نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری زیست فناوری میکربی، دانشگاه تهران، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Phenol and its derivatives are environmental pollutants commonly found in many industrial influents. Despite being toxic, phenol can be utilized by some microorganisms as sole carbon and energy sources.
Materials and methods: In this research, halotolerant phenol biodegrading yeasts were isolated in GPY and MA media containing 250 ppm phenol and 5% NaCl. Among isolated strains, the best strain that was able to utilize phenol in presence of 5% NaCl was selected and identified by PCR of ITS gene. The resistance of the yeast isolate to different phenol concentrations and its toxicity besides phenol degradation at saline culture were investigated by spectroscopic measurement of residual phenol and cell dry weight.
Results: In this research, 15 strains were isolated. Based on their ability for growth in different concentration of phenol and salt, ADH8 was selected as best strain. An inhibitory effect of phenol was observed at concentrations higher than 1250 ppm in presence of 5% NaCl, resulting in significant reduction of growth rates and phenol degradation. At concentration 750 ppm and 1000 ppm of phenol, all of the phenol was consumed after 24 h. Our results revealed that at the concentration of 1250 ppm of phenol, because of phenol toxicity on T. cutaneum, growth rate and phenol degradation was different. Higher lag phase and incubation time were observed in this concentration and total removal was detected after 48 h.
Discussion and conclusion: The results indicate that the highly phenol-resistant halotolerant yeast represents a potentially promising means for biodegrading phenol pollution in wastewater treatment effluent and contaminated soil containing salt.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
آلودگی محیط زیست با آلایندههای آلی بهویژه محصولات پتروشیمی در دهههای اخیر توجه زیادی را به خود جلب کرده است. امروزه نشت و گسترش ترکیبات پتروشیمی در اثر ناکارآمدی فرآیندهای استخراج، انتقال و پالایش و همچنین بروز سوانح در بخشهای مختلف اعم از مناطق تولید، پالایشگاهها و خطوط حملونقل، امری اجتنابناپذیر است (1 و 2). فنل (هیدروکسی بنزن) و ترکیبات فنلی از جمله مشتقات زغال سنگ هستند که بهطور طبیعی بهوسیلۀ قطران زغال سنگ به دست میآید. فنل بهعنوان فراوانترین آلایندۀ آروماتیک توسط پساب بسیاری از صنایع بهویژه صنعت نفت و پتروشیمی تولید و رهاسازی میشود (1). آژانس حفاظت از محیط زیست مقدار مجاز فنل را در خروجی پساب صنایع ppb 500 و در آب آشامیدنی حداکثر 1 تا 2 ppb تعیین کرده است (3 و 4). روشهای متعددی برای تصفیۀ پسابهای آلوده به ترکیبات فنلی وجود دارد که از آن جمله میتوان به روشهای فیزیکی و شیمیایی و زیستی اشاره کرد. تولید پساب و هزینۀ زیاد و ایجاد حدِواسطهای خطرناک از مهمترین معایب استفاده از روشهای فیزیکی و شیمیایی است و سرعت بالا در حذف، اجرای ساده و نیازنداشتن به نیروی متخصص از جمله مزایای آن است (2). استفاده از قابلیت میکروارگانیسمها بهمنظور تجزیۀ زیستی آلایندههای آلی از جمله فنل بهعنوان مهمترین جایگزین تیمار پسابهای حاوی فنل معرفی شده است. در این زمینه مطالعات زیادی بهویژه با استفاده از باکتریها بهمنظور تجزیۀ زیستی فنل و مشتقات آن انجام شده است (5 و6). باکتریهای مزوفیل هوازی بهعنوان مهمترین تجزیهکنندگان فنل معرفی شدهاند. در میان پژوهشهای انجامشده بر روی میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ فنل، اطلاعات کمی درخصوص تجزیه توسط قارچها بهعنوان یک عامل بسیار مؤثر و توانمند در حذف ترکیبات فنلی موجود است (1 و 7). قارچها مخمرهایی هستند که سیستمهای آنزیمی بسیار کارآمد و توانمند برای تولید و ترشح آنزیمهای اختصاصی و غیراختصاصی دارند و بهکمک آنها میتوان طیف وسیعی از ترکیبات آلاینده را تجزیه کرد (1). قارچها بهدلیل وجود ساختارهای مقاوم میتوانند در محیطهای پرتنش مانند pH کم و محیطهای غذایی فقیر نیز رشد کنند و در رقابت با سایر میکروارگانیسمهای محیطی بهخوبی بقا داشته باشند (1و3). علیرغم مطالعات گسترده بر حذف زیستی فنل توسط میکروارگانیسمهای مختلف، مطالعات چندانی در محیطهای آلوده با شرایط سخت از جمله محیطهای با دمای بالا و یا پایین، اکوسیستمهای شور و یا با pH بالا و یا پایین صورت نگرفته است (7- 9). با توجه به شوربودن بسیاری از خاکهای کشور، پساب حاوی فنل تولیدی صنایع مختلف از جمله صنایع دارویی، صنایع نفتی، صنایع تولید آفتکش، رنگ و ساخت رزینهای مصنوعی و صنایع سیمان (10) میتواند منجر به تولید پساب و خاک شور آلوده به فنل شود که این امر لزوم استفاده از میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ فنل و تحملکنندۀ نمک را بیش از پیش آشکار میکند (11 و 12). برایناساس، هدف از انجام این پژوهش جداسازی و معرفی جدایههای مخمر توانمند در حذف زیستی غلظت بالای فنل در شرایط نمکی بود. همچنین بهمنظور ارزیابی توانمندی جدایۀ منتخب، تأثیر غلظتهای مختلف فنل در حضور 5درصد نمک بر رشد و تجزیۀ زیستی فنل بررسی شد.
مواد و روشها.
جمعآوری نمونه: بهمنظور جداسازی مخمرهای تحملکنندۀ نمک و تجزیهکنندۀ فنل از خاکهای مختلف آلوده با آلایندههای نفتی و شور، نمونهبرداری انجام شد. برای این منظور 15 نمونه خاک آلوده به نفت از نقاط مختلف پالایشگاه قم، شازند اراک، خارک، بیبی حکیمۀ گچساران و جزیرۀ سیری جمعآوری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. نمونهها در آزمایشگاه با الک 5/0 میلیمتر همگن شد و ذرات درشت آن جداسازی شد.
.جداسازی مخمرهای تجزیهکنندۀ فنل در محیط حاوی نمک: بهمنظور جداسازی جدایههای مخمری با توانایی مصرف فنل در محیط نمکی، از دو روش غنیسازی و کشت در پلیت استفاده شد. محیط کشت گلوکز-پپتون-عصارۀ مخمر[1] (GPY) و مالت آگار[2] (MA) بههمراه ppm۲۵۰ فنل و ۵درصد NaCl بدین منظور استفاده شد. در روش غنیسازی، نمونههای خاک همگنشده بهمدت یک هفته در محیطهای مایع GPY و MB (مالت براث) بههمراه ppm۲۵۰ فنل ، ۵درصد NaCl وmg/l ۵۰ کلرامفنیکل در شیکر انکوباتور با دمای ۲۸ درجه سانتیگراد و دور rpm۱۶۰ گرماگذاری شد. بعد از این مدت ۱۰۰ میکرولیتر از محیط غنیشده بر روی محیط کشت دارای کلرامفنیکل و ۵درصد NaCl پخش و بهمدت یک هفته در انکوباتور گرماگذاری شد. در روش کشت گسترده در پلیت نیز ابتدا از نمونههای خاک، رقتهای ۳-۱۰ و ۴-۱۰ تهیه شد و درنهایت ۱۰۰ میکرولیتر از هریک از رقتها بر روی محیطهای GPY و MA دارای آنتیبیوتیک همراه با ۵درصد NaCl پخش شد. پلیتهای بهدستآمده در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد بهمدت یک هفته در انکوباتور گرماگذاری شدند (10).
سنجش میزان حذف فنل: بهمنظور بررسی توانمندی جدایههای بهدستآمده در حذف فنل، هریک از جدایه ها در غلظتهایppm ۱۲۵۰-۲۵۰ بررسی شدند. بهمنظور سنجش میزان حذف فنل، از روش اسپکتروفوتومتری در طول موج ۲۷۰ نانومتر استفاده شد (13). منحنی استاندارد غلظتهای مختلف فنل نیز با همین روش رسم شد. سنجش میزان فنل بهصورت 3بارتکرار و در دو آزمایش مستقل انجام شد.
.بررسی رشد سویۀ منتخب در غلظتهای مختلف فنل: بهمنظور بررسی رشد سویۀ منتخب و تعیین سمیت فنل بر رشد، محیط حاوی پایه معدنی بر حسب گرم در لیتر شامل MgCl2.2H2O (۳/۰گرم) KH2PO4 (۳/۴گرم) K2HPO4 (۴/۳گرم) بههمراه ۵/۰گرم عصاره مخمر بهعنوان فاکتور محرک رشد در یک لیتر آب مقطر و ۵درصد NaCl و فنل بهعنوان تنها منبع کربن در غلظتهای ppm ۷۵۰،۱۰۰۰،۱۲۵۰ استفاده شد. شمارش سلولی توسط لام هموسایتومتر و اندازهگیری وزن خشک سلولی در طی ۲۴، ۴۸ و۷۲ ساعت پس از گرماگذاری انجام شد. سنجش تودۀ سلولی خشک بهصورت 3بار تکرار و در دو آزمایش مستقل و سنجش تعداد سلول دو نمونه بهصورت جداگانه در هربار شمارش انجام شد.
.بررسی میزان حذف فنل توسط سویۀ منتخب در غلظتهای مختلف فنل: بهمنظور بررسی توانایی سویۀ منتخب در حذف فنل، میزان باقیماندۀ غلظتهای ppm ۷۵۰،۱۰۰۰،۱۲۵۰ از فنل در محیط مشابه بررسی شد، سنجش میزان فنل باقیمانده در ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از گرماگذاری انجام شد. سنجش میزان حذف فنل بهصورت 3بارتکرار و در دو آزمایش مستقل انجام شد.
شناسایی جدایۀ منتخب: بهمنظور شناسایی مولکولی، ابتدا جدایۀ منتخب در محیطGPY بهمدت ۲۴ ساعت در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. تودۀ زیستی با سانتریفیوژ ۱۰ میلیلیتر از کشت در ۸۰۰۰ دور در دقیقه بهمدت ۵ دقیقه جدا شد. سلولهای مخمر جداشده توسط سانتریفیوژ، بعد از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته شدند. در ادامه از طریق شکستن فیزیکی با کمک روش ساییدن زیستتودۀ منجمدشده با استفاده از ازت مایع، سلولها شکسته شدند (14). DNA مخمر بهروش فنل-کلروفرم استخراج و با الکل رسوب داده شد (14). برای تأیید حضور DNA الکتروفورز افقی با ژل آگاروز ۱درصد صورت گرفت (14). سپس تکثیر ژنITS توسط واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای ITS1 و ITS4 (ITS1: 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′ و ITS4: 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) انجام شد (15). مخلوط واکنش PCR حاوی ۲ میکرولیتر DNA بهعنوان الگو، ۱ میکرولیتر از هرکدام از پرایمرها (۱۰ پیکومول)، ۵/۱۲ میکرولیتر 2X Taq DNA polymerase master mix و ۵/۸ میکرولیتر آب مقطر دوبارتقطیر بود. محصول PCR برای تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره ارسال شد(16). برای شناسایی و بررسی نزدیکترین سویه ازلحاظ توالی ژن ITS به سویۀ منتخب، از انطباق توالی بهدستآمده با اطلاعات توالیهای موجود در پایگاه داده بانک ژنی استفاده شد. بهمنظور انجام همردیفی چندگانه بین توالیها از برنامۀ کروماس پرو[3] استفاده شد. با استفاده از نرمافزار بیوادیت[4] توالیهای همردیفشده مرتب شد و برای رسم درخت فیلوژنی به کار گرفته شد. در رسم درختهای فیلوژنی با استفاده از نرمافزار مگا-6[5] ، از الگوریتم اتصال- همسایگی[6] استفاده شد. برای اطمینان از تکرارپذیربودن درخت فیلوژنی، میزان بوت استرپ[7] پس از ۵۰۰ بار تکرار تعیین شد.
نتایج.
جداسازی جدایۀ مخمری تجزیهکنندۀ فنل در محیط پایه نمکی: با استفاده از دو روش غنیسازی و کشت در پلیت حاوی فنل و نمک، ۱۵ جدایۀ مخمری جداسازی شدند که در غربالگریهای بعدی استفاده شدند. جدایههای بهدستآمده بعد از بررسی مارکروسکوپی و میکروسکوپی روی محیط GPY خالصسازی شدند و برای انجام سنجش میزان حذف فنل استفاده شدند.
سنجش میزان حذف فنل: بهمنظور بررسی توانمندی سویهها در حذف فنل و غربالگری بهترین جدایه، هرکدام از آنها در غلظتهایppm ۱۲۵۰-۲۵۰ از فنل بررسی شدند. از ۱۵ سویۀ جداسازیشده، جدایۀ ADH8 بهعنوان جدایۀ منتخب با حداکثر تحمل ppm ۱۲۵۰ و رشد در حضور ۵درصد NaCl انتخاب شد. فنل در غلظتهای بالاتر از ppm ۱۲۵۰برای این سویه در محیط حاوی ۵درصد NaCl سمیت داشت و باعث کاهش رشد قابلِتوجهی در سلولهای مخمری شد.
شناسایی سویۀ منتخب: نتایج تعیین توالی و همردیفی با نزدیکترین سویهها در پایگاه دادۀ NCBI نشان داد که جدایۀ ADH8 با میزان شباهت ۱۰۰درصد نزدیکترین سویه به Trichosporon cutaneum است. توالی بهدستآمده از T. cutaneum با کد دسترسی KT962836 در بانک ژنی ثبت شد. جدول ۱ ویژگیهای ژن تعیینِتوالیشده و سویۀ مشابه بهدستآمده را نشان میدهد.
جدول ۱- نتایج حاصل از آنالیز ژن تعیینِتوالیشده جدایۀ ADH8
|
نام جدایۀ منتخب |
شماره دستیابی |
تعداد نوکلئوتیدهای تعیینِتوالیشده |
ژن موردنظر |
درصد شباهت |
|
Trichosporon cutaneum |
KT962836 |
۵۰۰ |
ITS |
۱۰۰ |
شکل 1- درخت فیلوژنی با استفاده از پرایمرهای ژن ITS، با الگوریتم اتصال- همسایگی و تعیین فاصلۀ توالیها
.بررسی رشد T. cutaneum در غلظتهای مختلف فنل: بررسی رشد T. cutaneum و تعیین میزان سمیت فنل بر رشد در غلظتهای ppm ۷۵۰، ۱۰۰۰ و ۱۲۵۰ نشان داد که این سویه در غلظتهای ppm ۷۵۰ و ۱۰۰۰ رشد قابلِتوجهی داشته و از فنل بهعنوان تنها منبع کربن موجود در محیط استفاده کرده است. در غلظت ppm ۷۵۰ حداکثر میزان رشد پس از ۲۴ ساعت گرماگذاری مشاهده شد (شکل ۲ و۳) و پس از آن بهدلیل مصرف منبع کربن، کاهش در تعداد مخمرهای زنده دیده شد. ازآنجاییکه این سویه توانایی رشد و تحمل سمیت در غلظت ppm ۱۰۰۰ را داراست، بهدلیل منبع کربن در دسترس بیشتر، این سویه نسبت به غلظت ppm ۷۵۰، رشد بیشتری را نشان میدهد. در غلظت ppm ۱۲۵۰ بهدلیل سمیت موجود در محیط، فاز تأخیر طولانیتر و رشد کندتر مشاهده شد و T. cutaneum برای استفاده از فنل نیاز به زمان تطبیق بالاتر با شرایط کشت داشته است (شکل ۲ و ۳). با مقایسۀ وزن خشک سلولی و تعداد سلولها در غلظتهای ppm 1000 و 1250 در شکل 2 و3 مشاهده میشود که علیرغم انتظار و برخلاف نتایج حاصل از شمارش سلولی در وزن تر مقدار زیستتوده در غلظت فنل ppm 1250 در مقایسه با ppm 1000 افزایش یافته که ازآنجاییکه از فنل بهعنوان تنها منبع کربن موجود محیط کشت است افزایش میزان تودۀ سلولی در غلظتهای بالاتر منطقی به نظر میرسد هرچند که بهدلیل سمیت فنل در غلظت ppm 1000 و 1250 نسبت به ppm 750 رشد با تأخیر شروع شده است.
.بررسی میزان حذف فنل توسط T. cutaneum در غلظتهای مختلف فنل: بهمنظور بررسی توانایی T. cutaneum در حذف فنل، در غلظتهای ۷۵۰، ۱۰۰۰و ۱۲۵۰ ppm ، سنجش فنل در ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت پس از گرماگذاری انجام شد. نتایج بهدستآمده نشان داد که T. cutaneum توانایی مصرف فنل در غلظتهای ppm ۷۵۰ و ۱۰۰۰ را داشت و پس از گذشت ۲۴ ساعت تمامی فنل اولیۀ موجود در محیط را مصرف کرده است. در غلظت ppm ۱۲۵۰ بهدلیل فاز تأخیر طولانیتر و نیاز سویه به تطبق خود به سمیت فنل موجود در محیط، حذف کامل فنل پس از ۴۸ ساعت انجام شد (شکل ۴).
شکل ۲- نمودار رشد: بررسی تأثیر غلظتهای مختلف فنل بر تعداد سلولهای زنده موجود در محیط حاوی ۵درصد NaCl کشت T. cutaneum
شکل3- نمودار رشد: بررسی تأثیر غلظتهای مختلف فنل بر بیومس خشک در محیط حاوی ۵ درصد NaCl کشت T. cutaneum
شکل4- نمودار حذف فنل: بررسی تأثیر غلظتهای مختلف بر حذف فنل در محیط حاوی ۵درصد NaCl کشت T. cutaneum
بحث و نتیجهگیری.
از مخمرها بهصورت گسترده بهمنظور تجزیۀ زیستی فنل و تولوئن استفاده شده است (17). زیستتخریبپذیری فنل توسط گونههای میانهدوست مخمری از جمله Candida tropicalis(17)،
C. maltosa (18)، C. phenolicus (19) و همچنین گونههای مزوفیل Trichosporon(20 و 21) بررسی و مطالعه شده است؛ اما تجزیۀ زیستی فنل در اکوسیستمهای آلوده با شرایط سخت محیطی از جمله سرما، گرما، pH بالا و پایین و شوری کمتر موردِتوجه پژوهشگران بوده است (7 و 8). در مطالعهای که مارگسین[viii] و همکارانش در سال ۲۰۰۳ انجام دادهاند از مخمرهای انطباقیافته برای رشد در سرما بهمنظور پاکسازی زیستی فنل و هیدروکربنهای نفتی استفاده شد. در این پژوهش نشان دادند که میزان متابولیسم در مخمرها در مقایسه با باکتریها بالاتر است و میتوان از این میکروارگانیسمها بهمنظور پاکسازی زیستی مناطق سرد آلوده استفاده کرد (22). براساس اطلاعات موجود، در این مطالعه حذف فنل در شرایط نمکی توسط T. cutaneumبرای اولین بار موردِتوجه قرار گرفته است. البته باید اشاره کرد که در مطالعات مشابه انجامشده این جنس بهعنوان مخمر تجزیهکنندۀ فنل معرفی شده است (1و21). اما شرایط حذف فنل در این مطالعات در شرایط مزوفیل و بدون استرس بوده است. در مطالعهای که آلکسیویا[ix] و همکاران در سال ۲۰۰۸ انجام دادهاند، غلظت ppm ۴۰۰ از فنل توسط T. cutaneumبه ppm ۱۰۰ در شرایط بدون استرس کاهش یافته است (1). در مطالعۀ انجامشده غلظت ppm ۱۲۵۰ از فنل در حضور ۵درصد NaCl به حدود صفر کاهش داده شده است که این نتایج نشان میدهد جدایۀ منتخب توانایی بالاتری دارد. در مطالعۀ انجامشده بر حذف زیستی فنل در شرایط نمکی باستوس[x] و همکارنش در سال 2000 دو جدایۀ شامل باکتری Alcaligenes faecalis و مخمر Candida tropicalis را از رودخانه آمازون جداسازی کردند. در این مطالعه عنوان شد که مخمر C. tropicalisقادر به تحمل ppm 1500 فنل در حضور ۱۵درصد نمک است درصورتیکه باکتری A. faecalis مزان تحمل ppm 1000 و ۶/۵درصد نمک را دارد. در این مطالعه میزان حذف فنل بررسی نشده است (10). همچنین Hinteregger و Streichsbier در سال 1997 باکتری تحملکنندۀ نسبی نمک Halomonas sp برای تیمار محیطهای آلوده فنلی همراه با نمک معرفی کرد. در این پژوهش از غلظت ppm 100 فنل و غلظتهای نمک 0 تا 14درصد استفاده شد و عنوان شد که بهترین نتایج در غلظت 5درصد نمک به دست آمد (23). در مطالعۀ انجامشدۀ دیگری مشخص شده است که
T. cutaneumتوانایی تجزیۀ ترکیبات زنوبیوتیک مختلف از جمله کروزول، مشتقات فنلی از جمله 2 ،6 دی نیتروفنل، 3 نیتروفنل و 4 نیتروفنل را بهمیزان کمی در شرایط بدون استرس دارد (20). نتایج بهدستآمده در این پژوهش و سایر پژوهشهای انجامشده نشان میدهد که T. cutaneum توانمندی بالایی در تجزیۀ ترکیبات منوآروماتیک از جمله فنل و مشتقات فنلی دارد. براساس نتایج بهدستآمده در این پژوهش مشخص شد که T. cutaneumتوانایی بالایی در مصرف فنل در شرایط نمکی دارد و بهعنوان یک سویۀ ارزشمند قابلیت استفاده در پاکسازی زیستی پساب و خاکهای آلوده به نمک و شور دارد. براساس نتایج ارائهشده در این پژوهش T. cutaneumقادر به حذف کامل فنل با غلظت ppm ۱۲۵۰ در طی ۴۸ ساعت و در حضور ۵درصد نمک است. با مقایسۀ نتایج بهدستآمده با سایر پژوهشهای انجامشده میتوان چنین ادعا کرد که نتایج ارائهشده، میزان حذف فنل را در T. cutaneumتا ۳ برابر مقدار گزارششدۀ قبلی و در حضور ۵درصد نمک نشان میدهد. با توجه به آلودگی وسیع خاک و پساب کشور درنتیجۀ فعالیت صنایع نفت و پتروشیمی، صنایع سیمان و دارویی و غیره و همچین با توجه به شوری ۳ تا ۵درصدی خاکهای بسیاری از مناطق کشور (24) یافتههای این پژوهش میتواند بهمنظور پاکسازی زیستی خاک و پسابهای آلودۀ حاوی نمک موردِتوجه و ارزشمند باشد.
)