نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استادیار بیوتکنولوژی، پژوهشگاه صنعت نفت، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: drilling for exploration and production of petroleum requires the use of drilling fluid in order to lubricate and cool the drill bit. Oil based muds (OBMs) containing diesel, are the preferred drilling fluids because of their better lubricity. After mixing with drill cuttings, OBMs form complex industrial wastes containing hydrocarbons and brine. Bioremediation can be considered as a promising alternative to physicochemical methods for cleaning up drilling wastes because of its environmental friendly and cost effective properties. Due to high salinity and lack of active microflora in drill cuttings, developing halophilic consortia could be beneficial for enhancing bioremediation efficiency.
Materials and methods: different oil-polluted and unpolluted saline soil and water samples have been used to enrich halophilic consortia able to degrade diesel hydrocarbons using a multistep enrichment technique. The growth capability of diesel-degrading consortia was evaluated by Bradford protein assay and standard plate count and growth curves were plotted. Furthermore, dominant strains of the consortia which were isolated from oil polluted saline soils were identified by molecular method.
Results: Among 10 microbial consortia isolated from different environments, the best consortium was isolated from Qom oil-polluted soil sample which could grow very well on Bushnell Haas mineral medium containing diesel as the sole source of carbon. The bacterial count of the consortium was increased up to 1.88×1015 CFU/ml after 96h of incubation. Comparison of the growth curves indicated that in comparison to unpolluted samples, polluted ones reached the logarithmic phase more quickly and the final turbidity was more. 16S rRNA gene sequencing analysis revealed that the dominant strains of consortia isolated from oil polluted saline soil samples belonged to the genera of Dietzia, Microbacterium and Salinicola.
Discussion and conclusion: Due to long term exposure of the polluted samples to oil pollution and high salinity, they have naturally been enriched by bacterial communities capable of degrading oil derivatives such as diesel in extreme conditions.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
در دنیای صنعتی امروز، نفت خام یکی از مهمترین منابع انرژی است که اکتشاف و استخراج آن، نیازمند فرآیند حفاری است. بهمنظور خنککردن و روانکردن سر مته و انتقال کندههای حفاری، در طول فرآیند حفر چاه، از سیالات حفاری استفاده میشود. سیالات حفاری، بهطور عمده به سه دستۀ سیالات پایه روغنی، پایه سنتزی و پایه آبی، تقسیم میشوند که در هر یک، ذرات جامد بهترتیب در بستری از هیدروکربنها مانند گازوئیل با دامنۀ ترکیبات 25-11 کربنه (1)، روغنهای مصنوعی مانند استرهای گیاهی، و یا آب، معلق هستند. سیالات پایه روغنی، بهعلت فراوانی نسبی هیدروکربنهای آروماتیک، سمیت بیشتری نسبت به سیالات پایه سنتزی دارند اما بهعلت روانکنندگی بهتر و نرخ حفاری بالاتر بر سایر سیالات ترجیح داده میشوند (2 و 3).
با توجه به حجم بالای تولید و انتقال نفت خام و مشتقات آن، مقادیر بالایی از آلایندههای هیدروکربنی، بهواسطۀ نشت تصادفی، آزادشدن از خطوط لولهها، نشت از مخازن ذخیرهسازی زیرزمینی و یا دفع گلهای حفاری بسیار شور به محیطهای خاکی و آبی رها میشوند (4-6).
از طرفی، مخازن نفت تشکیلشده اغلب مواقع در نزدیکی محیطهای آبی شور و تبخیری یافت میشود و آبی که در مخازن نفتی وجود دارد، عموماً بسیار شور است (7). عملیات حفاری نیز احتمال در معرض قرارگرفتن نفت را با شورآبها افزایش میدهد. بهعلاوه، غلظت بالایی از نمک، بهمنظور ایجاد سد اسمزی و ممانعت از تورم لایۀ حفرشده، به گلهای حفاری پایه روغنی اضافه میشود. بنابراین، حجم زیادی از کندههای حفاری، با گل بسیار شور نفتی آغشته میشود که تحت شرایط بیهوازی در استخرهای هرزاب حفاری، تجزیۀ زیستی آلودگی هیدروکربنی آنها دشوار است (8).
بنابراین در بسیاری از موارد، همراه با آلایندههای هیدروکربنی، غلظتهای بالایی از نمک نیز در محیطهای آلوده به نفت وجود دارد که پاکسازی و تجزیۀ آنها را دشوارتر میکند (9).
با این حال، هیدروکربنها برای اولین بار بهواسطۀ فعالیتهای انسان، وارد محیط زیست نشدهاند؛ بلکه همواره بخشی از بیوسفر کرۀ زمین بودند و موجودات زندۀ مختلفی مانند باکتریها، فیتوپلانکتونها و گیاهان آنها را تولید کردهاند (11). درنتیجه میکروارگانیسمها، در طول تکامل برای تجزیۀ هیدروکربنهای مختلف، سازگاری کسب کردهاند اما ورود بیشتر آنها از طریق آلایندههای نفتی، منجر به برهمخوردن تعادل فسفر- نیتروژن- کربن محیط میشود و از توان خودپالایی طبیعت برای تجزیه خارج میشود (10).
در حال حاضر، خاکهای آلوده به ترکیبات نفتی، با استفاده از سه روش فیزیکی، شیمیایی و زیستی، تیمار میشوند. بسیاری از روشهای فیزیکی یا شیمیایی، پرهزینه هستند و یا آلودگیها را بهطور کامل حذف نمیکنند. به نظر میرسد که پاکسازی زیستی[1]، روشی امیدبخش و مقرونبهصرفه برای حذف دامنۀ وسیعی از ترکیبات آلی بهویژه هیدروکربنهای نفت خام است (11).
دو روش عمده برای تسهیل پاکسازی زیستی وجود دارد: تحریک زیستی[2] : تحریک رشد میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ ذاتی محیط آلوده، از طریق متعادلساختن نسبتهای فسفر- نیتروژن- کربن (۱۲ و13) و تلقیح زیستی[3]: افزودن میکروارگانیسم یا میکروارگانیسمهای خارجی تجزیهکنندۀ آلایندهها به محیط آلوده. درصورتیکه میکروارگانیسمهای ذاتی محیط آلوده، علیرغم تحریک زیستی، قادر به حذف کامل آلایندهها نباشند، استفاده از روش تلقیح زیستی توصیه میشود (14).
اما در این روش (تلقیح زیستی)، استفاده از کنسرسیومهای باکتریایی به کشت خالص آنها ترجیح داده میشود؛ زیرا توانمندی آنزیمی کنسرسیومها، بهدلیل وجود روابط همافزایی[4] بین جوامع آنها و تولید آنزیمهای مختلف، بیشتر و کارآمدتر است (15). ازآنجاییکه ترکیبات آلایندۀ نفتی اغلب با غلظتهای بالایی از نمک وارد محیط میشوند، استفاده از میکروارگانیسمهای نمکدوست که در طی تکامل به زندگیکردن در شوری سازگار شدهاند پیشنهاد میشود.
هدف از این مطالعه، جداسازی و غنیسازی کنسرسیومهای میکروبی نمکدوست تجزیهکنندۀ گازوئیل از نمونههای خاک و آب شور، بهمنظور استفاده در پاکسازی زیستی پسماندهای حفاری است.
مواد و روش ها.
غنی سازی: همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، چهار نمونه خاک شور آلوده، سه نمونه خاک شور غیرآلوده و سه نمونه آب شور غیرآلوده، برای غنیسازی چندمرحلهای استفاده شد. محیط کشت پایۀ معدنی بوشنل هس[5] با pH 7، همراه با 7درصد (وزنی/حجمی) نمک NaCl و 5/0درصدگازوئیل استریلشده بهعنوان تنها منبع کربن، بهمنظور غنیسازی نمونههای خاک و آب در تجزیۀ گازوئیل استفاده شد. ترکیبات این محیط، عبارت بود از (گرم در لیتر آب مقطر):
KH2PO4, 1; K2HPO4, 1; NH4NO3, 1; MgSO4, 2/0; CaCl2, 02/0; FeCl3, 05/0.
pH محیط کشت، با استفاده از محلول یک مولار TrisHCl، در 2/7-7 تنظیم شد و در دمای 121درجه سانتیگراد و فشار 5/1 اتمسفر اتوکلاو شد. از هر یک از نمونههای خاک، یک گرم و از هر یک از نمونههای آب، یک میلیلیتر برداشته شد و به ارلنهای 250میلیلیتری حاوی 100 میلیلیتر محیط کشت بوشنل هس، منتقل شد. ارلنها بهمدت یک هفته در شیکر انکوباتور در دمای 32 درجه سانتیگراد و دور rpm 120، گرماگذاری شد و رشد میکروبی، با دنبالکردن کدورت آنها پس از یک هفته کنترل شد. پس از گذشت یک هفته، 1 میلیلیتر از هر یک از نمونههای غنیشده به محیط جدید دارای ۷درصد NaCl و۵/۰درصد گازوئیل، انتقال داده شد و مانند مرحلۀ قبل گرمخانهگذاری شدند. فرآیند غنیسازی چندمرحلهای، 7 بار تکرار شد.
جدول 1- ویژگیهای نمونههای خاک و آب استفادهشده در نمونههای خاک شور آلوده
|
مکان نمونهبردای |
موقعیت جغرافیایی |
EC µS/cm* |
pH |
TPH (mg/g)** |
|
خاک آلودۀ پوند 3 پالایشگاه تهران |
″7/12´31 ·35 شمالی ″56´24 ·51 شرقی |
124500 |
6/7 |
84 |
|
خاک آلودۀ جزیره خارک |
″9/40´13 ·29 شمالی ″5/11 ´18 ·50 شرقی |
61500 |
75/6 |
53 |
|
خاک آلودۀ قم |
″5/43´44 ·34 شمالی ″6/43´53 ·50 شرقی |
65250 |
05/8 |
46 |
|
خاک آلودۀ خانگیران |
″20´33 ·50 شمالی ″57´47 ·60 شرقی |
72200 |
04/7 |
59 |
|
نمونههای خاک و آب شور غیرآلوده |
||||
|
مکان نمونهبردای |
موقعیت جغرافیایی |
EC µs/cm |
pH |
|
|
خاک شور ارومیه |
″2/50´60 ·37 شمالی ″6/23´47 ·45شرقی |
36700 |
862/8 |
|
|
خاک شور میغان اراک |
″02/50´22 ·34 شمالی ″8/48´82 ·49شرقی |
351000 |
701/8 |
|
|
خاک شور اشتهارد |
″09/25´43 ·35 شمالی ″09/28´21 ·50 شرقی |
73500 |
928/7 |
|
|
آب شور ارومیه |
″2/50´60 ·37شمالی ″6/23´47 ·45شرقی |
442000 |
573/8 |
|
|
آب شور میغان اراک |
″02/50´22 ·34 شمالی ″8/48´82 ·49شرقی |
240000 |
127/8 |
|
|
آب شور اشتهارد |
″09/25´43 ·35 شمالی ″09/28´21 ·50 شرقی |
55200 |
649/7 |
|
µS/cm*: میکروزیمنس بر سانتیمتر، نشاندهندۀ هدایت الکتریکی است، mg/g** : میلیگرم بر گرم نشاندهندۀ مقدار کل هیدروکربنهای موجود در محیط است.
رسم منحنی رشد کنسرسیومهای میکروبی: در مرحلۀ هشتم غنیسازی، بهمنظور بررسی نحوۀ رشد کنسرسیومهای میکروبی حاصل، بار دیگر مانند مراحل قبل 1 میلیلیتر از محیط کشت غنیسازی مرحله هفتم هر یک از نمونهها، بر روی محیطهای تازه تلقیح شد و رشد و کدورت هر یک از نمونهها پس از تلقیح و گرمخانهگذاری، از طریق سنجش مقدار جذب آنها در طول موج 620 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر، در فواصل زمانی مشخص بررسی شد.
تخمین تراکم سلولی کنسرسیومهای میکروبی: بهمنظور انتخاب بهترین کنسرسیوم میکروبی در تجزیۀ گازوئیل، تراکم باکتریایی هر یک از کنسرسیومهای میکروبی جداسازیشده، از طریق دو روش زیر بررسی شد:
1) پروتئینسنجی بهروش بردفورد[6]
بهمنظور تهیۀ معرف بردفورد، 100 میلیگرم کوماسی بریلینت بلو [7] G-250 در 50 میلیلیتر اتانول 95درصد حل شد و در حین همزدن به آن 100 میلیلیتر فسفریک اسید 85درصد اضافه شد و پس از حلشدن رنگ، حجم آن به یک لیتر رسانده شد.
پس از همدماشدن معرف بردفورد با محیط، مقدار یک میلیلیتر از آن با 25 میکرولیتر از هر یک از نمونههای کشت میکروبی، در یک ویال 5/1میلیلیتری مخلوط و بهمدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس جذب نوری هر یک از نمونهها در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. برای تهیۀ منحنی استاندارد، غلظتهای مشخصی از سرم آلبومین گاوی[8] (ازmg/ml 125/0 تا mg/ml 2) در آب مقطر دیونیزه تهیه شد و همانند مرحلۀ قبل، میزان جذب نوری آنها در طول موج 595 نانومتر تعیین شد. سپس مقدار مجهول پروتئین موجود در هر یک از نمونههای کشت میکروبی، با استفاده از نمودار استاندارد تعیین شد (16).
2) شمارش باکتریهای هتروتروف و تجزیهکنندۀگازوئیل
تراکم سلولی محیطهای غنیسازیشده و همچنین نمونههای اصلی آب و خاک، با استفاده از این روش در روی دو محیط کشت R2A و بوشنل هس حاوی گازوئیل بررسی شدند.
محیط کشت R2A(17) یک محیط کشت کممغذی، با تنوع بالای منابع کربن است. pH محیط، با استفاده از محلول 2 مولار NaOH در4/7-2/7 تنظیم شد. یک گرم و یا یک میلیلیتر از هر یک از نمونههای آب یا خاک و نیز یک میلیلیتر از هر یک از محیطهای کشت غنیشده برداشته شد و در لولۀ حاوی 9 میلیلیتر محیط مایع R2A ریخته شد و از هر یک از آنها تا رقت 12-10سریال رقت تهیه شد. سپس 1/0 میلیلیتر از هر رقت، بر روی پلیتهای حاوی محیط R2A ریخته شد و با میلۀ شیشهای پخش شد و سپس پلیتها بهمدت 72 ساعت در دمای 32 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد.
محیط کشت جامد بوشنل هس (5/1درصد آگار) همراه با ۷درصد NaCl و دارای منبع کربن گازوئیل نیز بهعنوان محیط کشت اختصاصی شمارش باکتریهای تجزیهکنندۀ گازوئیل استفاده شد. در این مورد نیز مانند مرحلۀ قبل، از نمونههای خاک و آب و محیطهای غنیشده، تا رقت 12-10سریال رقت تهیه شد با این تفاوت که این بار بهجای محیط R2A، از 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی در هر یک از لولهها استفاده شد. پس از پخشکردن 1/0 میلیلیتر از هر یک از رقتها و جذبشدن آنها به محیط، مقدار 1/0 میلیلیتر گازوئیل استریلشده بهعنوان منبع کربن، روی آنها ریخته و پخش شد و در دمای 32 درجه سانتیگراد بهمدت 96 ساعت، گرماگذاری شد. پس از سپریشدن زمان گرمخانهگذاری، تعداد کلنیهای ایجادشده بر روی پلیتی که بین 30 تا 300 کلنی داشت، شمارش شد و عدد بهدستآمده در عکس ضریب رقت ضرب شد.
.بررسی ویژگیهای ریختشناسی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک: برای سویههای غالب هر یک از کنسرسیومهای میکروبی جداشده از نمونههای آلوده به نفت، تعدادی از تستهای بیوشیمیایی، ریختشناسی و فیزیولوژیک انجام شد. رنگآمیزی گرم براساس روش هوکر[9] انجام شد (18). برای تأیید نتایج حاصل از رنگآمیزی گرم، از تست 3درصد که بارون[10] توصیه کرده است، استفاده شد. فعالیت پراکسیدازی با استفاده از محلول 3درصد پراکسید هیدروژن و فعالیت اکسیدازی با استفاده از دیسکهای اکسیداز آمادۀ شرکت پادتن طب تعیین شدند. نمکدوستبودن یا تحملپذیری نمک سویهها نیز از طریق بررسی رشد آنها در محیطهای جامد و مایع R2A بدون نمک (۰درصد NaCl وزنی/ حجمی) انجام شد.
.شناسایی مولکولی سویههای غالب کنسرسیومهای میکروبی جداشده از نمونههای آلوده به نفت: به منظور شناسایی سویههای غالب کنسرسیومهای میکروبی منتخب، از طریق توالی ژن 16sr RNA، DNA کلنیهای تازهرشدکرده بر روی محیط R2A agar با استفاده از روش تغییریافتۀ مارمور[11]، استخراج شد (19). تأیید استخراج DNA، از طریق بارگذاری 10درصد از نمونه همراه با رنگ بارگذاری (با نسبت 6 به 1) بر روی ژل آگاروز (7/0درصد) در دستگاه الکتروفورز افقی انجام شد. برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز[12]، از پرایمرهای عمومی 27F (5´-AGAGTTTGATCMTGGGTCAG-3´) و 1492R (5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´) برای باکتریها، استفاده شد (20).
واکنش زنجیرهای پلیمراز برای سویههای منتخب، به این روش صورت گرفت: واسرشتسازی اولیه بهمدت 6 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد انجام و سپس، مرحلۀ تکثیر آغاز شد که شامل 30 چرخۀ تکرارشونده با دمای دناتوراسیون 94 درجه سانتیگراد بهمدت 60 ثانیه، دمای اتصال 56 درجه سانتیگراد بهمدت 60 ثانیه و دمای سنتز 72 درجه سانتیگراد بهمدت 60 ثانیه بود. درانتها، بهمنظور تکمیل نهایی ساختارهای تکثیرشده، یک مرحله سنتز بهمدت 7 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد، به مراحل افزوده شد. پس از تکثیر توالی موردنظر با استفاده از پرایمرهای استفادهشده، نمونه محصول PCR برای تعیین توالی به شرکت Bioneer در کره فرستاده شد و توالیهای به دستآمده با نرمافزار Chromas Pro بررسی شد و با توالیهای ثبتشده در پایگاه اطلاعات ژنومیEzTaxon مقایسه شد و نزدیکترین سویهها با ترادف SrRNA16 مشابه با سویۀ منتخب تعیین شد.
.
نتایج.
غنیسازی و رسم منحنی رشد: در هر بار غنیسازی، پس از یک هفته در هر 10 نمونۀ شور آلوده و غیرآلودۀ استفادهشده، کدورت ناشی از رشد مشاهده شد و وجود باکتریها از طریق رنگآمیزی گرم، تأیید شد (تصاویر میکروسکوپی تعدادی از نمونهها در شکل 1 نشان داده شده است).
|
1 |
2 |
شکل 1- شماره 1، تصویری از مقایسۀ محیط کشت شاهد و محیط نمونۀ آلودۀ قم پس از یک هفته غنیسازی؛ شماره 2، تصویر میکروسکوپی رنگآمیزی گرم کنسرسیوم میکروبی نمونۀ خاک آلودۀ قم
نحوۀ رشد هر کنسرسیوم میکروبی بررسی شد و منحنی رشد آن براساس جذب در طول موج 620 نانومتر رسم شد. بهمنظور مقایسۀ سرعت و مقدار رشد کنسرسیومهای میکروبی جداسازیشده از نمونههای آلوده با غیرآلوده، منحنیهای رشد کنسرسیومهای 4 نمونۀ خاک آلوده با هر یک از 6 کنسرسیوم میکروبی نمونۀ غیرآلوده، در کنار هم در یک نمودار رسم شدند (شکل 2). همانطور که در نمودار مشاهده میشود، کنسرسیومهای میکروبی بهدستآمده از نمونههای آلوده، سریعتر به فاز لگاریتمی رسیده و همچنین مقدار تراکم نهایی آنها (مقدار جذب در طول موج 620 نانومتر) بیشتر از نمونههای غیرآلوده است (جدول 2).
.تخمین تراکم سلولی هر کنسرسیوم میکروبی:
1- پروتئینسنجی بهروش بردفورد
همانطور که نشان داده شدهاست، مقدار پروتئین محاسبهشده در هر یک از کنسرسیومهای میکروبی، با یکدیگر در یک نمودار آورده شد (شکل 3). در این نمودار میتوان با مقایسۀ غیرمستقیم تراکم سلولی هر یک از کنسرسیومهای میکروبی، توانمندی آنها برای رشد در حضور گازوئیل بهعنوان تنها منبع کربن و تجزیۀ این آلاینده را تخمین زد. در بین کنسرسیومهای میکروبی، کشتهای غنیشده از نمونههای خاک آلودۀ خارک و قم، بهترتیب با mg/ml 213/0 و mg/ml 192/0 بیشترین مقدار محتوای پروتئین را نشان دادند.
شکل 2- مقایسۀ منحنیهای رشد کنسرسیومهای میکروبی غنیشده
جدول 2- نتایج شمارش باکتریهای هتروتروف و تجزیهکنندۀ گازوئیل در کنسرسیومهای میکروبی غنیشده و نمونههای اصلی بر روی محیط R2A و بوشنل هس
|
نام نمونه |
کنسرسیوم میکروبی |
نمونۀ اصلی |
OD620 نهایی کنسرسیومهای میکروبی بر روی محیط مایع بوشنل هس پس از یک هفته |
||
|
(محیط کشت R2A) |
(محیط کشت بوشنل هس همراه با گازوئیل) |
(محیط کشت R2A) |
(محیط کشت بوشنل هس همراه با گازوئیل) |
||
|
خاک آلودۀ قم |
CFU/mL 1015×9/1 |
CFU/mL 1015×9/1 |
103× 9/1 CFU/gram soil |
1012×5/4 CFU/gram soil |
1/3 |
|
خاک آلودۀ استخر هرزآب خانگیران |
CFU/mL 1013×2 |
CFU/mL 1015×6/1 |
107×1/3 CFU/gram soil |
107×1/3 CFU/gram soil |
4/4 |
|
خاک آلودۀ خارک |
CFU/mL 1012×9/2 |
CFU/mL 1014×8/1 |
104×8/6 CFU/gram soil |
108×3/3 CFU/gram soil |
8/3 |
|
خاک شور آلودۀ پوند 3 پالایشگاه تهران |
CFU/mL 107×5/1 |
CFU/mL 1015×9/1 |
105×9 CFU/gram soil |
108×9/7 CFU/gram soil |
5/3 |
|
خاک شور ارومیه |
CFU/mL 1014×7/4 |
CFU/mL 1010×6/2 |
105×6 CFU/gram soil |
106×4/4 CFU/gram soil |
3/3 |
|
خاک شور میغان |
CFU/mL 1010×4/9 |
CFU/mL 1013×3/2 |
106×3/2 CFU/gram soil |
105×7/4 CFU/gram soil |
8/3 |
|
خاک شور اشتهارد |
CFU/mL 1014×8/1 |
CFU/mL 1012×1/1 |
108×3/4 CFU/gram soil |
107×2/8 CFU/gram soil |
1/4 |
|
آب شور ارومیه |
CFU/mL 107×3/1 |
CFU/mL 108×6/1 |
103×5/3 CFU/mL |
103×6 CFU/mL |
3/3 |
|
آب شور میغان |
CFU/mL 1010×4/1 |
CFU/mL 108×9/1 |
106×3/5 CFU/ mL |
106×8/1 CFU/mL |
7/2 |
|
آب شور اشتهارد |
CFU/mL 109×2/1 |
CFU/mL 108×3/1 |
104×9/3 CFU/mL |
109×8 CFU/mL |
8/0 |
شکل3- مقایسۀ مقدار پروتئین و OD595 نمونههای مختلف با یکدیگر براساس پروتئینسنجی بردفورد
2- شمارش باکتریهای هتروتروف و تجزیهکنندۀ گازوئیل
جدول 2، نتایج حاصل از شمارش باکتریهای هتروتروف و تجزیهکنندۀ گازوئیل در کنسرسیومهای میکروبی بهدستآمده را نشان میدهد. همانگونه که مشخص است تعداد باکتریهای تجزیهکنندۀ گازوئیل در کنسرسیومهای میکروبی حاصل از نمونههای آلوده به نفت، در مقایسه با نمونههای غیرآلوده، بهمیزان قابلِتوجهی بیشتر است. ازآنجاییکه تراکم باکتریایی نمونههای آلوده به نفت، از سایر نمونههای آب و خاک بیشتر است، این نمونهها برای بررسیهای بیشتر در مراحل بعد انتخاب شدند.
بررسی ویژگیهای ریختشناسی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک سویههای غالب کنسرسیومهای میکروبی:
ویژگیهای ریختشناسی و بیوشیمیایی سویههای بررسیشده و همچنین نتایج حاصل از نمکدوستی و تحملپذیری نمک نیز در جدول 3 آورده شده است.
تنوع کلنیهای حاصل از رشد رقتهای مشابه از نمونههای اصلی خاک و آب و کنسرسیومهای میکروبی غنیشده از آنها بر روی محیط R2A نیز بایکدیگر مقایسه شد که تصاویر تعدادی از آنها در شکل 4 آورده شده است. همانطور که در شکل مشاهده میشود، تنوع کلنیها در نمونههای اصلی آب و خاک بیشتر از تنوع آنها در کنسرسیومهای میکروبی غنیشده است؛ درحالیکه تراکم آنها، در کنسرسیومهای میکروبی غنیشده بیشتر است.
شناسایی فیلوژنتیکی سویههای غالب کنسرسیومهای میکروبی جداشده از نمونههای آلوده به نفت: جهت بررسیهای فیلوژنتیکی، تعیین توالی ژن 16SrRNA برای هر 4 سویه، با استفاده از پرایمر رفت (27F)، انجام شد. جدول 3 نتایج شناسایی مولکولی سویههای منتخب و میزان شباهت آنها با نزدیکترین گونههای شناختهشده را نشان میدهد. شکل ۵ درخت فیلوژنی ترسیمشده برای باکتریهای ذکرشده در جدول 3 را نشان میدهد.
|
1 |
2 |
شکل 4- شمارههای 1 و 2، بهترتیب خاک آلوده و کنسرسیوم میکروبی غنیسازیشده از نمونۀ قم، در رقت3-10 بر روی محیط R2A
جدول 3- مقایسۀ توالی ژن S rRNA 16سویه های غالب کنسرسیومهای میکروبی جداشده از نمونههای آلوده به نفت با بانک ژن با استفاده از ابزار BLAST
|
نام سویه |
نزدیکترین سویه |
درصد شباهت |
واکنش به رنگآمیزی گرم |
تست KOH 3% |
تست کاتالاز |
تست اکسیداز |
نمکدوست یا تحملپذیر نمک |
|
Q (سویۀ غالب خاک آلودۀ قم) |
Dietzia schimae YIM 65001(T) |
100 |
+ کوکوس |
- |
+ |
- |
تحملپذیر نمک |
|
P3 (سویۀ غالب پوند3پالایشگاه تهران) |
Salinicola salarius M27(T) |
100 |
- باسیلوس |
+ |
+ |
- |
تحملپذیر نمک |
|
HKH (سویۀ غالب استخرهرزاب خانگیران) |
Microbacterium lindanitolerans MNA2(T) |
98.5 |
+ کوکوس |
- |
+ |
- |
نمکدوست |
|
KH (سویۀ غالب خاک آلودۀ خارک) |
Microbacterium indicum BBH6(T) |
98 |
+ کوکوس |
- |
+ |
+ |
تحملپذیر نمک |
شکل 5- درخت فیلوژنی باکتریهای تعیینِتوالیشده با استفاده از روش Neighbour-joining، Alcaliflexus imshenetskii DSM 15055T بهعنوان outgroup در نظر گرفته شده و اعداد ذکرشده در بخش انشعاب، نشاندهندۀ بوت استرپ از 1000 نمونه است. مقادیر بوت استرپ کمتر از 50 نشان داده نشده است.
بحث و نتیجه گیری.
تخلیۀ کندههای حفاری بهعنوان یکی از آلایندههای مهم در طی فعالیت حفاری چاههای نفت و گاز به محیط زیست و بدون هیچ تیماری، مشکلات مهمی برای خاک، آبهای زیرزمینی و سلامت انسان ایجاد میکند. پاکسازی زیستی را بسیاری از پژوهشگران، بهعلت هزینۀ مقرونبهصرفه و ایجادنکردن آلودگی ثانویه، تأیید کردهاند و مطالعات زیادی در زمینۀ پاکسازی پسماندهای حفاری با استفاده از میکروارگانیسمها انجام شده است (21).
در حال حاضر، بهطور کلی جامعه علمی پذیرفته است که هیچ تکگونهای از میکروارگانیسمها، نمیتواند بهطور کامل بخشی از نفت را تجزیه کند. تجزیۀ نفت خام، نفت تصفیهشده و یا مشتقات آنها، نیاز به کنسرسیومی از میکروارگانیسمها دارد (22). از دیدگاه کاربردی، استفاده از یک کنسرسیوم میکروبی بهجای کشت خالص باصرفهتر است؛ زیرا تنوع متابولیکی و توانمندی موردِنیاز برای کاربرد در محیط طبیعی را داراست (23).
استفاده از روش غنیسازی انتخابی و جداسازی کنسرسیوم میکروبی نسبت به کشتهای خالص باکتریایی، بهمنظور کاربرد آن در پاکسازی زیستی، در بسیاری از مطالعات مشابه انجام شده و موفقیتآمیز بوده است. بهعنوان مثال، دستغیب[xiii] و همکارانش، کنسرسیوم میکروبی نمکدوست تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی در غلظتهای بالای نمک را جداسازی کردند که یک سویۀ قابلِکشت از جنس Halomonas و یک سویۀ غیرقابلِکشت از جنس Marinobacter بهعنوان اعضای آن، شناسایی شدند و قادر به تجزیۀ فنانترن در غلظت 15درصد نمک NaCl بودند (24).
ریس[xiv] و همکارانش، کنسرسیومهای میکروبی نمکدوست از نمونههای خاک شور جداسازی کردند که قادر به تجزیۀ گازوئیل در غلظتهای NaCl۰تا۱۵درصد و متشکل از جنسهای Cellulomonas، Bacillus، Dietzia و Halomonas بود (25).
شارما[xv] و همکارانش نشان دادند که کنسرسیوم باکتریایی (متشکل از جنسهای Moraxella، Alteromonas، Klebsiella و Pseudomonas) گازوئیل بیشتری را نسبت به کشتهای خالص از باکتریها (مانند Klebsiella) تجزیه میکنند (25).
بنتو[xvi] و همکارانش، پاکسازی زیستی از طریق سه روش تلقیح و تحریک زیستی و تضعیف طبیعی را بررسی کردند و نشان دادند که تحریک زیستی بهویژه با استفاده از کنسرسیومی از باکتریها (در این پژوهش غالباً متشکل از Bacillus، Pseudomonas و Acinetobacter) بیشترین مقدار تجزیه برای گازوئیل را نشان میدهد (26).
در این پژوهش، پس از سپریشدن مرحلۀ غنیسازی، همانطور که منحنیهای رشد و همچنین نتایج حاصل از رنگآمیزی گرم نشان میدهند، از هر 10 نمونۀ آلوده و غیرآلودۀ شور، کنسرسیومهای میکروبی دارای قابلیت تجزیۀ گازوئیل در غلظت 7درصد NaCl جداسازی شدند. ازآنجاییکه هیدروکربنها را پیش از ورود آلایندههای نفتی، فیتوپلانکتونها وگیاهان و فرآیندهای مختلف آبی و خاکی در طبیعت تولید میکردند، باکتریها در طول تکامل برای تجزیۀ هیدروکربنها سازگار میشدند و درنتیجه جداسازی کنسرسیومهای باکتریایی تجزیهکنندۀ گازوئیل از محیطهای بدون سابقۀ آلودگی، تعجبآور نخواهد بود (27).
بررسی منحنیهای رشد مقایسهای نشان میدهد که کنسرسیومهای میکروبی جداشده از نواحی آلوده به نفت، سرعت رشد بیشتری نسبت به نمونههای غیرآلوده دارند، سریعتر به فاز لگاریتمی میرسند و میتوانند تنها منبع کربن موجود در محیط را استفاده کنند. درنهایت کدورت و تراکم سلولی بیشتری نیز در آنها ایجاد میشود و همانطور که در مطالعات گذشته نیز بررسی شده است، علت این پدیده آن است که جوامع باکتریایی در محیطهای دارای سابقۀ آلودگیهای نفتی، به تجزیۀ این ترکیبات در طولانیمدت سازگار میشوند و گروهی از باکتریها که قادر به استفاده از هیدروکربنهای نفتی هستند، جوامع غالب در این مکانها خواهند شد (28 و 29).
در بین کنسرسیومهای میکروبی جداسازیشده از نمونههای غیرآلوده، مقدار تراکم نهایی و سرعت رشد کنسرسیوم میکروبی جداشده از خاک شور اشتهارد، قابلِرقابت با نمونههای آلوده بود که با توجه به تراکم میکروبی بالای آن در ابتدا (جدول 2)، تا حدودی قابلِتوجیه است. از طرفی، با اینکه در این منطقه، آلودگی نفتی وجود ندارد ممکن است بهعلت گستردگی زمینهای کشاورزی در آن و تردد وسایل نقلیه، آلودگیهای خفیفی ایجاد شده باشند و این آلودگیها در طولانیمدت منجر به سازگاری جوامع باکتریایی محل نمونهبرداری و درنتیجه حذف ترکیبات هیدروکربنی شود که میتوانند سریعتر از سایر نمونههای غیرآلوده، منبع کربن محیط را استفاده کنند.
از طرفی، ویژگیهای ریختشناسی کلنیهای رشدیافته در رقتهای اولیۀ کنسرسیومهای میکروبی غنیشده در مقایسه با نمونههای اصلی (شکل 4)، نشاندهندۀ آن است که تنوع کلنیها در نمونههای اصلی خاک و آب، نسبت به تنوع آن در کنسرسیومهای میکروبی غنیشده، بیشتر است اما تعداد کلی کلنیها (تراکم سلولی) بهدلیل چندین مرحلۀ غنیسازی، در کنسرسیومهای میکروبی جداشده بالاتر بود. با اختصاصیکردن منبع کربن و درصد نمک، تنوع باکتریهای قادر به رشد در این شرایط کاهش خواهند یافت (30).
همانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، کنسرسیوم میکروبی جداسازیشده از خاک آلودۀ قم، دارای بیشترین تراکم سلولی نسبت به سایر کنسرسیومهای میکروبی است. تراکم بالای سلولی این کنسرسیوم در محیط بوشنل هس که تنها منبع کربن آن گازوئیل است، میتواند نشاندهندۀ توانمندی بیشتر میکروفلور آن در تجزیۀ گازوئیل نیز باشد. از طرفی، خود نمونۀ خاک آلودۀ قم، بر روی محیط R2A، دارای کمترین تراکم سلولی است. میتوان چنین نتیجه گرفت که ازآنجاییکه منشأ آلودگی این محیط، نشت قدیمی نفت در این مکان بوده است، جوامع باکتریایی غالب این نمونۀ خاک آلوده، همانطور که در مطالعۀ (31) نشان داده شده است، از انواع تجزیهکنندههای اجباری هیدروکربنها هستند که تنها در حضور هیدروکربنها قادر به رشد هستند.
به علاوه، در روش پروتئینسنجی که میتوان بهطور غیرمستقیم تراکم سلولی باکتریها را سنجید، کنسرسیوم میکروبی حاصل از خاک آلودۀ قم، دارای غلظت پروتئین قابلِتوجهی بود؛ بنابراین، سابقۀ شوری و آلودگی مکان نمونهبرداری، در نتایجی که در پاکسازی مشاهده میشود، بسیار تأثیرگذار است.
با نتایج بهدستآمده از این مطالعه، کنسرسیوم میکروبی جداسازیشده از خاک شور آلودۀ قم دارای پتانسیل بالایی برای کاربرد در پاکسازی زیستی گلهای حفاری آلوده به گازوئیل است.
با توجه به بررسیهایی که محققان انجام داده اند، شاخصترین باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی که تاکنون گزارش شدهاند در اغلب موارد ازحوزههای نفتی، آب تولیدشده و سایر محیطهای شور آلوده به نفت جداسازی شدهاند و متعلق به شاخههای Actinobacteria و Gamaproteobacteria هستند (7، 32-35). در این پژوهش در بین سویههای غالب جداشده از نمونههای آلوده به نفت، 3 سویه متعلق به شاخۀ Actinobacteria بودند که با بررسیهای پیشین همخوانی دارد. بررسیهای فیلوژنتیکی هر یک از سویهها و سابقۀ گزارش آنها در زمینۀ تجزیۀ زیستی هیدروکربنهای نفتی و یا گازوئیل، در زیر آمده است.
تعیین توالی ژن 16sr RNAو شناسایی سویۀ غالب کنسرسیوم میکروبی قم، نشان داد که این سویه با 100درصد شباهت، متعلق به گونۀ Dietzia schimae است. از این گونه، تا کنون چندین گزارش مبنی بر تجزیۀ نفت مشاهده شده است (36). تاکنون گزارشهای فراوانی در زمینۀ جداسازی گونههای مختلف این جنس، از محیطهای خاکی آلوده به هیدروکربنهای نفتی داده شده است و ازآنجاییکه گازوئیل نیز ترکیبی متشکل از هیدروکربنهای بلندزنجیره (C18-C25) است، جداسازی گونهای از جنس Dietzia، از خاک آلوده به نفت قم، با نتایج پژوهشهای پیشین همخوانی دارد. بهعنوان مثال، گونۀ D. cinnamea strain P4 (قادر به تجزیۀ آلکانهای C11-C36) و نیز Dietzia sp. E1 (تجزیهکنندۀ اجزای آلکان نفت خام (C12-C38) D.maris (36 و 37) از محیطهای خاکی آلوده به نفت، جداسازی شدهاند.
سویۀ غالب کنسرسیوم میکروبی خاک آلودۀ پوند 3 پالایشگاه تهران پس از بررسیهای فیلوژنتیکی، شباهت 100درصد با گونۀ Salinicola salarius نشان داد. این گونه را کیم[xvii] و همکارانش، در سال ۲۰۰۷ با عنوان Halomonas salaria از آب شور جداسازی کردند و نام آن را رفائل[xviii] و همکارانش در سال ۲۰۱۰ به Salinicola salariusتغییر دادند (38, 39). الیورا[xix] و همکارانش، جداسازی سویهای با 6/98درصد به H. salaria از رسوبات اعماق دریا با سابقۀ مواجهه با ترکیبات هیدروکربنی گزارش دادهاند که قادر به تولید امولسیفایر است (40).
سویههای غالب جداشده از کنسرسیوم میکروبی خاک آلودۀ خارک، با 98درصد شباهت، به گونۀ Microbacterium indicum نزدیک است. بهعلاوه، سویۀ غالب جداشده از کنسرسیوم میکروبی خاک آلودۀ استخر هرزاب خانگیران نیز با 5/98درصد شباهت به گونۀ Microbacterium lindanitoleransنسبت داده شد. M. lindanitoleransبرای اولین بار، از خاک آلوده به هگزاکلروسیکلوهگزان در سال 2010 (41) و M. indicum در سال 2007 از رسوبات اعماق دریا جداسازی شدهاند (42). تا کنون گزارشی در زمینۀ توانمندی تجزیۀ نفت یا مشتقات آن توسط M. indicum مشاهده نشده است. گونههای مختلف جنس Microbacteriumبهعنوان اعضایی از کنسرسیومهای باکتریایی از خاکهای آلوده به مواد بیگانه با محیط زیست[xx] مانند رنگها، فلزات مانند روی و کادمیم و نیز آفتکشها (M. oxydans) جداسازی شدهاند (41 و 43). بهعلاوه گونه هایی از جنس Microbacterium مانند M. hydrocarbonoxydans (44)،
M. aoyamense و M. oxydans (45) و M. foliorum (36)، از مناطق مختلفی جدا شدهاند که قادر به تجزیۀ PAHها، هیدروکربنهای نفتی و نفت خام بهعنوان منبع کربن هستند.
درمجموع، پاکسازی زیستی کندههای حفاری بهعنوان یکی از پسماندهای آلاینده در صنعت نفت، اهمیت زیادی دارد و دستیابی به کنسرسیومهای میکروبی و سویههای توانمند در تجزیۀ سریعتر و بیشتر هیدروکربنها، به پاکسازی مؤثرتر این پسماند کمک خواهد کرد. همانطور که در این پژوهش نیز نشان داده شد، محیطهای با سابقۀ آلودگی نفتی، بهعلت سازگاری طولانیمدت میکروارگانیسمها به حضور آلایندهها، در مقایسه با نمونههای غیرآلوده ظرفیت بالقوه بیشتری برای جداسازی کنسرسیومهای تجزیهکننده دارند و در بین کنسرسیومهای غنیشده، کنسرسیوم میکروبی جدشده از خاک آلودۀ قم، میتواند در پژوهشهای بعدیِ پاکسازی زیستی کندههای حفاری در مقیاس بالاتر در محیط خاک در استفاده شود.
[1]- Bioremediation
[2]- Biostimulation
[3] Bioaugmentation
[4]- Synergistic
[5]- Bushnell Haas (BH)
[6]- Bradford
[7]- Coomassie Brilliant Blue G-250
[8]- Bovine serum albumin )BSA)
[9]- Hucker
[10]- Baron
[11]- Marmur
[12]- Polymerase Chain Reaction (PCR)
[xiii]- Dastgheib
[xiv]- Riis
[xv]- Sharma
[xvi]- Bento
[xvii]- Kim
[xviii]- Rafael
[xix]- Olivera
[xx]- Xenobiotic
)