نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
2 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران
3 استادیار بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Selenium is an element with antioxidant activities that plays roles in thyroid hormone homeostasis, immunity and also fertility. Nevertheless, selenium toxicity (selenosis) causes problems for humans such as abnormalities of the nervous system, gastrointestinal problems and hair loss. Thus, this study was performed with the aim of bacterial biosorbent isolation in order to remove selenium contaminant from wastewater.
Materials and methods: In this research, at first using modified Luria- Bertani agar (mLBA) medium with certain concentration of sodium selenate salt, isolation of bacterial isolates was done from three collected wastewater and sludge samples from Khouzestan industrial factories. After determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC), the sorption capacity and the percentage of metal removal efficiency (%RE) were investigated by atomic absorption spectrophotometer using metabolically active and inactive samples belonging to an efficient isolate. Identification was performed by morphological, biochemical and molecular methods.
Results: Among 73 attained bacterial isolates at the first stage, 8 selenate oxyanion resistant isolates were gathered. Among these, AMS1-S8 isolate with MIC= 600mM and MBC= 1200mM were selected for more studies. Attained results in sorption mechanism determination stage showed that the sorption capacity in metabolically active sample is more than the inactive samples. Based on the identification results, it is revealed that this isolate belongs to the Enterobacter genus. This isolate is deposited as accession JQ965667 in the GeneBank database.
Discussion and conclusion: The results showed that active biomass of selected isolate, have most sorption capacity and %RE and among the other isolates, have high partial resistance against selenate. Therefore, it can be a relatively ideal option for the bioremediation of polluted environments.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
آب بهعنوان ارزشمندترین منبع طبیعی موجود، حدود 70 درصد از سطح زمین را پوشانده است (1). آلایندههای آب به دو گروه آلی و غیر آلی تقسیم میشوند. از میان آلایندههای غیر آلی، فلزات بهعلت رشد روز افزون کاربرد صنعتیشان، موجب آلودگی پایدار محیط زیست میشوند (2). در این میان، سلنیوم به چهار شکل: اکسیآنیون سلنات، سلنیت، سلنید و سلنیوم عنصری در طبیعت یافت میشود که سلنات و سلنیت بهعلت حلالیت بالا در آب، بیشترین دسترسی زیستی و بنابراین، بیشترین سمیت را برای سیستمهای زیستی دارند (3). گذشته از منابع طبیعی (بیشتر مواد معدنی فلزی- گوگردی، برای مثال ناشی از فعالیت آتشفشانها)، ترکیبات سلنیومی به شکل گسترده در نتیجه فعالیتهای انسانی مانند سوختهای فسیلی، کشاورزی (کودهای سلنیومی) و غیره در محیط پراکنده میشوند (4). مقادیر مازاد بر نیاز این عنصر (در حد میکرومول) اتصالات دیسولفیدی پروتئینها را هدف قرار داده و به اینترتیب، مشکلات پوستی یا عصبی از جمله ریزش مو، آسیبپذیری ناخنها، اختلالات عصبی و خستگی را در انسان ایجاد میکند. از طرفی، میزان مازاد بر نیاز این عنصر، با تولید رادیکالهای آزاد موجب آسیب به DNA میشود (4). اگرچه روشهای فیزیکی- شیمیایی مرسوم، برای برداشت آلودگیهای فلزی از پسابهای صنعتی استفاده میشوند، اما این روشها گران بوده، با محیط زیست سازگار نیستند و بیشتر به غلظت مواد زاید وابسته هستند (5 و 6). بههمین علت امروزه روشهای زیستی با استفاده از میکروارگانیسمهایی مانند مخمر و باکتری با هدف احیا، حذف یا تغییر شکل فلزات سمی مورد توجه ویژهای قرار گرفتهاند (7).
با توجه به تنوع متابولیکی میکروارگانیسمها و توان استفاده آنها از آلایندههای محیطی بهعنوان منابع غذایی یا تبدیل آنها به شکلی با پایداری بیشتر و سمیت کمتر (8)، هدف اصلی از انجام پژوهش حاضر جداسازی و معرفی جدایهای است که قادر به تبدیل اکسیآنیون سلنات به سلنیوم عنصری است.
مواد و روش ها.
نمونه برداری: نمونهبرداری از پساب و لجن سه کارخانه کربن بلک و فارسیت اهواز و توسعه نیشکر امیر کبیر خوزستان انجام شد. نمونههای تهیه شده در ظروف استریل بلافاصله در کنار یخ به آزمایشگاه انتقال یافته و بررسی شد (9).
.غربالگری اولیه باکتریهای مقاوم به فلز:جداسازی باکتریهای مقاوم از طریق کشت مستقیم در محیط جامد انجام شد. به این منظور نمونههای آب و رسوب با سرم فیزیولوژی استریل تا رقت 5-10 رقیق شد. سپس، در محیط کشت لوریا برتانی آگار تغییر یافته[1] (mLBA)(متشکل از 5/0 درصد عصاره مخمر، 1 درصد تریپتون و 5/1 درصد آگار) با غلظت 2/0 میلیمولار نمک سلنات سدیم کشت داده و گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتیگراد بهمدت 72 ساعت انجام شد. شایان ذکر است که اسیدیته این محیط بر روی 5/7 تنظیم شد (10).
.انتخاب جدایههای بهینه باکتریایی مقاوم به اکسیآنیون سلنات:در این مرحله، روش تعیین حداقل غلظت مهاری[2] (MIC)و حداقل غلظت کشندگی[3] (MBC)بهمنظور انتخاب جدایههایی با بالاترین مقاومت نسبی، استفاده شد. بهمنظور تعیین MIC با روش رقتسازی در محیط مایع، سوسپانسیون باکتریایی (با کدورت معادل 5/0 مک فارلند) در محیط کشت mLBbroth حاوی غلظت 5/32 تا 1200 میلیمولار نمک سلنات سدیم تلقیح شد. نمونه شاهد نیز با تلقیح سوسپانسیون باکتریایی در محیط کشت فاقد فلز، تهیه شد. گرماگذاری بهمدت 48 تا 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور150 دور در دقیقه انجام شد. در پایان، میزان MIC و MBC هر جدایه تعیین شد (11 و 12).
رسم منحنی رشد جدایه منتخب: به این منظور سوسپانسیون باکتریایی به محیط mLBbroth، در دو گروه واجد 100 میلیمولار سلنات سدیم و فاقد نمک، تلقیح و در 30 درجه سانتیگراد و 150 دور در دقیقه، گرماگذاری شد. در فواصل 4 ساعته، جذب نوری توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر اندازهگیری و منحنی رسم شد (13).
روش بهدست آوردن میزان کمی جذب فلز:برای دستیابی به این مهم، ابتدا زیست توده جدایه منتخب در محیط mLB broth تهیه شد. به این شکل که پس از کشت باکتری در این محیط، تا رسیدن مرحله رشد جدایه به اواسط فاز نمایی، گرماگذاری در30 درجه سانتیگراد و 150 دور در دقیقه انجام شد. سپس، سوسپانسیون باکتریایی در دور 6000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد بهمدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل در شرایط یاد شده 2 بار با آب 2 بار تقطیر استریل شستشو داده و سانتریفیوژ شد (14). حدود 4/0 گرم از وزن تر زیست توده با 40 میلیلیتر محلول فلزی محتوی 7896 میلیگرم در لیتر (ppm) اکسیآنیون سلنات با اسیدیته 8 در 30 درجه سانتیگراد و 150 دور در دقیقه مجاور شد. مجاورسازی تا رسیدن تعادل بین محلول فلزی و توده باکتریایی ادامه یافت (13 و 15).
میزان محتوی فلز در فاز رویی حاصل از سانتریفیوژ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی، مدل SAVANtAA A7104 ساخت کشور استرالیا، سنجیده شد. میزان فلز جذب شده به زیست توده با کسر میزان فلز مایع رویی از میزان اولیه محاسبه شد. تمام آزمایشات در 3 تکرار انجام و میانگین آنها به شکل عدد نهایی جذب گزارش شد (16 و 17).
رسم منحنی استاندارد غلظت سلنات:قبل از خواندن میزان جذب فلز توسط نمونهها، ابتدا به کمک محلولهای با غلظتهای 80، 200 و 500 میلیگرم در لیتر از آنیون سلنات، منحنی استاندارد جذب فلز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی در طول موج 00/204 نانومتر رسم شد. دقت دستگاه در حد میلیگرم در لیتر و نوع سوخت آن air/acetylene بود. میزان جذب هر یک از محلولهای استاندارد با 3 تکرار خوانده و نتیجه به شکل میانگین گزارش شد (9).
محاسبه میزان جذب فلز: پس از رسم منحنی استاندارد و تعیین غلظت فلز در فاز رویی هر نمونه، برای محاسبه میزان جذب فلز توسط زیست تودههای موجود، از فرمول زیر استفاده شد:
q = V (Ci – Cf) / S
که در آن شاخص q معرف میزان جذب فلز توسط زیست توده است که با واحد میلیگرم فلز جذب شده در هر گرم وزن خشک باکتری[4] گزارش میشود. شاخص V معرف حجم محلول مجاورسازی بر حسب لیتر، Ci غلظت اولیه محلول فلزی بر حسب میلیگرم در لیتر، Cf غلظت فلز پس از مجاورسازی بر حسب میلیگرم در لیتر و شاخص S وزن خشک زیست توده با واحد گرم است. بهمنظور محاسبه وزن خشک، زیست توده باکتری بهمدت یکشب در فور 100 درجه سانتیگراد قرار داده شد (9 و 18).
بررسی مکانیسم جذب اکسیآنیون سلنات: برای تعیین نوع فرآیند جذب توسط باکتری (وابسته و یا مستقل از متابولیسم) از دو روش برای غیر فعال کردن باکتری استفاده و همزمان مقایسهای میان میزان جذب این نمونهها با نمونه فعال متابولیسمی (شاهد) انجام شد (9).
در این مرحله نیز بهمنظور تهیه زیست توده، مطابق با مرحله تعیین میزان جذب فلز عمل شد. سپس، از دو روش زیر بهمنظور غیر فعال کردن زیست توده استفاده شد: 1- سلولها بهمدت 15 دقیقه، در فشار 1 اتمسفر و دمای121 درجه سانتیگراد اتوکلاو شد. 2- زیست توده بهدست آمده بهمدت یک شب در فور 100 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از کشت روی محیط نوترینت آگار و اطمینان از کشتهشدن زیست تودهها، میزان 4/0 گرم از وزن تر هر نمونه با 40 میلیلیتر محلول فلزی با غلظت سلنات معادل 7896 میلیگرم در لیتر مجاور شد. گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتیگراد و 150 دور در دقیقه انجام گرفت و پس از گذشت زمان لازم برای مجاورسازی، نمونهها در دمای 4 درجه سانتیگراد و 6000 دور در دقیقه، بهمدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی نمونهها برای تعیین غلظت فلز تحلیل شد (9).
محاسبه درصد کارایی پاکسازی فلز[5](%RE):پس از تعیین غلظت فلز در فاز رویی هر نمونه، برای محاسبه %RE، از فرمول %RE= (Ci – Cf) ×100/ Ci استفاده شد. Ci و Cf به ترتیب معرف غلظت اولیه محلول فلزی و غلظت فلز پس از مجاورسازی بر حسب میلیگرم در لیتر هستند. نمونهای که حداکثر کاهش درصد غلظت فلز را در محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ داراست، معرف حداکثر میزان جذب فلز توسط باکتری است (19).
تحلیل آماری: میزان تفاوت و سطح معناداری نمونهها در مرحله تعیین جذب نوری، توسط آزمون تحلیل واریانس یکطرفه (آنوا[6])، نسخه 19 نرم افزار اس. پی. اس. اس[7] تعیین شد. نتایج بهدست آمده از آزمونهای MIC، MBC، تعیین درصد کارایی پاکسازی و تعیین نوع فرآیند جذب فلز با استفاده از آزمون مربع کای[8] (سطح اطمینان 95/0) بررسی شد.
شناسایی جدایه منتخب:پس از بررسیهای انجام شده، جدایهای که در تمام مراحل، نسبت به سایر جدایههای این پژوهش، کارایی بهتری را نشان داد و در مقایسه با سایر مطالعات انجام شده در این زمینه، میزان MIC، MBC و کارایی بالاتری داشت، بر اساس ویژگیهای ریختشناسی کلونی، رنگآمیزی گرم، انجام آزمونهای مختلف بیوشیمیایی و در نهایت، شناسایی مولکولی و تعیین توالی 16 SrRNA شناسایی شد. شایان ذکر است که در مرحله شناسایی مولکولی، پس از استخراج ژنوم با 2 روش جوشاندن و استخراج با کیت، با توجه به منابع معتبر موجود، جفت پرایمری انتخاب شد که قابلیت تکثیر ناحیه ژنوم 16 SrRNA یوباکتر را داشت. توالی این جفت پرایمر در زیر آورده شده است (20).
نتایج.
پس از کشت نمونهها در محیط mLBA با غلظت 2/0 میلیمولار نمک سلنات سدیم و 72 ساعت گرماگذاری در 30 درجه سانتیگراد، از میان 73 جدایه اولیه، تنها 8 جدایه قادر به تولید کلونیهایی با رنگ قرمز بر روی پلیت بودند. با توجه به اینکه ظهور این رنگ بهعنوان مکانیسم احتمالی سمزدایی سلنات شناخته میشود، این 8 جدایه برای مطالعات بیشتر انتخاب شدند. در ادامه، خالصسازی با استفاده از محیط نوترینت آگار انجام و کلونیهای خالص شده بررسی شد.
.انتخاب جدایههای بهینه باکتریایی مقاوم به اکسیآنیون سلنات: در این مرحله جدایههای مورد بررسی به شکل جداگانه در گستره غلظتی 5/32 تا 1200 میلیمولار سلنات سدیم کشت داده شدند. همانگونه که در جدول 1 مشخص است و نتایج تحلیل آماری توسط آزمون مربع کای نیز نشان داد، از این میان، تنها جدایه AMS1-S8 با 600=MIC میلیمولار و 1200=MBC میلیمولار، بیشترین اختلاف معنادار را با سایر جدایهها دارد (991/5 X20.05,2>). از اینرو این جدایه برای مطالعات بعدی انتخاب شد.
رسم منحنی رشد:پس از کشت جدایه در محیط mLBbroth و تلقیح به محیط مشابه، گرماگذاری در شرایط 150 دور در دقیقه، 30 درجه سانتیگراد انجام و نمونهبرداری برای خواندن میزان جذب نوری انجام شد. نتایج نشان داد منحنی رشد در محیط فاقد سلنات از حدود ساعت 24 وارد فاز سکون میشود و در محیط دارای سلنات، از ساعت 16بهعلت تولید سلنیوم عنصری، جذب نوری[11] افزایش در خور توجهی مییابد (شکل 1). زمان مناسب تهیه زیست توده در مرحله تعیین میزان جذب، با توجه به این منحنی انتخاب شد.
جدول 1- تعیین MIC و MBC جدایههای سلنات
|
جدایه آزمون |
MIC (میلیمولار) |
MBC (میلیمولار) |
|
AMW2-S2 |
300 |
300 |
|
CBW-S3 |
600 |
600 |
|
CBW-S4 |
600 |
600 |
|
AMW2-S5 |
300 |
300 |
|
AMW2-S6 |
600 |
600 |
|
AMS1-S7 |
150 |
150 |
|
AMS1-S8 |
600 |
1200 |
|
CBS-S9 |
300 |
300 |
شکل 1- منحنی رشد جدایه AMS1-S8
شکل 2- منحنی و معادله خط استاندارد جذب سلنات
نتایج حاصل از بهدست آوردن میزان کمی جذب فلز:پس از رسم منحنی استاندارد جذب و محاسبه معادله خط (شکل 2)، غلظت نمونه مجهول (Cf) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی تعیین شد. سپس، میزان جذب اکسیآنیون سلنات (q) توسط جدایه مورد مطالعه، محاسبه شد.
نتایج حاصل از تعیین نوع فرآیند جذب فلز:در این بررسی که برای تعیین مکانیسم جذب جدایه انجام شد، از دو روش خشک کردن و اتوکلاو بهمنظور غیر فعال کردن (حذف فرآیندهای متابولیسمی و حیاتی) میکروارگانیسم استفاده شد. جدول 2 و شکلهای 3 و 4 نشان میدهد که میزان جذب و %RE نمونه فعال از نمونههای غیر فعال بیشتر است که نشان میدهد نمونه فعال متابولیسمی علاوه بر اینکه از همان مکانیسم جذب در نمونههای غیر فعال (جذب زیستی) برخوردار است، از روش تجمع زیستی نیز بهمنظور ذخیره فلز در درون خود استفاده میکند. با وجود این، با توجه به اعداد بهدست آمده جذب فعال بازده بالایی نداشته و بهعبارت دیگر این جدایه قسمت زیادی از جذب را بهروش مستقل از متابولیسم انجام میدهد.
جدول 2- میزان جذب و %RE سلنات در نمونههای فعال و غیر فعال متابولیسمی
|
نوع تیمار شاخص |
فعال متابولیسمی |
غیر فعال متابولیسمی |
|
|
شاهد |
خشک در 100 درجه سانتیگراد |
اتوکلاو |
|
|
میزان جذب سلنیوم (سلنات) (mg/gdw) |
9/558 |
7/397 |
2/506 |
|
%RE |
68/11 درصد |
44/9 درصد |
58/10 درصد |
شکل 3- میزان جذب سلنات توسط زیست توده فعال و غیر فعال
بهمنظور بررسی آماری، تمام آزمایشها در 3 تکرار انجام و نتایج بهدست آمده با استفاده از آزمون مربع کای با سطح اطمینان 95/0 بررسی شد. در مورد میزان جذب، این نتایج اختلاف معناداری را بین نتایج روش تیماری اتوکلاو و شاهد فعال (85/1019=X20.05,2، که بیانگر کارایی بیشتر نمونه شاهد فعال است)، خشکشده با فور و شاهد فعال (39/102=X20.05,2، که بیانگر کارایی بیشتر نمونه شاهد فعال است) و اتوکلاو و خشکشده با فور (41/144=X20.05,2، که نشاندهنده کارایی بیشتر نمونه تیمارشده با اتوکلاو است) نشان داد.
نتایج تحلیل آماری %RE نشان داد که اختلاف معناداری بین نمونه شاهد فعال و خشکشده با فور (8281/11=X20.05,2) وجود دارد که به معنای کارایی بیشتر نمونه شاهد است. از این گذشته مقایسه دو روش تیماری اتوکلاو و خشکسازی با فور، نشاندهنده اختلاف معنادار این دو تیمار و کارایی بیشتر نمونه تیمارشده با اتوکلاو بود (6689/15=X20.05,2).
نتایج شناسایی جدایه باکتریایی:با توجه به مطالب ذکرشده، در این مرحله جدایه AMS1-S8 مورد شناسایی دقیق بیوشیمیایی و مولکولی قرار گرفت (شکل 5 و 6 و جدول 3). در نهایت، پس از انجام PCR و الکتروفورز و انجام تعیین توالی، این جدایه بهعنوان باکتری Enterobacter ludwigiiمعرفی شد و درخت فیلوژنتیکی مربوط به آن، با استفاده از نرمافزار Mega4.0 رسم شد (شکل 7). این جدایه، با شماره ثبت JQ818822 در بانک جهانی ژن، ثبت شده است.
شکل 4- درصد RE سلنات توسط زیست توده فعال و غیر فعال
شکل 5- تصویر میکروسکوپی و پلیت جدایه AMS1-S
جدول 2- نتایج آزمونهای بیوشیمیایی
شکل 6- الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز؛ 1: کنترل مثبت، 2: جدایه AMS1-S8
شکل 7- درخت فیلوژنی رسم شده به روش Neighbor-Joining برای جدایه AMS1-S8
بحث و نتیجه گیری.
در جداسازی باکتریهای مقاوم به فلزات سنگین دو روش کشت مستقیم و کشت با غنیسازی اولیه[xii] وجود دارد. در این پژوهش، به دو علت از روش مستقیم استفاده شد: اول اینکه یک محیط کشت غنی دارای ترکیباتی است که باعث بهدام انداختن یونهای فلزی شده و بدین ترتیب موجب کاهش دسترسی زیستی میشود؛ دوم اینکه محیط غنی موجب افزایش توان جذب فلز توسط باکتری شده و یک جذب غیر واقعی مشاهده میشود (21).
بررسی مقاومت با روش MIC و MBC:MIC بهعنوان کمترین غلظت فلز در محیط است که از رشد میکروارگانیسم جلوگیری میکند. در مطالعه این شاخص، از دو روش استفاده میشود: 1- رقتسازی فلز در آگار و 2- رقتسازی در محیط مایع (22). از آنجا که در مرحله غربالگری باکتریهای مقاوم، مشاهده شد که جدایههای مورد بررسی توان رشد در تراکمهای بالای فلز را دارند ، گستره غلظتی مربوط به مرحله MIC در مقایسه با سایر مطالعات بسیار بالاتر بود. بنابراین، در این پژوهش بهمنظورتعیین میزان رشد جدایهها از روش رقتسازی در محیط مایع استفاده شد (23). در این مطالعه MIC جدایه AMS1-S8 در مقایسه با سایر مطالعات انجام شده قابل ملاحظه است. تنها در مطالعه انجام شده توسط گُش[xiii] و همکاران، با بهکارگیری غلظتهای 10 تا 1000 میلیمولار، این مقدار در گستره 650 تا 750 میلیمولار به دست آمد (24). لَمپیس[xiv] نیز جدایههایی با میزان MIC حدود 200میلیمولار را گزارش کرده است (25). در سال 2001، سَباتی[xv] و همکاران در مطالعهای که به منظور جداسازی جدایههای مقاوم به تلوریت و سلنات انجام دادند، موفق به جداسازی جدایههایی با MIC در حد ppm شدند (26).
روش بهدست آودن میزان کمی جذب فلز:در مطالعات جداگانه عبدالنبی[xvi] و همکاران، صدیق[xvii] و همکاران، ایلماز[xviii] و همکاران، امین[xix]، تلیدلیر[xx] و مطالعات متعدد دیگر، به منظور بررسی میزان حذف فلزات مختلف از زیست توده باکتریایی استفاده شده است که این زیست توده، پیش از مجاورسازی با فلز بهدست آمده است (19، 27- 30). با وجود این، در برخی مطالعات از جمله مطالعه ایلماز و همکاران و آندرئونی[xxi] و همکاران، از سلولهای در حال رشد به منظور برداشت فلز از محلول استفاده شده است (28 و 31). در این راستا، چنین بیان شده است که حذف فلز با استفاده از سلولهای در حال رشد، نیازمند صرف زمانی است که به منظور رشد میکروارگانیسم در محیط تحت تنش فلزی مورد نیاز است. با وجود این، مایرز[xxii] بیشترین مقدار کاهش سلنات را همزمان با فاز نمایی رشد جدایههایش (2 تا 4 روز) مشاهده کرده است (32).
از طرف دیگر در مطالعه هالتونن[xxiii] بیان شده است که چگالی سطحی و ثابت دپروتونه شدن گروههای عملکردی سطحی Baciilus subtilis بسته به فاز رشد تغییر میکند. بهطوریکه این پژوهشگر به نقل از دافنی[xxiv] و همکاران اظهار داشته است که با ورود زیست توده از فاز نمایی به فاز سکون رشد، چگالی سطحی و ثابت دپروتونه شدن گروههای کربوکسیل، فسفوریل و آمین کاهش مییابد. همچنین، هالتونن در تایید این نتایج گفته است که استفاده از سلولهای پیرتر Pseudomonas aeruginosa، موجب کاهش حذف کادمیوم میشود (5). از اینرو در پژوهش حاضر، از سلولهای رشد کردهای استفاده شد که پیش از مجاورسازی با فلز، در محیطی کشت داده شده و با رسیدن به اواسط مرحله لگاریتمی رشدشان، سانتریفیوژ و برای مجاورسازی استفاده شدند.
همچنین، بیان این موضوع دارای اهمیت است که استفاده از سلولهای مرحله لگاریتمی با فرض این علت بود که در این حالت، جدایهها در برابر استرس فلزی و برداشت فلزات کاراتر میباشند و این حالت مشابه با مطالعاتی است که توسط تَرانجینی[xxv]، سّرِت[xxvi] و همکاران، مرتضوی[xxvii] و همکاران و بسیاری از مطالعات دیگر، گزارش شده است (33- 35).
تعیین نوع فرآیند جذب:به طور کلی جذب فلزات سنگین توسط زیست توده غیر زنده میکروارگانیسمها، به روش جذب زیستی انجام میشود. در عوض همان زیست توده، در شرایط فعال متابولیسمی علاوه بر جذب یاد شده، ممکناست بتواند فلزات را به روش تجمع زیستی نیز در خود ذخیره سازد.
نتایج مربوط به جدایه AMS1-S8 نشان داد که کارایی نمونه شاهد فعال در جذب فلز بالاتر است؛ پس از آن نمونه غیر فعال شده با اتوکلاو بیشترین کارایی را نشان میدهد و نمونهای تیمار شده با حرارت 100 درجه سانتیگراد، کمترین بازده جذب را داراست. با توجه به مقالات مختلف، میکروارگانیسمها رفتارهای متناقضی را در رابطه با مکانیسم جذب فلز نشان میدهند. جانلیان[xxviii] و همکاران بیان داشتند که تخریب شدید ساختار سطحی سلول میتواند بر ظرفیت جذب زیست توده، موثر باشد. مقایسههایی که این پژوهشگر با استفاده از میکروسکوپ TEM انجام داد، نشان داد که عوامل تیماری قوی، بهعلت تجزیه پپتیدوگلیکان، لیپیدها و پروتئینها، ساختار سطح سلول را تخریب کرده و به طور معمول موجب کاهش ظرفیت جذب زیستی فلزات میشوند (36). از سویی برخی از مطالعات، نشاندهنده آثار متفاوت تیمار با اتوکلاو بر رفتار جذبی زیست توده هستند. برای مثال، افزایش جذب منگنز توسط زیست توده دو جلبک Spirogyra sp.و Nostoc commune، پس از تیمار با اتوکلاو مشاهده شده است (37). در مقابل، ابراهیمیپور[xxix] و همکاران بیان داشتند که علت کاهش جذب سرب در حالت اتوکلاو کردن، احتمالا به دو علت است: 1- در این حالت جذب فقط به شکل سطحی خواهد بود و جذب درونی وجود نخواهد داشت. 2- در حین اتوکلاو، برخی از سایتهای اتصال Pb2+ در اثر شوک ناشی از دمای بالا، دناتوره میشوند (1).
همانطور که بیان شد، نمونه فعال متابولیسمی جدایه معرفی شده بیشترین میزان جذب و %RE را دارد. بزرگترین مزیت استفاده از کشت زنده میکروبی برای تولید زیست توده، عدم نیاز به مراحل جداگانهای مثل کشت، جمعآوری، خشک کردن، آمادهسازی و ذخیره است. از طرفی با توجه به این نتایج و نتایج بهدست آمده از مرحله تعیین MIC و MBC، و با یادآوری مروری بر مطالعات انجامشده، میتوان اینگونه استنباط کرد که این جدایه، گزینه کمابیش ایده آل برای کاربردهای صنعتی در راستای پاکسازی محیط زیست است.
[1]- Modified Luria-bertani agar
[2]- Minimum Inhibitory Concentration
[3]- Minimum Bactericidal Concentration
[4]- mg/ gdw
[5]- Metal Removal Efficiency
[6]- ANOVA
[7]- SPSS
[8]- Chi-Square
[9]- Forward
[10]- Reverse
[11]- OD
[xii]- Primary enrichment culture method
[xiii]- Ghosh
[xiv]- Lampis
[xv]- Sabaty
[xvi]- Abd-Elnaby
[xvii]- Siddique
[xviii]- Yilmaz
[xix]- Amin
[xx]- Telly Dalir
[xxi]- Andreoni
[xxii]- Maiers
[xxiii]- Halttunen
[xxiv]- Doughney
[xxv]- Tarangini
[xxvi]- Sarret
[xxvii]- Mortazavi
[xxviii]- Junlian
[xxix]- Ebrahimipour
)