نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه مراغه، ایران
2 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه مراغه، ایران
3 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه پاریس، فرانسه
4 استاد مهندسی بیوشیمی، دانشگاه سوربون، فرانسه
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Laccases (EC 1.10.3.2; benzenediol: oxygen oxidoreductase) are copper-containing oxidases that use molecular oxygen to oxidize various aromatic and non-aromatic compounds. Laccase is applied in delignification of lignocellulosic compounds for production of bioethanol, bioremediation of industrial wastewaters especially textile, food industries, and making biosensors.
Materials and methods: The Taguchi experimental design method was used for optimization of laccase production in recombinant strain Yarrowia lipolytica YL4. A L-16 Taguchi orthogonal array was used to optimize the carbon and nitrogen sources along with vitamin in four levels.
Results: The results showed that glucose, ammonium chloride, yeast extract and thiamine have significant effects on the production of laccase, respectively. The laccase activity reached to 1.52 U/mL after optimization of medium which is 7.6-fold higher than un-optimized medium.
Discussion and conclusion: According to the analysis of results, the Taguchi experimental design method is a successful approach to increase laccase and recombinant proteins production in Y. lipolytica.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
لاکاز (بنزودیول اکسیژن اکسیدوردوکتاز، EC 1.10.3.2) از آنزیمهای اکسیدوردوکتاز حاوی مس است که اکسیژن مولکولی را برای اکسیدکردن ترکیبات آروماتیک و غیرآروماتیک استفاده میکند (1). لاکازها، گلیکوپروتئینهای دایمر یا تترامری هستند که چهار اتم مس به ازای هر مونومر دارند (2).
لاکاز در رنگزدایی رنگهای صنعتی در پسابها، اکسیداسیون و حذف ترکیبات فنلی و زنوبیوتیکها کاربرد (3 و 4) و توانایی دپلیمریزهکردن لیگنین را دارد (5). بهتازگی، کاربرد لاکاز بهعنوان کاتالیزور زیستی در سنتز ترکیبات آلی درخور توجه بسیار شده است و این آنزیم با داشتن توانایی پلیمریزهکردن مواد، در صنایع غذایی کاربرد دارد (6). نخستین بار یوشیدا در سال 1883، لاکاز را در شیرابه درختان لاکی چینی یا ژاپنی کشف کرد که به وفور در بافتهای گیاهان یافت میشود. شناسایی و خالصسازی لاکاز از عصاره گیاهی خام دشوار است و بنابراین، لاکازهای گیاهی کمتر شناخته و استفاده شدهاند. لاکازهای قارچی بیشتر در بازیدیومایستها و آسکومایستها یافت میشوند (7 و 8).
یارروویا به خانواده همیآسکومایستها تعلق دارد که در پژوهشهای بنیادی و زیستفناوری طی دهههای گذشته به آن توجه شده است (9 و 10). سویه یارروویا لیپولیتیکا از محیطهای مختلفی مانند محیطهای غنی از لیپید یا محیطهای دریایی و شور جداسازی و توانایی آن در تجزیه پروتئینها و لیپیدها با تولید لیپازهای خارجسلولی و فعالیتهای پروتئیولیتیکی بهروشنی مشاهده شده است. بیشتر سویههای یارروویا در دماهای بیشتر از 32 درجه سانتیگراد رشد نمیکنند و بهشدت هوازی هستند (11–13). مخمر یارروویا لیپولیتیکا میزبان یوکاریوتی جذاب برای تولید پروتئینهای هترولوگ است و گنجایش ترشحی زیادی برای پروتئینهای هترولوگ و نوترکیب دارد (14 و 15).
طراحی آزمایش به یافتن ارتباط بین عوامل آزمایششده و تولید محصول کمک میکند (16). روش تاگوچی شامل طراحی سیستم، طراحی عامل و طراحی تعادل فرایندهاست تا فرایند به بهترین کیفیت محصول منتج شود. مزیت عمده روش تاگوچی استفاده از طراحی عوامل است که روشی مهندسی برای طراحی فرایند یا محصول با تمرکز روی تعیین عوامل است تا بهترین سطوح شاخص کیفیت را با حداقل خطا ایجاد کند. روش تاگوچی روشی کارا و قوی برای طراحی فرایندهایی است که بهشکل مداوم و بهینه در شرایط گوناگون عمل میکنند (17).
هدف پژوهش حاضر، بهینهسازی تولید آنزیم نوترکیب لاکاز در محیطکشت حاوی گلوکز (منبع کربن) توسط مخمر یارروویا لیپولیتیکا با روش تاگوچی است.
مواد و روشها.
ریزموجودات استفادهشده و نگهداری آنها: لاکاز قارچ پوسیدگی سفید ترمتس ورسیکالر[1] (lacIIIb)با همکاری گروه پژوهشی کاترین مادزاک[2] در مرکز ملی پژوهشهای کشاورزی فرانسه (INRA) و کلاد جولیولت[3] در دانشگاه سوربون فرانسه با وکتور کامل بیانی/ترشحی بر پایه پروموتور هیبرید قوی در مخمر یارروویا لیپولیتیکا بیان شده است. میزان لاکازی که مخمر نوترکیب یارروویا لیپولیتیکا سویه YL4 تولید میکند، حدود 2/0 واحد در میلیلیتر گزارش شده است (14 و 18). سویه مخمر در دمای 4 درجه سانتیگراد درون محیط کشت YPD (حاوی 10 گرم در لیتر عصاره مخمر،20 گرم در لیتر گلوکز و پپتون در لیتر) به مدت 6 ماه نگهداری میشود (19).
سنجش فعالیت لاکاز: سنجش استاندارد فعالیت لاکاز با اندازهگیری اکسیداسیون آنزیمی ABTS[4] در 420 نانومتر (cm-1M-1104× 6/3=ɛ برای محصول اکسیدشده) انجام میشود (18). برای تهیه محلول رویی حاوی آنزیم، 1 میلیلیتر محیطکشت به مدت 5 دقیقه در 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. 10 میکرولیتر از محلول رویی حاصل به 50 میکرولیتر ABTS 1 میلیمولار در بافر سیتریکاسید/ هیدروژنفسفاتدیسدیم (1/0 مولار با اسیدیته 3) با دمای 30 درجه سانتیگراد اشباعشده با هوا اضافه شد. سینتیک فعالیت آنزیم با دستگاه اسپکتروفتومتری طی 1 دقیقه و در طول موج 420 نانومتر بررسی شد. 1 واحد در میلیلیتر (U/mL) فعالیت آنزیم، مقداری از آنزیم است که 1 میکرومول از ABTS را طی 1 دقیقه و در دمای 30 درجه سانتیگراد اکسید میکند (18).
سنجش میزان رشد: برای بررسی و اندازهگیری میزان رشد مخمرها از روش مستقیم شمارش با لام نئوبار استفاده شد (20).
فرایند تخمیر تولید لاکاز در ارلن: ابتدا سویه مخمر در شرایط استریل روی محیطکشت YPD [5] جامد کشت و برای مدت 24 ساعت درون انکوباتور با دمای 29 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس در شرایط استریل، یک کلنی به 20 میلیلیتر محیط YPD مایع در ارلن 100 میلیلیتری منتقل شد و درون انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتیگراد و دور چرخش 200 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از 24 ساعت، مایه تلقیح آماده شد. محیطکشت تولید لاکاز یعنی محیطکشت PPB[6] (حاوی 20 گرم گلوکز، 32/0 گرم عصاره مخمر، 32/1 گرم دیهیدروژنپتاسیمفسفات، 32/1 گرم کلریدآمونیم، 132/0 گرم سولفاتمنیزیم و 334/0 میلیگرم تیامین در لیتر) به مقدار 50 میلیلیتر در ارلن 250 میلیلیتری به میزان 1 درصد تلقیح شد. نمونهبرداری برای شمارش سلولهای مخمر و سنجش فعالیت لاکاز انجام شد و سپس ارلنهای تلقیحشده به شیکر-انکوباتور با دمای 29 درجه سانتیگراد و دور چرخش 200 دور در دقیقه منتقل شدند و در مدت 7 روز، هر 24 ساعت نمونهبرداری برای بررسی میزان رشد مخمر و سنجش تولید لاکاز در شرایط استریل انجام شد (18).
طراحی آزمایش به روش تاگوچی: برای طراحی آزمایش از نرمافزار (Nutek Inc., MI) Qualitek-4استفاده شد. در این روش، ابتدا عامل و سطوح پیشبینی و وارد نرمافزار میشوند. پس از واردشدن نتایج آزمایش حاصل از سه تکرار، نرمافزار دادهها را با روش میانگین تجزیه و تحلیل و مقدار بهینه را برای عامل پیشنهاد میکند و بر اساس آن باید آزمایش تأییدی انجام شود. عامل اصلی پژوهش حاضر، مقدار گلوکز (منبع کربن)، عصاره مخمر و کلریدآمونیم (منابع نیتروژن) و ویتامین تیامین در چهار سطح بود که مقادیر در نرمافزار وارد شدند (جدول 1) و بر اساس آنها، نرمافزار شانزده آزمایش را پیشنهاد کرد (جدول 2). 50 میلیلیتر از محیطکشت طبق جدول 2، در ارلنهای 250 میلیلیتری ریخته و اتوکلاو شد. در شرایط استریل، 1 درصد مایع تلقیح از سویه مخمر به همه محیطها اضافه شد. سپس ارلنها به درون انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتیگراد و سرعت چرخش 200 دور در دقیقه منتقل شدند و هر 24 ساعت طی 7 روز در شرایط استریل از ارلنها نمونهبرداری شد تا تعداد مخمرها و میزان تولید آنزیم بررسی شود. پس از انجام آزمایشها، مطابق با آنچه نرمافزار با در نظرگرفتن سهم هر یک از عوامل در آزمایش در نظر میگیرد، مقدار سطوح بهینه هر عامل پیشنهاد میشود.
آزمایشها برای سطوح مختلف منبع کربن (گلوکز)، منابع نیتروژن (کلریدآمونیم و عصاره مخمر) و ویتامین تیامین مشخصشده در جدول 1 طراحی شدهاند.
جدول 1- عوامل و سطوح منتخب برای بهینهسازی به روش تاگوچی
|
عامل |
سطح یک |
سطح دو |
سطح سه |
سطح چهار |
|
گلوکز |
50 |
100 |
150 |
200 |
|
کلریدآمونیم |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
عصاره مخمر |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
تیامین |
0 |
3/0 |
6/0 |
9/0 |
سطوح برای گلوکز، کلریدآمونیم، عصاره مخمر گرم بر لیتر و برای تیامین میلیگرم در لیتر است.
جدول 2- آزمایشهای طراحیشده (آرایههای متعامد M-16) به روش تاگوچی
|
شماره آزمایش |
منبع کربن |
کلریدآمونیم |
عصاره مخمر |
تیامین |
|
آزمایش شماره 1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
آزمایش شماره 2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
|
آزمایش شماره 3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
|
آزمایش شماره 4 |
1 |
4 |
4 |
4 |
|
آزمایش شماره 5 |
2 |
1 |
2 |
3 |
|
آزمایش شماره 6 |
2 |
2 |
1 |
4 |
|
آزمایش شماره 7 |
2 |
3 |
4 |
1 |
|
آزمایش شماره 8 |
2 |
4 |
3 |
2 |
|
آزمایش شماره 9 |
3 |
1 |
3 |
4 |
|
آزمایش شماره 10 |
3 |
2 |
4 |
3 |
|
آزمایش شماره 11 |
3 |
3 |
1 |
2 |
|
آزمایش شماره 12 |
3 |
4 |
2 |
1 |
|
آزمایش شماره 13 |
4 |
1 |
4 |
2 |
|
آزمایش شماره 14 |
4 |
2 |
3 |
1 |
|
آزمایش شماره 15 |
4 |
3 |
2 |
4 |
|
آزمایش شماره 16 |
4 |
4 |
1 |
3 |
نتایج.
برای بهینهسازی تولید لاکاز در محیطکشت PPB حاوی گلوکز، طراحی آزمایش به روش تاگوچی برای تعیین سطوح مناسب عوامل اصلی استفاده شد. در روش تاگوچی، چهار عامل گلوکز، عصاره مخمر، کلریدآمونیم و تیامین در چهار سطح، عوامل اصلی در نظر گرفته شدند (18). اثر گلوکز بهعنوان منبع کربن و عامل اول در محدوده 50 تا 200 گرم در لیتر (در چهار سطح 50، 100، 150 و 200 گرم در لیتر)، کلریدآمونیم و عصاره مخمر بهعنوان منابع نیتروژن و بهترتیب عامل دوم و سوم در محدوده غلظتهای 1 تا 4 گرم در لیتر (در چهار سطح 1، 2، 3 و 4 گرم در لیتر) و تیامین بهعنوان ویتامین و عامل چهارم در محدوده 0 تا 9/0 میلیگرم در لیتر (در چهار سطح 0، 3/0، 6/0 و 9/0 میلیگرم در لیتر) روی تولید لاکاز بررسی شد. این عوامل و سطوح آنها به نرمافزار Qualiteck-4 وارد شدند و نرمافزار، شانزده آزمایش را پیشنهاد کرد. پس از ساخت محیطکشتها و تلقیح و گذشت 6 روز که زمان اوج تولید است، سنجش لاکاز انجام و نتایج به نرمافزار وارد شد. میزان تولید لاکاز برای شانزده آزمایش پیشنهادی نرمافزار پس از شش روز در شکل 1 دیده میشود.
نتایج آزمایشها با نرمافزار تجزیه و تحلیل و مطابق شکل 2 مشخص شد که سطح دو گلوکز (100 گرم در لیتر)، سطح دو عصاره مخمر (2 گرم در لیتر)، سطح سه کلریدآمونیم (یعنی 3 گرم در لیتر) و سطح سه تیامین (6/0 میلیگرم در لیتر)، سطوح مناسب چهار عامل مؤثر در محیطکشت برای تولید لاکاز هستند.
شکل 1- نتایج تولید لاکاز برای شانزده آزمایش طراحیشده به روش تاگوچی در محیط PPB حاوی گلوکز پس از 6 روز
شکل 2- اثر اصلی تغییر سطح هر یک از عوامل بر روند بهینهسازی تولید لاکاز توسط مخمر یارروویا لیپولیتیکا سویه YL4
جدول 3، تأثیر هر سطح از هر عامل را بر تولید بهینه لاکاز در سویه یادشده نشان میدهد؛ مطابق این جدول، برهمکنش گلوکز و کلریدآمونیم با 50 درصد اثر، بیشترین تأثیر را بر تولید لاکاز داشته است و پس از آن، اثر برهمکنش کلریدآمونیم و عصاره مخمر با مقدار 46 درصد در جایگاه دوم قرار دارد. برهمکنش گلوکز و عصاره مخمر اثری برابر 42 درصد، برهمکنش عصاره مخمر و تیامین 12 درصد تأثیر و در نهایت، برهمکنش گلوکز و تیامین با 5/5 درصد کمترین تأثیر را بر تولید لاکاز دارند.
جدول 3- برهمکنش چهار عامل گلوکز، کلریدآمونیم، عصاره مخمر و تیامین بر تولید لاکاز
|
شماره |
عوامل برهمکنشدهنده |
ستونها |
درصد اهمیت |
|
1 |
گلوکز×کلرید آمونیم |
2×1 |
16/50 |
|
2 |
کلریدآمونیم×عصاره مخمر |
3×2 |
51/46 |
|
3 |
گلوکز×عصاره مخمر |
3×1 |
08/42 |
|
4 |
کلریدآمونیم×تیامین |
4×2 |
87/21 |
|
5 |
عصاره مخمر×تیامین |
4×3 |
79/12 |
|
6 |
گلوکز×تیامین |
4×1 |
53/5 |
روش تاگوچی، بهینهسازی پیچیده فرایندهای زیستی را تسهیل و بهآسانی اثر هر عامل را بر پایه رابطه بین متغیرها و شرایط بهینه شناسایی میکند. پس از مشخصشدن عوامل اصلی و سطوح مناسب آنها، نرمافزار آزمایشی را برای بیشترین تولید لاکاز پیشنهاد کرد؛ در طرح پیشنهادی مقدار گلوکز 100گرم در لیتر، کلریدآمونیم 3 گرم در لیتر، عصاره مخمر 2 گرم در لیتر و تیامین 6/0 میلیگرم در لیتر در نظر گرفته شد. بهینهسازی محیط تخمیر برای رشد بهینه میکروبی و افزایش تولید آنزیم انجام میشود (21). نرمافزار، بیشترین مقدار تولید آنزیم لاکاز مورد انتظار را 843/0 واحد در میلیلیتر پیشبینی کرده بود؛ با انجام آزمایش بر اساس عوامل و سطوحی که نرمافزار پیشنهاد کرد، تولید لاکاز به 52/1 واحد در میلیلیتر رسید که میزان تولید نسبت به محیطکشت PPB غیربهینه، 6/7 برابر شد.
بحث و نتیجهگیری.
سینگهال و همکاران از روش تاگوچی برای بهینهسازی تولید لاکاز در قارچ کریپتوکوکوس آلبیدوس استفاده کردند. مقادیر تعیینشده نرمافزار برای اسیدیته به میزان 6، گلوکز (منبع کربن) به مقدار 1/0 درصد، پپتون گوشت (منبع نیتروژن) به مقدار 5/0 درصد، سولفاتمس به مقدار 2 میلیمول بر لیتر و مایع تلقیح به مقدار 1 درصد بود. پس از بهینهسازی، میزان تولید لاکاز به 2 واحد در میلیلیتر افزایش یافت. مایع تلقیح با حدود 52 درصد، بیشترین تأثیر و اسیدیته با مقدار 7 درصد، کمترین تأثیر را بر تولید لاکاز داشتند (22).
در مطالعه دیگری شرایط کشت غوطهور برای اینکه سویه تریکودرما آسپرلوم، لاکاز تولید کند با آرایههای متعامد تاگوچی بهینهسازی شد. عوامل اسیدیته، گلوکز، سبوس گندم، سیتراتآمونیم، میزان مایع تلقیح، عصاره مخمر، سولفاتمس و محلول نمکهای معدنی در سطوح آرایههای متعامد در طراحی آزمایشها انتخاب شدند. نرمافزار Qualitek-4، هجده مجموعه آزمایش را طراحی کرد که شرایط بهینه پیشبینیشده نرمافزار اسیدیته 5/4، گلوکز 1 درصد وزن بر حجم، سبوس گندم 2 درصد وزن بر حجم، سیتراتآمونیم 02/0 درصد، مایع تلقیح 5 درصد، عصاره مخمر 1 درصد، سولفاتمس 5/0 میلیمولار و محلول نمکهای معدنی 15 درصد بود؛ با این شرایط بهینه پیشبینیشده، میزان تولید لاکاز به اندازه 76/56 درصد افزایش یافت (23).
پاتل و همکاران، اهمیت منابع کربن و نیتروژن و تأثیر آنها بر تولید لاکاز توسط سویه پلوروتوس آستریتوس را بررسی کردند. تأثیر منابع کربن و نیتروژن بر میزان لاکازی که قارچهای تولیدکننده لاکاز تولید میکنند، اهمیت بسیاری دارد. پژوهشهای بسیاری درباره اهمیت نوع و غلظت منابع نیتروژن با هم توافق دارند و این پارامتر تنظیمکننده قوی در تولید آنزیمهای تجزیهکننده لیگنین توسط بازیدیومایستهای پوسیدگی چوب است. غلظتهای متفاوت کربن، میزان فعالیت لاکاز مختلفی را نشان میدهند؛ زمانی بیشترین فعالیت لاکاز به میزان 3 واحد در میلیگرم حاصل شد که گلوکز به میزان 1 درصد در محیط وجود داشت. غلظتهای استفادهشدنی نیتروژن در محیط، آنزیمهای تجزیهکننده لیگنین را تنظیم میکنند؛ سطح کم نیتروژن، تولید آنزیمهای تجزیهکننده لیگنین را تحریک و سطح زیاد نیتروژن، تولید را محدود میکند. پژوهشهای مشابه درباره غلظت نیتروژن، نتایج گفتهشده را تأیید میکنند (24). در پژوهش حاضر، گلوکز (منبع کربن) و عصاره مخمر و کلریدآمونیوم (منابع نیتروژن) و تیامین (ویتامین و تحریککننده رشد) برای افزایش تولید لاکاز نوترکیب توسط مخمر یاررویا لیپولیتیکا بهینه شدند و نتایج برای بهینهسازی و افزایش پروتئینهای نوترکیب با سیستم بیانی مخمر یاررویا لیپولیتیکا استفاده میشوند.
)