نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشیار ویروس شناسی، پژوهشکده کشاورزی هستهای، پژوهشگاه علوم و فنون هستهای، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی، ایران
3 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، ایران
4 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج، ایران
5 پژوهشکده کشاورزی هستهای، پژوهشگاه علوم و فنون هستهای، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Foot and Mouth Disease (FMD) is the most contagious disease in cloven-hoofed animals which causes a lot of economical losses. FMD virus belongs to Picornaviridae family and Aphthovirus genus. The aim of the study is evaluation of humoral and cellular immune responses triggered by a Gamma-irradiated FMD vaccine in the guinea-pig model.
Materials and Methods: FMD virus type Asia-1 was multiplied on BHK21 cell line and irradiated by gamma ray in different doses. According to dose/survival curve, D10 value and optimum dose of virus inactivation were calculated 7.69 and 50 kGy, respectively. Antigenic characteristic of irradiated and un-irradiated virus samples were evaluated by complement fixation test (CF test) and safety test was done by four blind passages cell culture on IBRS2 cell line. The inactivated virus sample was formulated as Radio- vaccine and immune responses were evaluated in three groups of ginea-pigs; the first group Radio-vaccine, the second group conventional vaccine and the last one was negative control.
Results: The results of neutralizing antibody titration for two vaccinated groups were significant (P<0.05), but between Radio-vaccine and conventional vaccine was no significant. The increase in splenocyte multiplication for two vaccinated groups by MTT test was significant (P<0.05).
Discussion and conclusion: The Gamma irradiated inactivated FMD type Asia-1 vaccine is a good candidate for immunization of guinea-pig without the problems such as residue, virus escape and etc. And it can use for vaccination of cattle in the future.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
بیماری تب برفکی یکی از بیماریهای حاد ویروسی است که موجب بیماری گونههای مختلف حیوانات زوجسم و وحوش میشود. در بین نشخوارکنندگان اهلی، نخست گاو و سپس گوسفند و بز به این بیماری حساس هستند. این بیماری در بیشتر بخشهای دنیا و حداقل در 70 گونه از حیوانات وحشی گزارش شده است و سرعت انتشار سریع آن موجب خسارتهای بسیاری به شیر، گوشت و سایر محصولات دامی میشود (1). این ویروس هفت سروتایپ دارد که سه سروتایپ آن (A، O و Asia 1) در ایران رایج و از خانواده پیکورناویریده هستند و شش جنس آفتوویروس، اینترویروس، کاردیوویروس، رینوویروس، هپارناویروس و پارچوویروس دارد. این خانواده ویروسی،کسپید بیستوجهی و ژنوم RNA تکرشتهای خطی، مثبت با اندازه 5/7 تا 5/8 کیلوجفت باز[1] دارد (2). پرتوهای یونساز گاما و ایکس که برای غیرفعالسازی ریزموجودات استفاده میشوند، پرتوهای الکترومغناطیسی با طول موج کوتاه و قدرت نفوذ زیاد هستند. مطالعات درباره ویروسها نشان دادهاند که عفونتزایی ویروسها با پرتوتابی از بین میرود ولی آنتیژنسیتی آنها بدون تغییر میماند (3 و 4). فرسکورا و همکاران در سال 1973 مشاهده کردند که ویروس FMD type C لیوفیلیزه که با پرتوی گاما غیرفعالشده، ویژگی آنتیژنسیتی خود را طبق آزمون ثبوت کمپلمان کاملاً حفظ کرده است (5). مورتون و همکاران در سال 1970، واکسن غیرفعال بیماری انسفالیت اسبی ونزولایی (VEE) را به روش پرتوتابی گاما با دوزهای 8 تا 10 میلیون راد تهیه کردند که ویژگی ایمونولوژیک زیادی برای موشها و خوکچههای هندی نشان داد. همچنین خوکچههای هندی در آزمون چلنج زنده ماندند و میزان آنتیبادی خنثیکننده در خوکچههای هندی و خرگوش افزایش داشت. این یافتهها نشان دادند که پرتوهای یونساز در تهیه واکسن غیرفعال VEE بسیار مؤثر هستند (6). واکسنی که امروزه برای تب برفکی استفاده میشود، واکسن غیرفعالشده با اتیلن ایمین همراه با ادجوانت هیدروکسیدآلومینیوم است؛ این واکسن معایبی ازجمله نیمهعمر کوتاه، باقیماندهای توکسیک و آلرژیک در واکسن، احتمال فرار ذرههای ویروسی از تیمار با مواد شیمیایی و طولانیبودن زمان غیرفعالسازی ویروس دارد. بنابراین هدف پژوهش حاضر، ساخت رادیوواکسن بیماری تب برفکی تایپ آسیا-1 با استفاده از پرتوی گاما و واکسیناسیون خوکچههای هندی و در نهایت، ارزیابی پاسخهای ایمنی هومورال و سلولی ایجادشده در خوکچههای هندی واکسینهشده است (7 و 8). با توجه به خسارتهای اقتصادی زیاد بیماری تب برفکی به صنعت دامداری در کشور و سایر کشورهای منطقه ازجمله کاهش شیر، گوشت و پشم حیوانات آلوده، روند تقاضا برای واکسن ایمن و مؤثر این بیماری رو به افزایش است. با توجه به کاهش مدت زمان غیرفعالسازی ویروس به چند دقیقه در فرایند تولید واکسن پرتوتابی، توانایی سیستم تولید واکسن افزایش مییابد. همچنین، با در نظر گرفتن قدرت نفوذ بسیار زیاد پرتوی گاما که فقط دیوار سربی قادر به ممانعت از نفوذ آن است، هیچ ذره ویروسی زنده در واکسن باقی نمیماند؛ این در حالی است که در روش غیرفعالسازی ویروس با موادشیمیایی، احتمال فرار ذرههای ویروسی از تیمار با ماده شیمیایی وجود دارد. بنابراین، امید است که روش پرتوتابی در آینده برای تولید صنعتی این واکسن استفاده شود.
مواد و روشها.
ویروس: در پژوهش حاضر، از ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1[2] استفاده شد که مؤسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی از ایران جداسازی کرده است. پس از تکثیر ویروس در کشت سلولی رده پایدار IBRS2 و جمعآوری آن، سانتریفوژ با دور کم برای جداسازی ذرههای سلولی پارهشده از سوسپانسیون ویروسی انجام و سپس، تیتراسیون ویروس به روش دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد[3] انجام شد. استوک ویروسی تهیهشده در ویالهای استریل به حجم 5 میلیلیتر تقسیم و در فریزر منفی 70 درجه سانتیگراد نگهداری شد (9 و 10).
دوزیمتری و پرتوتابی: سیستم پرتودهنده گامای استفادهشده در پژوهش حاضر به پژوهشکده کاربرد پرتوها و شرکت ام دی اس نوردین[4] کشور کانادا مربوط است، نرخ دوز این سیستم و اکتیویته آن بهترتیب ثانیه/گری 8/4 و 20469 کوری است. دوزیمتری با روش فریک[5] طبق استاندارد دوزیمتری فریک شماره E 1026–04e انجام شد. ویالهای حاوی 5 میلیلیتر ویروس منجمد به همراه یخ خشک با دوزهای 10، 20، 25، 30، 40، 35، 45 و 50 کیلوگری پرتوی گاما پرتوتابی شدند و سه تکرار برای هر دوز پرتوتابی انجام شد (10-13).
تیتراسیون ویروسهای پرتوتابیشده و محاسبه دوز غیرفعالسازی: پس از پرتوتابی نمونههای ویروسی با دوزهای مختلف پرتوی گاما، تیتراسیون ویروسی به همان روش دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد انجام و منحنی دوز/پایندگی با نرمافزار Origin6.1 رسم شد. با رابطه بهترین خطی که بر این نمودار منطبق میشود، فاکتور ارزش[6] D10 (دوزی از پرتوی گاما بر حسب کیلوگری که جمعیت ویروسی را یک سیکل لگاریتمی کاهش میدهد) محاسبه و سپس دوز مطلوب غیرفعالسازی کامل ویروس با در نظر گرفتن تیتر اولیه آن محاسبه شد (1-13).
آزمون بیضرری و بررسی ویژگیهای آنتیژنیک ویروس پرتوتابیشده: برای تأیید غیرفعالسازی کامل ویروس پرتوتابیشده با دوز مطلوب و انجام آزمون بیضرری واکسن غیرفعالشده، نمونههای ویروسی پرتوتابیشده در سه دوز 40، 45 و 50 کیلوگری و هر کدام دو تکرار در کشت سلولی تکلایه رده سلولی پایدار کلیه بچه هامستر[7] کشت داده شدند. پس از 48 ساعت، در صورت مشاهدهنشدن آثار تخریب سلولی (CPE)، از سوسپانسیون آنها تا چهار پاساژ متوالی روی سلولهای BHK21 کشت داده و هر پاساژ، 48 ساعت از نظر نشانههای تخریب سلولی بررسی شد. برای بررسی ویژگیهای آنتیژنیک ویروس پرتوتابیشده نسبت به ویروس شاهد از آزمون ثبوت کمپلمان استفاده شد. در این آزمون، از سیستم همولیتیک که شامل گلبول قرمز گوسفند شستهشده و آنتیبادی ضد آن است و آنتیبادی ضدویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 و سریال رقت آنتیژن ویروسی پرتوتابیشده و نشده استفاده شد (13 و 14).
فرمولاسیون واکسن: پس از تأیید غیرفعالسازی کامل ویروس توسط پرتوی گاما و حفظ ویژگی آنتیژنیک ویروس پرتوتابیشده، 50 میلیلیتر ویروس غیرفعالشده به روش پرتوتابی و روش رایج غیرفعالسازی (اتیلن ایمین) با تیتر مشخص (5/108 دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد در میلیلیتر[8]) همراه با ادجوانت ژل هیدروکسیدآلومینیوم[9]، بافر فسفات دیهیدروژنپتاسیم و فسفاتهیدروژنسدیم و ساپونین فرموله و اسیدیته بین 7 تا 8 با استفاده از گلیکوکول (گلیسین+سود) تنظیم شد.
واکسیناسیون حیوانات: در پژوهش حاضر از الگوی حیوانی خوکچه هندی استفاده شد. تعداد 9 عدد خوکچه هندی ماده با وزن تقریبی 20 گرم انتخاب و در سه گروه تقسیم شدند و بهترتیب به گروه اول 200 میکرولیتر واکسن رایج تولیدشده در مؤسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی، به گروه دوم 200 میکرولیتر رادیوواکسن تولیدشده در پژوهش حاضر و به گروه سوم بافر فسفات (شاهد) به روش زیرپوستی تزریق شد. دوز یادآور واکسن، 21 روز پس از نخستین تزریق واکسن انجام و 10 تا 14 روز پس از دوز دوم، خونگیری از قلب حیوانات و جداسازی سرم خون انجام و طحال خوکچههای هندی جداسازی شد.
آزمون MTT: برای بررسی میزان تکثیر لنفوسیتهای T در طحال حیوانات واکسینهشده، ابتدا طحال جداسازیشده همراه با بافر فسفات استریل و روی یخ به آزمایشگاه منتقل و پس از جداسازی لنفوسیتهای طحال، شمارش آنها و تعیین درصد سلولهای زنده با لام نئوبار انجام شد. کشت لنفوسیتهای طحال با استفاده از محیطکشت RPMI1640 بدون فنلرد و همراه با 10 درصد سرم جنین گوساله در میکروپلیت 96 خانه انجام و برای هر نمونه 9 خانه کشت داده شد؛ بهشکلی که 3 خانه با افزودن فیتوهماگلوتینین (عامل محرک رشد سلول) شاهد مثبت، 3 خانه با افزودن آنتیژن ویروسی بهعنوان آزمون اصلی نمونه و 3 خانه شاهد منفی انتخاب شد. پس از 48 ساعت، معرف نمک تترازولیوم طبق دستورعمل کیت تجاری[10] افزوده شد و پس از 4 ساعت، بلورهای فورمازان تشکیل شدند؛ در چاهکهایی که رشد لنفوسیتها بیشتر بود، بلورهای بیشتری مشاهده شدند. سپس حلال کیت، شامل SDS 10 درصد در کلریدریکاسید 01/0 مولار اضافه و یک شب در 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری و در انتها، جذب نوری هر خانه با دستگاه الایزاریدر در طول موج 540 نانومتر خوانده شد. ضریب شاخص تحریکی تکثیر لنفوسیتهای طحال با تقسیمکردن میانگین جذب نوری خانههای آزمون اصلی نمونه به میانگین جذب نوری خانههای شاهد منفی محاسبه و در سه گروه واکسن پرتوتابیشده، واکسن رایج و گروه شاهد با یکدیگر مقایسه شد (15 و 16).
تیتر آنتیبادی خنثیکننده: از آزمون خنثیسازی سرم برای تیتراسیون آنتیبادی خنثیکننده در سرم حیوانات واکسینهشده استفاده شد؛ 100 میکرولیتر از رقتهای 1:8، 1:16، 1:32، 1:64 و 1:128 سرم تهیه و با 100 میکرولیتر ویروس تب برفکی با تیتر 100 دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد مخلوط شد، پس از یک ساعت مخلوط یادشده به چاهکهای حاوی کشت سلول BHK21 منتقل و پس از 48 ساعت، تیتر آنتیبادی با توجه به آشکارشدن یا نشدن آثار تخریب سلولی[11] محاسبه شد. در هر چاهکی که سرم حیوان، ویروس را خنثی کرده است، نشانههای تخریب سلولی دیده نشد به این معنا که سرم حیوان، آنتیسرم ضدویروس را داشته است و در هر چاهکی که نشانههای تخریب سلولی دیده شد یعنی سرم حیوان، آنتیسرم ضدویروس را نداشته، ویروس خنثی شده است و نشانههای تخریب سلولی بروز کردهاند. در نهایت، بیشترین رقت سرم که نشانههای تخریب سلولی را در 50 درصد سلولهای تکلایهای نشان میدهد، تیتر سرم در نظر گرفته و لگاریتم مبنای ده عکس ضریب آن رقت، تیتر آنتیسرم ضدویروس گزارش شد (17).
اندازهگیری میزان سایتوکاینها: در پژوهش حاضر، سایتوکاینهای اینترفرون گاما[12] که بیشتر لنفوسیتهای T کمککننده کلاس یک[13] آنها را تولید میکنند و اینترلوکین 4[14] که بهطور عمده لنفوسیتهای T کمککننده کلاس دو[15] آنها را تولید میکنند با کیتهای تجاری الایزا ساخت شرکت ای بیوساینس[16] اندازهگیری شدند.
مطالعات آماری: مقایسه میانگینها برای نتایج تیتر آنتیبادی خنثیکننده، ضریب شاخص تحریکی رشد لنفوسیتهای طحال، مقادیراینترفرون گاما و اینترلوکین 4 به روش آنالیز واریانس یکطرفه[17] با نرمافزار اسپیاساس-16[18] تجزیه و تحلیل شدند (18).
نتایج.
تیتر ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 پرتوتابیشده و نشده به روش دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد و با رابطه رید و مونچ[19] محاسبه شد (جدول 1). با توجه به تیتر ویروس در دوزهای مختلف پرتوتابی، نمودار دوز/پایندگی با نرمافزار 6.1 Origin رسم و رابطه بهترین خط عبوری از منحنی یافت شد (شکل 1). با معادله خط، فاکتور ارزش D10 و دوز مطلوب غیرفعالسازی کامل ویروس به ترتیب 69/7 و 52/50 کیلوگری محاسبه شدند. در جدول 2، نتایج بررسی نشانههای تخریب سلولی در چهار پاساژ متوالی از نمونههای پرتوتابیشده در دوزهای 40، 45 و 50 کیلوگری مشاهده میشوند؛ با توجه به این نتایج، دوز مطلوب گاما برای غیرفعالسازی ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 با تیتر 5/106 در میلیلیتر که در هر چهار پاساژ متوالی نشانه تخریب سلولی ایجاد نکند، 50 کیلوگری تعیین شد.
جدول1- تیتر نمونههای ویروس پرتوتابیشده با پرتو گاما با دوزهای صفر، 10، 20، 25، 30، 35، 40 و 50 کیلوگری
|
دوز پرتوتابی (کیلوگری) |
0 |
10 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
50 |
|
تیتر ویروسی دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد/mL |
5/6 10 |
5/5 10 |
66/3 10 |
5/3 10 |
102 |
66/1 10 |
33/1 10 |
5/0 10 |
5/0 10 |
شکل1- منحنی دوز/پایندگی و رابطه بهترین خط عبوری از منحنی برای نمونههای ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 پرتوتابیشده
جدول 2- نتایج آزمون بیضرری در نمونههای ویروسی پرتوتابیشده تا چهار پاساژ متوالی
|
نمونه ویروس پرتوتابیشده |
نشانههای سایتوپاتیک در پاساژهای متوالی |
|||
|
پاساژ اول |
پاساژ دوم |
پاساژ سوم |
پاساژ چهارم |
|
|
kGy 40– نمونه 1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
kGy 40– نمونه 2 |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
kGy 45– نمونه 1 |
- |
+ |
+ |
+ |
|
kGy 45– نمونه 2 |
- |
+ |
+ |
+ |
|
kGy 50– نمونه 1 |
- |
- |
- |
- |
|
kGy 50– نمونه 2 |
- |
- |
- |
- |
اتصال اختصاصی بین آنتیسرم اختصاصی ضدویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 و نمونههای ویروسی پرتوتابیشده با دوزهای مختلف پرتو گاما از صفر تا 50 کیلوگری به روش ثبوت کمپلمان ارزیابی شد؛ این آزمون مشخص کرد که ویژگی آنتیژنیک نمونههای ویروسی پس از پرتوتابی تغییر نکرده است. لوپ G-H قرارگرفته در پپتید VP1 کپسید ویروس تب برفکی، جایگاه اختصاصی اتصال آنتیبادی خنثیکننده به ویروس و گفتنی است که این لوپ در ویروس پرتوتابیشده در پژوهش حاضر بدون تغییر مانده است. نتایج آزمون ثبوت کمپلمان در جدول 3 مشخص میکنند که ویژگی آنتیژنیک ویروس پس از پرتوتابی تا دوز 50 کیلوگری پرتوی گاما در دو رقت اولیه نسبت به نمونه پرتوتابینشده بدون تغییر باقی میماند و باعث القای پاسخ ایمنی مناسب در حیوان میشود.
جدول 3- نتایج آزمون ثبوت کمپلمان نمونههای پرتوتابیشده با پرتو گاما
|
دوز پرتوتابی (کیلوگری) |
رقت ویروس تب برفکی تایپ آسیا-1 با تیتر 106در هر میلیلیتر از دوز عفونتزایی کشت بافتی 50 درصد |
|||
|
1 |
2/1 |
4/1 |
8/1 |
|
|
0 |
+4 |
+4 |
+0.5 |
0 |
|
10 |
+4 |
+4 |
+0.5 |
0 |
|
20 |
+4 |
+4 |
+0.5 |
0 |
|
30 |
+4 |
+4 |
Tr |
0 |
|
40 |
+4 |
+4 |
Tr |
0 |
|
45 |
+4 |
+4 |
Tr |
0 |
|
50 |
+4 |
+4 |
Tr |
0 |
پس از تزریق واکسن فرمولهشده به خوکچه های هندی، تیتر آنتیبادی خنثیکننده، میزان تکثیر لنفوسیتهای T طحال و میزان اینترفرون گاما و اینترلوکین 4 در هر سه گروه تعیین شد (جدول 4). تیتر آنتیبادی خنثیکننده و میزان تکثیر لنفوسیتهای طحال در گروههای واکسن مرسوم و رادیوواکسن افزایش معناداری (P<0.05) نسبت به گروه شاهد نشان دادند، هرچند اختلاف معناداری بین دو گروه واکسینهشده وجود نداشت (P>0.05). افزایش غلظت اینترفرون گاما در هر دو گروه واکسینهشده نسبت به گروه شاهد معنادار و این افزایش در گروه رادیوواکسن نسبت به واکسن مرسوم معنادار (P<0.05) بود. افزایش غلظت اینترلوکین 4 در هر دو گروه واکسینهشده نسبت به گروه شاهد معنادار نیست (P>0.05).
جدول 4- نتایج تیتر آنتیبادی خنثیکننده، میزان تکثیر لنفوسیتهای T طحال، میزان اینترفرون گاما و اینترلوکین 4
|
گروه واکسن |
تکثیر لنفوسیتها (SI) |
میانگین SI ±انحراف معیار |
غلظتIFN-γ (pg/ml) |
میانگین غلظت IFN-γ ± انحراف معیار |
غلظت IL4 |
میانگین غلظت IL4 ± انحراف معیار |
تیتر آنتیبادی |
|
شاهد |
67/0 |
018/0 ± 69/0 |
53/98 |
96/12±68/84 |
52/665 |
220/220± 84/857 |
< 6/0 |
|
شاهد |
70/0 |
69/82 |
05/1098 |
< 6/0 |
|||
|
شاهد |
704/0 |
84/72 |
96/809 |
< 6/0 |
|||
|
واکسن مرسوم |
15/1 |
149/0± 1/1 |
95/332 |
41/48±25/315 |
96/809 |
57/1697± 84/2351 |
> 1/2 |
|
واکسن مرسوم |
20/1 |
48/260 |
97/4170 |
> 1/2 |
|||
|
واکسن مرسوم |
92/0 |
33/352 |
60/2074 |
> 1/2 |
|||
|
رادیوواکسن |
3/1 |
280/0± 56/1 |
80/501 |
65/128±08/395 |
41/1035 |
63/641± 73/1436 |
> 1/2 |
|
رادیوواکسن |
27/1 |
00/252 |
75/2176 |
>1/2 |
|||
|
رادیوواکسن |
90/0 |
45/323 |
05/1098 |
> 1/2 |
بحث و نتیجهگیری.
والی و کاری، پژوهشگران فرانسوی، در سال 1927 نخستین تلاش برای استفاده از واکسن حفاظتی تب برفکی را انجام دادند (19). باهنمان در سال 1973 در مرکز FMD آمریکا از آزیریدینها مانند اتیلن ایمین برای واکسن تب برفکی استفاده کرد (19). پرتوهای یونساز گاما و ایکس که برای غیرفعالسازی ریزموجودات استفاده میشوند، پرتوهای الکترومغناطیسی با طول موج کوتاه و قدرت نفوذ زیاد هستند. مطالعات درباره باکتریها و ویروسهای دامی نشان دادهاند که پرتوتابی، عفونتزایی ویروسها را از بین میبرد و آنتیژنسیتی آنها بدون تغییر میماند و تیمارهای شیمیایی روی ویژگیهای آنتیژنیک اثر میکنند مگر اینکه این مواد شیمیایی از محیط واکسن حذف یا خنثی شوند (9، 12، 14 و 20). در پژوهش حاضر، از عامل غیرفعالکننده پرتوی یونساز گاما استفاده شد. مزیتهای استفاده از پرتوی گاما به جای مواد شیمیایی عبارتند از: باقیماندههای توکسیک و آلرژیک مواد شیمیایی استفادهشده برای غیرفعالسازی ویروس در محصول نهایی واکسن پرتوتابیشده وجود ندارند؛ به دلیل قدرت نفوذ بسیار زیاد پرتو گاما که تنها دیوار سربی مانع نفوذ آن میشود، امکان فرار ذرههای ویروسی از تیمار با پرتو وجود ندارد و خطر ابتلا به بیماری پس از واکسیناسیون از بین میرود ولی در واکسن های غیرفعال به روش شیمیایی امکان فرار ذرههای ویروسی زنده از تیمار با ماده شیمیایی وجود دارد؛ پرتودهی در دمای کم انجام میشود و مدت زمان پرتودهی مطابق استانداردهای موجود فقط چند دقیقه است و بنابراین امکان تغییر پروتئینهای آنتیژنتیک ویروس در روش پرتوتابی وجود ندارد و با کمشدن زمان پرتوتابی توان سیستم تولید واکسن در واحد زمان افزایش مییابد (3، 4، 5 و 21).
لمباردو و اسمولکو (1990) از پرتوی گامای تابششده از چشمه کبالت 60 برای غیرفعالسازی ویروس تب برفکی و تهیه واکسن با کیفیت آنتیژنیک خوب برای آن استفاده کردند (12). اسمولکو و لمباردو (2005) پرتوتابی گاما را برای غیرفعالسازی نسبی یا کامل ویروسهای تب برفکی، هرپس سیمپلکس ویروس و RLV استفاده کردند و نشان دادند که منحنی غیرفعالسازی به ویروس و سایر پارامترهای خارجی مانند دوز، نوع پرتو، دمای پرتوتابی و طبیعت مواد ویروسی طی فرایند پرتوتابی بستگی دارد. نتیجه درخور توجه پژوهش یادشده، کاربرد تئوری هدف برای غیرفعالسازی ویروس تب برفکی بود که بهطور موفقیتآمیزی به آنتیژن پرتوتابیشده غیرفعال این ویروس بهصورت واکسن ضد بیماری تب برفکی منجر شد. همچنین، مقدار یک میلیون دوز این واکسن بهطور تجاری تولید شد و گوسالهها را در برابر بیماری محافظت کرد (14). شریف و مول باچر (2010) نشان دادند که ویروس آنفولانزا A غیرفعالشده با پرتوی گاما، نامزد واکسن پیشنهاد میشود و متوجه شدند که تجویز داخل بینی ویروس Flu A/RR/8 پرتوتابی گاما شده بهشکل تک دوز باعث القای پاسخ ایمنی متقاطع در عفونتهای هتروساب تایپی ازجمله سویه آنفولانزای پرندگان H5N1 میشود. بنابراین، روش تهیه ویروس آنفولانزای پرتوتابیشده با پرتوی گاما، فناوری جدیدی برای تهیه واکسن آنفولانزا با اثر حفاظتی متقاطع شد (22). فورویا و همکاران در دانشگاه ملی استرالیا (2010)، اثر روشهای غیرفعالسازی بر پاسخ ایمنی متقاطعی را بررسی کردند که ویروسهای آنفولانزا A کشتهشده القا میکنند. آنها با بررسی کارایی ویروسهای غیرفعالشده با اشعه ماورای بنفش، فرمالین و پرتوی گاما برای القای پاسخ ایمنی در آزمون چلنج بر ضد ویروس هترولوگ و همولوگ نشان دادند که فعالیت هماگلوتیناسیون در ویروس غیرفعالشده با پرتوی گاما و ویروسهای غیرفعالشده با فرمالین و اشعه ماورای بنفش بهترتیب سه و ده برابر کاهش داشته است. از این رو پرتوتابی گاما در مقایسه با سایر روشهای غیرفعالسازی، کمترین اثر تخریبی را روی ساختار پروتئینی ویروس دارد و ویروس غیرفعالشده با پرتوی گاما برخلاف ویروس غیرفعالشده با دو روش دیگر باعث القای ایمنی در ویروسهای هتروساب تایپ میشود. همچنین، ویروس غیرفعالشده با پرتوی گاما برخلاف ویروسهای غیرفعالشده با فرمالین و اشعه ماورای بنفش باعث القای پاسخ ایمنی سلولی از نوع تی سایتوتوکسیک[xx] میشود. واکسن آنفولانزای غیرفعالشده با پرتوی گاما، ایمونوژنیستی غالبی در مقایسه با سایر روشهای رایج غیرفعالسازی تجاری دارد و باعث اثر حفاظتی بیشتری در مقابله با عفونتهای هموتایپ و هتروتایپ این ویروس میشود که به کاهش پاسخ التهابی ریه و میزان ویروس در ریه میزبان منجر میشود (23). معتمدی و همکاران (1385)، ویروس تب برفکی (FMDV type A87/IRN) را با پرتوی گاما ساطع از چشمه کبالت 60 غیرفعال کردند و پس از فرمولاسیون بهعنوان رادیوواکسن برای ایجاد ایمنی هومورال در خوکچه هندی استفاده کردند (9 و 24).
با توجه به مزایایی که واکسن پرتوتابیشده نسبت به واکسن غیرفعال با مواد شیمیایی دارد و نیز شیوع سه سویه ویروس تب برفکی در ایران (A05، O Panasia و Asia 1)، آمادهسازی و آزمون واکسن پرتوتابی برای هر کدام از سویهها بهطور جداگانه ضروری بود. در پروژهای مشترک بین پژوهشگاه علوم و فنون هستهای و مؤسسه تحقیقات واکسن و سرمسازی رازی، واکسن پرتوتابیشده برای تایپ O Panasia ویروس تب برفکی بررسی و نتایج رضایتبخشی یافت شد (25). نتایج پژوهش حاضر مشخص کردند که رادیوواکسن تهیهشده برای تایپ آسیا-1 ویروس تب برفکی باعث ایجاد پاسخ ایمنی هومورال حفاظتی (تولید آنتیبادی با تیتر بیش از 1/2) و ایمنی سلولی (تکثیر بیشتر لنفوسیتهای طحال و میزان اینترفرون گامای بیشتر) مناسب در خوکچه هندی میشود. از نظر تولید اینترفرون گاما نیز حیوانات واکسینهشده با رادیوواکسن، غلظت بیشتری را نشان دادند و بنابراین، تحریک لنفوسیتهای T کمککننده کلاس یک در رادیوواکسن بهتر از واکسن مرسوم انجام میشود. از آنجا که غلظت اینترلوکین 4 در هر دو گروه واکسینهشده نسبت به شاهد معنادار نبود، هیچیک از دو نوع واکسن، لنفوسیتهای T کمککننده کلاس دو را تحریک نمیکنند. پیشنهاد میشود بررسیهای ایمونولوژیکی کاملتر ازجمله اندازهگیری میزان اینترلوکین 2 و 10 و اثر بر لنفوسیتهای T سیتوتوکسیک در پژوهشهای آتی انجام شوند و در نهایت، رادیوواکسن تولیدشده در میزبان اصلی، گوساله، آزمون شود.
[1]- kbp
[2]- Asia-1
[3]- TCID50
[4]- MDS Nordion
[5]- Fricke
[6]- D10 Value
[7]- BHK21
[8]- 108.5 TCID50/ml
[9]- Al (OH)3
[10]- Cell Proliferation Kit 1 (MTT)- Roche
[11]- CPE
[12]- IFN-γ
[13]- T-helper1
[14]- IL4
[15]- T-helper2
[16]- eBioscience
[17]- Anowa One-way (LSD method)
[18]- SPSS16
[19]- Reed and Mounch
[xx]- T Cytotoxic Cells
)