مقدمه.
در سال‌های اخیر آلودگی‌‌های هیدروکربنی ناشی از فعالیت‌‌های مربوط به صنعت نفت، ‌‌یکی از مشکلات زیست‌محیطی مهم است. رهاسازی تصادفی محصولات نفتی در محیط به یک نگرانی جهانی تبدیل شده است. ترکیبات هیدروکربنی از‌‌جمله آلاینده‌های آلی و سرطان‌زا هستند. روش‌‌های مکانیکی و شیمیایی که به‌طور عمومی برای پاک‌سازی آلودگی‌‌های نفتی به کار‌‌ می‌‌روند هزینه‌‌بر هستند و کارایی کمی دارند. پاک‌سازی زیستی از روش‌‌های نویدبخش در تیمار این مکان‌‌های آلوده به شمار می‌‌رود؛ چرا که این روش به انرژی کمی نیازمند است، ‌‌به‌صرفه و اقتصادی است و منجر به معدنی‌سازی کامل آلاینده می‌‌شود (1). رشد میکروارگانیسم‌‌ها بر روی هیدروکربن‌‌های نفتی به‌طور غالب با توانایی تولید پلیمرهایی با خصوصیات کاهش کشش سطحی محیط توسط آنها مرتبط است که به‌طور رایج تحت عنوان بیوسورفکتانت از آنها نامبرده می‌شوند. بیوسورفکتانت‌‌ها ترکیبات دوگانه‌‌دوستی هستند که توسط بسیاری از میکروارگانیسم‌‌ها تولید می‌شوند. وجود گروه‌‌های آب‌دوست و آب‌گریز در ساختار چنین ترکیباتی سبب می‌‌شود این مولکول‌‌ها توانمندی قرارگیری میان دو فاز امتزاج‌ناپذیر و تغییر ویژگی‌های سطحی را دارا باشند (2). یکی از کاربرد‌های مهم بیوسورفکتانت‌‌ها در پاک‌سازی زیستی هیدروکربن‌‌های نفتی است. بیوسورفاکتانت‌‌ها می‌توانند هیدروکربن‌‌ها را امولسیفیه کنند و با کاهش کشش سطحی حلالیت آنها را در آب افزایش دهند و به این ترتیب باعث افزایش جابجایی مواد نفتی از ذرات خاک شوند و دسترسی زیستی میکروارگانیسم‌ها به این ترکیبات را افزایش دهند (2 و 3). حوزۀ‌‌ جداسازی و معرفی باکتری‌‌های مولد بیوسورفاکتانت به‌میزان زیادی مورد مطالعه دانشمندان بوده است؛ ولی تا‌‌کنون تعداد کمی از قارچ‌‌های مولد بیوسورفاکتانت شناسایی و معرفی شده‌اند. قارچ‌‌ها در مقایسه با باکتری‌‌ها از بازده بالایی در تولید این ترکیبات برخوردار هستند که علت آن را می‌‌توان وجود دیوارۀ سخت و محکم در باکتری‌‌ها و همچنین سیستم‌های ترشحی کارآمدتر در قارچ‌ها دانست (4). این بازده تولید بالا می‌‌تواند استفاده از بیوسورفاکتانت‌‌های قارچی در صنعت و جایگزینی سورفاکتانت‌‌های با پایۀ شیمیایی را ممکن سازد (4). میکروارگانیسم‌‌ها بیوسورفکتانت‌‌ها را به‌‌‌‌عنوان متابولیت ثانویه، ‌‌در انتهای فاز لگاریتمی و در طول فاز سکون تولید می‌‌کنند. این ترکیبات بعد از تولید، ‌‌به خارج از سلول ترشح و یا به بخشی از سلول متصل می‌‌مانند. تولید این ترکیبات توسط میکروارگانیسم‌‌ها امکان رشد آنها بر روی سوبستراهای نامحلول را فراهم می‌‌سازد (2). بیوسورفکتانت‌‌ها نسبت به سورفکتانت‌‌های شیمیایی زیست‌‌تخریب‌‌پذیر و سازگار با محیط زیست هستند و دارای سمیت کمتر، ‌‌کارایی و پایداری بیشتر در شرایط سخت ازجمله دما، ‌‌شوری و اسیدیته بالا هستند؛ به این دلیل می‌‌توانند در بسیاری از زمینه‌‌ها از جمله حذف آلاینده‌های نفتی به‌روش زیستی به‌‌‌‌عنوان جایگزینی مناسب برای سورفکتانت‌‌های شیمیایی به کار برده شوند (5). هدف این پژوهش، ‌‌مطالعه و دستیابی به جدایه‌‌های قارچی بومی و توانمند در جهت تولید ترکیبات فعال سطحی و همچنین ارزیابی آن در حذف زیستی نفت خام است. برای این منظور بعد از نمونه‌برداری و جداسازی ایزوله‌های قارچی از محیط‌های آلوده با روش‌های استاندارد میزان تولید ترکیبات فعال درسطح در آنها بررسی می‌شود و فعالیت نفت‌خواری در بهترین جدایه بررسی خواهد شد.
‏‏مواد و روش‏ها.
جمع‌آوری نمونه: به‌‌منظور جداسازی قارچ‌های مولد بیوسورفاکتانت، ‌‌15 نمونه خاک آلوده به نفت از نقاط مختلف پالایشگاه قم، ‌‌شازند اراک، ‌‌خارک، ‌‌بی‌بی حکیمه گچساران و جزیرۀ سیری جمع‌آوری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. نمونه‌‌ها در آزمایشگاه با الک 5/0 میلی‌متر همگن شد و ذرات درشت آن جداسازی شد. در ادامه pH و هدایت الکتریکی خاک‌ها به‌منظور بررسی شوری خاک اندازه‌‌گیری و جهت جداسازی جدایه‌‌ها استفاده شد.
جداسازی قارچ‌‌های تولید‌‌کنندۀ بیوسورفاکتانت: جداسازی قارچ‌‌ها از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده به‌روش غنی‌‌سازی با نفت صورت گرفت. محیط کشت مورداستفاده در فرایند غنی‌‌سازی، ‌‌محیط تغییریافتۀ پایۀ‌ نمکی همراه با یک‌درصد نفت خام سبک جزیرۀ سیری به‌عنوان منبع کربن و 50 میلی‌‌گرم‌برلیتر کلرامفنیکل به‌منظور مهار رشد باکتریایی بود. ترکیبات این محیط کشت شامل (گرم‌برلیتر): NaNO3 (2)، ‌‌CaCl2.2H2O (1/0)، ‌‌KH2PO4 (3)، ‌‌MgSO4 (2/0)، ‌‌FeSO4.7H2O (01/0)، ‌‌Na2HPO4.12H2O (3)، ‌‌KCl (1) و عصارۀ مخمر (02/0) درصد در یک لیتر آب دیونیزه، ‌‌همراه با 2 میلی‌‌لیتر محلول عناصر جزئی شامل (گرم‌‌بر‌‌لیتر): FeCl3.6H2O (08/0)، ‌‌ZnSO4.H2O (75/0)، ‌‌CoCl2.6H2O (08/0)، ‌‌CuSO4.5H2O (075/0)، ‌‌MnSO4.H2O (75/0)، ‌‌NaMoO4.2H2O (05/0)، ‌‌H3BO3 (15/0) بود. تمامی نمک‌‌های به‌‌کاربرده‌شده در محیط کشت مربوط به شرکت مرک آلمان است. pH اولیه پیش از اتوکلاو 0.2±8/6 تنظیم شد (6). 5/0 گرم از هر نمونه خاک درون فلاسک ارلن مایر 250 حاوی 50 میلی‌لیتر محیط‌‌کشت تلقیح شد. سپس فلاسک‌‌‌‌ها به‌‌مدت دو هفته در شیکر با دور 180 و دمای 28 درجه سانتیگراد قرار گرفت. درنهایت رقت‌های 2-10، ‌‌3-10 و 4-10 از هر فلاسک تهیه و بر‌‌ روی پلیت PDA حاوی نفت خام به‌روش کشت گسترده پخش شد و پلیت‌‌ها به‌‌مدت یک هفته در دمای 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری گردید. کلنی‌‌های رشد‌‌کرده درون هر پلیت، ‌‌خالص شد و جدایه‌‌های قارچی خالص‌‌شده در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
غربالگری جدایه‌‌های توانمند در تولید بیوسورفکتانت: محیط کشت مورداستفاده به‌منظور غربالگری جدایه‌‌های به‌‌دست‌آمده حاوی: (3درصد) NaNO3، ‌‌(25/0درصد) KH2PO4، ‌‌(25/0درصد) MgSO4(7H2O)، ‌‌1درصد عصارۀ مخمر و 5درصد روغن آفتابگردان بود و pH آن در 7 تنظیم شد (7). بدین منظور درون هر فلاسک 250 حاوی 50 میلی‌لیتر محیط‌‌کشت یک قطعه یک سانتی‌متر مربع از کشت تازۀ قارچی تلقیح شد. فلاسک‌‌های تلقیح‌شده به شیکر با 150 دور در دقیقه و دمای 28 درجه سانتیگراد منتقل شدند. بعد از 7 روز محتویات هرکدام از فلاسک‌‌‌‌ها سانتریفوژ و مایع رویی از کاغذ صافی عبور داده‌‌ شد. در ادامه روغن باقیمانده با دکانتور جدا شد. درنهایت حضور بیوسورفکتانت در سوپرناتانت مربوط به هر جدایه با‌‌ استفاده از روش گسترش روغن ، ‌‌روش پارافیلم و تنسیومتری بررسی و اندازه گیری شد (8، ‌‌9، ‌‌10 و 11).
روش گسترش روغن: در این روش ابتدا ml40 آب‌‌مقطر درون یک پلیت شیشه‌ای با قطر cm 15 ریخته و µl 20 نفت خام در مرکز این پلیت اضافه شد. سپس µl 10 از نمونۀ‌‌ موردبررسی در مرکز لایۀ‌‌ نفت حاصله ریخته شد و قطر هالۀ‌‌ شفاف ایجاد‌‌شده به‌عنوان معیاری از تولید بیوسورفاکتانت اندازه‌‌گیری شد (8).
آزمون پارافیلم M: ‌‌در این روش، ‌‌25 میکرولیتر از صاف‌شدۀ کشت تخمیر مایع هفت‌روزه از ایزوله‌های قارچی، ‌‌بر روی پارافیلم به‌عنوان یک سطح آب‌گریز آزمایشگاهی قرار داده شد و قطر قطرۀ حاصله به‌عنوان معیاری از تولید بیوسورفاکتانت در مقایسه با نمونۀ شاهد بررسی شد (9، ‌‌10).
تأیید تولید بیوسورفاکتانت با تنسیومتری: ‌‌این کار به‌روش حلقه دونوی انجام شده که اساس آن اندازه‌‌گیری نیروی لازم برای جدا‌‌کردن یک حلقۀ‌‌ سیمی از سطح یا بین دو سطح است که این نیروی جداسازی، ‌‌متناسب با کشش بین سطحی است. به این منظور کشش سطحی سوپرناتانت کشت مایع قارچی با استفاده از دستگاه تنسیومتر دیجیتال مدل اتنشن 701 سنجش شد (11).
شناسایی مورفولوژیک و مولکولی جدایۀ منتخب: جدایۀ قارچی با بیشترین توانمندی در تولید ترکیبات فعال سطحی برای شناسایی انتخاب شد. مورفولوژی ماکروسکوپی (ظاهر، ‌‌اندازه، ‌‌شکل و رنگ کلنی) با مشاهده‌‌ پلیت PDA حاوی میسلیوم‌‌های این جدایه تعیین‌‌ شد. ویژگی‌های میکروسکوپی جدایۀ منتخب نیز با تهیۀ کشت روی لام و رنگ‌‌آمیزی با لاکتوفنل کاتن‌‌بلو تعیین شد (12). به‌‌منظور شناسایی مولکولی، ‌‌ابتدا جدایۀ قارچی در محیط PDB به‌مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. سپس میسلیوم‌‌ قارچی با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا شد و بعد از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته ‌‌شد. در ادامه ازطریق شکستن فیزیکی با کمک روش کوبیدن زیست‌تودۀ منجمدشده با استفاده از ازت مایع، ‌‌سلول‌ها شکسته و DNA حاصل به‌‌‌روش استخراج با فنل-کلروفرم جدا‌‌سازی شد (13). در این روش ابتدا عصارۀ سلولی به‌‌دست‌آمده در میکروفیوژ با دور rpm 8000 به‌مدت 5 دقیقه قرار داده شد. سپس روشناور جداشده که حاوی مولکول‌‌های DNA است، ‌‌به یک ویال استریل منتقل شد. در این مرحله هم‌حجم روشناور، ‌‌از مخلوط فنل-کلروفرم (به‌نسبت 1:1) به ویال افزوده شد. سپس ویال به‌مدت دو دقیقه تکان داده شد تا محتویات آن با هم مخلوط شود. در ادامه ویال در میکروفیوژ با دور rpm 13000 به‌مدت 5 دقیقه قرار داده شد و پس از این مدت‌زمان به‌آرامی ویال‌‌ از درون دستگاه خارج شد تا فاز‌‌ها با هم مخلوط نشوند و فاز رویی درون یک ویال استریل دیگر ریخته شد. در ادامه حجم تقریبی محتوای ویال تعیین شد و به‌میزان 1/0 آن محلول سدیم‌استات 3 مولار با pH برابر 5 و 3 برابر حجم تعیین‌شده اتانول مطلق سرد افزوده شد. سپس ویال به‌مدت 30 دقیقه به فریزر با دمای 20- درجه سانتیگراد منتقل شد. در ادامه فاز رویی با دور rpm 13000 به‌مدت 5 دقیقه جدا و دور ریخته شد و 700 میکرو‌‌لیتر اتانول 70درصد به رسوب DNA افزوده شد و مجدداً با دور rpm 13000 به‌مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شد و فاز رویی موجود در ویال دور ریخته شد. درنهایت رسوب حاصل در 15 تا 20 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شد. واکنش PCR جهت شناسایی مولکولی با دو پرایمر ITS و بتاتوبولین انجام شد. در ابتدا با پرایمرهای اختصاصی قارچی ITS1 و ITS4 (ITS1: 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′ و ITS4: 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) و سپس جهت تأیید نتایج و شناسایی گونۀ قارچی با پرایمرهای بتاتوبولین
(Btsa: 5′-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3′ و BT1b: 5′-GAC GAG ATC GTT GAA CTC-3′) انجام پذیرفت (14). برای اضافه‌کردن مواد جهت انجام واکنش PCR، ‌‌1 میکرولیتر پرایمر رفت و 1 میکرولیتر پرایمر برگشت با غلظت 10 پیکومول به‌همراه 1 میکرولیتر از DNA قارچی با غلظت 40 نانوگرم به 5/12 میکرولیتر مخلوط آماده شرکت آمپلیکون دانمارک اضافه شد و حجم نهایی ویال با آب مقطر استریل به 25 میکرولیتر رسانیده شد. برنامۀ PCR به‌صورت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد تقلیب اولیه انجام شد و در ادامه 30 سیکل دمایی به‌صورت 30 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، ‌‌30 ثانیه در 54 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد انجام شد. درنهایت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد ویال گرمادهی شدند. محصول به‌دست‌آمده بعد از خالص‌سازی از روی ژل جهت تعیین ترادف به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. نتایج تعیین ترادف، ‌‌ازطریق هم‌ردیفی توالی با بانک‌ ژنی NCBI ارزیابی شد. درنهایت سویۀ منتخب در بانک میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران ثبت و نگهداری شد. در رسم درخت‌‌های فیلوژنی، ‌‌از الگوریتم اتصال- همسایگی برای هم‌ردیفی و تعیین فاصلۀ توالی‌‌ها استفاده شد. برای اطمینان از تکرارپذیربودن درخت فیلوژنی، ‌‌میزان بوت استرپ پس از 500 بار تکرار تعیین شد.
بررسی توانمندی جدایۀ منتخب در تخریب نفت خام: جهت تعیین توانمندی حذف و میزان رشد جدایۀ‌ به‌دست‌آمده در نفت خام، ‌‌در ابتدا جدایۀ قارچی با استفاده از روش سنجش کل محتوای هیدروکربنی ازطریق اسپکتروفتومتری براساس روش رحمان و همکاران (15) و نیز اندازه‌‌گیری میزان رشد قارچی (سنجش زیست‌توده خشک) ارزیابی شد. در ادامه نیز با استفاده از روش طیف‌‌سنجی FTIR جهت تأیید میزان حذف ترکیبات نفتی موردسنجش قرار گرفت (16).
در این راستا، ‌‌جدایۀ‌‌ منتخب در محیط کشت پایۀ‌‌ نمکی MSM (نفت به‌عنوان تنها منبع کربن) و نیز PDB (نفت خام به‌عنوان مکمل منبع کربن) دارای 1 و 2درصد نفت خام کشت داده شد. سپس قطعه‌ای با قطر یک سانتیمتر از کشت تازه قارچی هفت‌روزه، ‌‌پانچ شد و به فلاسک‌‌‌‌های ارلن مایر 50 میلی‌‌لیتر حاوی 10 میلی‌لیتر محیط کشت استریل دارای 1درصد نفت خام تلقیح شد. نمونۀ شاهد نیز بدون تلقیح قارچی برای تأیید میزان حذف نفت در نظر گرفته شد. فلاسک‌‌‌‌های تلقیح‌شده در سه تکرار به‌مدت دو هفته در دمای 28 درجه سانتیگراد در شیکر انکوباتور با 180 دور در دقیقه برای رشد و استفاده قارچ‌‌ از هیدروکربن‌های نفتی گرماگذاری شد. پس از گذشت دو هفته، ‌‌فلاسک‌‌‌‌ها جهت استخراج کل محتوای هیدروکربنی و تعیین میزان نفت باقیمانده بررسی شد و میزان جذب نمونه‌های حاصل با دستگاه اسپکتروفتومتر شیماتزو UV160 در طول‌موج 420 نانومتر تعیین گشت. نهایتاً برای تعیین میزان حذف نفت، ‌‌جذب نمونه‌‌های تیمار با نمونۀ شاهد مقایسه شد و میزان حذف گزارش گردید (17).
اندازه‌‌گیری کل محتوای هیدروکربنی: برای آنالیز میزان کلی هیدروکربن‌‌ها از روش جذب پرتو مادون‌قرمز IR استفاده شد. عدد حاصل از این آنالیز با تعداد پیوند‌‌های کربن-هیدروژن موجود در نمونه رابطۀ مستقیم دارد و متناسب با کشش گروه‌‌های CH2 باند‌‌های آلیفاتیکی است (18)؛ به این منظور، ‌‌در انتهای روز 15 محتوای هیدروکربنی باقیمانده در محیط کشت با حلال تتراکلرید کربن استخراج شد و با استفاده از سل مایع، ‌‌طیف جذبی نمونه‌‌ها در باند بین cm-12000 تا cm-13000 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مادون‌قرمز مدل پرکینلمر آنالیز شد. درنهایت میزان حذف نفت با توجه به نمونۀ شاهد تعیین شد (16).
اندازه‌گیری میزان زیست‌توده: به‌منظور سنجش میزان زیست‌توده، ‌‌وزن خشک میسلیوم‌‌های قارچی اندازه‌‌گیری شد. برای این منظور زیست‌تودۀ قارچی حاصل در محیط پایۀ نمکی و دارای 1درصد نفت خام کشت و بعد از اندازه‌‌گیری میزان حذف نفت، ‌‌از محیط کشت با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 1 جدا شد و به‌مدت یک شبانه‌روز در دمای 105 درجه سانتی‌گراد خشک گردید. سپس وزن خشک به‌دست‌آمده بر‌‌اساس گرم‌درلیتر گزارش شد (16).

نتایج.
جداسازی قارچ‌های تولیدکننده بیوسورفاکتانت: ویژگی نمونه‌های مختلف در جدول 1 ارائه شده است. از 15 نمونۀ‌‌ خاک آلوده به نفت جمع‌آوری‌شده با انجام عمل غنی‌سازی40 جدایۀ‌‌ قارچی مختلف با ویژگی‌های مورفولوژیکی متفاوت جداسازی و خالص‌سازی شد و کلونی‌های مشابه جداسازی‌شده از محیط‌های یکسان حذف شدند.
براساس نتایج آزمون پارافیلم M و گسترش روغن از بین 40 جدایۀ حاصل، ‌‌5 جدایۀ برتر به‌عنوان قارچ‌‌های منتخب برای مراحل بعدی انتخاب شد (جدول 2).

جدول 1- نتایج آزمایش‌‌های مربوط به 5 جدایۀ برتر در آزمون‌های بیوسورفکتانت با روش پارافیلم M آزمایشگاهی و گسترش روغن؛ ++ نشان‌دهندۀ‌‌ پخش گستردۀ‌‌ قطره (بالای 10 میلی‌‌متر) و + نشان‌دهندۀ پخش محدودتر (کمتر از 10 میلی‌متر) قطره نسبت به شاهد روی سطح پارافیلم
تست پارافیلم M قطر هاله (cm) در روش گسترش روغن جدایه
++ 5/5 SH-1
+ 4 SH-12
+ 5/4 SH-50
+ 3 SH-53
++ 5/8 SH-02
- 0 شاهد

جدول 2- خاک‌های نمونه‌گیری‌شده از مناطق آلوده به نفت و بررسی برخی از خصوصیات خاک‌ها
محل نمونه‌برداری موقعیت جغرافیایی
(ثانیه-دقیقه-درجه) علت آلودگی EC
(ds/m) pH
خارک 9/40 13 29 N:
5/11 18 50 E: مناطق ذخیرۀ نفت 6 5/6
سیری 51 54 25:N
38 31 54: E پایان/ اصلی صادرات نفت کشور 8/5 3/7
شازند اراک 8 5 34: N
2 41 49: E پالایشگاه نفت 21/3 2/7
بی‌‌بی حکیمه 0 14 30: N
15.2 11 50: E شکستگی در خطوط انتقال نفت 2/7 8

انتخاب جدایۀ برتر براساس کاهش میزان کشش سطحی: کشش سطحی یکی از معیارهای اصلی نشان‌دهندۀ تولید مواد فعال در سطح است. جهت انتخاب برترین جدایه در تولید بیوسورفاکتانت، ‌‌کشش سطحی کشت جدایه‌های منتخب انتخابی سنجش شد. جدول 3 کشش سطحی جدایه‌های ذکرشده و محیط شاهد را نشان می‌‌دهد. با توجه به اینکه کاهش کشش سطحی تا زیر 40 میلی‌‌نیوتن‌‌بر‌‌متر شاخص تولید بیوسورفاکتانت در نظر گرفته می‌شود (19)، ‌‌بررسی تولید بیوسورفاکتانت نشان داد که جدایۀ SH-02 با کاهش قابل‌توجهی در کشش سطحی مایع تخمیر قارچی نسبت به سایر جدایه‌‌ها، ‌‌در تولید ترکیبات زیستی فعال در سطح، ‌‌توانمندتر است و کشش سطحی در محیط را به‌میزان 6/26 میلی‌‌نیوتن‌‌برمتر در مقایسه با آب مقطر 66/69 میلی‌‌نیوتن‌‌برمتر و محیط کشت 6/45 میلی‌‌نیوتن‌‌بر‌‌متر کاهش می‌دهد (جدول 3).

جدول 3- کشش سطحی حاصل از 5 جدایۀ انتخابی
کشش سطحی
(میلی‌‌نیوتن‌‌برمتر) نام جدایه
3/ 0±0/34 SH-1
05/0±1/38 SH-12
3/ ±0/39 SH-50
5/0±41 SH-53
01/0±6/26 SH-02
23/0±66/69 آب
03/0±57/44 محیط کشت بدون تلقیح (شاهد)

برای تعیین زمان حداکثر تولید بیوسورفاکتانت توسط این سویه، ‌‌میزان تولید بیوسورفکتانت در طی 12 روز ارزیابی شد؛ در این راستا، ‌‌هالۀ شفاف تولیدی در روز‌‌های 3، ‌‌6، ‌‌9 و 12 اندازه‌‌گیری شد (شکل1). به این ترتیب با رسم نمودار حاصل، ‌‌مشخص شد که SH-02 بیشترین تولید بیوسورفکتانت را در روز 6 با قطر هالۀ 9 سانت‌متر دارد (شکل2).

شکل 1- آزمون گسترش روغن، ‌‌تولید هالۀ شفاف به قطر 5/8 سانتیمتر با اضافه‌کردن سوپرناتانت کشت SH-02 در روز 7 تخمیر

شکل 2- نمودار تولید بیوسورفکتانت در روز‌‌های مختلف با استفاده از روش گسترش روغن توسط جدایۀ SH-02 ، ‌‌SH-1 SH-53 ، ‌‌SH-50 و SH-12

شناسایی مورفولوژیک و مولکولی جدایۀ منتخب: بررسی‌‌های ریخت‌شناسی کلنی و کشت روی لام تهیه‌شده از قارچ منتخب و آرایش و حالت میکروکنیدی‌های داسی شکل مشاهده شده در جدایۀ SH-02 نشان‌دهندۀ این است که این جدایه به جنس Fusarium شباهت نزدیکی دارد (شکل 3). نتایج به‌‌دست‌آمده از شناسایی مولکولی و تعیین ترادف ژن‌های ITS و بتاتوبولین و مقایسۀ توالی به‌‌دست‌آمده در بانک ژنی NCBI نشان داد که جدایۀ SH-02 با میزان شباهت 99 درصد متعلق به Fusarium sp. است. این جدایه در بانک ژنی با کد دستیابی KT881548 ثبت شد و با کد Fusarium sp. UTMC 5039 در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران ثبت و نگهداری شد.

شکل 3- الف) شمای میکروسکوپی، ‌‌ب) مورفولوژی کلنی Fusarium sp. UTMC 5039

توالی ژن بتاتوبولین قارچ‌های مشابه و جدایۀ SH-02 به‌کمک نرم‌افزار کلاستال X ، ‌‌هم‌ردیف‌‌سازی شد و درخت فیلوژنی آن با الگوریتم اتصال- همسایگی و با استفاده از نرم‌افزار مگا 5 رسم شد. موقعیت فیلوژنی جدایه SH-02 با Fusarium sp. در شکل 4 نشان داده شده است.
.سنجش توانایی تخریب نفت خام توسط Fusarium sp. UTMC 5039: به‌منظور بررسی توانایی حذف UTMC 5039 Fusarium sp. در محیط‌‌های کشت ساده و پیچیده نمودار تولید زیست‌توده و حذف ترکیبات نفتی در محیط‌‌ کشت پایۀ نمکی و محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز براث دارای یک‌درصد نفت خام، ‌‌در طی روزهای 5، ‌‌10، ‌‌15 و 20 بعد از انکوباسیون مورد سنجش کل محتوای هیدروکربنی باقیمانده قرار گرفت. این سویه در هر دو محیط قادر به حذف نفت خام بود (شکل5). نتایج حاصل از این مرحله در شکل 6 و 7 نشان داده شده است. با توجه به نتایج به‌‌دست‌آمده، ‌‌این سویه در حذف نفت خام توانمند است و در محیط پایۀ نمکی به‌میزان 60درصد و در محیط کمپلکس PDB حدود 90درصد ترکیبات نفتی را در طی مدت 20 روز استفاده می‌شود (شکل 6 و 7).


شکل 4- درخت فیلوژنی جدایۀ منتخب SH-02 با استفاده از پرایمرهای بتاتوبولین، ‌‌با الگوریتم اتصال- همسایگی برای هم‌ردیفی و تعیین فاصلۀ توالی‌‌ها و نیز نرم‌‌افزارهای مگا5، ‌‌این جدایه بیشترین نزدیکی را به سویۀ Fusarium sp. UTMC 5039 نشان داد.

شکل 5- حذف زیستی نفت خام Fusarium sp. UTMC5039 در محیط کشت MSM الف) شاهد، ‌‌ب) تلقیح‌شده با قارچ

شکل 6- مقایسۀ درصد حذف و تولید زیست‌توده در محیط پایۀ نمکی دارای یک‌درصد نفت خام توسط سویۀ Fusarium sp. UTMC5039

شکل 7- مقایسۀ درصد حذف و تولید زیست‌توده در محیط PDB دارای یک‌درصد نفت خام توسط سویۀ Fusarium sp. UTMC 5039

نتایج بررسی تعیین توان تحمل شرایط سمی نفت خام توسط Fusarium sp. UTMC 5039، ‌‌در حضور 2درصد نفت خام در دو محیط پایۀ نمکی و کمپلکس در انتهای روز 20 نشان می‌‌دهد که افزایش میزان نفت، ‌‌حذف را به 25درصد در محیط پایۀ نمکی و 43درصد در محیط PDB کاهش می‌دهد. افزایش سمیت و کاهش سطح دسترسی میکروارگانیسم به هوا را می‌توان دلیل این نتیجه عنوان کرد.
در ادامه به‌منظور تخمین دقیق میزان حذف ترکیبات آلیفاتیک موجود در نفت توسط گونۀ Fusarium sp. UTMC 5039 بعد از 20 روز کشت سویۀ موردنظر در محیط پایۀ نمکی حاوی 1درصد نفت خام، ‌‌طیف‌سنجی فروسرخ انجام شد و میزان حذف با توجه به نمونۀ شاهد بدون تلقیح تعیین گردید. نمودار به‌دست‌آمده نشان داد که این گونه بیشتر از 50درصد ترکیبات آلیفاتیک را در مقایسه با نمونۀ شاهد حذف کرده است (شکل 8).


شکل 8- طیف FTIR مربوط به Fusarium sp. UTMC5039 در مقایسه با نمونۀ شاهد

بحث و نتیجه‏‏گیری.
با توجه به اهمیت فوقالعادۀ‌‌ بیوسورفکتانت‌‌ در صنعت در حال حاضر، ‌‌دستیابی به سویه‌‌ای توانمند با بازده بالا از اهمیت زیادی برخوردار است. میکروارگانیسم‌‌های متنوعی شامل باکتری‌‌ها، ‌‌کپک‌‌ها و مخمرها قادر به تولید بیوسورفکتانت هستند؛ ولی اکثر مطالعات صورت‌گرفته در این حوزه مربوط به باکتری‌‌ها است (20). اکثر باکتری‌های تولید‌‌کنندۀ بیوسورفاکتانت گزارش‌شده در مقالات به جنس‌‌هایی از Pseudomonas ، ‌‌Bacillus، ‌‌Acinetobacter و Arthrobacter تعلق دارند که به‌علت بیماری‌زابودن بسیاری از این باکتری‌‌ها، ‌‌کاربرد آنها به‌خصوص در صنایع غذایی و دارویی محدود شده است (21)؛ در این راستا با ‌‌وجود اینکه قارچ‌‌ها توانایی زیادی در تولید ترکیبات فعال سطحی دارند، ‌‌کمتر بررسی شده‌اند و تاکنون تعداد کمی قارچ مورد مطالعه قرار گرفته است. سویه‌‌های معرفی‌شده در این زمینه غالباً مخمرند و متعلق به سه جنس Candida، ‌‌Pseudozyma و Yarrowia هستند. البته اخیراً نیز گزارش‌‌هایی از تولید بیوسورفکتانت توسط گونه‌‌های کپکیCunninghamella echinulata و جنس Aspergillus منتشر شده است (4). براساس یافتههای بودور و همکاران خاکهای آلوده به نفت بازده بیشتری در جداسازی میکروارگانیسم‌‌های مولد بیوسورفکتانت دارند (22). به این منظور جداسازی و غنی‌سازی از خاک‌‌های آلوده به نفت صورت گرفت تا احتمال دستیابی به سویۀ‌‌ مولد افزایش یابد. براساس نتایج رادوان و همکاران تولید بیوسورفکتانت توسط یک میکروارگانیسم وابسته به جذب سوبستراهای آب‌گریز توسط آن میکروارگانیسم است. در این پژوهش علاوه بر نمونه‌گیری از مناطق آلوده به نفت به‌منظور افزایش شانس جداسازی ایزوله‌های توانمند، ‌‌مشاهده شد که در حضور سوبسترای آب‌گریز مانند روغن و نفت این سویه قادر به تولید بیوسورفکتانت است (23).
با مقایسۀ‌‌ نتایج به‌‌دست‌آمده در این پژوهش با مقادیر گزارش‌‌شده در مقالات، ‌‌قارچ منتخب‌‌ Fusarium sp. UTMC 5039 با تولید هالۀ شفاف در آزمون گسترش روغن به‌میزان 9 سانتیمتر مولد بیوسورفکتانت است و کشش سطحی محیط را به‌میزان 6/26 میلی‌‌نیوتن‌‌برمتر کاهش می‌دهد که این میزان کاهش کشش سطحی در مقایسه با مقادیر گزارششده قابل‌توجه است. به‌عنوان مثال در پژوهشی که سیلوا و همکاران انجام داده‌اند، ‌‌قارچ Cunninghamella echinulata به‌‌عنوان مولد بیوسورفکتانت کشش سطحی محیط کشت را به‌میزان 36 میلی‌نیوتون‌برمتر کاهش داد و قطر هالۀ حاصل از آزمون گسترش روغن، ‌‌7/4 سانتیمتر گزارش شد (24). همچنین مطالعۀ عادلی و همکارنش در سال 1392 بر دو گونه از باکتری Shewanella نشان داد که بیشترین قطر هالۀ به‌‌دست‌آمده در تست گسترش روغن تنها 4/1 سانتیمتر است (25). نتایج محمدی و همکارانش در سال 1390 جهت جداسازی سویۀ توانمند در تولید بیوسورفکتانت از حوضچه‌های نفتی نهایتاً منجر به دستیابی به گونه‌ای از جنس Bacillusشد که کشش سطحی را به‌میزان 30 میلی‌‌نیوتن‌‌برمتر کاهش می‌دهد (26). در پژوهشی که مصطفی پور رمی و همکارانش در سال 1393 جهت جداسازی و شناسایی گونه‌های تولیدکنندۀ بیوسورفکتانت از جنس Acinetobacter انجام دادند، ‌‌توانمندترین جدایۀ به‌دست‌آمده تنها قادر به کاهش کشش سطی تا 36 میلی‌‌نیوتن‌‌برمتر است (27). بررسی‌‌های انجام‌شده در زمینۀ‌‌ نقش بیوسورفکتانت‌‌ها در حذف آلودگی‌‌های نفتی، ‌‌ارتباط میان تولید برخی از انواع بیوسورفکتانت‌‌ توسط یک میکروارگانیسم و توانایی آن در حذف آلودگی‌‌های نفتی را تأیید می‌‌کنند. درواقع بیوسورفکتانت‌‌ها می‌‌توانند با کاهش کشش سطحی، ‌‌سوبسترای آب‌گریز نفتی را برای استفاده در ‌‌دسترس میکروارگانیسم قرار دهند. به نظر می‌‌رسد توانایی حذف نفت سویۀ Fusarium sp. UTMC 5039 ارتباط تنگاتنگی با تولید ترکیبات فعال در سطح دارد. درواقع بیوسورفکتانت تولیدشده با خاصیت امولسیفه‌کنندگی باعث حل‌شدن نفت خام در محیط کشت می‌شود و به این ترتیب نفت خام به‌‌عنوان سوبسترا برای این سویه در دسترس قرار می‌‌گیرد. چنان‌که در این پژوهش نیز مشاهده شد، ‌‌در مرحلۀ سنجش توانایی تخریب توسط Fusarium sp. UTMC 5039، ‌‌نفت موجود در فلاسک دارای این سویه نسبت به شاهد و فلاسک‌‌های فاقد سویۀ مولد در روز 7 به‌صورت محلول در محیط کشت درآمد و سویه تا روز 20 قادر به حذف و استفاده 60درصدی نفت خام موجود در محیط به‌عنوان تنها منبع کربن بود. این نتیجه با یافته‌های سایر پژوهشگران دربارۀ اثبات تولید بیوسورفاکتانت و تأثیر آن در افزایش حذف زیستی هم‌راستا است؛ به‌عنوان مثال Gnanamani و همکاران با بررسی پاک‌سازی زیستی آلودگی‌‌های نفت خام با استفاده از جداسازی میکروارگانیزم‌‌های تولیدکنندۀ‌‌ ترکیبات فعال زیستی نشان دادند که تولید بیوسورفاکتانت ارتباط مستقیمی با جذب سوبستراهای هیدروکربنی موجود در محیط دارد و باعث انجام موفق پاک‌سازی زیستی زمین‌‌های آلوده می‌شود (20). نتایج پژوهش‌های محمدی و همکارانش در سال 1390 گونه‌ای از جنس Bacillus است که با تولید بیوسورفکتانت قادر به کاهش کشش سطحی و قادر به حذف 5/81درصد نفت در غلظت 1درصد نفت است (26). براساس مطالعات انجام‌شده در مقالات، ‌‌تاکنون گزارشی از فعالیت تواَمان تولید بیوسورفکتانت و حذف زیستی نفت توسط این گونه منتشر نشده ‌‌است؛ همچنین فعالیت نفت‌‌خواری این گونه در این پژوهش در مقایسه با گزارش‌‌هایی که راجع به نفت‌‌خواری جنس Fusarium منتشر شده‌‌اند حدود 5/1 برابر بیشتر است؛ بنابراین با توجه نتایج حاصل، ‌‌Fusarium sp. UTMC 5039 می‌‌تواند به‌‌عنوان یک سویۀ ارزشمند و مناسب برای تولید بیوسورفاکتانت و پاک‌سازی آلودگی‌‌های نفتی مورد توجه قرار گیرد. شناسایی و خالص‌سازی ترکیب فعال سطحی تولیدشده و همچنین بررسی ارتباط میزان تولید بیوسورفکتانت با میزان حذف نفت و مطالعۀ فعالیت ایزوله در نمونه خاک‌های آلوده می‌تواند در ادامه مورد توجه قرار گیرد.