نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد اصلاح نباتات، دانشگاه خلیج فارس، بوشهر، ایران
2 استادیار بیماریشناسی گیاهی، دانشگاه خلیج فارس، بوشهر، ایران
3 استادیار ژنتیک و اصلاح نباتات، دانشگاه خلیج فارس، بوشهر، ایران
4 استادیار اصلاح نباتات، دانشگاه خلیج فارس، بوشهر، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) are a group of plant rhizosphere inhabitants bacteria which stimulate plant growth and increase host tolerance to environmental stresses using several mechanisms. Fluorescent pseudomonads are considered as the most important plant growth promoting rhizobacteria. The aim of this study is screening Pseudomonas fluorescens strains isolated from barley rhizosphere in Bushehr province for growth stimulating properties and tolerace to salt stre.
Materials and methods: 25 P. fluorscens strains were evaluated for growth stimulating properties including siderophore, indole-3-acetic acid (IAA) and hydrogen cyanide (HCN) production, inorganic phosphate solubilization and the ability to tolerate salinity levels (0, 200, 400 and 600 mM of sodium chloride) under in vitro conditions.
Results: The results revealed that among the 25 strains studied, all were siderophore-producers (1.34-8.48 µM/ml) and 88% were able to produce HCN. The ability to solubilize mineral phosphate was observed in 88% of strains. Superior strains with PGP traits (B2-10, B4-6, B10, P68 and CHA0) were able to produce IAA (1.78-2.29 mg/ml). All strains were able to tolerate NaCl concentrations of 200-600 mM, however, their colony diameter decreased with increase in salinity levels.
Discussion and conclusion: The current study showed that some P. fluorescens strains isolated from barley rhizosphere like B2-10, B4-6, B2-11 and B10, had plant growth-promoting characteristics and salt tolerance ability, so it can be concluded that these strains have the potential to be applied as useful microorganisms in bifertilizers to enhance plant growth under salt stress conditions.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
ریزوباکتریهای محرک رشد گیاه[1] (PGPR) ساکن در ناحیه فراریشه[2] گیاهان میزبان، گروه متنوعی از ریزموجودات هستند که با مکانیسمهای متعددی بر رشد گیاه تأثیر میگذارند (1). PGPR با افزایش انحلال عناصر غذایی نظیر فسفر، تولید تنظیمکنندههای رشد گیاهی مانند اکسین، تثبیت نیتروژن و تولید سیدروفور بهطور مستقیم در افزایش رشد گیاهان نقش ایفا میکنند (2). همچنین، این باکتریها با مکانیسمهایی نظیر رقابت برای جذب مواد غذایی و اشغال جایگاههای مناسب برای فعالیت عوامل بیماریزا، تولید انواع آنتیبیوتیکها، آنزیمهای تجزیهکننده دیواره سلولی و نیز تولید سیانیدهیدروژن، بیمارگرهای گیاهی را کنترل میکنند و بهطور غیرمستقیم موجب افزایش رشد گیاه میزبان میشوند (3). در میان باکتریهای محرک رشد ساکن فراریشه، گونههای مختلف Pseudomonas fluorescens به دلیل داشتن مکانیسمهای متعدد برای تحریک رشد گیاه و مهار بیمارگرهای گیاهی اهمیت بسیار زیادی دارند (3).
ریزموجودات مختلف خاک، سیدروفورها را تولید میکنند و جنس Pseudomonas ازجمله مهمترین تولیدکنندگان سیدروفور است (4). در شرایط کمبود آهن، باکتریهای ساکن فراریشه با تولید سیدروفور، آهن موجود در ریزوسفر را جذب میکنند. تولید سیدروفور علاوه بر تأمین آهن و اثر غیرمستقیم بر رشد گیاه، موجب کاهش دسترسی عوامل بیماریزای گیاهی به آهن و مهار رشد آنها میشود (5).
فسفر از جمله عناصر ضروری برای رشد گیاهان است و نامحلولبودن بخش بزرگی از فسفر خاک، دسترسی به آن را برای گیاهان مشکل میکند. ریزوباکتریهای حلکننده فسفات قادرند فسفر آلی و معدنی را از طریق ترشح اسیدهای آلی نظیر گلوکونیکاسید و اگزالیکاسید و آنزیمهای حلکننده فسفات نظیر فسفاتاز، فسفوناتاز و فیتاز حل کنند و سبب افزایش رشد و عملکرد گیاهان شوند (6). همچنین، ریزوباکتریها قادرند با بیوسنتز هورمون اکسین، مورفولوژی ریشه را تغییر دهند و موجب افزایش رشد و عملکرد گیاهان شوند (7).
سیانیدهیدروژن[3] (HCN)یکی دیگر از متابولیتهای ثانویه است که برخی باکتریهای محرک رشد ازجمله سودوموناسهای فلورسنت آن را تولید میکنند (8). HCN مادهای سمی برای قارچهای بیمارگر گیاهی است و از سوی دیگر، باکتریهای تولیدکننده HCN بر متابولیسم گیاه تاثیر میگذارند و موجب افزایش تشکیل ریشههای مویین میشوند (9).
شوری زیاد خاک ازجمله عوامل محدودکننده تولید محصولات کشورزی در سراسر جهان بهویژه مناطق خشک است (10). تلقیح گیاهان با انواع باکتریهای مفید ازجمله سودوموناسهای فلورسنت از اقدامات مهم برای مقابله با شوری است که آثار نامطلوب تنش بر رشد گیاه را کاهش میدهد (11). باکتری پس از کلنیزهکردن ناحیه فراریشه گیاه، HCN، سیدروفورها، آمینوسیکلوپروپان-1-کربوکسیلات (ACC)دآمیناز و هورمونهای گیاهی را تولید میکند و با تولید این متابولیتها، موجب کاهش آثار منفی تنشهای محیطی و افزایش رشد و عملکرد گیاه میشود (3 و 11).
نظر به آثار مفید باکتریهای محرک رشد بر افزایش رشد گیاهان و نیز تحمل تنشهای غیرزنده، هدف پژوهش حاضر غربالگری سویههای P. fluorescens از نظر ویژگیهای محرک رشدی گیاه و تعیین میزان تحمل این باکتریها به تنش شوری در شرایط آزمایشگاه است.
مواد و روشها.
سویههای باکتریایی: تعداد 24 سویه P. fluorescens که از فراریشه گیاهان جو در مزارع مختلف استان بوشهر جداسازی شده بودند، از آزمایشگاه کنترل بیولوژیک بیماریهای گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه خلیج فارس بوشهر تهیه شدند. سویه CHA0 که دارای صفات تحریککنندگی رشد گیاه است، از آزمایشگاه کنترل بیولوژیک بیماریهای گیاهی دانشگاه ETH زوریخ، سوئیس دریافت و در آزمایشها بهعنوان استاندارد استفاده شد.
نگهداری سویههای سودوموناس فلورسنت: برای نگهداری طولانیمدت سویههای Pseudomonas fluorescens، ابتدا پرگنه رشدیافته باکتری بر محیط کینگ ب آگار[4] (KB) (12) با استفاده از سوزن کشت به 10 میلیلیتر محیط کینگ ب براث سترون در شیشههای مک کارتنی منتقل و 16 ساعت در دمای 27 درجه سلسیوس روی دستگاه شیکرانکوباتور (مدل BINDER ساخت شرکت Service Hotlirce ,USA) با تکان 160 دور در دقیقه[5] قرار داده شد. باکتری رشدیافته در محیطکشت به نسبت مساوی با گلیسرول 87 درصد استریل مخلوط و دو ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. در نهایت 100 میکرولیتر از مخلوط به لولههای اپندورف سترون منتقل و در فریزر منفی 80 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
.اندازهگیری توان حلکنندگی فسفات معدنی: آزمون حلکنندگی فسفات معدنی تمام سویهها روی محیط کشت اسپربر[6] جامد (10 گرم گلوکز، 5/0 گرم عصاره مخمر، 1/0 گرم کلریدکلسیم، 5/2 گرم تری فسفات کلسیم، 25/0 گرم سولفاتمنیزیم، 15گرم آگار در 1000میلیلیتر آب مقطر) انجام شد. باکتریها روی تشتکهای پتری حاوی محیطکشت اسپربر بهشکل لکهای کشت داده شدند و پتریها به مدت 7 روز در دمای 27 درجه سلسیوس درون انکوباتور نگهداری شدند. هاله شفاف اطراف پرگنه باکتریها بهعنوان فعالیت مثبت باکتری در حل فسفات معدنی محسوب و قطر هاله پس از یک هفته اندازهگیری شد. این آزمون در سه تکرار برای هر سویه باکتری انجام شد (13).
توانایی تولید سیدروفور نوع پایووردین: از روش اسپکترومتری برای اندازهگیری میزان تولید سیدروفور پایووردین[7] استفاده شد؛ به این شکل که مقدار 100 میکرولیتر از کشت 16 ساعته باکتریها در محیط سوکسینات (3 گرم فسفاتدیهیدروژنکلسیم، 6 گرم فسفاتهیدروژندیپتاسیم، 4 گرم سوکسینیکاسید، 1 گرم سولفاتآمونیوم، 2/0 گرم سولفاتمنیزیم آبدار و اسیدیته 7) به ارلنهای 100 میلیلیتری حاوی 40 میلیلیتر محیطکشت تازه سوکسینات منتقل شد. محیطها 40 ساعت در دمای 27 درجه سلسیوس و درون دستگاه شیکر انکوباتور با دور 120 دور در دقیقه نگهداری شدند. سلولهای باکتری با سانتریفیوژکردن در g10000 به مدت 10 دقیقه رسوب داده شدند. پس از حذف رسوب باکتری، میزان جذب مایع رویی در طول موج 400 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/VIS2100 ساخت شرکت Unico) اندازهگیری شد (14). در نهایت، دادهها با رابطه A=eBC به مول در لیتر تبدیل شدند؛ =A میزان جذب، =ε ضریب جذب مولی، =B قطر کوت و =C غلظت ماده (بر حسب میکرومول در میلیلیتر)
تولید سیانید هیدروژن (HCN): این آزمون بر اساس روش آلستروم و برنز[8] (15) انجام شد. برای بررسی تولید سیانیدهیدروژن، ابتدا 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری (کشت 16 ساعته) رشدیافته در محیط لوریا برتانی براث[9] (LB) شامل 10 گرم باکتوتریپتون، 5 گرم عصاره مخمر، 5 گرم کلریدسدیم و 1000 میلیلیتر آب مقطر در هر تشتک حاوی محیط NA پخش شد. کاغذ صافی آغشته به معرف (شامل 02/0 گرم کربناتسدیم و 05/0 گرم پیکریکاسید) در قسمت درب پتری قرار گرفت و درب پتری با نوار پارافیلم مسدود شد تا از خروج هر گونه متابولیت گازی ازجمله سیانیدهیدروژن HCN جلوگیری شود. پتریها یک هفته به حالت واژگون در دمای 27 درجه سلسیوس درون انکوباتور نگهداری شدند. چنانچه باکتری رشدیافته روی سطح محیطکشت، HCN تولید کند، تغییر رنگ کاغذ صافی آغشته به محلول معرف از رنگ اولیه زرد به کرم، قهوهای روشن، قهوهای تیره تا آجریرنگ دیده میشود که نشانه تفاوت در میزان HCN تولیدی است. رنگ کرم، کمترین مقدار تولید HCN (ارزش صفر) و رنگ آجری، بیشترین تولید HCN (ارزش 3) را نشان میدهد. برای هر باکتری سه تکرار در نظر گرفته شد (15).
.بررسی سودوموناسهای فلورسنت از نظر مقاومت به غلظتهای مختلف شوری در شرایط آزمایشگاه: . سنجش مقاومت به شوری سویههای سودوموناس به روش سرچشمهپور و همکاران (16) انجام شد. برای بررسی میزان تحمل سویهها به شوری، از محیطکشت NA با غلظتهای متفاوت (صفر، 200، 400 و 600 میلیمولار) کلریدسدیم استفاده شد. به این منظور، ابتدا محیطهای کشت حاوی نمک در شرایط سترون در ظرف پتری توزیع و سپس هر ظرف پتری به 9 قسمت مساوی تقسیم و کشت تازه هر سویه با روش قطرهگذاری به آنها تلقیح شد. کشت سویهها به شکلی بود که درون هر ظرف پتری، 9 سویه مختلف قرار گرفت و برای هر سویه 3 تکرار در 3 ظرف پتری در نظر گرفته شد. ظروف پتری درون انکوباتور با دمای 28 درجه سلسیوس نگهداری و تغییر قطر، حالت و ظاهر پرگنهها پس از 24 و همچنین برای مطالعه دقیقتر رفتار و واکنش باکتری، پس از 120 ساعت بررسی و مقایسه شدند. سرعت نسبی رشد با مشاهده کیفی پرگنه سویهها و مقایسه میزان افزایش قطر پرگنه هر سویه در سطوح مختلف شوری و همچنین مقایسه با دیگر سویهها بهترتیب با درجهها و اعداد بسیار ضعیف 1، ضعیف 2، بهنسبت ضعیف 3، بهنسبت متوسط 4، متوسط 5، بهنسبت شدید 6، شدید 7 و بسیار شدید 8 ثبت شد (16).
.توانایی تولید ایندولاستیکاسید (IAA) بهشکل نیمهکمی: سنجش نیمهکمی توانایی تولید IAA در پنج سویه که از نظر ویژگیهای تحریککنندگی رشد گیاه نسبت به سایر سویهها برتری داشتند، بر اساس روش پیشنهادی بریک و همکاران[10] انجام شد (17). در این روش، از ظروف پلیت یکبار مصرف استریل 9 سانتیمتری استفاده و هر پلیت با رسم خطوط مناسب در زیر آن به 9 مربع کوچک با ابعاد 2×2 سانتیمتر تقسیم شد. درون هر ظرف پلیت، 25 میلیلیتر محیطکشت سترون LB-آگاری ریخته شد که به آن معادل 5 میلیمولار ( g/l2115/1) ماده ال-تریپتوفان افزوده شده بود (LBT). سپس با چوبهای خلال استریلشده، نقطه مرکزی سطح محیطکشت هر یک از مربعها با هر سویه مایهزنی و یک برگ غشای نیتروسلولزی روی محیطکشت LB مایهزنیشده قرار داده شد. پلیتها واژگون به مدت 1 تا 2 روز درون انکوباتور با دمای 27 درجه سلسیوس نگهداری و روزانه از نظر رشد باکتری بررسی شدند. زمانی که قطر پرگنههای ظاهرشده روی LB به حدود 2 میلیمتر رسید، برگهای غشای نیتروسلولزی حاوی پرگنه باکتریها درون ظروف پلیت دیگر حاوی یک برگ کاغذ صافی واتمن شماره 2 اشباعشده با 5/2 میلیلیتر محلول معرف سالکوفسکی قرار داده شدند (17). برای تهیه محلول سالکوفسکی، مقدار 6/98 میلیلیتر از پرکلریکاسید (71 درصد) با 4 میلیلیتر محلول 5/0 مولار کلرورآهن درون بالن ژوژه 200 میلیلیتری مخلوط و با آب مقطر به حجم نهایی 200 میلیلیتر رسانده شد. برگهای غشای نیتروسلولزی به مدت 5/0 تا 2 ساعت با محلول سالکوفسکی تیمار شدند و در طول این زمان، اطراف پرگنههای باکتریهایی که توان تولید IAA را داشتند، هاله قرمزرنگی تشکیل شد که رنگ و اندازه هالهها بسته به مقدار IAA تولیدی سویهها متفاوت بود. در این زمان، قطر هاله (HD) و قطر پرگنه (CD) اندازهگیری و متوسط نسبت قطر هاله به قطر پرگنه (HD/CD) برای هر سویه محاسبه شد و مبنای درجهبندی نیمهکمی توان تولید IAA قرار گرفت (17).
آزمون کمی تولید IAA: سویهها در محیط LBT فاقد آگار، به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس روی شیکر دورانی با چرخش معادل 90 دور در دقیقه رشد داده شدند. سپس مقدار 3 میلیلیتر از سوسپانسیون باکتری برداشته شد و پس از سانتریفیوژکردن آن در rpm 5000 به مدت 25 دقیقه، محلول صاف رویی هر سوسپانسیون جدا شد. عصاره صافشده هر سوسپانسیون باکتری با محلول سالکوفسکی به نسبت 2 به 1 ترکیب و پس از 20 دقیقه نگهداری در اتاق، میزان جذب نور با اسپکتوفتومتر در 535 نانومتر خوانده شد. میزان تولید اکسین سویهها در مقایسه با منحنی استاندارد حاصل از مقدار جذب نور غلظتهای صفر، 5، 10، 15 و 20 میکروگرم در میلیلیتر ایندولاستیکاسید محاسبه شد (18 و 19).
تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه واریانس دادهها با نرمافزار SAS نسخه 1/9 انجام شد. سپس میانگینها به روش آزمون چنددامنهای دانکن مقایسه و نمودارها با نرمافزار EXCEL 2007 رسم شدند.
نتایج.
در پژوهش حاضر، تولید HCN، سیدروفور، انحلال فسفات معدنی و تحمل به شوری 25 سویه باکتری P. fluorescens جداسازی شده از فراریشه جو انجام و سپس، پنج سویه برتر، انتخاب و آزمون تولید IAA روی آنها انجام شد.
تولید سیدروفور پایووردین: نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان دادند که سویههای باکتریایی از نظر تولید سیدروفور پایووردین در سطح احتمال 1 درصد با یکدیگر اختلاف معنادار داشتند (جدول 1). مقایسه میانگین سیدروفور تولیدی سویهها نشان داد که مقادیر تولید آن از 34/1تا 48/8 میکرومول در میلیلیتر متغیر است (جدول 2). سویههای BT9، B2-10، B4-6 و WBO3-3 بیشترین مقدار سیدروفور (بهترتیب 48/8، 67/5، 55/5 و36/8 میکرومول در میلیلیتر) را تولید کردند و سویههای B14، WKZ1-17، B2-12، P68 و WH-M1 با تولید سیدروفور به میزان 01/1، 31/1، 54/2، 44/1 و 56/1 میکرومول بر میلیلیتر بهترتیب توانایی کمتری در تولید سیدروفور داشتند.
ارزیابی تولید سیانیدهیدروژن: نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان دادند که سویههای باکتریایی از نظر تولید سیانیدهیدروژن در سطح احتمال 1 درصد با یکدیگر اختلاف معنادار داشتند. مقایسه میانگین دادهها با آزمون دانکن حاکی از این بود که اغلب سویهها توانایی تولید HCN را داشتند، هرچند مقدار تولید این متابولیت در سویههای مختلف متفاوت بود. از 25 سویه بررسیشده، سویههای WB1-14، WH-M1، B10، B2-10، B2-11، WH-jkmh و B13 دارای بیشترین مقدار تولید سیانیدهیدروژن و سویههای B2-14، UTPF68، WB1-1، B14، B2-7، WBO3-3، WB1-9، WBO2-10، WT1-53 و B3-6 فاقد این توانایی بودند (جدول 1).
توانایی انحلال فسفات معدنی: نتایج تجزیه واریانس دادهها نشان دادند که سویههای باکتریایی از نظر انحلال فسفات معدنی در سطح 1 درصد با یکدیگر اختلاف معنادار داشتند (جدول 1). مقایسه میانگین دادهها با آزمون چنددامنهای دانکن نشان داد که سویههای WB0-3، BT9 و WT1-53 دارای بیشترین توانایی مصرف تریفسفاتکلسیم (قطر هاله بهترتیب 67/25، 50/19 و 18 میلیمتر) و سویههای WH-M1، WB1-14 و UTPF68 فاقد این توانایی بودند (جدول 2).
جدول 1- تجزیه واریانس سویههای P. fluorscens از نظر تولید سیدروفور، HCN و قدرت انحلال فسفات معدنی
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
||
سیدروفور |
سیانیدهیدروژن |
انحلال فسفات |
||
سویههای باکتری |
24 |
**209/13 |
**38/3 |
**97/135 |
خطا |
50 |
611/0 |
466/0 |
17/13 |
کل |
74 |
|
|
|
ضریب تغییرات |
|
67/20 |
43/47 |
25/30 |
** معنادار در سطح احتمال 1 درصد
جدول2- مقایسه میانگین تولید سیدروفور، HCN و قدرت حلکنندگی فسفات معدنی سویههای P. fluorscens
انحلال فسفات معدنی (قطر هاله به میلیمتر) |
تولید HCN (ارزش 0 تا 3) |
سیدروفور (میکرومول بر میلیلیتر) |
باکتری |
ردیف |
33/19b |
66/2 a |
39/3defgh |
B13 |
1 |
33/15bcdefg |
333/0f |
51/1j |
B14 |
2 |
67/16bcdef |
3f |
080/3efghi |
B3-6 |
3 |
67/12bcdefgh |
3a |
59/4cd |
B10 |
4 |
14 efcd |
33/2abc |
31/2ghij |
WKZ1-17 |
5 |
67/10efgh |
33/1cdef |
99/3def |
B2-14 |
6 |
15bcdefg |
66/1cdef |
55/5bc |
B4-6 |
7 |
50/19b |
2 abcd |
48/8a |
BT9 |
8 |
83/11cdefgh |
33/1cdef |
67/5bc |
B2-10 |
9 |
33/10efgh |
33/1cdef |
70/4cd |
B2-7 |
10 |
67/7h |
66/2 ab |
53/3defg |
B1-10 |
11 |
33/10efgh |
2abcd |
34/6b |
B2-11 |
12 |
17bcde |
66/1bcde |
25/6b |
B-10 |
13 |
11defgh |
666/0ef |
54/2ghij |
B2-12 |
14 |
67/25a |
0f |
36/8a |
WBO3-3 |
15 |
12 cdefgh |
666/0ef |
73/2fghij |
WB1-9 |
16 |
50/8gh |
1def |
80/4cd |
WH-M10 |
17 |
18bcd |
0f |
34/1j |
WT1-53 |
18 |
67/9fgh |
0f |
77/1j |
WBO2-10 |
19 |
0i |
3a |
56/1j |
WH-M1 |
20 |
0i |
3a |
01/2hij |
WB1-14 |
21 |
67/13bcdefgh |
333/0f |
91/1ij |
WB1-1 |
22 |
0i |
333/0f |
44/1j |
UTPF68 |
23 |
33/16cde |
66/2ab |
19/2ghij |
Wh-jkmh |
24 |
50/18 bc |
2abcd |
41/4cd |
CHA0 |
25 |
*در هر ستون، میانگینهای دارای حروف مشترک، در سطح 5 درصد آزمون دانکن با یکدیگر تفاوت معناداری ندارند.
تحمل به شوری: نتایج تجزیه واریانس دادهها، اختلاف معنادار سویههای باکتریایی با یکدیگر از نظر تحمل به شوری در سطح 1 درصد را نشان دادند (جدول 3).
جدول 3- تجزیه واریانس تحمل به شوری در سویههای P. fluorescens
منبع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
شوری |
3 |
**84/233 |
باکتری |
24 |
**19/50 |
شوری×باکتری |
72 |
**73/10 |
خطا |
200 |
4/2 |
کل |
299 |
|
ضریب تغییرات |
|
8/19 |
**معنادار در سطح احتمال 1 درصد
نتایج مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف شوری بر رشد کلنی باکتریها نشان دادند که با افزایش سطح شوری، قطر کلنی باکتریها در مقایسه با شاهد (بدون کاربرد نمک) کاهش یافته است. بیشترین قطر کلنی به سویه WKZ1-17 در سطح شوری صفر (بدون کاربرد نمک) متعلق بود که تفاوت معناداری با سویه WB1-1 در همین سطح شوری نداشت. کمترین قطر کلنی در سویه WH-M1 و در شوری 600 میلیمولار مشاهده شد که تفاوت معناداری با سویههای B13، B4-6، B2-7، B10، B2-12، WT1-53، WBO2-10،WH-M1، WB1-14، Whjkmh و CHAO در همین سطح شوری نداشت (جدول 4).
جدول 4- مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف شوری بر رشد سویههای P. fluorescens
600 میلیمولار |
400 میلیمولار |
200 میلیمولار |
شاهد |
شوری باکتری |
ردیف |
67/4 wxyz |
67/4 wxyz |
6 stuvw |
67/7 nopqr |
B13 |
1 |
7 pqrst |
67/8 lmno |
67/10 ghi |
33/15 cde |
B14 |
2 |
33/8 mnop |
33/8 mnop |
5/16 cd |
33/12 fg |
B3-6 |
3 |
33/8 mnop |
8 mnopq |
33/12 fg |
33/16abc |
B10 |
4 |
6 stuvw |
5 vwxyz |
6 stuvw |
33/17a |
WKZ1-17 |
5 |
67/7 nopqr |
11 ghij |
67/8 lmno |
10 jkl |
B2-14 |
6 |
67/4 wxyz |
67/5 tuvwx |
6 stuvw |
12 fgh |
B4-6 |
7 |
6 stuvw |
6 stuvw |
33/7 opqrs |
33/8 mnop |
BT9 |
8 |
67/5 tuvwx |
5 vwxyz |
6 stuvw |
7 pqrst |
B2-10 |
9 |
67/4 wxyz |
5 vwxyz |
67/5 tuvwx |
5 vwxyz |
B2-7 |
10 |
67/7 nopqr |
67/8 lmno |
67/11 fghi |
11 hgij |
B1-10 |
11 |
67/6 qrstu |
8 mnopq |
33/8mnop |
67/11 fghi |
B2-11 |
12 |
5 vwxyz |
6 stuvw |
33/5 uvwxyz |
12 fgh |
B-10 |
13 |
67/4 wxyz |
67/6 qrstu |
33/5 uvwxyz |
9 klmn |
B2-12 |
14 |
7 pqrst |
33/10 a |
67/14 e |
9 klmn |
WBO3-3 |
15 |
33/6 rstuv |
33/6 rstuv |
13 f |
33/14 e |
WB1-9 |
16 |
6 stuvw |
6 stuvw |
33/7 opqrs |
33/9 kml |
WH-M10 |
17 |
33/5 uvwxyz |
4yz |
9 klmn |
67/5 tuvwx |
WT1-53 |
18 |
67/4 wxyz |
67/6 qrstu |
6 stuvw |
33/6rstuv |
WBO2-10 |
19 |
67/3 z |
33/4 xyz |
33/5 uvwxyz |
15 e |
WH-M1 |
20 |
67/4 wxyz |
33/5 uvwxyz |
67/5 tuvwx |
67/6 qrstu |
WB1-14 |
21 |
33/6 rstuv |
67/7 nopqr |
33/11 ghij |
17ab |
WB1-1 |
22 |
67/6 qrstu |
7 pqrst |
33/6 rstuv |
8 mnopq |
P68 |
23 |
5 vwxyz |
33/5 uvwxyz |
33/5 uvwxyz |
6 stuvw |
Whjkmh |
24 |
5 vwxyz |
67/5 tuvwx |
67/5 tuvwx |
67/7 nopqr |
CHA0 |
25 |
*در جدول، میانگینهایی که دارای حروف مشترک هستند، در سطح 5 درصد آزمون دانکن با یکدیگر تفاوت معناداری ندارند.
**اعداد جدول، میانگین قطر کلنی باکتریها بر حسب میلیمتر هستند.
در آزمون تحمل به شوری، 25 سویه مطالعهشده با توجه به میزان رشد در سطوح مختلف شوری به پنج گروه حساس، نیمهحساس، نیمهمتحمل، متحمل و بسیار متحمل تفکیک شدند. گروهبندی بر مبنای میزان رشد سویهها در مقایسه با محیط غذایی بدون نمک که همه جدایهها در آن رشد کردند و همچنین مقایسه سویهها با یکدیگر انجام شد. مبنای گروهبندی، تعداد سویههای مربوط به هر گروه و نام سویههای برتر انتخابشده از هر گروه در جدول 5 دیده میشود.
جدول 5- گروهبندی سویههای P. fluorescens از نظر تحمل به شوری
درجه تحمل |
وضعیت رشد* |
تعداد از 25 سویه |
سویههای برتر |
حساس |
200mMرشد ضعیف تا بهنسبت کم در سطح |
19 |
CHA0 |
نیمهحساس |
رشد متوسط تا شدید در سطح mM200 |
6 |
B10 |
نیمهمتحمل |
رشد ضعیف تا بهنسبت کم در سطح mM400 |
24 |
B2-10 |
متحمل |
رشد متوسط تا شدید در سطح mM400و رشد ضعیف تا بهنسبت کم در سطح mM600 |
25 |
B4-6 وB2-11 |
بسیار متحمل |
رشد متوسط تا شدید در سطح mM600 |
1 |
UTPF68 |
*مبنای مقایسه، میزان رشد هاله هر سویه در محیط NA بدون شوری است.
ارزیابی توان تولید IAAبهشکل نیمهکمی: سویهها در آزمون نیمهکمی از نظر توانایی تولید IAA به پنج گروه با تواناییهای مختلف تقسیم شدند: گروه 1 با توانایی تولید بسیار زیاد (HD/CD بیش از 3)، گروه 2 با توانایی تولید زیاد (HD/CD بین 5/2 تا 3)، گروه 3 با توانایی تولید متوسط (HD/CD بین 2 تا 5/2)، گروه 4 با توانایی تولید کم (HD/CD بین 5/1 تا 2) و گروه 5 با توانایی تولید بسیار کم (HD/CD بین 1 تا 5/1) (جدول 6).
جدول 6- گروهبندی سویههای P. fluorescensاز نظر توان تولید IAAدر روش نیمهکمی
متوسط نسبت قطر هاله به قطر پرگنه (HD/CD) |
||||
5/1-1 |
2-5/1 |
5/2-2 |
3-5/2 |
3˃ |
- |
UTPF68 |
B2-11 |
- |
B4-6 |
- |
CHA0 |
B2-10 |
- |
- |
- |
B10 |
- |
- |
- |
ارزیابی توان تولید IAAبهشکل کمی: تجزیه واریانس دادههای تولید IAA بهشکل کمی، اختلاف معنادار سویههای باکتریایی با یکدیگر را از نظر تولید IAA در سطح 1 درصد نشان داد (جدول 7). مقایسه میانگین دادهها حاکی از این بود که سویههای B4-6 و B2-10 بیشترین (بهترتیب 29/2 و 27/2 میلیگرم در لیتر) و سویه B2-11 کمترین (78/1 میلیگرم در لیتر) مقدار IAA را تولید کردند (شکل 1).
جدول 7- تجزیه واریانس سویههای P. fluorescens از نظر تولید IAA به روش کمی
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
میانگین مربعات |
سویههای باکتری |
5 |
**174/2 |
خطا |
12 |
06/0 |
کل |
7 |
|
ضریب تغییرات |
|
76/14 |
**معنادار در سطح احتمال 1 درصد
شکل 1- مقایسه میانگین میزان تولید IAA در روش کمی بر حسب میلیگرم بر لیتر
بحث و نتیجهگیری.
ریزوباکتریهای محرک رشد گیاه بهویژه گونه P. fluorescens با استقرار در مکانهای مختلف ریشه و کلنیزاسیون مؤثر، رشد گیاهان را با مکانیسمهای مختلف تحریک میکنند. مطالعه بیشتر این گونهها از نظر تولید مواد محرک رشد گیاهی، دورنمای روشنی را در افزایش رشد گیاهان نوید میدهد (20).
همه سویههای بررسیشده در پژوهش حاضر توانایی تولید سیدروفور را داشتند که این توانایی بر حسب سویه باکتری از 34/1 تا 48/8 میکرومول در میلیلیتر متغیر بود. سوزا و همکاران[xi] در مطالعهای درباره تنوع تولید سیدروفور در باکتریهای مرتبط با برنج (Oriza sativa L.) دریافتند که از 336 باکتری کشتشده، 84 درصد سویهها توانایی تولید سیدروفور را دارند (21). نتایج حاصل از پژوهش آندرس و همکاران[xii] نشان دادند که 75 درصد سویههای P. fluorescens قادر به تولید سیدروفور در محیطکشت مایع بودند (22). سیدروفورهایی که باکتریها تولید میکنند با افزایش فراهمسازی آهن در خاک اطراف ریشه، جذب آهن توسط گیاه و رشد ریشه را افزایش میدهند. این مکانیسم علاوه بر تأمین آهن گیاه، اثر غیرمستقیمی بر رشد گیاهان میگذارد که باعث کاهش رشد عوامل بیماریزای گیاهی و کاهش دسترسی آنها به آهن میشود (4).
در مطالعه حاضر مشخص شد که 92 درصد سویههای P. fluorescens بررسیشده، توانایی انحلال فسفات معدنی در شرایط آزمایشگاهی را دارند. فسفر موجود در خاک بهشکل ترکیبات فسفاتهای آلی و ترکیبات فسفات معدنی و بهطور عمده در قالب مواد معدنی نامحلول در دسترس است (23). احمد و همکاران نیز 72 جدایه از باکتریهای مختلف را بررسی کردند که در بین آنها، بیش از 80 درصد باسیلوس و 5/55 درصد سودوموناسها حلکننده فسفات بودند (24). سرچشمهپور و همکاران گزارش کردند که جدایههای برتر حلکننده فسفات همگی به جنس Pseudomonas تعلق دارند و کارایی زیادی به واسطه توانایی در کاهش اسیدیته دارند (25). فسفر موجود در خاک بهشکل ترکیبات فسفات آلی و معدنی نامحلول در دسترس است. باکتریهای حلکننده فسفات با تولید انواع اسیدهای آلی قادر به انحلال ترکیبات معدنی فسفات نظیر تریفسفاتکلسیم هستند (26). باکتریهای حلکننده فسفات از جمله Pseudomonas spp. با کمک آنزیمهایی نظیر فسفاتاز، فسفوناتاز و اسیدهای آلی مانند گلوکونیکاسید و سیتریکاسید، فسفر را از ترکیبات آلی و معدنی خاک آزاد میکنند. گلوکونیکاسید و 2-کتوگلوکانات، نقش مهمی در محلولسازی فسفات و توانایی بیوکنترل سودوموناسهای فلورسنت ایفا میکنند (1 و 27).
نتایج تولید HCN توسط سویههای سودوموناس بررسیشده در پژوهش حاضر نشان دادند که 68 درصد سویهها توانایی تولید سیانیدهیدروژن را دارند و میزان تولید از درجه بهنسبت کم تا زیاد متغیر است. نتایج پژوهش کرمر و سویسی[xiii] نیز نشان دادند که تقریباً 32 درصد مجموعهای شامل 2000 سویه باکتری، توانایی تولید HCN را داشتند (28). HCN ازجمله مهمترین متابولیتهای ثانویهای است که بسیاری از ریزجانداران تولید میکنند و به طور مستقیم از پرولین، گلایسین و یا گلیکوزیدهای سیانوژنیک ساخته میشود. تولید HCN توسط سودوموناسها به مقدار آهن سه ظرفیتی جذبشدنی بستگی دارد. این ترکیب از سویی برای قارچها سمی و از سوی دیگر تولید آن توسط باکتریها موجب تشکیل ریشههای مویین میشود (9).
در پژوهش حاضر، بیشتر سویههای P. fluorescens جداشده از ریزوسفر جو، بیشترین سطح شوری آزمایششده را تحمل کردند. افزایش سطوح شوری باعث کاهش توده کلنی جدایهها شد، بهطوری که در بعضی جدایهها، میزان رشد در سطوح بالای شوری طی 24 ساعت اولیه بسیار کم بود و این نتیجه با نتایج سرچشمهپور و همکاران مطابقت داشت (25). مطالعههای کوردویلا[xiv] نشان دادهاند که سازگاری باکتریها به سطوح بالای شوری ممکن است از طریق افزایش سطوح پتاسیم بین سلولی و گلوتامات باشد (29). افزایش غلظت نمک در خارج از غشای سلولی باکتری موجب افزایش پتانسیل اسمزی شده و این، یکی از دلایل مهم کاهش رشد باکتریها است (30).
نتایج روش نیمهکمی تولید اکسین در پژوهش حاضر نشان دادند که هر شش سویه باکتری قادر به تولید این متابولیت هستند و بسته به میزان تولید، طیفی رنگی از صورتی کمرنگ تا پررنگ ایجاد میکنند. با توجه به اینکه نسبت قطر هاله به پرگنه و همچنین شدت رنگ ایجادشده بین سویههای مختلف P. fluorescens متفاوت بود، استنباط میشود که توانایی تولید اکسین بین آنها یکسان نیست و این نتیجه با نتایج عرب و همکاران مطابقت داشت (31). نتایج تولید کمی IAA نشان دادند که سویههای B4-6 وB2-10 بیشترین مقدار (بهترتیب 29/2 و 27/2 میلیگرم در لیتر) تولید کردند. احمد و همکاران نیز در بررسی تولید اکسین توسط 11 سویه P. fluorescens دریافتند که میزان تولید اکسین از 34/5 تا 44/2 میکروگرم در میلیلیتر متغیر است (32). طبق مطالعات پیشین، حدود 80 درصد باکتریهای جداشده از ریزوسفر خاک قادر به تولید ایندول-3-استیکاسید یا اکسین هستند (33). تولید غلظت زیاد اکسین توسط سودوموناسهای فلورسنت، ویژگی بارز بیشتر آنها است (34) .این هورمون موجب افزایش سطح ریشه و تعداد ریشههای مویین ریشه میشود و به این ترتیب، جذب مواد غذایی و استقرار بیشتر گیاه در خاک را افزایش میدهد (35).
با توجه به سازگاری سودوموناسهای فلورسنت محرک رشد گیاه با شرایط محیطی زیستگاه خود، در مطالعه حاضرسویههای P. fluorescens محرک رشد گیاه جداسازیشده از ریزوسفر جو در استان بوشهر مطالعه شدند. این سویهها علاوه بر داشتن ویژگیهای تحریککنندگی رشد گیاه مانند انحلال فسفات معدنی و تولید سیدروفور، HCN و IAA، دارای ویژگیهای تحمل به شوری نیز بودند. با توجه به گستردگی اراضی شور در کشور که موجب کاهش رشد گیاهان میشوند، استفاده از باکتریهای محرک رشد قادر به تحمل تنش شوری نسبت به سایر سویههای غیرمتحمل بر رشد و عملکرد گیاهان در شرایط تنش شوری بسیار تاثیرگذار است.
تشکر و قدردانی
نگارندگان از همکاری صمیمانه مسئولان دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه خلیج فارس بوشهر در اجرای این پژوهش سپاسگزاری میکنند.
[1]- Plant growth-promoting rhizobacteria
[2]- Rhizosphere
[3]- Hydrogen Cyanide
[4]- KingʼS Medium B Agar
[5]- Round per minute (rpm)
[6]- Sperber
[7]- Pyoverdin
[8]- Alstrom and Burns
[9]- Luria Bertani Broth
[10]- Bric et al
[xi]- Souza et al
[xii]- Andress et al
[xiii]- Kremer and Souissi
[xiv]- Cordovilla