نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
2 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 دانشیار بیوتکنولوژی، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Cellulose is the most abundant biopolymer in the world. Cellulase, including endoglucanase, cellobiohydrolase and beta-glucosidase, catalyzes the hydrolysis of cellulose. Released glucose from enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass is used in different biotechnology fields.
Materials and methods: In this study, seven different Trichoderma species were obtained from Persian Type Culture Collection (PTCC) and in order to select the best ones, cellulase activity of native strains was determined. Sodium salt of carboxymethyl cellulose (CMC-Na), Avicel and cellobiose were used for endoglucanase, cellobiohydrolase (exoglucanase) and cellobiase (beta-glucosidase) assays, respectively. Kinetics of cellulose production was evaluated for the selected strain. Finally, random mutagenesis with 0.2 M sodium nitrate was done.
Results: Among 7 different fungal species, Trichoderma parceramosum PTCC 5140 was selected as the best strain with the highest cellulase activity. This strain, by production of 0.182 U/ml of endoglucanase, 0.538 U/ml of exoglucanase and 0.109 U/ml of cellubiase, showed the highest amount of all three constituents of cellulolytic complex. Random mutagenesis and mutant selection of this strain caused to isolate 4 stable mutants that were able to produce 2 to 11 fold more enzymes compared with the parent strain.
Discussion and conclusion: Evaluation of cellulase production in mutant strains of Trichoderma parceramosume PTCC 5140 showed that use of chemical mutagenesis with 2 to 11 fold increasing in enzyme activity is a potent method to improve cellulase complex activity. In the current study, obtained mutant strains could be introduced as a potent cellulase producer for further studies in bioconversion processes.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
با رشد روزافزون جمعیت جهان و صنعتیشدن بیشتر کشورها، مصرف انرژی پیوسته در حال افزایش است. به نظر میرسد که تقاضای انرژی در ایران بهطور متوسط سالیانه ۶/۲درصد در سالهای ۲۰۰۳-۲۰۳۰ افزایش یابد. استفاده از انرژیهای تجدیدپذیر بهویژه سوختهای زیستی[1] سبب میشود که ایران شانس بهتری در مبادلۀ منابع انرژی غیرفسیلی داشته باشد و مصرف سوختهای فسیلی را کاهش دهد. در ایران تولید سوختهای زیستی براساس باقیماندههای کشاورزی از پتانسیل بالایی برخوردار است (۱، ۲ و ۳).
ترکیبات لیگنوسلولزی بهفراوانی در طبیعت وجود دارد و میتواند در تولید صنعتی و انبوه بیواتانول بهعنوان مادۀ اولیۀ ارزانقیمت و تجدیدپذیر استفاده شود. سلولز، همیسلولز و لیگنین اجزای اصلی سازندۀ ترکیبات لیگنوسلولزی هستند. جهت استفاده از سلولز لازم است بهکمک تیمارهای مقدماتی، سازمانبندی کریستالی سلولز به هم بخورد و سپس مولکولهای خطی حاصل، به الیگوساکاریدهای کوچکتر و درنهایت به واحد ساختمانی خود یعنی د-گلوکز تبدیل شود. پیشتیمارهای بهکاررفته میتواند فیزیکی، شیمیایی، آنزیمی یا ترکیبی از این روشها باشد تا حداکثر بازده و خلوص قند مدنظر به دست آید (۴ و ۵).
هیدرولیز آنزیمی سلولز یک فرایند پیچیده است که نیاز به مشارکت حداقل سه گروه آنزیم دارد: اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز که بهطور سینرژیستی با یکدیگر عمل میکنند. آنزیم اندو- بتا-1و۴ گلوکاناز[2] یا زیرواحد اندوگلوکاناز، بهطور تصادفی به مناطق درونی بیشکل فیبر سلولز حمله میکند و در آن نواحی پیوندهای بتا ۱و۴ گلیکوزیدی زنجیره سلولز را بهطور تصادفی میشکند و زنجیرههایی با انتهای آزاد ایجاد میکند. کربوکسیمتیل سلولز[3] سوبسترای مناسبی برای این آنزیم است. حاصل عمل این آنزیم، گلوکز و سلوالیگوساکاریدها است. آنزیم اگزو- بتا-۱و۴-گلوکاناز[4] یا زیرواحد اگزوگلوکوناز، بخش عمدۀ کمپلکس سلولاز قارچی را تشکیل میدهد. میزان آن بین ۴۰ الی ۷۰درصد کل پروتئینهای تشکیلدهندۀ سلولاز محاسبهشده است که در اکثر مواقع نواحی بلورین سلولز را هدف قرار میدهد پیوند گلیکوزیدی بتا ۱و۴ را از سر شکسته و از انتهای غیراحیاکننده، زنجیرههای آزاد واحدهای سلوبیوز را جدا میکند. آنزیم بتا-۱و۴-گلوکوزیداز[5] که سلوبیاز هم نامیده میشود، بر خود سلولز بیتأثیر است و واحدهای دوتایی گلوکوزیدی و سلوبیوز و همچنین در برخی موارد الیگوساکاریدهای تولیدشده را هیدرولیز و به گلوکز تبدیل میکند (۶، ۷ و ۸).
در میان میکروارگانیسمها قارچها عامل اساسی تجزیۀ زیستی مواد سلولزی خاک هستند. انواع متعددی از قارچها شامل جنسهای Aspergillus، Fusarium، Trichoderma، Neurospora و Thermomonosporaدارای فعالیت تجزیهکنندگی سلولز هستند. مهمترین گونههای صنعتی مولد سلولاز شاملTrichoderma reesei , Trichoderma viride هستند. از قارچهای دیگر که قادر به تجزیۀ سلولز هستند، میتوان به Fusarium solani، Penicellium، T. koningii و T. viridae اشاره کرد (۹ و ۱۰). قارچها بهدلیل تولید مقادیر فراوان آنزیم سلولولیتیک خارج سلولی و اهمیت آنها در صنعت، مورد توجه زیادی قرار گرفتهاند.
بهدلیل تولید کم محصول، بهندرت از سویههای وحشی جداشده از طبیعت برای تولید تجاری فرآوردۀ مختلف استفاده میشود. استفاده از روشهای مختلف بهسازی و افزایش تولید محصولات مختلف سابقۀ طولانی در زیستفناوری دارد و یکی از مهمترین راهبردها برای این منظور جهشزایی سویۀ وحشی است که بدین منظور میتوان از عوامل جهشزای فیزیکی همچون اشعه ماوراء بنفش و روشهای شیمیایی همچون تیمار با اتیدیوم بروماید و یا اسید نیترو نام برد (11).
برایناساس هدف از انجام این مطالعه بررسی گونههای مختلف جنس Trichoderma موجود در مرکز منطقهای کلکسیون میکروارگانیسمهای صنعتی ایران بهمنظور ارزیابی توانایی آنها در تولید اجزای آنزیم سلولاز بود. سپس از روش ایجاد جهشهای القایی با استفاده از اسید نیترو بهعنوان ابزاری در بهبود سویه استفاده شد. نتایج بهدستآمده در میزان تولید آنزیم در سویههای جهشیافته مقایسه شد و درنهایت، بهترین سویهها با بیشترین میزان تولید زیرواحدهای مختلف آنزیم نسبت به سویۀ وحشی معرفی شدند. معرفی سویههای قارچی جهشیافته با افزایش 2 تا 11 برابری در فعالیت آنزیم سلولاز از جمله یافتههای این پژوهش کاربردی است.
مواد و روشها.
میکروارگانیسمهای موردِاستفادۀ مولد سلولاز: در این پژوهش 7 گونۀ مختلف جنس Trichoderma شامل T.viride PTCC 5157، T. virens PTCC 5300، Trichoderma sp. PTCC 5238،T. reesei PTCC 5142، T. Paraceramosome PTCC 5140، T. longibrachiatum PTCC 5307 و T. longibrachiatum PTCC 5308 از مرکز منطقهای کلکسیون میکروارگانیسمهای صنعتی ایران[6] استفاده شد.
غربالگری قارچهای تولیدکنندۀ سلولاز و انتخاب گونۀ برتر: انتخاب گونۀ برتر از میان ۷ گونۀ تهیهشده براساس فعالیت آنزیمهای سلولولیتیک و وزن خشک سلولی حاصل انجام شد که در ادامه به روش انجام هریک اشاره شده است.
بررسی فعالیت سلولازی سویههای قارچی: ازآنجاکه سلولاز متشکل از سه آنزیم است و سوبسترای موردنیاز آنزیمها جهت فعالیت متفاوتاند، برای تهیۀ محیط تولید آنزیم از دو سوبسترای آویسل و کربوکسیمتیل سلولز استفاده شد. به این صورت که جهت بررسی فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز از سوبسترای کربوکسیمتیل سلولز و جهت فعالیت آنزیمهای سلوبیاز و اگزوگلوکاناز از سوبسترای آویسل استفاده شد. برای این منظور ۸۰ میلیلیتر محیط نمکی مندل حاوی ۱۰ گرم در لیتر آویسل[7] و یا کربوکسیمتیل سلولز همراه با ۱ گرم در لیتر پپتون در ارلن ۲۵۰ میلیلیتر تهیه شد و قارچها در آن کشت داده شدند. محیط کشت مندل علاوه بر منبع کربن و نیتروژن، حاوی محلول نمکی و عناصر ناچیز نیز بود و pH محیط بر روی ۲/۰±۷ تنظیم شد. محیط کشت بهمدت ۵ روز در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد در انکوباتور شیکردار با ۱۵۰دور در دقیقه هوادهی شد و نمونهها از نظر میزان تولید زیستتوده و فعالیت آنزیمهای سلوبیاز، اگزوگلوکاناز و اندوگلوکاناز بررسی شدند. تمامی آزمایشها با سه تکرار انجام شد (۱2 و ۱3).
از روش دینیتروسالیسیلیکاسید[8] جهت تعیین غلظت قندهای احیاکنندۀ حاصل از فعالیت آنزیمها و کیت سنجش گلوکز شرکت پارس آزمون استفاده شد (14و ۱5). جداسازی سوپرناتانت حاصل از فعالیت قارچ جهت بررسی فعالیت آنزیمی توسط فیلتراسیون انجام شد.
بررسی فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز: جهت سنجش فعالیت اندوگلوکانازی، ۲۵/۰ میلیلیتر سوپرناتانت کشت قارچی به ۲۵/۰ میلیلیتر محلول کربوکسیمتیل سلولز 2درصد در بافر سیترات 50 میلیمولار و ۸/۴pH، اضافه شد و در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد بهمدت ۳۰ دقیقه گرماگذاری شد. سپس ۵/۱ میلیلیتر معرف DNS جهت توقف واکنش اضافه شد. نمونهها بهمدت ۵ دقیقه مخلوط و جوشانده شد. پس از سردشدن نمونهها، جذب نوری آنها در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد.
بررسی فعالیت اگزوگلوکانازی: جهت سنجش فعالیت اگزوگلوکاناز بعد از صافکردن محیط کشت، ۵/۰ میلیلیتر بافر ۵۰ میلیمولار و ۸/۴pH، به ۲۵/۰ میلیلیتر سوپرناتانت کشت قارچی افزوده شد و انکوباسیون در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد بهمدت۶۰ دقیقه انجام شد. بهمنظور توقف واکنش ۵/۱ میلیلیتر معرف DNS به مخلوط واکنش اضافه شد. نمونهها بهمدت ۵ دقیقه مخلوط و جوشانده شد. پس از سردشدن نمونهها، جذب نوری آنها در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد.
بررسی فعالیت سلوبیازی: جهت سنجش فعالیت سلوبیاز، ۵/۰ میلیلیتر از سوپرناتانت کشت قارچی بههمراه ۵/۰ میلیلیتر محلول ۱۵ میلیمولار سلوبیوز در بافر سیترات ۵۰ میلیمولار و ۸/۴pH، در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد بهمدت ۳۰ دقیقه انکوبه شد. نمونهها بهمدت ۵ دقیقه مخلوط و جوشانده شد. پس از سردشدن نمونهها، جذب نوری آنها در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد. 10 میکرولیتر از نمونۀ حاصل از واکنش به ۱ میلیلیتر کیت گلوکز اضافه شد و سپس جذب نوری در طول موج ۵۰۰ نانومتر خوانده شد.
تعیین واحد آنزیمی: یک واحد آنزیمی، معرف مقدار آنزیمی است که در هر دقیقه ۱ میکرومول گلوکز را آزاد میکند. برای محاسبۀ واحد آنزیمی از فرمول زیر استفاده شد. در این رابطه بالا ۱۷/۱۹۸ وزن مولکولی گلوکز است.
|
|
وزن خشک سلولی: وزن خشک سلولی بهعنوان شاخص رشد قارچ در محیط کشت تولید آنزیم (مندل) و درنتیجه مقدار مصرف سوبسترا توسط میکروارگانیسم اندازهگیری شد. به این منظور، کشت ۵روزۀ قارچ بعد از فیلتراسیون روی کاغذ واتمن شماره ۱ بهمدت ۲۴ ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد خشک و وزن توده سلولی براساس گرم در لیتر گزارش شد.
بررسی منحنی تولید آنزیم سلولاز توسط PTCC 5140T. parceramosume: برای تعیین بهترین زمان جهت سنجش فعالیت آنزیمی، سینتیک تولید آنزیم سلولاز در گونه پرتولید بررسی شد. برای این منظور ارلنهای۲۵۰ میلیلیتر حاوی۸۰ میلیلیتر محیط نمکی مندل تهیه و در هرکدام یک قطعۀ ۱×۱ سانتیمتری از سطح پلیت PDA [9]حاوی میسلومهای اسپوردارPTCC 5140 T. parceramosumeتلقیح شد. محیط کشت بهمدت ۷ روز در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد در انکوباتور شیکردار با ۱۵۰دور در دقیقه قرار داده شد. میزان تولید آنزیمهای سلوبیاز، اگزوگلوکاناز و اندوگلوکاناز ازطریق سنجش فعالیت هر یک از زیرواحدها بهصورت روزانه بررسی شد. تمامی آزمایشها با سه تکرار انجام شد.
جهشزایی PTCC 5140T. parceramosume بهمنظور افزایش تولید آنزیم سلولاز: در این پژوهش برای ایجاد سویههای جهشیافتۀ مناسب، از روش جهشزایی شیمیایی و تیمار با اسید نیترو استفاده شد. غلظت ۲/۰ مولار از نیتریتسدیم در بافر استات ۲/۰ مولار و اسیدیته ۸/۴ تهیه شد و در مراحل جهشزایی استفاده شد. جهت رسم نمودار درصد بقا، رقتهای سریالی از سوسپانسیون حاوی اسپور قارچی بهتعداد 108 اسپور در میلیلیتر تهیه شد. سپس 1 میلیلیتر از سوسپانسیون حاوی اسپور قارچی به 4 میلیلیتر اسید نیترو اضافه شد و در شیکر با 150 دور در دقیقه و در زمانهای 10،20،30، 40، 45، 50 و 60 دقیقه قرار داده شد. برداشت از نمونه بهمیزان 100 میکرولیتر همراه با افزودن 400 میکرولیتر بافر فسفات صورت گرفت. 100 میکرولیتر از هر رقت به پلیت حاوی محیط کشت تولید آنزیم افزوده شد و انکوباسیون نمونهها در دمای 30 درجه سانتیگراد و بهمدت 3 تا 5 روز انجام شد. شمارش تعداد کلنیهای موجود در هر پلیت مربوط به زمانهای مختلف جهش بهمنظور دستیابی به زمانی که در آن ۹۹/۹۹درصد از اسپورها از بین رفته باشند، انجام شد (16).
انتخاب سویۀ برتر جهشیافته: جهت انتخاب سویۀ جهشیافته برتر از دو روش کیفی (غربال اولیه) و کمی (غربال ثانویه) استفاده شد. در روش کیفی، تشکیل هالۀ شفاف درنتیجۀ هیدرولیز سلولز توسط آنزیم تولیدی همراه با افزودن رنگ قرمز کنگو استفاده شد. بدین منظور محلول ۱/۰درصد قرمز کنگو به محیط کشت اضافه شد و سپس شستشوی پلیت با کلرید سدیم 1 مولار پس از 15 دقیقه انجام شد. فعالیت آنزیم سلولاز با توجه به قطر هالۀ ایجادشده به قطر کلنی سویۀ جهشیافته (H/C) ارزیابی شد. سویههای جهشیافتۀ دارای مقیاس بزرگتر (H/C≥1.5) جهت سنجش کمی انتخاب شدند. جهت بررسی کمی، سوپرناتانت مایع تخمیر توسط فیلتراسیون جداسازی شد و فعالیت آنزیمهای سلولاز برای هر سویه اندازهگیری شد. جهشیافتههایی با توان بالای تولید آنزیم انتخاب شدند (16).
سنجش پایداری در تولید و فعالیت آنزیم سلولاز در سویههای جهشیافته: میزان پایداری تولید و فعالیت آنزیمی سویههای جهشیافته منتخب و همچنین سویۀ وحشی بررسی شدند. بدین منظور سویههای پرتولید 10 بار واکشت داده شدند و درانتها فعالیت آنزیمی در هر سویه منتخب سنجیده شد.
آنالیز آماری: نتایج و اطلاعات بهدستآمده در مراحل مختلف، بهوسیلۀ نرمافزار آماریSPSS ویرایش 19 تجزیۀ آماری شدند. در این پژوهش از آزمون آماری One-way ANOVA، Tukey با ضریب اطمینان 95درصد استفاده شد و سطح معناداری نتایج بهصورت P≤0.05 گزارش شد.
نتایج.
بررسی ماکروسکوپی گونههای Trichoderma: قارچهای کشتشده در محیط مندل از لحاظ رنگ، میزان رشد و ویسکوزیته ظاهری (بهصورت کیفی) محیط بررسی شدند. با توجه به اینکه این محیط حاوی سوبسترای کربوکسیمتیل سلولز بود و از ویسکوزیتۀ بالایی برخوردار بود، کاهش ویسکوزیته در محیط میتواند نشاندهندۀ تولید سلولاز و شکست سوبسترا باشد. نتایج، حاکی از آن بود که در محیط مندلی که از کربوکسیمتیل سلولز بهعنوان سوبسترا استفاده شده بود، ویسکوزیتۀ محیط حاوی سویههای PTCC 5308 وPTCC 5300 پس از گذشت ۵ روز نسبت به سایر سویهها، تغییر چندانی نداشته است. با این حال سویههای PTCC 5307 و PTCC 5140 کاهش ویسکوزیته درنتیجۀ مصرف کربوکسیمتیل سلولز را نشان دادند (جدول1). همچنین براساس نتایج بهدستآمده مشخص شد که دربارۀ محیط مندلی که در آن از آویسل بهعنوان سوبسترا استفاده شده بود نیز سویههای PTCC 5140 وPTCC 5307 نسبت به سایر سویهها رشد بهتری داشتند.
غربالگری قارچهای تولیدکنندۀ سلولاز: غربالگری قارچهای تولیدکنندۀ سلولاز با تعیین وزن خشک سلولی و همچنین بررسی فعالیت زیرواحدهای آنزیم سلولاز انجام شد.
بررسی وزن خشک سلولی: در شکل ۱ وزن خشک حاصل از رشد ۷ گونۀ Trichoderma بر روی دو نوع سوبسترای کربوکسیمتیل سلولز و آویسل در محیط مندل نشان داده شده است. طبق نتایج بهدستآمده در محیطهایی که از کربوکسیمتیل سلولز بهعنوان سوبسترا استفاده شده بود، سویۀ PTCC 5300 بیشترین میزان رشد را داشت و در محیطهایی که از آویسل بهعنوان سوبسترا استفاده شده بود، سویههای PTCC 5157 و PTCC 5308 بیشترین میزان رشد را داشتند. نتایج بیانگر آن بود که لزوماً سویههایی که رشد بالایی دارند، میزان فعالیت آنزیمهای سلولاز آنها بالا نیست، بهطوری که سویۀ PTCC 5140 با رشد متوسط (شکل ۱)، میزان فعالیت آنزیم بسیار بیشتری نسبت به سایر سویهها داشت (شکل ۲).
جدول 1- مشخصات ظاهری رشد گونههای مختلف Trichoderma در محیط حاوی کربوکسیمتیل سلولز و آویسل
|
کد سویه |
|
|
تغییر ویسکوزیته |
|||
|
|
کربوکسیمتیل سلولز |
آویسل |
کربوکسیمتیل سلولز ++ |
آویسل + |
کربوکسیمتیل سلولز |
آویسل |
|
5157 |
کرم روشن |
کرم تیره |
+ |
- |
||
|
5308 |
کرم مات |
زرد روشن |
+ |
+ |
++++ |
+ |
|
5300 |
صورتی روشن |
شیری روشن |
+ |
- |
+++ |
+ |
|
5238 |
صورتی روشن |
شیری کدر |
+++ |
++ |
++ |
- |
|
5142 |
صورتی روشن |
صورتی کدر |
++ |
++ |
++ |
- |
|
5307 |
کرم- قهوه ای |
زیتونی روشن |
+++ |
+++ |
- |
- |
|
5140 |
صورتی |
زیتونی |
++++ |
++++ |
- |
- |
رشد: - عدم رشد و یا تغییر + ضعیف ++ متوسط +++ خوب ++++ خیلی خوب. ویسکوزیته: - عدم تغییر + تا ++++ کاهش گرانروی از ضعیف تا خیلی خوب
شکل 1- وزن خشک حاصل از رشد گونههای قارچ Trichoderma در محیط حاوی آویسل و کربوکسیمتیل سلولز
بررسی فعالیت سلولازی: جهت تعیین بهترین سویه از میان ۷ قارچ تهیه شد و فعالیت آنزیمهای سلوبیاز، اگزوگلوکاناز و اندوگلوکاناز بررسی شدند (شکل ۲). با توجه به نتایج بهدستآمده مشخص شد که سویۀ T. parceramosumeبا داشتن فعالیت اندوگلوکانازی ۱۸۲/۰ واحد در میلیلیتر فعالیت اگزوگلوکانازی ۵۳۸/۰ واحد در میلیلیتر و فعالیت سلوبیازی ۱۰۹/۰ واحد در میلیلیتر بهعنوان سویهای که بالاترین فعالیت را در هر سه آنزیم داشت انتخاب شد. نتایج حاصل از فعالیت سلولازی در (شکل ۲) نشان داده شده است.
شکل 2- فعالیت زیرواحدهای مختلف آنزیم سلولاز حاصل از رشد گونههای مختلف جنس Trichoderma
روند تولید آنزیم سلولاز توسط سویۀ PTCC 5140T. parceramosumeدر محیط تولید آنزیم: بهمنظور تعیین بهترین زمان جهت سنجش فعالیت آنزیمی، روند تولید آنزیم در روزهای مختلف بررسی شد. برای این منظور میزان فعالیت آنزیمهای اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز در ۱ میلیلیتر محیط کشت در زمان یک دقیقه برای هر سه آنزیم و بهصورت روزانه تعیین شد.
شکل 3- تولید آنزیم اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز توسط سویۀ PTCC 5140 T. parceramosume
نتایج بهدستآمده نشان داد که تولید آنزیم اندوگلوکاناز، ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد و با گذشت زمان افزایش یافت. حداکثر میزان تولید آنزیم اندوگلوکاناز در روز ۵ به ۲۳۷/۰ واحد در میلیلیتر رسید و از روز ۷ به بعد بهتدریج کاهش نشان داد (شکل۳). تولید آنزیم اگزوگلوکاناز نیز ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد. حداکثر میزان تولید آنزیم اگزوگلوکاناز در روز ۵ بهمیزان ۲۴۴/۰ واحد در میلیلیتر اندازهگیری شد و از روز ۷ به بعد بهتدریج کاهش یافت (شکل۳). تولید آنزیم سلوبیاز ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد و حداکثر میزان تولید آنزیم سلوبیاز در روز ۵ بهمیزان ۰۵/۰ واحد در میلیلیتر به دست آمد و پس از روز ۷ بهتدریج کاهش یافت (شکل۳).
انتخاب سویۀ برتر جهشیافته: پس از رسم نمودار درصد بقا و بهدستآوردن معادله، 53 دقیقه زمانی است که در آن ۹۹/۹۹ درصد سویهها تحتِتأثیر جهش با اسید نیترو از بین میروند و سویههایی که در این زمان بر روی پلیت تشکیل کلنی میدهند، به احتمال زیاد جهشیافته هستند.
در بررسی کیفی فعالیت آنزیم، از میان 100 پرگنه جهشیافته توسط اسید نیترو، 20 پرگنه که قطر هالۀ آنها بزرگتر از سویۀ والد بودند، بهعنوان سویههای برتر انتخاب شدند. بررسی کمّی فعالیت آنزیم نشان داد که فعالیت اندوگلوکانازی و سلوبیازی سویۀ 19، بهترتیب 8/2 و 2/11 برابر و فعالیت اگزوگلوکانازی سویۀ 10 نسبت به سویۀ والد 3/1 برابر افزایش یافته است (جدول 2).
جدول 2- سنجش فعالیت آنزیمهای اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز سویههای جهشیافته نسبت به سویۀ والد
|
نمونه |
اندوگلوکاناز (واحد در میلیلیتر) |
افزایش فعالیت |
اگزوگلوکاناز (واحد در میلیلیتر) |
افزایش فعالیت |
سلوبیاز (واحد در میلیلیتر) |
افزایش فعالیت |
|
سویه والد |
156/0 |
- |
243/0 |
- |
013/0 |
- |
|
1 |
202/0 |
2/1 |
108/0 |
- |
018/0 |
3/1 |
|
2 |
39/0 |
5/2 |
277/0 |
1/1 |
008/0 |
- |
|
3 |
277/0 |
7/1 |
291/0 |
1/1 |
032/0 |
4/2 |
|
4 |
271/0 |
7/1 |
26/0 |
06/1 |
004/0 |
- |
|
5 |
354/0 |
2/2 |
249/0 |
02/1 |
004/0 |
- |
|
6 |
317/0 |
2 |
092/0 |
- |
021/0 |
6/1 |
|
7 |
275/0 |
7/1 |
152/0 |
- |
041/0 |
1/3 |
|
8 |
199/0 |
2/1 |
073/0 |
- |
008/0 |
- |
|
9 |
318/0 |
2 |
233/0 |
- |
048/0 |
6/3 |
|
10 |
305/0 |
9/1 |
316/0 |
3/1 |
054/0 |
1/4 |
|
11 |
317/0 |
2 |
264/0 |
08/1 |
149/0 |
4/11 |
|
12 |
351/0 |
2/2 |
301/0 |
2/1 |
136/0 |
4/10 |
|
13 |
259/0 |
6/1 |
258/0 |
06/1 |
068/0 |
2/5 |
|
14 |
361/0 |
3/2 |
308/0 |
2/1 |
115/0 |
8/8 |
|
15 |
333/0 |
1/2 |
269/0 |
1/1 |
089/0 |
8/6 |
|
16 |
344/0 |
2/2 |
301/0 |
23/1 |
121/0 |
3/9 |
|
17 |
421/0 |
6/2 |
261/0 |
07/1 |
094/0 |
2/7 |
|
18 |
313/0 |
2 |
269/0 |
1/1 |
059/0 |
5/4 |
|
19 |
451/0 |
8/2 |
265/0 |
09/1 |
146/0 |
2/11 |
|
20 |
375/0 |
4/2 |
274/0 |
1/1 |
069/0 |
3/5 |
براساس نتایج بهدستآمده در جدول 2، سویههای جهشیافته ۱۰، ۱۱، ۱۷ و ۱۹ بالاترین میزان تولید آنزیمهای سلولازی را نسبت به سویۀ والد نشان میدهند.
سنجش پایداری فعالیت آنزیمی در سویههای جهشیافته و والد: بهمنظور تعیین میزان پایداری فعالیت هر یک از زیرواحدهای آنزیم سلولاز، فعالیت آنزیمی سویۀ وحشی در 4 سویۀ جهشیافته و پس از 10 بار کشت مجدد سنجیده شد. نتایج حاصل از میانگین 10 تکرار در جدول 3 ذکر شده است.
جدول 3- میانگین سنجش فعالیت آنزیمهای اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز سویههای جهشیافته نسبت به سویۀ والد (10 تکرار)
|
میانگین فعالیت آنزیم سلوبیاز (واحد در میلیلیتر) |
میانگین فعالیت آنزیم اگزوگلوکاناز (واحد در میلیلیتر) |
میانگین فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز (واحد در میلیلیتر) |
شماره سویه |
|
50/0 |
245/0 |
238/0 |
سویۀ والد |
|
- |
320/0 |
- |
10 |
|
149/0 |
- |
- |
11 |
|
- |
- |
438/0 |
17 |
|
153/0 |
- |
446/0 |
19 |
سویۀ جهشیافتۀ 10 با فعالیت اگزوکلوکانازی320/0 واحد در میلیلیتر و سویۀ جهشیافتۀ شماره 19 با فعالیت اندوگلوکانازی 446/0 واحد در میلیلیتر و فعالیت سلوبیازی 153/0 واحد در میلیلیتر سویۀ جهشیافتۀ شماره 17 با فعالیت اندوگلوکانازی 438/0 واحد در میلیلیتر و سویۀ موتانت شماره 11 با فعالیت سلوبیازی 149/0 واحد در میلیلیتر بهعنوان سویههای جهشیافته انتخاب شدند. نتایج حاصل از پایداری فعالیت آنزیمی نتایج نشان داد که فعالیت اندوگلوکانازی، اگزوگلوکانازی و سلوبیازی در سویههای جهشیافته پس از 10 بار کشت تغییری نداشته و تولید پایدار آنزیم مشاهده شد (جدول3).
بحث و نتیجهگیری.
ترکیبات لیگنوسلولزی بهفراوانی در طبیعت وجود دارد و بهعنوان مادۀ اولیه در تولید صنعتی و انبوه بیواتانول بهعنوان یک مادۀ ارزانقیمت و تجدیدپذیر، میتواند استفاده شود. ترکیب اصلی شیمیایی زیستتوده در منابع لیگنوسلولزی مختلف، متفاوت است؛ اما بهطور کلی از ۲۵درصد لیگنین و ۷۵درصد پلیمرهای کربوهیدراتی سلولز و همیسلولز تشکیل شده است (۴، ۱7 و ۱8).
قبل از استفادۀ میکروارگانیسم از سوبسترای لیگنوسلولزی، چارهای جز هیدرولیز این ترکیبات جهت تولید قندهای قابلِتخمیر نیست. پیش تیمارهای فیزیکی، شیمیایی، آنزیمی یا ترکیبی از این روشها میتواند در آزادسازی قندهای موجود در ساختارهای لیگنوسلولزی به کار برده شود. هیدرولیز آنزیمی بهدلیل شرایط متعادل از نظر pH و دمای فعالیت، معایب روشهای رایج مانند هیدرولیز اسیدی یا قلیایی از جمله خوردگی را ندارد، اختصاصیت و بازده در تولید گلوکز بالا است و ترکیبات سمی کمی تولید میشود در عین حال باید اشاره کرد که در حال حاضر، قیمت تولید آنزیمهای میکروبی تجزیهکننده بالا است (۴، ۵ و ۱9). جهت استفاده از سلولز بهعنوان منبع انرژی، ابتدا سلولز ازطریق هیدرولیز توسط آنزیمهای سلولاز باید به گلوکز تبدیل شود و سپس بهوسیلۀ عمل تخمیر اتانول تولید شود. تولید سلولاز، پرهزینهترین قسمت این فرآیند است به همین سبب کاستن هزینۀ تولید آنزیم سبب کاهش هزینۀ نهایی تولید اتانول خواهد شد؛ علاوه بر این، آنزیم سلولاز موارد کاربرد متعدد دیگری نظیر استفاده در صنایع نساجی و صنایع کاغذسازی دارد (۱7 و 20). میکروارگانیسمهای سلولیتیک قادر به تجزیۀ سلولز هستند و عمدتاً در دو گروه قارچها و باکتریها قرار میگیرند. باکتریها در مقایسه با قارچها آنزیم کمتری تولید میکنند و کارایی کمتری در تولید آنزیم دارند. در حال حاضر روشهای رایج برای بهبود سویه جهت استفاده در صنعت، استفاده از روشهای فیزیکی و شیمیایی برای ایجاد جهش و مهندسی ژنتیک است. با این حال در گام اول باید سویۀ والد توانایی مناسبی در تولید آنزیم داشته باشد. قارچهای تجزیهکنندۀ سلولز از جمله گونههای مخلتف جنسهای Trichoderma، Aspergillus و Penicillium از مهمترین قارچهای تولیدکنندۀ سلولاز هستند و در این میان Trichoderma جهت تولید سلولاز در صنعت بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. به همین دلیل در این پژوهش برای اولین بار گونههای مختلف جنس Trichoderma بررسی شد. در بسیاری از پژوهشهای انجامشده T. reesei بهعنوان سویۀ برتر در تولید سلولاز معرفی شده است (۸، ۹ و ۱۰). در این تحقیق میزان فعالیت زیرواحدهای آنزیم سلولاز در بین ۷ گونه جنس Trichoderma مقایسه شد. نتایج نشان داد که T. parceramosum PTCC 5140 در مقایسه با سایر گونهها توانایی بالاتری در تولید آنزیم سلولاز دارد. این سویه با داشتن فعالیت اندوگلوکانازی ۱۸۲/۰ واحد در میلیلیتر فعالیت اگزوگلوکانازی ۵۳۸/۰ واحد در میلیلیتر و فعالیت سلوبیازی ۱۰۹/۰ واحد در میلیلیتر بهعنوان سویهای که بالاترین فعالیت را در هر سه آنزیم داشت انتخاب شد. بررسی منحنی تولید آنزیم در این سویه نشان داد که تولید آنزیمهای سلولاز، ۲۴ ساعت پس از تلقیح اسپورها در محیط مندل شروع شد و با گذشت زمان افزایش یافت. حداکثر میزان تولید هر سه آنزیم در روز ۵ و بهترتیب بهمیزان ۲۳۷/۰، ۲۴۴/۰ و ۰۵/۰ واحد در میلیلیتر به دست آمد و پس از روز ۷ روند کاهشی داشت. این کاهش احتمالاً بهعلت کمبود مواد غذایی بهخصوص منابع کربنی و درنتیجه تجزیۀ آنزیمهای سلولازی توسط آنزیمهای پروتئازی و مصرف این آنزیمها بهمنظور تأمین رشد سلول است.
استفاده از روشهای کلاسیک و مدرن جهشزایی سویههای صنعتی با استفاده از مواد جهشزایی شیمیایی و یا روشهای فیزیکی و مهندسی ژنتیک بهعنوان مهمترین ابزار بهینهسازی و افزایش تولید از زمانهای گذشته مورد توجه دانشمندان بوده است (21).
چاندرا[x] و همکاران در سال 2009 افزایش تولید آنزیم سلولاز در T. citrinovirideرا ازطریق جهشزایی اتیل، متیل سولفونات و اتیدیوم برماید بررسی کردند. براساس نتایج ارائهشده عنوان شد که جهشزایی شیمیایی این سویه بهمنظور افزایش تولید سلولاز باعث افزایش 14/2، 10/2 و 73/1 برابری بهترتیب در تولید اگزوکلوکاناز، اندوگلوکاناز و سلوبیاز شده است (22). در پژوهش دیگر انجامشده توسط ادسول[xi] و همکاران در سال 2007 بهمنظور افزایش تولید سلولاز ازطریق جهشزایی با اشعۀ ماوراء بنفش و ترکیب شیمیایی اتیل متیل سولفونات درPenicillium janthinellum NCIM 1171 عنوان شد که دو برابر افزایش فعالیت در آنزیمهای اگزوکلوکاناز و کربوکسیمتیل سلولاز مشاهده شد (11). براساس نتایج بهدستآمده دراین پژوهش در سویۀ جهشیافته 10، فعالیت آنزیمهای اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز بهترتیب ۹/۱، ۳/۱ و ۱/۴ برابر بهصورت پایدار افزایش یافت. همچنین افزایش تولید در سویۀ جهشیافته 11 برای این سه آنزیم بهترتیب 2، ۰۸/۱ و ۴/۱۱ برابر بود که بیشترین افزایش تولید آنزیم سلوبیاز را نشان داد. سویۀ 17 نیز با ۶/۲، ۰۷/۱ و ۲/۷ برابر و سویۀ 19، ۸/۲، ۰۹/۱ و ۲/۱۱ افرایش تولید را بهترتیب در فعالیت آنزیمهای اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و سلوبیاز نشان دادند (جدول 2). تولید آنزیمهای سلوبیاز و اندوگلوکاناز در سویۀ جهشیافته 19 و همچنین تولید آنزیم اگزوگلوکانازدر سویۀ موتانت 10 نسبت به سویۀ والد تفاوت چشمگیری داشته به همین دلیل دو سویۀ موتانت 10و 19 بهعنوان سویههای جهشیافتۀ برتر انتخاب شدند (جدول3). درنهایت نتایج این تحقیق نشان داد که سویۀ جهشیافتۀ PTCC 5140 T. parceramosumمیتوانند بهعنوان سویۀ مناسبی جهت استفاده در صنعت مورد توجه قرار گیرد و باعث افزایش بهرهوری تولید قندهای ساده در مرحلۀ هیدرولیز آنزیمی ترکیبات سلولزی بهمنظور استفاده بهعنوان سوبسترای تولید محصولات مختلف در حوزۀ زیستفناوری شود.
)