نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
2 استاد فیزیک پزشکی، مرکز تحقیقات بیولوژی، واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
3 استادیار ژنتیک، واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
4 استادیار میکروبیولوژی، واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
5 کارشناس ارشد قارچشناسی پزشکی، واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Shigella is a Gram-negative enteric bacilli that causes serious problems in advanced and developing countries. The purpose of this study was to evaluate colorimetric assay based on gold nanoparticles for rapid detection of S. flexneri using ipaH gene amplification products.
Materials and methods: To identify the genus Shigella, the specific primers were used to amplify ipaH gene with polymerase chain reaction (PCR) method. Then, single-stranded probe was used to connect to the specific region of the PCR product. After addition of gold nanoparticles, the color changing was observed visually in the solution and imaged with scanning electron microscope (SEM). To examine the sensitivity of new method, a range of different concentrations of PCR products was used and the results were compared with gel electrophoresis method.
Results: The hybridization of probes with amplified products of ipaH gene caused the accumulation of gold nanoparticles which resulted in color changing in the reaction solution from red to purple, but no color changing was observed in the negative control. Then, the accumulation of gold nanoparticles was approved with SEM.
Discussion and conclusion: Because of the specificity of ipaH gene in S. flexneri, the colorimetric assay with high sensitivity can be used for specific detection of S. flexneri in the clinical specimen and food samples.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
اسهالهای عفونی یکی از مشکلات مهم بهداشتی در سراسر جهان به شمار میروند و هرساله باعث ابتلا و مرگومیر زیاد مبتلایان در کشورهای جهان سوم میشوند. در بین پاتوژنهای عامل اسهال، شیگلا[1] نقش مهمی در ایجاد اسهالهای خونی و التهابی دارد. این بیماری عمدتاً ازطریق شخص به شخص و یا از طریق آب یا غذا انتقال مییابد (1). افراد کمسن، پیر و یا افرادی که دچار کاهش عملکرد سیستم ایمنی بدن هستند، ممکن است در معرض خطر بیشتری برای عفونت باشند (2). روشهای تشخیص شیگلا شامل روشهای رایج کشت، روشهای ایمونولوژیک و روشهای میکروبیولوژی مولکولی هستند. تشخیص این باکتری با روش کشت باکتریایی بهدلیل وقتگیربودن و نیز فقدان محیط کشت انتخابی مناسب، مشکل است (3). گرچه تاکنون روشهای ایمونولوژیک نیز برای تشخیص باکتری شیگلا محقق شده است، با این حال تنها یک کیت تجاری جهت انجام آزمایش میکروبیولوژیکی در دسترس است. روشهای میکروبیولوژی مولکولی نیز مانند polymerase chain reaction (PCR)، برای تشخیص و شناسایی شیگلا گسترش قابلِتوجهی یافته است. با این حال، اشکال عمده در استفاده ازPCR ، نیاز به تجزیه و تحلیل نتایج پس از انجام آزمایش با استفاده از روش ژل الکتروفورز است که یک فرآیند نسبتاً زمانبر است و ممکن است بهدلیل آلودگی آزمایشگاهی همراه با نتایج مثبت کاذب باشد (5 ،4).
در سالهای اخیر، استفاده از نانوذرات، بهخصوص نانوذرات فلزی در تحقیقات زیستپزشکی گسترش زیادی یافته است (6). نانوذرات دارای خصوصیات ویژهای از قبیل اندازۀ بسیار کوچک، نسبت سطح بزرگ به حجم و ویژگیهای فیزیکوشیمیایی خاصی هستند که مواد در مقیاس بزرگتر فاقد این ویژگیها هستند (7). در این میان، نانوذرات طلا بیشترین کاربرد را در علوم پزشکی دارند و در مواردی چون هدفمندسازی ژنی و بهدلیل سمیت سلولی کم، استفاده شدهاند (8). بهدلیل اینکه روشهای اندازهگیری متعددی نظیر جذب نوری، فلورسانس و پخش رامان میتوانند برای تشخیص نانوذرات طلا به کار روند، این ذرات نشانگرهای مناسبی در طراحی زیستحسگرها محسوب میشوند، بهطوریکه تشخیص DNA با استفاده از نانوذرات طلا نسبت به سیستمهای معمول تشخیص ژنومی، حدود ده برابر افزایش حساسیت و صدهزار برابر ویژگی بیشتری نشان میدهند (9). هدف از پژوهش حاضر توسعۀ یک روش سریع با حساسیت و اختصاصیت بالا برای تشخیص باکتری شیگلا فلکسنری با استفاده از روش رنگسنجی بر پایۀ نانوذرات طلا است (10). اساس این روش بر پایۀ اتصال پروب مربوط به محصول PCR به نانوذرات طلا استوار است. بدینصورت که در صورت وجود قطعۀ ژنومی موردنظر در نمونه و تکثیر آن توسط PCR، پروب مربوطه به محصول PCR متصل میشود و نانوذرات طلا بهصورت آزاد و رها در محلول باقی میمانند و با اضافهکردن محلول نمک تجمع نانوذرات طلا و درنتیجه تغییر رنگ محلول واکنش اتفاق میافتد و در نبود این قطعۀ ژنی اتصال بین پروب و نانوذرات رخ میدهد و درنتیجه هیچ تغییر رنگی مشاهده نمیشود.
مواد و روشها.
کیت استخراج DNA، آنزیم taq polymerase، dNTP، بافر PCR ، نشانگر اندازۀ DNA (DNA size marker) ، کلرید منیزیم، اتیدیوم بروماید، بافرTBE از شرکت سیناکلون و نانوذرات طلا با اندازه 15 نانومتر از شرکت سیگما تهیه شدند. باکتری شیگلا فلکسنری ATCC:12022 از بانک میکروبی دانشگاه علوم پزشکی تبریز تهیه شد و آزمایشات لازم برای تأیید سویۀ موردنظر صورت گرفت. سپس این باکتری در محیط مولر هینتون آگار ساب کالچر داده شد.
استخراج DNA: بهمنظور استخراج ژنوم باکتری شیگلا فلکسنری، باکتری از محیط کشت مولر هینتون آگار به محیط نوترینت براث تلقیح شد و بهمدت 24 ساعت داخل انکوباتور شیکردار با دمای37 درجه سانتیگراد قرار گرفت و سپس DNA آن با استفاده از کیت استخراج DNA باکتریهای گرممنفی با کد PR881613C محصول شرکت سینا کلون، استخراج شد و برای استفاده در مراحل بعدی آزمایش داخل فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. نحوۀ استخراج براساس اتصال DNA به ماتریس حاوی فیلتر غشایی سیلیسی در حضور غلظت بالا از نمک و تخلیص و شستشو از ستون در حضور غلظت پایین نمک مثل بافر تخلیص است.
اندازهگیری کمی و کیفی DNA خارجشده: برای اندازهگیری کمی غلظتDNA خارجشده از دستگاه بیوفتومتر ساخت شرکت اپندورف کشور آلمان استفاده شد. ابتدا رقتهای متوالی از DNA خارجشده تهیه شد و میزان غلظت آنها در طول موج های 260 و 280 نانومتر خوانده شد. سپس برای اندازهگیری کیفی DNA خارجشده، از روش الکتروفورز در ژل آگارز 8/0درصد و رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید استفاده شد.
طراحی آغازگر[2] برای انجام PCR: در این مطالعه بهمنظور انجامPCR ژنipaH ، آغازگرهای جلویی و برگشتی با استفاده از نرمافزار ژنرانر[3] طراحی و توسط نرمافزار آنلاین بلاست[4] تأیید شد. سپس سفارش ساخت آغازگرهای طراحیشده به شرکت سینا کلون داده شد. توالی آغازگرها و پروب استفادهشده در این پژوهش، در جدول ۱ نشان داده شده است.
آزمون PCR: جهت انجام PCR از دستگاه ترموسایکلر گرادیانت ساخت شرکت اپندورف کشور آلمان استفاده شد. برای تکثیر ژن ipaH از زوج آغازگرهای جلویی و برگشتی (طبق جدول شماره 1) استفاده شد. همچنین برای تکثیر ژن ipaH مخلوط واکنش[5] زیر تهیه و استفاده شد.
بافر PCR X1، MgCl2mM 5/1، mM dNTP 5/1، آغازگر جلویی و برگشتی هرکدام pmol20، پلیمراز Taq 1 µ،DNA الگو ng10 که حجم نهایی برای هر واکنش 30 میکرولیتر و چرخههای حرارتی استفادهشده بهصورت جدول 2 بود.
جدول 1- توالی آغازگرهای استفادهشده جهت PCR ژنipaH و پروب برای آزمون رنگسنجی
|
Bp |
Oligonucleotide |
|
|
169 |
ipaHF:5′-CAGAAGAGCAGAAGTATGAG-3′ ipaHR:5′-CAGTACCTCGTCAGTCAG-3′ |
Primers |
|
16 |
ipaHP: 5’ CAGTCTCACGCATCAC3’ |
Probe |
جدول 2- چرخۀ حرارتی استفادهشده جهت انجام PCR
|
ردیف |
مرحله |
دما (سانتیگراد) |
زمان |
تکرار |
|
1 |
واسرشتگی اولیه[6] |
94 |
10 دقیقه |
1 |
|
2 |
واسرشتگی[7] |
94 |
30 ثانیه |
30 |
|
3 |
اتصال[8] |
48 |
1 دقیقه |
30 |
|
4 |
تکثیر[9] |
72 |
40 ثانیه |
30 |
|
5 |
تکثیر نهایی[10] |
72 |
10 دقیقه |
1 |
اندازهگیری کمی و کیفی محصول PCR: برای اندازهگیری میزان کمی محصول PCR از دستگاه بیوفتومتر اپندورف استفاده شد و رقتهای متوالی از محصول PCR تهیه و میزان غلظت آنها در طول موجهای 260 و280 آنگستروم خوانده شد. سپس جهت بررسی میزان کیفی محصول PCR با ژل آگارز 2درصد الکترفورز شد. برای رنگآمیزی ژل از اتیدیوم بروماید استفاده شد و سپس توسط دستگاه ژل داک[11] تصویربرداری انجام شد.
انجام آزمون رنگسنجی جهت تشخیص باکتری شیگلا فلکسنری: سفارش ساخت پروب استفادهشده در آزمون رنگسنجی به شرکت MWG آلمان داده شد. برای اعمال دماهای موردِنیاز در آزمونهای رنگسنجی از دستگاه PCR گرادیانت استفاده شد. برای این منظور داخل میکروتیوب مقدار 5 میکرولیتر بافر فسفات با 7pH=، pmol/µl200 محصول PCR و بهمقدار pmol/µl100 پروب اضافه شد. سپس توسط دستگاه ترموسایکلر گرادیان بهترتیب دمای C◦95 و به منظور دناتوراسیون بهمدت 20 دقیقه و دمای C◦43 و بهمدت 10 دقیقه جهت واکنش هیبریداسیون اعمال شد. سپس میکروتیوبها از دستگاه خارج شدند و 100 میکرولیتر از محلول نانوذرات طلا با 1OD= اضافه شد و بهمدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه شد تا اتصال پروب به محصول PCR صورت گیرد. سپس بهتدریج با اضافهکردن محلول نمک 2/0 مولار به لولهها وقوع یا عدم وقوع تغییر رنگ بهصورت چشمی ثبت شد.
تعیین حساسیت و اختصاصیت آزمون رنگسنجی: برای سنجش اختصاصیت این آزمون به جای شیگلا فلکسنری از باکتری E coli o157استفاده شد و برای نشاندادن حساسیت آزمون، از سری رقتهای 1:2، 1:10، 1:20، 1:50 از محصول PCR تهیه شد و حساسیت آزمون رنگسنجی در مقایسه با ژل الکترفورز سنجیده شد.
تصویربرداری SEM: تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی با استفاده از دستگاه SEM بهمنظور نشاندادن تجمع نانوذرات طلا در حضور باکتری شیگلا فلکسنری و یا عدم تجمع آن در صورت فقدان باکتری ذکرشده انجام گرفت. در این پژوهش از دستگاه SEM مرکز پژوهش متالوژی رازی، ساخت کشور جمهوری چک استفاده شد.
نتایج.
اندازهگیری کمی و کیفی DNA استخراج شده: در این مطالعه غلظت DNA خارجشده با استفاده از دستگاه بیوفتومتر 580 میکروگرم بر میلیلیتر به دست آمد و نتایج حاصل از الکتروفورز، وجود باندهای سالم با درصد خلوص بالا را نشان دادند.
اندازهگیری کمی و کیفی محصول PCR: میزان کمی محصول PCR با استفاده از دستگاه بیوفتومتر و در طول موجهای 260 و280 نانومتر اندازهگیری شد و غلظت 1/17 میکروگرم بر میلیلیتر به دست آمد. همچنین با استفاده از الکتروفورز محصول PCR ژن ipaH بر روی ژل آگارز طبق انتظار، محصول ذکرشده دارای 169 جفت باز بود (شکل 1).
شکل 1- الکتروفورز محصول PCR. ردیف 1 نشانگر، ردیف 5-2 محصول PCR ژن ipaH باکتری شیگلا فلکسنری، ردیف 6 کنترل منفی.
تشخیص باکتری شیگلا فلکسنری با روش رنگسنجی: به تدریج پس از افزودن 9 میکرولیتر محلول نمک 2/0 مولار به مخلوط واکنش حاوی نانودرات طلا، بافرفسفات، محصول PCR و پروب، تجمع نانوذرات طلا با تغییر رنگ محلول حاوی باکتری شیگلا فلکسنری از قرمز به بنفش مشاهده شد. درحالیکه در نمونۀ کنترل منفی هیچ تغییر رنگی مشاهده نشد.
تعیین میزان حساسیت روش رنگسنجی: آزمون رنگسنجی و همچنین ژل الکترفورز بر روی رقتهای مختلف محصول PCR صورت گرفت و حساسیت این آزمون در مقایسه با ژل الکترفورز سنجیده شد. بدین صورت که در ژل الکتروفورز رقتهای 1:2 و 1:10 باند بسیار ضعیفی تشکیل دادند ولی تمام رقتها با آزمون رنگسنجی و تغییر رنگ مخلوط واکنش از قرمز به بنفش حضور باکتری را نشان دادند که این بررسی نشان از حساسیت بالای آزمون رنگسنجی در مقایسه با ژل الکترفورز است (شکل 2).
شکل 2- سمت راست تصویر الکتروفورز، شماره 1 مربوط به نشانگر، شماره (5-2) رقتهای 1:2، 1:10، 1:20، 1:50محصول PCR ژن ipaH باکتری شیگلا فلکسنری که فقط رقتهای 2/1 و 10/1 باند بسیار ضعیفی ایجاد کرده است. شماره 6 کنترل منفی است.
سمت چپ: لولههای آزمون رنگسنجی؛ شماره 4-1 بهترتیب رقتهای 1:2، 1:10، 1:20، 1:50 محصول PCR ؛ که در تمام رقتها تغییر رنگ قرمز به بنفش مشاهده میشود. شماره 5 کنترل منفی است.
تعیین میزان اختصاصیت آزمون رنگسنجی: برای نشاندادن اختصاصیبودن آزمون رنگسنجی از محصول PCR اختصاصی (باکتری شیگلا فلکسنری) و محصول PCR غیراختصاصی (باکتری E.coli O157) استفاده شد. بدین صورت که با انجام آزمون رنگسنجی در حضور باکتری شیگلا فلکسنری نانوذرات طلا تجمع یافت و رنگ مخلوط واکنش از قرمز به بنفش تغییر کرد ولی در حضور محصول PCR غیراختصاصی، تغییر رنگی مشاهده نشد (شکل 3).
بررسی نمونهها با میکروسکوپ الکترونی SEM: با استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM مشاهده شد که نانوذرات طلا در مخلوط واکنش حاوی باکتری شیگلا فلکسنری تجمع یافته بود ولی در مخلوط واکنشی که باکتری شیگلا فلکسنری وجود نداشت هیچگونه تجمعی انجام نگرفته بود (شکل 4).
شکل 3- لولۀ سمت راست تغییر رنگ نانوذرات طلا از رنگ قرمز به بنفش یعنی حضور باکتری شیگلا فلکسنری را نشان میدهد ولی در لولۀ سمت چپ بهدلیل نبودِ باکتری شیگلا فلکسنری هیچ تغییر رنگی مشاهده نمیشود.
شکل 4- الف: بهدلیل پخشبودن نانوذرات طلا تصویر بهصورت یکنواخت است و هیچگونه تجمعی مشاهده نمیشود ب: کنتراست تصویر بهدلیل تجمع نانوذرات طلا و ایجاد توده است.
بحث و نتیجهگیری.
شیگلا باسیل گرم منفی رودهای است که عفونتهای ناشی از آن مشکلات جدی را در کشورهای پیشرفته و در حال توسعه ایجاد کرده است. شیوع عفونتهای ناشی از شیگلا بهدلیل بیماریزایی این باکتری حتی با مقادیر کم ارگانیسم و همچنین انتقال آسان آن از فردی به فرد دیگر و نیز آلودهشدن غیرمستقیم افراد از طریق مصرف مواد غذایی و آب آلوده بسیار آسان است (11). با توجه به اهمیت درمان مؤثر بیمارانی که به شیگلوزیس مبتلا شدهاند شناسایی زودهنگام عامل این بیماری بسیار ضروری است. در ایران طی سالهای گذشته میزان شیوع باکتری شیگلا فلکسنری نسبت به سایر گونهها بیشتر بود و به این دلیل مطالعۀ حاضر بر روی این باکتری صورت گرفت. در این پژوهش برای شناسایی باکتری شیگلا فلکسنری از ژن اختصاصی ipaH که عامل بیماریزایی[xii] نیز هست استفاده شد (12).
در مطالعۀ حاضر آزمایش PCR با اعمال گرادیانت دمایی در دماهای مختلف انجام شد و دمای بهینه واکنش زنجیرهای پلیمراز در گرادیانت دمایی C◦48 به دست آمد. محصول PCR به اندازۀbp 169 ایجاد شد که از این محصول برای انجام آزمون رنگسنجی استفاده شد. نانوذرۀ استفادهشده در این بررسی دارای اندازۀ 15 نانومتر و به رنگ قرمز بود و حداکثر جذب را در طول موج 520 نانومتر نشان داد. این مطالعه برای اولین بار برای شناسایی باکتری شیگلا فلکسنری استفاده شد و نتایج آن در مقایسه باPCR و ژل الکتروفورز در زمان کمتر و با حساسیت و اختصاصیت بالا به دست آمد. در این مطالعه برخلاف پوریا گیل و همکارانش که از نانوذرات طلای عاملدار برای تشخیص مایکوباکتریوم استفاده کرده بودند از نانوذرات طلای غیرعاملدار به دلیل نیازنداشتن به تجهیزات پیچیده برای عاملدارکردن استفاده شد (13). آزمون رنگسنجی همانند مطالعه دنیش پراساد و همکارانش که از نانوذرات طلا، پروب، مولکول DNA، بافر فسفات و نمک 2/0 مولار برای شناسایی گونههای سالمونلا در مواد غذایی استفاده شده بود انجام گرفت و مطابق با آزمون ایشان، در مطالعۀ حاضر نیز حساسیت و اختصاصیت این آزمون در مقایسه با ژل الکترفورز بسیار بالا بود (10). همچنین در این روش همانند مطالعه هیوکسینگ لی[xiii] و همکارانش که براساس تفاوت در ویژگیهای الکترواستاتیک الیگونوکلئوتیدهای تکرشتهای و دورشتهای بود، هیبریداسیون پروب با DNA باکتری موردنظر، باعث تجمع نانوذرات طلا بهشکل شبکهای متصل به هم و درنتیجه تغییر رنگ مخلوط واکنش شد که این تغییر رنگ نشاندهندۀ وجود مولکول هدف در نمونه بود که بهروش چشمی هم قابلِتشخیص بود (14). برای نشاندادن اختصاصیت آزمون رنگسنجی از محصول PCR اختصاصی (باکتری شیگلا فلکسنری) و محصول PCR غیراختصاصی (E coli O157) استفاده شد بدین صورت که با انجام آزمون رنگسنجی در حضور باکتری شیگلا فلکسنری، نانوذرات طلا تجمع یافت و رنگ مخلوط واکنش از قرمز به بنفش تغییر کرد ولی در حضور محصول PCR غیراختصاصی چنین تغییر رنگی مشاهده نشد (15). برای نشاندادن حساسیت آزمون رنگسنجی نیز از سری رقتهای 1:2، 1:10، 1:20، 1:50 از محصول PCR تهیه شد و حساسیت این آزمون در مقایسه با روش ژل الکترفورز سنجیده شد. بدین صورت که در ژل الکتروفورز رقتهای 1:2 و 1:10 باند بسیار ضعیفی تشکیل دادند ولی تمامی رقتها با آزمون رنگسنجی و تغییر رنگ مخلوط واکنش از قرمز به بنفش حضور باکتری را نشان دادند. این بررسی نشان از حساسیت بالای آزمون رنگسنجی در مقایسه با روش ژل الکترفورز است. با استفاده از میکروسکوپ SEM تجمع نانوذرات طلا در حضور باکتری شیگلا فلکسنری، و عدم تجمع آن در فقدان باکتری مشاهده شد. در مطالعۀ حاضر استفاده از روش رنگسنجی بر پایۀ نانوذرات طلا برای اولین بار برای شناسایی شیگلا فلکسنری انجام گرفته است. نتایج این مطالعه نشان داد که این روش میتواند برای شناسایی سریع و با حساسیت بالا نسبت به روش ژل الکترفورز انجام گیرد. همچنین میتوان از این روش برای تشخیص باکتری ذکرشده در نمونههای بالینی و در مواد غذایی استفاده کرد.
)