillusو Micrococcus.آنها به این نتیجه رسیدند که با توجه به جعیت بومی این نمونه خاک‌ها، زیست‌پالایی خاک‌های آلوده در ایران روشی کاملاً اجرایی و کاربردی است (9).

گزارش‌های متعدد دیگری نیز وجود دارند که نقش مهم گونه‌های جنس باسیلوس در فرآیندهای تجزیه آلاینده‌های محیطی و پاکسازی زیستی را تأیید می‌کنند. جنس باسیلوس از مجموعه‌ متنوعی از باکتری‌ها تشکیل شده که ویژگی آنها، تولید اندوسپور است. این باکتری‌ها تنوع بسیار زیادی از نظر فیزیولوژی، اکولوژی و ژنتیک دارند و توانایی آنها در تجزیه طیف گسترده‌ای از مواد با منشأ گیاهی و جانوری شگفت‌آور است. اعضای این جنس ترکیباتی مانند سلولز، نشاسته، پروتئین‌ها، آگار، هیدروکربن‌ها و ... را به‌راحتی تجزیه می‌کنند (10). تنوع ژنتیکی و توانایی‌های فراوان آنزیمی سبب شده‌اند که به باسیلوس‌ها در فرآیندهای پاکسازی زیستی توجه شود و جزو ثابت بسیاری از فرمولاسیون‌های میکروبی تجاری باشند که برای پاکسازی آلاینده‌های نفتی عرضه می‌شوند (11). نوآگو[7] و همکاران از Bacillus subtilis و Bacillus cereus برای تجزیه گازوئیل استفاده کردند و توانایی تجزیه بسیار زیاد این دو گونه را نشان دادند (12). در مطالعه خان[8] و همکاران، نشان داده شد که اعضای جنس باسیلوس حتی در شرایط تنش محیطی نیز توانایی زیادی در تجزیه هیدروکربن‌های نفتی دارند (13).

با وجود مطالعه‌های گسترده درباره اثر تنوع زیستی بر پاکسازی آلاینده‌های نفتی و تغییرات تنوع میکروبی طی پاکسازی، تاکنون مطالعه‌ای درباره تغییرات تنوع گونه‌های باسیلوس طی پاکسازی زیستی انجام نشده است. هدف پژوهش حاضر، بررسی تنوع گونه‌های باسیلوس طی پاکسازی زیستی نمونه خاک آلوده به گازوئیل با روش‌های مستقل از کشت است. علاوه بر گونه‌های باسیلوس کشت‌پذیر در آزمایشگاه، بخش عمده‌ای از باکتری‌های نزدیک به این جنس با روش‌های متداول امروزی جداسازی نمی‌شوند؛ با وجود کشت‌پذیرنبودن، این باکتری‌ها در محیط حضور دارند و با شناسایی آنها، از توانایی متابولیک آنها برای حذف سریع‌تر آلاینده‌ها استفاده می‌شود. هدف پژوهش حاضر، مطالعه تغییرات تنوع گونه‌های باسیلوس طی فرآیند پاکسازی زیستی خاک‌های آلوده به ترکیبات نفتی و بررسی نقش آنها در حذف گازوئیل است. به این منظور، از روش‌های مولکولی بر مبنای PCR-DGGE برای مطالعه تنوع باسیلوسها در میکروکازم‌های حاوی خاک آلوده به گازوئیل استفاده شد.

.مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری:نمونه‌برداری از خاک‌های غیر‌آلوده و با میزان بار آلی اندک از ناحیه‌ای در شمال‌شرقی شهر کرج (854165/35 و 984552/50) انجام شد. پیش از نمونه‌گیری، خاک‌های سطحی حاوی بقایای گیاهی کنار زده شدند و نمونه از عمق حدود 3 تا 10 سانتی‌متری تهیه شد. پس از برداشت، نمونه‌ها برای یکنواخت‌شدن ذره‌های درشت خرد و الک شدند و تمام مواد اضافی شامل سنگ‌ها و بقایای گیاهی از آنها جدا شد.

تهیه میکروکازم:میکروکازم، قطعه‌ای کوچک از اکوسیستم است که برای بررسی و مطالعه ویژگی‌های مختلف آن، در شرایط کنترل‌شده از محیط به آزمایشگاه منتقل می‌شود. برای تهیه میکروکازم در پژوهش حاضر، میزان 700 گرم از خاک آماده‌شده در ظرف‌های دردار ریخته و میزان 2 درصد وزنی (W/W) گازوئیل به یک ظرف و 4 درصد وزنی (W/W) گازوئیل به ظرف دیگر اضافه شد. برای یکنواخت‌شدن پراکنش گازوئیل در خاک، گازوئیل در هگزان نرمال حل و یکنواخت روی خاک اسپری شد. برای حذف حلال و بخش‌های فرار گازوئیل، خاک آلوده دو هفته زیر هود شیمیایی نگهداری[9] شد. پس از این مدت، برای تنظیم نسبت کربن، نیتروژن و فسفات (با نسبت 100:10:1) به میزان 1/0 وزن گازوئیل، نیترات‌آمونیوم و به میزان 01/0 وزن گازوئیل، دی‌پتاسیم‌فسفات در 140 میلی‌لیتر آب مقطر استریل حل و به میکروکازم‌ها اضافه شد. سپس محتویات میکروکازم‌ها با چنگال‌های استریل مجزا، کامل مخلوط شدند. ظرف دیگری که حاوی خاک بدون آلودگی بود، شاهد در نظر گرفته شد و تنها 140 میلی‌لیتر آب مقطر استریل به آن اضافه شد. وزن ظرف‌ها در ابتدا یادداشت و با وزن‌کردن هفته‌ای ظرف‌ها، رطوبت کم‌شده با اضافه‌کردن آب مقطر استریل جبران شد. میکروکازم‌ها به مدت شش ماه بررسی و مطالعه شدند.

.اندازه‌گیری میزان هیدروکربنهای نفتی کل (TPH[10]):برای اندازه‌گیری میزان هیدروکربن‌های نفتی باقیمانده در خاک، هر دو هفته 5 گرم از نمونه خاک میکروکازم برداشته و 24 ساعت در هوای آزاد قرار داده شد تا رطوبت آن خشک شود. نمونه خاک همراه با 5 گرم سولفات‌سدیم بدون آب که به مدت یک شب در آون 60 درجه سانتی‌گراد خشک شده بود، داخل فالکون 15 میلی‌لیتری ریخته و مخلوط شد. سپس، میزان 10 میلی‌لیتر هگزان نرمال به هر فالکون اضافه و ورتکس شد. فالکون‌ها به مدت 10 دقیقه در دور ×g4500 و دمای 15 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جمع‌شده داخل پتری‌دیش شیشه‌ای ریخته شد که از پیش وزن آن اندازه‌گیری شده بود. این روش، سه بار تکرار شد. پس از اینکه هگزان به‌طور کامل تبخیر و پتری‌دیش خشک شد، وزن پتری‌دیش اندازه‌گیری و با مقایسه وزن پیشین و وزن پتری‌دیش حاوی هیدروکربن‌های استخراج‌شده، میزان گازوئیل استخراج‌شده توسط هگزان محاسبه شد (14).

.تحلیل هیدروکربن‌های باقیمانده با کروماتوگرافی گازی (GC[11]):برای استخراج هیدروکربن‌های نفتی از خاک، 1 گرم نمونه خاک میکروکازم برداشته و هم‌وزن خاک، سولفات‌سدیم بدون آب به آن اضافه و مداوم به مدت 15 دقیقه هم زده شد. پس از آبگیری، حلال دی‌‌کلرومتان به میزانی اضافه شد که روی خاک را کامل بپوشاند و سپس ارلن مایر به مدت 20 دقیقه در حمام سونیکاتور قرار داده شد. برای اطمینان از استخراج کامل هیدروکربن‌های باقیمانده، مرحله استخراج حلالی سه مرتبه تکرار شد. پس از تبخیر فاز حلال، ماده استخراج‌شده در سیکلوهگزان حل و 1 میکرولیتر از آن به دستگاه کروماتوگرافی Chrompack مدل 438A مجهز به آشکارسازFID[12] و با ستون مویینه CP- sil5-CB 0.15; 0.25; 50 (به طول m50، قطر mm25/0 و ضخامت پوشش ml 15/0( تزریق شد. برنامه دمایی از 40 درجه سانتی‌گراد آغاز و 4 دقیقه ثابت نگه داشته شد، سپس با شیب 5 درجه سانتی‌گراد در دقیقه به285 درجه سانتی‌گراد رسید.

شمارش باکتری‌های هتروتروف:هر دو هفته یک بار، میزان 1 گرم خاک از هر میکروکازم برداشته و با محلول رینگر استریل تا رقت 9-10 سریال رقت تهیه شد. با سر سمپلر استریل، 100 میکرولیتر از هر رقت روی محیط جامد R2A آگار منتقل و با پیپت‌پاستور استریل به‌طور کامل روی محیط پخش شد. محیط‌ها 48 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شدند. تعداد کلنی‌های موجود روی رقت مناسب، شمارش و تعداد کل باکتری‌های هتروتروف موجود در هر نمونه با توجه به ضریب رقت و حجم نمونه کشت‌شده محاسبه شد.

استخراج DNA از خاک:به این منظور، از کیت استخراج DNA از خاک (Soil DNA Extraction Kit) محصول شرکت MN آلمان استفاده شد. نمونه‌برداری هر دو ماه یک بار انجام شد؛ به این شکل که محتویات هر میکروکازم یکنواخت و سپس 5/0 گرم خاک برداشته شد. مراحل استخراج طبق دستورعمل شرکت سازنده کیت انجام شد. برای بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج‌شده از روش الکتروفورز روی ژل آگارز استفاده شد (15).

.تکثیر ژن  16S rRNAبرای بررسی تنوع با الکتروفورز با شیب ماده واسرشت‌کننده:در پژوهش حاضر، برای تکثیر ژن‌های 16S rRNA مربوط به گونه‌های باسیلوس موجود در نمونه‌های خاک از پرایمر اختصاصی گونه‌های باسیلوس (Bac-F) که Garbeva و همکاران (2002) طراحی کرده‌اند و برای مطالعه تنوع گونه‌های باسیلوس در خاک‌های کشاورزی استفاده شده بود و پرایمر عمومی باکتریایی 518R طراحی‌شده توسط Moreno و همکاران استفاده شد (16 و 17). توالی پرایمرهای استفاده‌شده در جدول 1 دیده می‌شود. پرایمرها از شرکت Bioneer کره جنوبی تهیه شدند.

برای تکثیر ژن‌های 16S rRNA از کیت PCR شرکت سیناژن استفاده شد. مواد لازم طبق دستورعمل شرکت سازنده به ویال‌های PCR افزوده شدند. دستورعمل انجام PCR شامل این مراحل است: چرخه اول در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، چرخه دوم (35 تکرار) به‌شکل دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، دمای 68 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و چرخه سوم در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 7 دقیقه.

 

جدول 1- توالی پرایمرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر

منبع

اختصاصیت

توالی

نام پرایمر

Garbeva  et al. (16)

Bacillus spp.

5´-(GC clamp)GGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT-3´

Bac-F

Moreno et al. (17)

عمومی باکتریایی

5´-CGTATTACCGCGGCTGCTGG-3´

518R


. .تعیین تنوع با استفاده از روش ژل الکتروفوروز با شیب ماده واسرشت‌کننده (DGGE[xiii]):محصول PCR حاصل از DNA محیطی با استفاده از پرایمر‌های اختصاصی ژن 16S rRNA، قطعه‌هایی هم‌اندازه و با طول یکسان هستند. بنابراین ژن‌های 16S rRNA موجود محصول PCR یادشده با الکتروفورز ژل آگارز از یکدیگر تفکیک نمی‌شوند و تنوع موجود در نمونه را نشان نمی‌دهند. تغییرات توالی (محتوای GC) بین rRNA‌های مختلف میکروبی، ویژگی‌های مختلفی طی حرکت مولکول‌های DNA در ژل دناتوره‌کننده ایجاد می‌کنند که اساس چندشکلی بین گروه‌های میکروبی در DGGE است (18). در این روش، رشته‌های DNA دو رشته‌ای در شیبی از مواد واسرشت‌کننده (اوره و فرمامید) در طول ژل حرکت می‌کنند و با گذشت زمان و زیادشدن غلظت ترکیبات واسرشت‌کننده، پیوندهای بین بازهای موجود در دو رشته از هم باز می‌شوند و مولکول DNA کم‌کم شکل Y به خود می‌گیرد و در نهایت، در نقطه‌ای از ژل متوقف می‌شود. نکته مهم این است که اگر دو رشته DNA کامل از یکدیگر جدا شوند، میزان تحرک الکتروفورزی دوباره با طول قطعه ارتباط خواهد داشت و بنابراین باید از جداشدن کامل دو رشته DNA جلوگیری شود؛ به این منظور، یک توالی GC[xiv] به طول 30 تا 40 نوکلئوتید به ابتدای 5' یکی از دو پرایمر استفاده‌شده برای تکثیر قطعه‌های مدنظر اضافه شد.

الکتروفورز با شیب ماده واسرشت‌کننده:برای انجام DGGE از DCoDE™ (BioRad, Hercules, CA) استفاده شد. پیش از انجام DGGE، محلول‌های ژل آکریل‌آمید و محلول‌‌های واسرشت‌کننده بر اساس دستورعمل شرکت BioRad تهیه شدند. ابتدا محلول 40 درصد اکریل‌آمید/بیس‌اکریل‌آمید حاوی 93/38 گرم اکریل‌آمید و 07/1 گرم بیس‌اکریل‌آمید ساخته شد و سپس محلول‌های صفر و 100 درصدطبق مقادیر ارایه‌شده در جدول 2 آماده شدند.

 

جدول 2- محلول‌های واسرشت‌‌کننده صفر و 100 درصد

نام معرف

محلول صفر درصد

محلول 100 درصد

40 درصد Acrylamide/Bis

8/18ml

8/18ml

50X TAE buffer

2ml

2ml

Formamide

40ml

--------

Urea

42g

--------

dH2O

to 100ml

to 100ml

 

برای جداسازی قطعه‌های تکثیرشده ژن 16S rRNA در پژوهش حاضر، از شیب غلظت‌های بهینه‌شده 65 و 25 درصد استفاده شد. الکتروفورز با ولتاژ 80 ولت و دمای 60 درجه سانتی‌‌گراد به مدت 16 ساعت انجام و پس از پایان یافتن الکتروفورز، ژل به مدت 30 دقیقه در رنگ اتیدیوم‌بروماید قرار داده شد و به مدت 20 دقیقه در آب دیونیزه رنگبری شد. ژل با دستگاه Gel Documentation مشاهده و تصویر آن برای مطالعه‌های بعدی ذخیره شد.

 

نتایج

.اندازه‌‌گیری میزان تجزیه هیدروکربن‌های نفتی:تحلیل میزان کل هیدروکربن‌های نفتی (TPH) به‌عنوان شاخص حذف هیدروکربن‌های نفتی در میکروکازم‌ها استفاده شد. مطابق شکل 1، روند حذف آلاینده گازوئیل در میکروکازم 2 درصد سریع‌تر و طی شش ماه، 50 درصد گازوئیل از خاک حذف شده است؛ این در حالی است که روند تجزیه در میکروکازم 4 درصد کندتر و طی این مدت، حدود 44/44% گازوئیل از این میکروکازم حذف شده است.

شکل 1- بررسی میزان حذف ترکیبات نفتی در میکروکازم‌های حاوی 2 و 4 درصد گازوئیل طی دوره شش‌ماهه

 

برای اطلاع دقیق‎تر از چگونگی حذف گازوئیل و روند حذف هیدروکربن‌های مختلف در خاک آلوده، نمونه‌ای از هر یک از میکروکازم‌ها در شروع و پایان آزمایش تهیه و پس از استخراج باقیمانده هیدروکربن‌ها در خاک، با کروماتوگرافی گازی بررسی شد. شکل 2 نتایج مربوط به تحلیل نمونه گازوئیل اولیه (آبی) و هیدروکربن باقیمانده استخراج‌شده از میکروکازم 4 درصد (قرمز) و میکروکازم 2 درصد (سبز) با روش کروماتوگرافی گازی را نشان می‌دهد.

 

شکل 2- تحلیل کیفیت هیدروکربن‌های نمونه گازوئیل اولیه (آبی) و هیدروکربن‌های استخراج‌شده از میکروکازم 4 درصد (قرمز) و میکروکازم 2 درصد (سبز) با کروماتوگرافی گازی

 

شمارش باکتری‌های هتروتروف:تعداد کل باکتری‌های کشت‌پذیر به‌عنوان شاخصی از فعالیت ریزموجودات خاک در دوره پاکسازی ارزیابی شد. تغییرات تعداد کل باکتری‌ها طی تجزیه زیستی گازوئیل در میکروکازم‌های حاوی 2 و 4 درصد گازوییل در شکل 3 دیده می‌شود.

با توجه به شکل 3، در هر سه میکروکازم با افزایش میزان رطوبت خاک در هفته دوم، تعداد باکتری‌ها افزایش یافته است. اگرچه پس از افزایش اولیه در میکروکازم شاهد، سیر تغییر تعداد کل باکتری‌ها تقریباً ثابت و بدون تغییر درخور توجهی طی شش ماه است، تعداد باکتری‌ها در میکروکازم‌های 2 و 4 درصد پس از هفته دهم کاهش پیوسته و آرامی را نشان می‌دهد. بیشترین میزان باکتری‌های هتروتروف شمارش‌شده در میکروکازم شاهد (بدون گازوئیل) حدود 108 باکتری در هر گرم خاک بود، در حالی که بیشترین تعداد باکتری (در حدود 1012 باکتری در هر گرم خاک) در میکروکازم 4 درصد در هفته هشتم مشاهده شد.

 

شکل 3- تعداد کل باکتری‌های کشت‌پذیر در هر میکروکازم طی تجزیه گازوئیل در شش ماه (C: شاهد)

 

تکثیر ژن 16S rRNA با استفاده از پرایمرهای DGGE:DNA محیطی که از طریق کیت Soil DNA Extraction kit شرکت MN استخراج شده بود به‌عنوان الگوی PCR با استفاده از پرایمرهای ویژه DGGE (Bac-F و 518R) استفاده شد. درستی انجام واکنش زنجیره پلیمراز با مشاهده قطعه مدنظر به طول 358 جفت باز با الکتروفورز افقی تأیید شد (شکل 4).

  

شکل 4- تعیین دمای مناسب برای اتصال پرایمرها و تکثیر ژن 16S rRNA در واکنش PCR

 

الکتروفورز با شیب ماده واسرشت‌کننده:محصولات واکنش PCR حاصل از DNA سه میکروکازم که هر دو ماه یک بار نمونه‌برداری شده بودند، برای انجام DGGE استفاده شدند. از غلظت‌های مختلف 30 تا 70، 40 تا60، 30 تا 60 و 25 تا 65 شیب مواد دناتوره کننده برای بهینه‌سازی تفکیک باندها در روش DGGE استفاده و در نهایت شیب غلظت 25 تا 65 درصد که بهترین تفکیک باندها در آن مشاهده شد به‌عنوان غلظت‌های بهینه انتخاب شد. مقایسه شدت و محل قرارگیری باندها در ژل DGGE نشان داد که بین دو میکروکازم حاوی گازوئیل اختلاف درخور توجهی از نظر تنوع گونه‌های باسیلوس طی ماه‌های مختلف وجود ندارد.

 

شکل5- مقایسه تغییرات تنوع گونه‌های جنس باسیلوس در ژل DGGE در میکروکازم‌های شاهد (K)، 2 درصد گازوییل (2%) و 4 درصد گازوییل (4%) در زمان‌های مختلف

 

بحث و نتیجه‌گیری

پاکسازی زیستی، روشی کارآمد و اقتصادی و جایگزین مناسب روش‌های فیزیکی و شیمیایی است (19). تجزیه زیستی مواد نفتی و دیگر هیدروکربن‌ها در محیط، فرآیند پیچیده‌ای است که از جنبه‌های مختلف به عوامل فیزیکوشیمیایی محیط، مقدار نفت یا نوع هیدروکربن‌های موجود در محیط و تعداد و ساختار جمیعت بومی میکروبی وابسته است (20). در حال حاضر، بیشتر میکروب‌های موجود در نمونه‌های محیطی، در آزمایشگاه کشت‌پذیر نیستند و از این رو، به روش‌های مولکولی و مستقل از کشت برای مطالعه تنوع میکروبی توجه روزافزون شده است. روش DGGE، یکی از روش‌های مستقل از کشت است که امکان مطالعه حضور و فراوانی نسبی جمعیت‌های مختلف میکروبی را در محیط از طریق نشانگرهای ژنتیکی مانند ژن 16S rRNA میسر می‌کند (21).

اعضای جنس باسیلوس، باکتری‌های میله‌ای گرم مثبت، اغلب متحرک و از نظر توان متابولیسمی بسیار متنوع هستند و در فرآیندهای صنعتی مختلف و متنوعی استفاده می‌شوند. به علت تنوع مسیرهای متابولیکی گونه‌های باسیلوس، به‌طور گسترده‌ای در پاکسازی آلاینده‌های زیست‌محیطی استفاده می‌شوند. در مطالعه داس و موکرجی، از Bacillus subtilis برای پاکسازی خاک آلوده به ترکیبات نفتی استفاده و نشان داده شد که این باکتری با تولید بیوسورفکتانت سبب افزایش سرعت پاکسازی آلاینده نفتی می‌شود (22).

راجو[xv] و همکاران، از دو گونه باسیلوس
 B. thuringiensis B3 و B. cereus برای تجزیه زیستی گازوئیل، نفت خام و روغن مصرف‌شده اتومبیل استفاده کردند؛ آنها نشان دادند که مخلوط این دو سویه به‌ترتیب 84 و 24 درصد TPH را از خاک آلوده به نفت خام و روغن مصرف‌شده طی 30 روز خذف می‌کند (23).

با وجود اهمیت گونه‌های جنس باسیلوس در حذف آلاینده‌های زیست‌محیطی و پاکسازی زیستی که به برخی از آنها اشاره شد، تاکنون مطالعه جامعی درباره تغییرات جمعیت آنها طی پاکسازی زیستی خاک‌های آلوده به ترکیبات نفتی انجام نشده است. برای نخستین بار در پژوهش حاضر، تغییرات تنوع گونه‌های جنس باسیلوس طی حذف زیستی گازوئیل از خاک آلوده مطالعه شد. این مطالعه، اهمیت گونه‌های کشت‌پذیر و کشت‌ناپذیر جنس باسیلوس در حذف آلاینده‌های خاک و کمک به پایداری اکوسیستم‎های طبیعی را نشان می‌دهد.

مطابق شکل 1، سرعت تجزیه ترکیبات هیدروکربنی در میکروکازم 2 درصد نسبت به میکروکازم 4 درصد بیشتر است و این نشان می‌دهد که غلظت بهینه آلاینده گازوئیل در خاک مطالعه‌شده حدود 2 درصد است و افزایش غلظت آلاینده به علت عواملی مانند سمیت ترکیبات نفتی برای باکتری‌ها یا کاهش دسترسی آنها به مواد مغذی، سبب کاهش سرعت تجزیه آلاینده شده است. در پژوهش محسن‌زاده و احمدی[xvi] در زمینه پتانسیل پاکسازی میکروبی خاک‌های آلوده به گازوئیل در شهر همدان نیز نتایج مشابهی یافت و بیشترین میزان حذف گازوئیل در غلظت 5/0 درصد مشاهده شد (24).

مطابق شکل 1، در ابتدای فرآیند تجزیه زیستی، سرعت حذف گازوئیل در هر دو میکروکازم سریع‌تر است و به‌تدریج با کاهش غلظت آلاینده پس از هفته دهم در هر دو میکروکازم کندتر می‌شود، هرچند کاهش سرعت تجزیه در میکروکازم حاوی 2 درصد گازوییل مشهودتر است. بررسی میزان هیدروکربن‌های باقیمانده در میکروکازم‌های 2 و 4 درصد با نمونه گازوئیل اولیه با روش کروماتوگرافی گازی (شکل 2) نیز نتایج روش اندازه‌گیری وزنی TPH را تأیید می‌کند. همچنین این شکل نشان می‌دهد که با وجود تفاوت چشمگیر میزان تجزیه هیدروکربن‌ها بین دو میکروکازم بررسی‌شده، بخش‌های مختلف برش گازوئیل در هر دو میکروکازم به‌شکل یکسان تجزیه شده‌اند و تمایل ویژه‌ای برای مصرف هیدروکربن‌های کوتاه یا بلندزنجیره در هیچ‌یک از میکروکازم‌ها مشاهده نمی‌شود.

روند تجزیه زیستی مشاهده‌شده در پژوهش حاضر با نتایج بررسی تاکواری[xvii] و همکاران مشابه است. در مطالعه‌ای که تاکواری و همکاران در سال 2012انجام دادند، تجزیه زیستی گازوئیل در میکروکازم از راه تحریک زیستی و تلقیح زیستی بررسی شد و نتایج نشان دادند که میزان TPH تمام نمونه‌ها طی مدت پژوهش تا حدی کاهش یافته است. در میکروکازمی که از کمپوست برای تحریک زیستی استفاده شد، کاهش سریع TPH در 10 روز اول مشاهده شد و پس از آن، سرعت تجزیه زیستی تا روز 60 به‌تدریج کاهش یافت. با تکمیل‌شدن فرآیند پاکسازی طی 120 روز، حدود 6/87 درصد ترکیبات نفتی تجزیه شدند (25). در پژوهش حاضر، میزان حذف ترکیبات نفتی در بهترین حالت 50 درصد بود که در میکروکازم حاوی 2 درصد گازوییل مشاهده شد و در مقایسه با نتایج Taccari و همکاران، کمتر است. به نظر می‌رسد که میزان زیاد ترکیبات هوموس موجود در کمپوست عالی سبب جداشدن بهتر ترکیبات آب‌گریز از ذره‌های خاک و افزایش سرعت حذف TPH می‌شوند (26).

مطابق شکل 3، رشد باکتری‌ها طی دو هفته اول و پس از افزودن آب، نیترات، فسفات و هیدروکربن‌ها در تمام میکروکازم‌ها افزایش یافته و جمعیت باکتری‌های هتروتروف به هزار برابر مقدار اولیه خود رسیده است. پس از هفته دهم و هم‌زمان با مصرف بخش عمده‌ای از ترکیبات در دسترس موجود در گازوئیل، تعداد باکتری‌ها در هر دو میکروکازم 2 و 4 درصد افت کرد و پس از آن، در مقدار به‌نسبت ثابت حدود 109 باکتری در هر گرم از خاک باقی ماند. مقایسه شکل‌های 1 و 3 نشان می‌دهد که روند افزایش تعداد کل باکتری‌های هتروتروف و بیشترین تعداد باکتری‌ها با سرعت تجزیه گازوئیل کاملاً منطبق است و با کاهش تعداد باکتری‌ها در هفته دهم، سرعت تجزیه زیستی نیز کاهش می‌یابد. این نتایج با داده‌های پژوهش واکوئز[xviii] و همکاران هم‌خوانی دارد؛ در پژوهش یادشده نیز پس از افزودن آب و منابع نیتروژن و فسفات به میکروکازم حاوی خاک و گازوئیل، جمعیت میکروبی بی‌درنگ به میزان ده تا صد برابر افزایش یافت و نتیجه‌گیری شد که چون روند افزایش در تمام میکروکازم‌ها (ازجمله میکروکازم شاهد) یکسان بوده، احتمالاً افزایش تعداد باکتری‌های کشت‌پذیر ناشی از تحریک زیستی و هوادهی خاک بوده است (27).

در مطالعه شبیر[xix] و همکاران، بیشترین تعداد باکتری‌ها در میکروکازم خاک آلوده به نفت سفید، دو تا سه هفته پس از گرمخانه‌گذاری شمارش و با بیشترین سرعت حذف آلاینده هم‌زمان بود (28).

الگوی باندها در ژل DGGE، تخمین خوبی از تنوع گونه‌های باکتریایی موجود در محیط است و اگرچه این فرض محدودیت‌هایی دارد، در پژوهش‌های متعددی برای بررسی تنوع باکتریایی استفاده شده است؛ ازجمله این محدودیت‌ها عبارتند از: خطای ناشی از استخراج DNA، تکثیرنشدن نشانگرهای ژنی مربوط به گونه‌های ناشناس و تشکیل کایمرا طی PCR کشت‌های مخلوط. با وجود این، محل قرارگیری باندها و فراوانی و دانسیته باندها به‌عنوان شاخصی از تنوع میکروبی استفاده می‌شود (29).

در پژوهش حاضر، از پرایمرهای اختصاصی جنس باسیلوس و روش DGGE برای بررسی تنوع گونه‌های باسیلوس در خاک استفاده شد. مطابق شکل 5، با گذشت زمان و هم‌زمان با اضافه‌شدن گازوئیل و منابع غذایی در میکروکازم‌های حاوی گازوئیل، تنوع باندها کاهش یافت و میکروکازم 4 درصد در نقطه 4 (هفته هشتم) بیشترین تنوع باند را داشت که با میزان گازوئیل و میزان شمارش باکتری‌ها در این میکروکازم متناسب بود. از هفته هشتم به بعد و هم‌زمان با کاهش میزان گازوئیل و کاهش تعداد باکتری‌ها، تنوع باندهای حاصل از تکثیر ژن 16S rRNA گونه‌های باسیلوس نیز کاهش یافت. در میکروکازم شاهد، رشد باکتری‌ها پس از اضافه‌کردن آب افزایش و تعداد باکتری‌ها پس از کاهش منابع غذایی در محیط کاهش یافت و این کاهش با کاهش تنوع باندها در ژل DGGE متناسب بود. بیشترین تعداد باکتری (CFU/g 1011× 2) در میکروکازم 2 درصد و در هفته هشتم شمارش شد و به مرور با کاهش گازوئیل، تعداد باکتری‌ها نیز کمتر شد و این کاهش با کاهش تنوع باندها روی ژل DGGE هم‌زمان بود.

مقایسه تنوع باندهای DGGE بین سه میکروکازم بررسی‌شده نشان می‌دهد که با وارد‌شدن آلاینده به خاک، تنوع باسیلوس‌ها افزایش می‌یابد که نقش باسیلوس‌ها در تجزیه گازوئیل را نشان می‌دهد، به‌طوری که تنوع باندها در میکروکازم 2 درصد بیشتر از میکروکازم شاهد و در میکروکازم 4 درصد بیش از میکروکازم 2 درصد است. به احتمال بسیار، این الگوی باندها نشان می‌دهد که با ورود آلاینده به‌عنوان منبع کربن، تنوع گونه‌های باسیلوس در ابتدای فرآیند تجزیه افزایش و در ادامه  با حذف ترکیب هیدروکربنی به‌تدریج کاهش می‌یابد که شاید نشان‌دهنده بازگشت ترکیب جمعیت به شرایط پیش از حضور آلاینده است.

مطالعه تنوع میکروبی هم‌زمان با تجزیه زیستی در گزارش‌های متعددی استفاده و نتایج جالب توجهی از آن حاصل شده است. سی[xx] و همکاران، تنوع میکروبی را در میکروکازم‌هایی که با هیدروکربن‌های آروماتیک آغشته شده بودند، مطالعه و مشاهده کردند که تنوع جمعیت میکروبی هم‌زمان با ورود هیدروکربن‌ها کاهش می‌یابد (30).ویناس[xxi] و همکاران به نتایج کاملاً متضادی در مطالعه دیگری رسیدند؛ در بررسی آنها مشخص شد که در خاک آلوده به creosote طی فازهای مختلف تجزیه هیدروکربن‌ها، گروه‌های مختلفی از باکتری‌ها در خاک فعال می‌شوند (31).

نتایج مطالعه حاضر نشان دادند که 50 و 44/44 درصد گازوئیل به‌ترتیب در میکروکازمی با 2 و 4 درصد گازوئیل طی دوره شش‌ماهه تجزیه شد. بنابراین، میزان آلودگی هیدروکربنی در کارآیی پاکسازی زیستی مؤثر است. بیشترین تعداد باکتری‌ها در میکروکازم‌های حاوی گازوئیل هم‌زمان با افزایش سرعت تجزیه زیستی شمارش شدند و در هر دو میکروکازم، حضور بیشترین تعداد باکتری‌ها با بیشترین سرعت حذف آلاینده هم‌زمان بود. بنابراین، نتیجه‌گیری می‌شود که شمارش جمعیت میکروبی شاخص مناسبی برای پایش فعالیت تجزیه زیستی آلاینده نفتی در خاک است و با توجه به تغییرات تنوع باندهای DGGE، نتایج پژوهش حاضر نشان دادند که گونه‌های باسیلوس نقش مؤثری در پاکسازی آلودگی خاک در خاک‌های آلوده به گازوئیل دارند.

تشکر و قدردانی

پژوهش حاضر با حمایت مادی و معنوی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج انجام شده است. نویسندگان از حمایت‌های ارزنده کارشناسان محترم آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد کرج به‌ویژه سرکار خانم اسدی سپاسگزاری می‌کنند.



[1]- Bioremediation

[2]- Bioaugmentation

[3]- Biostimulation

[4]- Hamamura

[5]- Abed

[6]- Mesdaghinia AR.

[7]- Nwaogu

[8]- Khan

[9]- Weathering

[10]- Total petroleum hydrocarbon

[11]- Gas chromatography

[12]- Flame Ionization Detector

[xiii]- Denaturing Gradiaent Gel Electrophoresis

[xiv]- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCC

CGCCGCCC CCGCCCGG GAAACCGGGGC

[xv]- Raju

[xvi]- Mohsenzadeh F., Ahmadi NA.

[xvii]- Taccari

[xviii]- Vázquez

[xix]- Shabir

[xx]- Sei

[xxi]- Vinas

(1)              Abd–Elsalam HE., Hafez EE., Hussain AA., Ali AG., El-Hanafy AA. Isolation and identification of three rings poly aromatic hydrocarbons (anthracene and phenantherene) degrading bacteria. American-Eurasian Journal of Agricultural & Environmental Sciences 2009; 5(1): 31-38.
(2)              Haritash AK., Kaushik CP. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Journal of Hazardous Materials 2009; 169: 1-15.
(3)              Abdulsalam S., Bugaje IM., Adefila SS., Ibrahim S. Comparison of biostimulation and bioaugmentation for remediation of soil contaminated with spent motor oil. International Journal Environment Science Technology 2011; 8(1): 187-194.
(4)              Paul D., Pandey G., Pandey J., Jain RK. Accessing microbial diversity for bioremediation and environmental restoration. Trends in Biotechnology 2005; 23(3): 135-142.
(5)              Onifadeh AK., Abubakr FA. Characterization of hydrocarbon-degrading microorganisms isolated from crude oil contaminated soil and remediation of the soil by enhanced natural attenuation. Research Journal of Microbiology 2007; 2(2): 149-155.
(6)              Caldini G., Cenci G., Manenti R., Morozzi G. The ability of an environmental isolate of Psedomonas fluorescens to utilize chrysene and other four- ring polynuclear aromatic hydrocarbons. Applied Microbiology and Biotechnology 1995; 44(1-2): 225-229.
(7)              Hamamura N., Ward DM., Inskeep WP. Effects of petroleum mixture types on soil bacterial population dynamics associated with the biodegradation of hydrocarbons in soil environments. FEMS Microbiology Ecology 2013; 85(1): 168-178.
(8)               Abed RM., Al-Kindi S., Al-Kharusi S. Diversity of bacterial communities along a petroleum contamination gradient in desert soils. Microbial Ecology 2015; 69(1): 95-105.
(9)              Mesdaghinia AR., Nasseri S., Arbabi M., Rezaie S. Isolation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria associated with the petroleum contaminated soils in Iran Proceedings of the 9th international conference on Environmental Science and Technology, Rhodes Island, Greece 2005; 984-991.
(10)          Slepecky RA., Hemphill HE. The genus Bacillus-nonmedical In: The prokaryotes. Rosenberg, E: Springer Verlag; 2006: 530-562.
(11)          Speight JG., Arjoon KK. Bioremediation of petroleum and petroleum products. New York: John Wiley & Sons; 2012.
(12)          Nwaogu LA., Onyeze GOC., Nwabueze RN. Degradation of diesel oil in a polluted soil using Bacillus subtilis. African Journal of Biotechnology 2008; 7(12): 1939-1943.
(13)          Khan K., Naeem M., Arshed MJ., Asif M. Extraction and characterization of oil degrading bacteria. Journal of Applied Sciences 2006; 6: 2302-2306.
(14)          Schwab AP., Su J., Wetzel PS., Banks MK. Extraction of petroleum hydrocarbons from soil by mechanical shaking. Environmental Science & Technology 1999; 33(11): 1940-1945.
(15)          Sambrook J. Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring laboratory Press; 2001.
(16)          Garbeva P., Van Veen JA., Van Elsas JD. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes via PCR-DGGE. Micobial Ecology 2003; 45(3): 302-316.
(17)          Moreno C., Romero J., Espejo RT. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio. Microbiology 2002; 148(4):1233-1239.
(18)          Fischer MM., Lerman LS. Length-independent separation of DNA restriction fragments in two dismensional gel electrophoresis. Cell 1979; 16(1): 191-200.
(19)          Zhang Z., Hou Z., Yang C., Ma C., Tao F., Xu P. Degradation of n-alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons in petroleum by a newly isolated Pseudomonas aeruginosa DQ8. Bioresource Technology 2011; 102(5): 4111-4116.
(20)          Leahy JG., Colwell RR. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiological Reviews 1990; 54(3): 305-315.
(21)          Vinas M., Sabate J., Espuny MJ., Solanas AM. Bacterial community dynamics and polycyclic aromatic hydrocarbon degradation during bioremediation of heavy creosotecont animated soil. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71(11): 7008-7018.
(22)          Das K., Mukherjee AK. Crude petroleum-oil biodegradation efficiency of Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil contaminated soil from North-East India. Bioresource Technology 2006; 98(7): 1339- 1345.
(23)          Raju MN., Leo R., Herminia SS., Morán REB., Venkateswarlu K., Laura S. Biodegradation of Diesel, Crude Oil and Spent Lubricating Oil by Soil Isolates of Bacillus spp. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 2017; 1-8.
(24)          Mohsenzadeh F., Ahmadi NA. Study on potential microbial removal of disel oil from contaminated soil in Hamedan city. Biological Journal of Microorganisms 2012; 1(2) 77-86.
(25)          Taccari M., Milanovic V., Comitini F., Casucci C., Ciani M. Effects of biostimulation and bioaugmentation on diesel removal and bacterial community. International Biodeterioration & Biodegradation 2012; 66(1): 39-46.
(26)          Namkoong W., Hwang EY., Park JS., Choi JY. Bioremediation of dieselcontaminated soil with composting. Environmental Pollution 2002; 119(1): 23-31.
(27)          Vázquez S., Balbina Nogales L., Ruberto E., Hernández J., Christie-Oleza A., Lo Balbo Rafael B., et al. Bacterial community dynamics during bioremediation of diesel oil-contaminated Antarctic soil. Microbial Ecology 2009; 57(4): 598-610.
(28)          Shabir G., Afzal M., Anwar F., Tahseen R., Khalid ZM. Biodegradation of kerosene in soil by a mixed bacterial culture under different nutrient conditions. International Biodeterioraion & Biodegradation 2008; 61(2): 161-166.
(29)          Stamper DM., Walch M., Jacobs RN. Bacterial population changes in a membrane bioreactor for graywater treatment monitored by denaturing gradient gel electrophoretic analysis of 16S rRNA gene fragments. Applied and Environmental Microbiology 2003; 69(2): 852-860.
(30)          Sei K., Inoue D., Wada K., Mori K., Ike M., Kohno T., Fujita M. Monitoring behaviour of catabolic genes and change of microbial community structures in seawater microcosms during aromatic compound degradation. Water Research 2004; 38(20): 4405-4414.
(31)          Vinas M., Sabaté J., Espuny MJ., Solanas AM. Bacterial community dynamics and polycyclic aromatic hydrocarbon degradation during bioremediation of heavily creosote-contaminated soil. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71(11): 7008-7018.