نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد علوم و صنایع غذایی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران
2 دکترا تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران
3 استادیار علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران
4 کارشناس ارشد ایمونولوژی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران
5 دانشیار آمار زیستی و اپیدمیولوژی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران
6 کارشناس ارشد سم شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران
7 کارشناس علوم و صنایع غذایی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Bacterial strains present in food products undergo different thermal processes such as coldness and warmth. Such cases cause a shock in bacteria and force the bacteria to produce proteins and partly, develop a change in the production of enzyme. This can give the strain a special characteristic, knowledge of this characteristic will contribute to a timely and more precise identification.
Materials and methods: During this time more than 100 samples have been examined, out of which, 48 Indol positive isolation samples were examined by phenotypic tests and sodium dodecyle sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE).
Results: – The results of numerical analysis of phenotypic characteristics and protein patterns showed that only 79% of the collected isolates (phenon 1 and 2) could be identified as E.coli compared with reference strains. E.coli strains from ice creams were showed some Variation in banding patterns. Major differences were observed in protein bands between 23.59 - and 20.79 -kDa molecular mass range which the isolates were compared with reference strains.
Discussion and conclusion: Our study concluded that food’s bacterial strains are influenced by temperatures in different processes and also it could stimulate the production of proteins or change the enzymes. Therefore, The reason of taking care of the issues is that changes in the proteins’ structures can lead to change in the biochemical properties, and finally this change can misguide us. Further research is being performed to characterize these atypical strains by molecular methods.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
وجود مواد مغذی با ارزش شرایط را برای رشد و فعالیت بسیاری از میکروارگانیسمها فراهم میکند. مواد غذایی یکی از منابع مهم ایجاد آلودگی توسط عوامل شیمیایی و زیستی محسوب میشود. به طوریکه تخمین زده میشود 70 درصد بیماریهای عفونی از طریق مواد غذایی ناسالم به انسان سرایت میکنند (1). برخی از سویههای تولید کننده توکسین نظیر E. coli O26 پس از E. coli O157:H7 مسئول ایجاد اسهال و ادرار خونی در انسان است. گاو به عنوان یک مخزن مهم سویه O26 شناخته شده است. با توجه به بالا بودن اشرشیا کلی تیپیک نسبت به این سویهها که به تعداد کم بیماریزا هستند و آزمونهای مثبت کاذب کمتری نسبت به سویههای تولید کننده توکسین دارند. بنابراین، تشخیص زود هنگام آن مهم جلوه میکند. سویههای بهدست آمده از گاو و انسان از لحاظ الگوی پلیمورفیسم و ژنهای بیماریزا یکسان هستند بنابراین، انتقال بین دو گونه ممکن است رخ دهد. شیوع با جدایه های تولید کننده توکسین متاسفانه با وجود ارتقای سطح بهداشتی هنوز در تمامی کشورها گزارش میشوند. چند صد شیوع از سویه های Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157 و سویه های non-O157 تاکنون گزارش شده است. اهمیت موضوع در این موارد به اندازهایی است که در موارد شیوع پایین بررسیهای گسترده برای پی بردن به منشاء آلودگی انجام میشود و گاهی یک چالش بهداشتی محسوب شده تا آنجا که در بسیاری موارد روشهای تشخیصی جدیدتر جایگزین روش های معمول میشود و سیستم سلامت محور تنها به درمان فرد بسنده نکرده بلکه ریشهکنی منشاء آلودگی را در دستور کار قرار میدهد. بنابراین، برای پی بردن به سلامت میکروبی مواد غذایی شاخص میکروبی تعریف میشود (2). شاخصهای میکروبی بیشتر به منظور ارزیابی ایمنی و بهداشت مواد غذایی به کار میروند (3). نخستین شاخص آلودگی مدفوعی اشرشیا کلی است (4). به منظور از بین بردن میکروارگانیسمهای موجود در مواد غذایی، معمولاً مخلوط حاصل را در دمای مناسب پاستوریزه میکنند (5). بنابراین، رعایت نکردن موارد بهداشتی در تهیه، نگهداری و عرضه میتواند سلامت مصرف کننده را به خطر بیندازد. اشرشیا کلی از مهمترین آلوده کنندههای مواد غذایی محسوب میشود (6). جایگاه اصلی این باکتری کلون انسان و حیوانات خونگرم است و در صورتیکه از طریق مدفوعی- دهانی منتقل شود، اسهال ایجاد میکند (7). با توجه به اینکه اشرشیاکلی باکتری مقاومی است که میتواند هفتهها و ماهها در آب و مواد غذایی بهویژه در حرارت صفر درجه زنده بماند و از آنجا که بستنی به عنوان یک ماده غذایی توسط سنین مختلف استفاده میشود. از نظر منبع تهیه و شرایط بافری و دمایی بسیار مستعد برای آلودگی با این باکتریهاست (8). اگر چه تعداد این باکتری تحت تاثیر سایر فلور طبیعی روده نظیر باکتروئیدز قرار دارد ولی با این وجود میزان آن همواره در روده غالب است (9).
این باکتری از عوامل اصلی ایجاد کننده اسهال در کشورهای توسعه نیافته است.انتقال بیماری از طریق انسان ـ موادغذایی ـ حیوان است. حداقل در بیماریزایی 103 در هر گرم ماده غذایی است. میزان مرگ و میر ناشی از این باکتری در نوزادان بسیار بالاست. در ضمن، عامل اصلی بیماری اسهال مسافران بوده و این بیماری در نقاطی که بهداشت فردی رعایت نمیشود شایع است. معمولا اسهال مسافران به سرعت ایجاد نمیشود و ممکن است 2 تا 3 روز بعد از خوردن یا هنگام بازگشت به منزل ایجاد شود. برخی مواد غذایی در معرض خطر عبارتند از، گوشت، فراورده های لبنی، شیر، آب آلوده که مهمترین منبع آلودگی، سبزی های خام و سالاد است. پیشگیری از آن شامل، کنترل بهداشت دست اندرکاران تولید و تهیه مواد غذایی، کنترل آب مصرفی و شستن دست ها از عوامل عمده پیشگیری از انتقال بیماری می باشد (10). اشرشیاکلی، پاتوژن فرصت طلبی است که در روده بزرگ انسان و سایر حیوانات وجود دارد. وجود این باکتری در آب و مواد غذایی دلیل بر آلودگی آنها از طریق منابع مدفوعی است. عفونت ادراری، سپتی سمی، مننژیت نوزادی و اسهال مسافران، شایعترین عوارض بیماری هستند (11). طبق تخمین سازمان جهانی بهداشت موارد واقعی بیماریهای ناشی از آلودگی غذایی بیش از 30 تا 35 برابر موارد دیگر ثبت شده است (10).
جدایههای باکتریایی که در مواد غذایی حضور دارند، تحت تاثیر فرآیندهای مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار میگیرند. این فرآیندها باعث ایجاد شوک در باکتریها شده و باکتریها را وادار به تولید پروتئینها و در برخی موارد تغییراتی در تولید آنزیمها ایجاد میکند. تغییر در بیان پروتئینها و آنزیمها باعث شده ویژگیهای بیوشیمیایی و احتیاجات تغذیهای این باکتریها نسبت به جدایههایی که در این شرایط قرار نگرفتهاند تغییر کند و این تغییر در ویژگیها میتواند باعث خطا در تشخیص شود. این امر باعث شده اطلاع از الگوی پروتئینی از اهمیت ویژهای برخوردار باشد و نشان دهد جدایههای حاصل دچار تغییراتی به علت شوک دمایی شدهاند یا خیر. به نظر میرسد این تغییرات ویژگی خاصی به جدایهها داده و اطلاع از این ویژگیها میتواند در تشخیص به موقع و دقیقتر کمک کننده باشد. هدف از پژوهش حاضر مقایسه نتایج آزمونهای بیوشیمیایی و الگوی الکتروفورزی پروتئین بین سویههای E.coli بهدست آمده از بستنی و سویه استاندارد برای پی بردن به وجود تنوع در سویههای اشرشیا کلی بهدست آمده از بستنی در شهر اصفهان است.
مواد و روش ها.
نمونهبرداری: برای تعیین آلودگی بستنیهای سنتی به شکل تصادفی از نقاط مختلف شهر اصفهان در یک طرح کاملاً تصادفی نمونهگیری انجام شد تا تمام نمونهها دارای شانس مساوی باشند. نمونهها تا زمان آزمایش در فریزر منفی 10 درجه سانتیگراد به مدت 2تا 4 ساعت نگهداری شدند.
جداسازی: با استفاده از پیپت سترون مقدار 10 میلیلیتر از آزمونه با رقت 1/0 را به 10 میلیلیتر لوله حاوی محیط کشت [1]LMX با غلظت مضاعف (68 گرم در لیتر) محتوی لوله درهم اضافه شد و به مدت7 ساعت در 35 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. تغییر رنگ محیط مایع به سبز مایل به آبی و ایجاد گاز به عنوان شاخص حضور اشرشیاکلی در محیط کشت است. سپس، به هر یک از لولهها مقدار 5/0 میلیلیتر محلول سدیم هیدروکسید یک مولار اضافه شد در صورت ایجاد نور فلورسانس در طول موج 366 نانومتر و ایجاد حلقه قرمز با افزودن معرف کواکس[2] حضور اشرشیاکلی تایید شد. در صورت عدم تغییر رنگ و ایجاد گاز، گرمخانهگذاری تا 24 ساعت دیگر افزایش یافت. قبل از اضافه کردن معرف اندول، برای جداسازی جدایهها با استفاده از یک لوپ سترون روی محیط کروموکالت آگار کشت خطی داده و به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. اشرشیاکلی به شکل کلونیهای آبی تیره و بنفش، سایر گروهای کلی فرم به شکل کلونیهای قرمز رنگ و میکرو فلورها به شکل بیرنگ مشاهده شد. کلونیهای بنفش و آبی انتخاب و روی محیط آگار مغذی[3] کشت، به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شد. در این روش پس از تهیه رقتهای 1/0، آزمونهای میکروبی با توجه به روشهای استاندارد انجام شد (12). تعداد 48 جدایه اندول مثبت، بررسی شدند. جدایههای خالص به آگار مغذی درون لوله منتقل و برای آزمون تکمیلی در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. همچنین، برای نگهداری تمام جدایهها در سرم فیزیولوژی، تعدادی کلونی از کشت تازه هر جدایه به اپندورفهای حاوی سرم فیزیولوژی سترون منتقل و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای نگهداری دراز مدت، جدایههای خالص به لولههای حاوی محیط آگار مغذی منتقل و به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. سپس، پارافین مایع سترون به لولههای کشت اضافه و در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
ویژگیهای کشت و واکنشهای بیو شیمیایی: تمامی جدایهها با جدایه استاندارد اشرشیا کلی کد 1399 [4]تهیه شده از انیستیتو پاستور ایران در آزمونهای بیوشیمیایی مقایسه شدند. واکنش گرم باکتریها به دو روش رنگآمیزی بر اساس روش اصلاح شده هوکر[5] و حلالیت در هیدروکسید پتاسیم 3 درصد انجام شد (13- 15). برای بررسی ریختشناختی میکروارگانیسم از رنگآمیزی ساده استفاده شد (15). آزمونهای کاتالاز[6]، اکسیداز[7]، ذوب ژلاتین، تولید گاز از گلوکز به روش شاد[8] انجام شد (16). برای تمایز بین متابولیسم تخمیری از اکسیدی از محیط O/F ساخت شرکت مرک آلمان استفاده شد. تولید متیل رد و استوئین[9] در محیط آماده MR/VP، احیای نیترات در محیط آماده نیترات برات ساخت شرکت مرک آلمان[10] انجام شد. برای انجام آزمون تولید اوره آز از محیط پایه اوره آگار [11] حاوی 40 درصد اوره فیلترشده (22/0 میکرون) استفاده شد. بقیه آزمونها از جمله تولید سولفور، اندول، حرکت، مصرف سیترات، مصرف گلوکز، لاکتوز و سوکروز [12] روی محیط آماده ساخت شرکت مرک کشور آلمان انجام شد. برای بررسی پروفایل پروتئینها از کیت شرکت سیتومتین ژن[13] ساخت ایران مطابق دستور سازنده استفاده شد.
تحلیل عددی[14]: برای دستهبندی جدایهها بر اساس متغیرهای بیوشیمیایی مهم و ترسیم دندروگرام از روش تحلیل عددی استفاده شد. برای گروهبندی جدایهها از تجزیه خوشه ای[15] و برنامه[16] ترسیم نمودار استفاده شد (17).
روش انجام الکتروفورز پروتئین: الکتروفورز در قالب دو ژل دارای یک بخش متراکم کننده[17] در بالا و یک بخش جدا کننده[18] در پایین انجام شد. ژل جداکننده با غلظت 12 درصد و ژل متراکم کننده با غلظت 6 درصد به روش اصلاح شده لاملی[19] به شکل عمودی[20] انجام شد (18). قبل از قرار دادن نمونهها در حفرههای ژل، از محلول 002/0 درصد برم فنل بلو حاوی 15 درصد گلیسرول بهعنوان نشانگر استفاده شد. سپس، 30 میکرولیتر از نمونهها در حفرههای ژل قرار داده شدند. پس از قرار گرفتن نمونهها در چاهکهای ژل، الکتروفورز به مدت 4 ساعت در 100 ولت با شدت جریان 20 میلیآمپر و دمای ثابت 10 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از رسیدن نشان گر به انتهای ژل صفحات شیشهای از دستگاه خارج و ژل از بین آن بیرون آورده شد. رنگآمیزی با محلول 1/0 درصد کوماسی بلو در محلول آب، متانول، اسید استیک به نسبت 1:5:5 به مدت یک شبانه روز روی شیکر با سرعت Rpm 59 انجام شد. سپس، رنگ بری با متانل، آب، اسید استیک به نسبت 1:5:5 به مدت 3 ساعت انجام شد و ژل در محلول 7 درصد اسید استیک نگهداری شد. برای ترسیم رگرسیون از مارکر مولکولی LMW-SDS Marker Kit [21] استفاد شد. لگاریتم وزن مولکولی مارکر و فاصله طی شده از سطح ژل برای هر باند مارکر محاسبه تا معادله رگرسیون برای نشان دادن وزن مولکولی باندهای مجهول ترسیم شود.
نتایج.
.ویژگیهای بیوشیمیایی کلی فرمهای جدا شده: از نمونههای مختلف بستنی سنتی جمعآوری شده از نقاط مختلف شهر اصفهان باکتریهای گرم منفی، میلهای شکل با طول 2 تا 6 میکرون و عرض 1 تا 5/1 میکرون، متحرک، واجد تاژک محیطی، فاقد اسپور، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی، قادر به احیای نیترات، تخمیری، از نظر کپسول بعضی کلونیهای موکوئیدی و واجد کپسول ولی بیشتر آنها فاقد کپسول قادر به تولید اندول که به طور قابل توجهی به سویه اشرشیا کلی شباهت داشتند، جداسازی شد. پس از خالصسازی جدایهها، سایر آزمونهای بیوشیمیایی برای تشخیص قطعی تر انجام شد. تمامی جدایههای بهدست آمده از بستنیها روی محیط آگار مغذی در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت گرمخانهگذاری شدند. ایجاد کلونیهای صاف، مدور، خاکستری با سطح براق و لبههای گرد به اندازه 1 تا 3 میلیمتر دارای قوام کرهای و روی محیطهای کشت ائورین متیلن بلو و کرومو کالت آگار قادر به رشد بودند، محیط آبگوشت مغذی را به طور یکنواخت کدر میکنند و رسوبی در ته لوله بوجود میآورند که با تکان دادن حل میشود قادر به تولید گاز از لاکتوز در محیط LMX بودند(شکل 1). از میان 48 جدایه اندول مثبت بهدست آمده (شکل2)، 71 درصد قادر به ایجاد رنگ سبزمتالیک در محیط ائوزین متیلن بلو، 83 درصد قادر به ایجاد کلونی آبی بنفش روی محیط کروموکالت آگار، واکنش متیل رد و تولید استوئین به ترتیب 96 و 2 درصد مثبت، 8 درصد قادر به هیدرولیز ژلاتین، 71 درصد قادر به ایجاد رنگ فلورسانت در محیط LMX در مقابل نور فرابنفش با طول موج 366 نانومتر، 84 درصد جدایهها قادر به ایجاد رنگ آبی در محیط LMX، 13 درصد قادر به تولید اوره آز و 88 درصد قادر به حرکت بودند. 85 درصد جدایهها روی محیط مک کانکی به علت تخمیر لاکتوز کلونیهای قرمز رنگ بوجود آوردند. نتایج ویژگیهای بیوشیمیایی در جدول 1 مشخص شده است.
تحلیل عددی: به علت وجود تنوع بیوشیمیایی میان جدایهها و عدم تشخیص قطعی از دستهبندی جدایهها استفاده شد. خوشهها بر حسب متغیرهای مهم دستهبندی شد. تحلیل عددی بیان گر قرار گرفتن جدایهها در 8 گروه بر اساس اختلاف در آزمونهای بیوشیمیایی بودند (شکل 3).
شکل 1- رنگ آبی مایل به سبز در لوله سمت چپ و تولید اندول در لوله وسط در مقایسه با لوله شاهد سمت راست
شکل 2- واکنش اشرشیاکلی، تولید گاز در محیط Triple sugar iron agar عدم مصرف سیترات در محیط سیمون سیترات و تولید اندول در محیط تریپتون واتر برات
جدول 1- ویژگیهای گروههای انتروباکتریاسه جداشده از بستنی
|
شماره گروه
آزمون |
درصد استرینهای مثبت هر گروه |
E.coli ATCC1399 |
|||||||
|
1 (34) |
2 (4) |
3 (2) |
4 (1) |
5 (1) |
6 (1) |
7 (4) |
8 (1) |
||
|
گرم |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
کاتالاز |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
اکسیداز |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
احیای نیترات |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
متابولیسم تخمیری |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
ایجاد رنگ فلورسانت روی LMX |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
|
ایجاد رنگ سبز متالیک روی EMB |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
|
ایجاد رنگ سبز آبی روی LMX |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
– |
+ |
|
ایجاد کلونی قرمز روی مک کانکی آگار |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
|
ایجاد کلونی بنفش روی کروموکالت آگار |
+ |
+ |
50 |
+ |
– |
– |
– |
– |
+ |
|
تولید پیگمان |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
هیدرولیز اوره |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
مصرف سیترات |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
متیل رد (MR) |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
+ |
+ |
|
تولید استوئین (VP) |
– |
– |
– |
– |
– |
+ |
– |
– |
– |
|
هیدرولیز ژلاتین |
9 |
11 |
– |
– |
– |
– |
25 |
– |
– |
|
هیدرولیز لیزین |
60 |
50 |
– |
+ |
– |
+ |
50 |
– |
+ |
|
تولید اندول |
(+) |
(+) |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
حرکت |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
|
تولید گاز از گلوکز |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
|
تولید H2S از سیستئن |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
|
واکنش اسیدی (ACID /acid +G) |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
|
تولید قلیا (ALK/acid) |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
|
سیترات |
– |
– |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
– |
|
سوکروز |
(+) |
(+) |
ND |
– |
– |
+ |
– |
ND |
+ |
|
مالتوز |
(+) |
(+) |
ND |
(+) |
– |
+ |
– |
ND |
(+) |
|
ملیبیوز |
(+) |
(+) |
ND |
(+) |
– |
+ |
– |
ND |
(+) |
|
سلوبیوز |
– |
– |
ND |
– |
– |
+ |
– |
ND |
– |
|
ترهالوز |
+ |
+ |
ND |
+ |
– |
+ |
– |
ND |
+ |
|
سوربیتول |
(+) |
(+) |
ND |
(+) |
– |
+ |
– |
ND |
(+) |
|
ملونات |
– |
– |
ND |
– |
– |
+ |
– |
ND |
– |
+: بیش از 80 درصد جدایهها در مدت 24 تا 48 ساعت مثبت بودند.
-: بیش از 80 درصد جدایهها در مدت 5 روز منفی بودند.
(+): بیش از 80 درصد جدایهها پس از 72 ساعت مثبت تاخیری بودند.
ND: Not Determine
شکل 3 - گروهبندی جدایهها بر اساس شباهت در آزمونهای بیوشیمیایی شامل گروه اول (از جدایه 1تا جدایه 16)، گروه دوم (از جدایه 22 تا جدایه 29)، گروه سوم (از جدایه 39 تا جدایه 42)، گروه چهارم (جدایه 2)، گروه پنجم (جدایه 6)، گروه ششم (جدایه 32)، گروه هفتم (از جدایه 21تا جدایه 35) و گروه هشتم (جدایه 46)
در نتایج 31 آزمون فنوتیپی تنوع ما بین زیر گونه استاندارد و جدایههای بهدست آمده مشاهده شد. با استفاده از تحلیل عددی و ترسیم دندروگرام جدایهها در 8 گروه قرار گرفتند. این گروهها نتیجه تفاوت فنوتیپی بین استرینها و اختلاف آنها در تولید اسید با استفاده از منابع کربنی مختلف بود.
جدایههای گروه اول قادر به ایجادکلونیهایی با رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو، کلونیهایی با رنگ بنفش روی کروموکالت آگار و رنگ فلورسانت در مقابل لامپ ماوراء بنفش با طول موج 366 نانومتر، متیل رد مثبت، تولید استوئین منفی، متحرک، فاقد توانایی هیدرولیز اوره و فاقد توانایی مصرف سیترات بودند، همچنین، قادر به هیدرولیز لیزین و قادر به تخمیر گلوکز در شرایط بیهوازی بوده که از این جهات کاملاً شبیه جدایههای استاندارد بودند. ولی تنها 9 درصد جدایههای گروه یک قادر به هیدرولیز ژلاتین بودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند.
استرین گروه دوم قادر به ایجاد رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو نبودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند. ولی همگی توانایی تولید کلونی قرمز رنگ روی محیط مک کانگی آگار را داشتند. تمامی جدایهها قادربه ایجاد رنگ آبی در محیط LMX بوده ولی هیچکدام قادر به ایجاد رنگ فلورسانت در مقابل نور فرابنفش با طول موج 366 نانومتر نبودند که از این لحاظ با جدایههای استاندارد اختلاف داشتند. تمامی جدایهها متحرک، فاقد توانایی هیدرولیز اوره و فاقد توانایی مصرف سیترات بودند. متیل رد مثبت و تولید استوئین منفی، فاقد توانایی هیدرولیز ژلاتین، متحرک، قادر به ایجاد واکنش Acid /Acid+G و تنها 50 درصد جدایهها قادر به هیدرولیز لیزین بودند، که از این لحاظ بسیار شبیه به جدایه استاندارد بودند. همچنین، نقوش الکتروفورزی جدایههای فوق شباهت بسیار زیادی به جدایه استاندارد داشتند. اما جدایههای این گروه مانند جدایههای گروه 2 شدیداً تخمیری نبودند.
جدایههای گروه سوم عدم توانایی تولید رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو و کلونیهای قرمز رنگ روی محیط مک کانگی آگار را داشته، 50 درصد جدایهها قادر به ایجاد کلونیهای آبی بنفش روی محیط کروموکالت آگار بودند. همگی قادر به ایجاد رنگ آبی در محیط LMX broth بودند، ولی فاقد توانایی ایجاد فلورسانت در مقابل نور فرابنفش با طول موج 366 نانومتر بودند. تمامی جدایهها قادر به تولید پیگمان زرد روی محیط آگار مغذی، فاقد توانایی هیدرولیز اوره، فاقد توانایی مصرف سیترات، قادر به تولید متیل رد، فاقد توانایی تولید استوئین، فاقد توانایی هیدرولیز ژلاتین، متحرک، قادر به تولید واکنش Acid /Acid+G در محیط TSI و فاقد توانایی هیدرولیز لیزین بودند که از این لحاظ به Escherichia hermaniشباهت داشتند.
جدایههای گروه چهارم فاقد توانایی تولید رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو و فاقد توانایی ایجاد کلونیها به رنگ قرمز در محیط مک کانگی آگار بوده، ولی قادر به ایجاد کلونیهایی به رنگ آبی بنفش در محیط کروموکالت آگار و ایجاد رنگ آبی فاقد فلورسانت در محیط LMX broth بودند. آنها فاقد پیگمان، فاقد هیدرولیز اوره، فاقد توانایی مصرف سیترات، متیل رد منفی و فاقد توانایی تولید استوئین،
غیر متحرک ولی قادر به هیدرولیز لیزین بوده که بر اساس آزمونهای بیو شیمیایی به E.coli (Metabolically Inactive Strains) شباهت داشتند، ولی با اشرشیاکلی تیپیک کاملاً متفاوت بودند.
جدایههای گروه پنجم فاقد توانایی تولید رنگ سبز متالیک در محیط ائوزین متیلن بلو و فقدان تولیدکلونیهای قرمز رنگ در محیط مک کانگی آگار، فقدان تولید کلونیهای آبی بنفش در محیط کروموکالت آگار، فقدان تولید رنگ آبی و فلورسانت در محیط LMX broth قادر به هیدرولیز اوره، قادر به مصرف سیترات، متیل رد مثبت، متحرک و ایجاد واکنش ALK/acid در محیط TSI، فاقد توانایی هیدرولیز لیزین بوده و به Providencia rettgeri شباهت داشتند.
جدایههای گروه ششم به علت هیدرولیزه اوره، مصرف سیترات، ایجاد کلونیهای قرمز رنگ روی محیط مک کانگی آگار، متیل رد منفی، قادر به تولید استوئین، غیر متحرک، ایجاد واکنش
Acid /Acid+G و توانایی هیدرولیز لیزین به Klebsiella oxytoca شباهت داشتند.
جدایههای گروه هفتم به علت هیدرولیز اوره، عدم مصرف سیترات، تولید اسید مخلوط (متیل رد مثبت) فاقد تولید استوئین ایجاد واکنش ALK/acid در محیط TSI، فقدان تولید کلونیهای قرمز رنگ در محیط مک کانگی آگار، فقدان ایجاد رنگ سبز متالیک در محیط ائوزین متیلن بلو[22]، فقدان ایجاد رنگ آبی همراه با فلورسانت در محیط LMX broth شباهت زیادی به Morganella morganiداشتند.
جدایه گروه هشتم نیز به علت تولید اسید مخلوط، متیل رد مثبت، ایجاد واکنش ALK/acid در دندروگرام به جدایه M.morgani شباهت داشت ولی به علت عدم توانایی در هیدرولیز اوره و متحرک بودن با‌آن اختلاف داشت و به علت آنکه از لحاظ سایر ویژگیهای متابولیکی ضعیف بود و واکنشهایی بینابینی با سایر جنسهای خانواده انتروباکتریاسه نشان میداد نظیر شباهتهایی که با (Metabolic inactive) E.coliداشت در هیچ گروه شناخته شدهای طبقهبندی نشد.
الکتروفورز پروتئین سلولی: باکتریها روی محیط آگار مغذی کشت و به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. سپس، کلونیها در آب مقطر سترون سوسپانسیون و OD آنها روی 3/2 تا 3 واحد در 600 نانومتر با اسپکتروفوتومتر تنظیم شد. به نمونهها بافر حاوی سدیم دودسیل سولفات،
2- مرکاپتواتانول[23] اضافه و به مدت 5 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از لیز شدن و استخراج پروتئین، الکترو فورز در ژل 12درصد پلیاکریل آمید درسیستم ناپیوسته مطابق دستورالعمل کیت انجام شد. نمودار رگرسیون برای نشان دادن وزن مولکولی ترسیم شد، که نشان میدهد با هر واحد افزایش فاصله از سطح ژل، در حدود 14/0 از لگاریتم وزن مولکولی مارکر کاسته خواهد شد و در حالت کلی 95/0 از تغییرات لگاریتمی وزن مولکولی توسط فاصله طی شده در ژل جدا کننده بر مبنی کیلودالتون قابل پیشگویی است (شکل 4).
در مقایسه الکتروفورز پروتئینهای جدایهها با یکدیگر و جدایه استاندارد اشرشیا کلی کد 1399، شباهت بسیار زیادی بین جدایههای جداسازی شده با یکدیگر و جدایه استاندارد قابل مشاهده بود. ولی اختلافاتی نیز وجود داشت. در جدایه شماره 3 پنج باند پروتئینی به وزن مولکولی 95/80، 35/24، 15/22، 75/17 و 15/12 کیلو دالتون وجود داشت. که ازاین نظر با جدایههای استاندارد اختلاف داشتند. جدایه شماره 42 دارای یک باند به وزن 59/23 کیلو دالتون و باند دیگر به وزن 79/20 کیلو دالتون بود که با جدایه استاندارد اختلاف داشت. جدایههای شماره 2، 3، 4، 6، 7، 8 و 1 دارای یک باند پروتئینی به وزن مولکولی 73/9 کیلودالتون بودند که با جدایه استاندارد اختلاف داشت. همچنین، جدایههای شماره 11 و 12 دارای یک باند پروتئینی به وزن مولکولی 66/16 کیلودالتون بودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند. نمونهگیری مجدد با تعداد بیشتر جدایهها انجام شد تا الگوی دقیقتری از پروفایلهای پروتئینی جدایههای اشرشیاکلی بهدست آید. در الگوهای الکتروفورزی سایر سویههای بهدست آمده از بستنی این اختلاف با جدایه استاندارد قابل مشاهده بود (شکل 5).
شکل4- رگرسیون بین وزن مولکولی مارکر و فاصله طی شده در ژل جدا کننده
Lane 1, 13; Lane 2, 1; Lane 3, 2; Lane 4, 3; Lane 5, 5; Lane 6, 7; Lane 7, 11; Lane 8 ,12 ; Lane 9, 10 and Lane 10, Reference strains E. coli ATCC ; Lane 11, Marker
شکل5- نقوش الکتروفورزی جدایههای بهدست آمده در مقایسه با جدایه استاندارد
بحث و نتیجه گیری.
باکتریهایی که در مواد غذایی حضور دارند تحت تاثیر فرآیندهای مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار میگیرند. این موارد باعث ایجاد شوک در باکتریها شده و باکتری را وادار به تولید پروتئینها و در برخی موارد تغییراتی در تولید آنزیمها نموده که این امر میتواند ویژگیهای خاصی به آنها داده که اطلاع از این ویژگی در تشخیص به موقع و دقیقتر کمک کننده است. در این بررسی جدایههای اندول مثبت نظیرinactive) )E.coli، E.hermani، P.rettgeri، K.oxytoca، M.mogani میتوانستند در نتیجه نهایی خطا ایجاد کنند، اما تحلیلهای انجام شده با استفاده از محیطهای حاوی مواد کروموژنیک نظیر LMX broth و کرموکالت آگار و و ایجاد فلورسانت در طول موج 366 نانومتر نشان داد، که با حداقل خطای احتمالی میتوان اشرشیا کلی را شناسایی کرد. البته باید به این نکته توجه کرد که در این روش بستنیهای حاوی مواد رنگی نظیر زعفران، کاکائو، توت فرنگی و ... به علت ایجاد تغییر رنگ محیط و اختلال در فلورسانت حاصل میتواند باعث ایجاد خطا در نتیجه آزمون شود و از آنجا که رنگ فلورسانت اهمیت زیادی دارد، در این بررسی کوشش شد تا بیشتر از نمونههای شیری پاستوریزه استفاده شود، هر چند از نمونههای حاوی مواد رنگی نیز استفاده شد، ولی به علت ایجاد رقت بالا برای حل این مشکل، زمان جواب در این روش طولانیتر شد. اگر از رقت یکدهم استفاده شود بسته به تعداد اشرشیاکلی در نمونه، جواب آزمون بین 7 تا 24 ساعت زمان لازم دارد. در بررسیهای انجام شده نتایج حاصل از میزان آلودگی به اشرشیاکلی با نتایج کریم[xxiv] و همکاران مطابقت داشت. بررسیهای انجام شده نشان داد جدایههای بهدست آمده از بستنیهای سنتی در الگوی الکتروفورزی دارای دو باند پروتئینی در ناحیه 59/23 و 79/20 بودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند. به نظر میرسد این جدایهها به علت قرار گرفتن در شرایط مختلف دمایی نظیر پاستوریزاسیون و انجماد دچار تغییراتی در ویژگیهای آنزیمی و پروتئینهای ساختمانی شدند. بنابراین، لازم است در روند تشخیص این جدایهها این نکات مد نظر قرار بگیرد، زیرا تغییر در پروفایل پروتئینی میتواند باعث تغییر در ویژگیهای بیوشیمیایی شود و در نهایت، باعث ابهام در تشخیص شود. بررسیهای انجام شده نشان داد بین جدایههای بهدست آمده از بستنی و جدایه استاندارد تفاوتهایی وجود دارد. جدایه استاندارد دارای یک باند پروتئینی مشخص با وزن مولکولی 86/22 کیلودالتون بود ولی جدایههای بهدست آمده بیشتر دارای وزن مولکولی 59/23 کیلودالتون و 79/20 کیلودالتون بودند که یک تفاوت کاملا مشخص بین این جدایهها با جدایه استاندارد بود. این امر میتواند یک شاخص مهم برای جدایههایی باشد که تحت تاثیر شوکهای حرارتی قرار میگیرند. با توجه به وجود تفاوتهایی که این دو باند با جدایه استاندارد نشان میدهد شاید بتوان نتیجه گرفت، جدایههای باکتریایی که در مواد غذایی حضور دارند به علت آنکه تحت تاثیر فرآیندهای مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار میگیرند، باکتری را وادار به تولید پروتئینها و در برخی موارد تغییراتی در تولید آنزیم نموده که این امر باعث شده جدایههای حاصل دچار تغییراتی به علت شوک سرد شده که میتواند ویژگیهای خاصی به جدایهها جهت مقاومت در مقابل این عوامل مخرب بدهد. تفاوت در ویژگیهای جدایههای گروه یک و دو با جدایه استاندارد نشان دهنده این مهم است.
در مطالعاتی که توسط ندایی نیا[xxv] و همکاران در شهر اصفهان انجام شد، نتایج مشابهی از تفاوت باندهای پروتئینی در جدایههای حاصل از بستنی و جدایه استاندارد وجود داشت که با یافتههای این مطالعه مطابقت میکند (19). بیشتر مطالعات انجام شده در مورد بررسی آلودگی نمونههای غذایی با رویکرد سلامت محور مد نظر قرار گرفته که نمونههایی از آن آورده شده است ولی از لحاظ مولکولی نیاز است در این مورد بررسیهای بیشتری در نقاط مختلف روی نمونههای غذایی مختلف انجام گیرد. مطالعات انجام شده در پاکستان توسط سومور[xxvi] نشان داد که نزدیک به 60 درصد نمونههای شیر خام به اشرشیاکلی آلوده بود و این جدایهها تحت تاثیر فرآیندهای حرارتی میتواند دچار ویژگیهای متفاوتی شود که باعث تشخیص مشکل تر آن در محصول میشود (9). در بررسیهای انجام شده در شهرکرد توسط شاکریان[xxvii] و همکاران، 200 نمونه بستنی سنتی از سطح شهرستان جمعآوری و از نظر آلودگی میکروبی آزمایش شد. از این تعداد 100 نمونه آلودگی به باکتریهای هوازی مزوفیل، 114 نمونه آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس، 99 نمونه آلودگی به انتروباکتریاسه و 2 نمونه به اشرشیاکلی آلوده بودند (20). در بررسی دیگری که در شهرستان مشهد انجام شد 91 درصد از نمونههای بستنی سنتی دارای آلودگی میکروبی بودند، که از این تعداد 84 درصد به باکتری خانواده انتروباکتریاسه، 67 درصد به استاف اورئوس و 11 درصد به اشرشیاکلی آلوده بودند (19). در بررسی دیگری که در شهرستان گناباد توسط محمدزاده[xxviii] و همکاران روی بستنی سنتی انجام شده میزان 32 درصد از نمونهها آلوده به اشرشیاکلی بودند (21). در بررسی دیگری که توسط پورمحمودی[xxix] و همکاران در شهر یاسوج انجام شد، 70 درصد مراکز تهیه و توزیع بستنی سنتی آلودگی میکروبی داشتند که از این مقدار 17 درصد کل نمونهها آلوده به اشرشیاکلی بودند (1). نتایج پژوهش کریم[xxx] و همکاران نیز نشان داد که در پنج منطقه تهران (شمال – جنوب – شرق – غرب و مرکز) 61/63 درصد در شمال، 08/81 درصد در جنوب، 9/72 درصد در شرق، 8/75 درصد در غرب و 7/85 درصد در مرکز به اشرشیاکلی آلوده بودند (22). ارزیابی وضعیت فیزیکی- شیمیایی و میکروبی بستنیهای سنتی تولید شده در شهر زاهدان توسط شادان[xxxi] و همکاران نشان داد که 2 درصد نمونهها در فصل بهار و 3/5 درصد نمونهها در فصل تابستان آلوده بودند (23). در بررسی دیگری در شیراز توسط شکر فروش[xxxii] و همکاران انجام شد، نشان داد که از 70 واحد تولید و عرضه بستنی سنتی 20 درصد نمونهها به اشرشیاکلی آلوده بودند (24). بررسیهایی انجام شده توسط صالحیان[xxxiii] و همکاران در شهر ساری نشان داد که 84 درصد بستنیهای سنتی آلوده هستند، که آلودگی به اشرشیا کلی 52 درصد را به خود اختصاص داده است (25). بنابراین، بر اساس بررسیهای انجام شده از ظاهر واحدهای تهیه، تولید و توزیع بستنیهای سنتی نمیتوان از بهداشتی بودن سلامت محصول اطمینان حاصل کرد. با توجه به موارد مطرح شده در مورد میزان آلودگی و اهمیت اشرشیا کلی به عنوان شاخص بهداشتی لازم است بررسیهای بیشتر با رویکرد مولکولی بهویژه در زمینه غذایی انجام شود.
تشکر و قدردانی
از معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، واحد تحقیق و توسعه معاونت غذا و دارو، مدیریت و همکاران محترم بخش میکروبشناسی آزمایشگاه کنترل مواد غذایی، آشامیدنی، آرایشی و بهداشتی که با حمایتهای مالی و با در اختیار قرار دادن امکانات ما را در انجام این پژوهش یاری فرمودند تشکر و قدردانی میشود.
[1]- Fluorocult LMX Broth Modified (Merck 1.10620)
[2]- Kovac's reagent
[3]- Nutrient agar
[4]- ATCC1399 E. coli
[5]- Hucker
[6]- Catalase
[7]- Oxidase test
[8]- Schaad
[9]- Clark and Lubs medium
[10]- Merck, Germany
[11]- Christensen
[12]- Triple sugar Iron agar
[13]- cyto Matin GeneImmune, IRAN
[14]- Numerical analysis
[15]- UPGMA
[16]- NTSYSPC VER .2.02e
[17]- Stacking Gel
[18]- Separating Gel
[19]- Laemmmli
[20]- Vertical slab unit
[21]- LMW-SDS Marker Kit (14 kDa−97 KDa) (Uppsala, Sweden)
[22]- EMB
[23]- 2ME
[xxiv]- Karim
[xxv]- Nedaeinia
[xxvi]- Soomro
[xxvii]- Shakerian
[xxviii]- Mohamadzadeh
[xxix]- Pourmahmoodi
[xxx]- Karim, G
[xxxi]- Shadan
[xxxii]- Shekarforoush
[xxxiii]- Salehian
)