نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران
3 استادیار علوم سلولی و مولکولی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: One of the most important factors in Urinary Tract Infection caused by Uropathogenic Escherichia coli, is the attachment of bacteria to the host cell surface. Thus, inhibition of bacterial attachment is the appropriate action to prevent infection. The aim of this study was to investigate the antimicrobial and especially anti adhesive characteristics of probiotic bacteria against Escherichia coli by using microbial techniques.
Materials and methods: In this study two strains of Lactobacillus acidophilus PTCC 1643 and Lactobacillus casei PTCC 1608 were used .40 Uropathogenic Escherichia coli were collected from Semnan province hospitals.20 samples with the more capability of biofilm production were selected for microbial tests. To evaluate the antimicrobial activity of complete culture and supernatant of probiotic lactobacilli, modified double layer method and dilution of supernatant were used, respectively. The mechanism of co- aggregation of lactobacilli with pathogens was examined. The microtitre plate method was used to detect anti-adhesive activity of Lactobacilli supernatant.
Results: The antimicrobial and anti-adhesive effects of probiotic lactobacilli on Uropathogenic Escherichia coli were confirmed in all tests. In this study, Lactobacillus casie with the growth inhibitory (42/7 mm) and anti-adhesive (46/7mm) effects were reported as a proper probiotic bacterium.
Discussion and conclusion: According to the results, the probiotic lactobacilli have spectacular effects to prevent attachment, biofilm formation and pathogenicity of UPEC, so using them to prevent and treat Urinary tract infection is a practical, reasonable and acceptable method.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی[1] عامل اولیه عفونت دستگاه ادراری[2] در کشورهای توسعه یافته محسوب میشود (1). در ایالات متحده امریکا سالانه 6/1 میلیارد دلار هزینه صرف درمان این بیماری میشود و تخمین زده میشود 40 تا 50 درصد از زنان سالم بالغ در طول دوره زندگی خود حداقل یکبار عفونت دستگاه ادراری را تجربه میکنند (2). این بیماری ابتدا با عفونت مثانه شروع میشود، بیشتر با فرا گرفتن کلیهها توسعه پیدا کرده و سرانجام ممکن است به نارسایی کلیوی منجر شود و حتی به خون هم راه یابد (1). توانایی این باکتری برای اتصال به بافتهای میزبان یکی از برترین عاملهاست که کلونیزاسیون را در دستگاه ادراری تسهیل میکند و اجازه ﭘایداری باکتری در برابر جریان ادراری و هجوم آن به اپیتلیال مثانه را میدهد. پدیده اتصال، ورود باکتری به داخل سلولهای اپیتلیال را تحریک میکند (2).
یکی از راههای کنترل عفونت‌های حاد ادراری استفاده از آنتیبیوتیک است که در حال حاضر سویههای مقاوم به آنتیبیوتیک در حال افزایش هستند. در سالهای اخیر مطالعات انجام گرفته، تأیید کننده آثار ضد بیماریزایی پروبیوتیکهاست. به علت تولید عاملهای ضد میکروبی متعدد، پروبیوتیک‌ها به عنوان عوامل درمانی و پیشگیری کننده از بیماریهای عفونی ایجاد شده با پاتوژنهای دهانی، رودهای و ادراری- تناسلی مطرح شدهاند (3). ویژگی مهم باکتریهای پروبیوتیک، توانایی این باکتری‌ها به منظور مهار اقزایش تعداد میکروارگانیسمهای بیماریزا و نیز مهار قدرت بیماریزایی آنها است. باکتریهای اسید لاکتیک از قبیل جنس لاکتوباسیلوس، با تولید عاملهای ضد میکروبی و نیز بهکارگیری مکانیسمهای مختلف، دارای عملکرد بسیار موثری در این راستا هستند (4- 6).
بهطور کلی نحوه عملکرد لاکتوباسیلوسهای پروبیوتیکی در تداخل با بیماریزاهای دستگاه ادراری تناسلی بسیار متنوع است و این تنوع به علت چهار ویژگی اصلی این باکتری‌ها از جمله توانایی اتصال، قدرت رقابت و قدرت مهار یوروپاتوژنهاست (7). همچنین، باکتریهای پروبیوتیک با توانایی تجمع سلولی[3] با میکروبهای بیماریزا مجتمع میشوند و با آثار ضد اتصالی خود مانع از رسیدن و اتصال باکتریهای پاتوژن به سلول هدف در میزبانشان میشوند (8). بنابراین، پژوهش حاضر به منظور بررسی آثار ضد میکروبی و ضد اتصالی لاکتوباسیلوسهای پروبیوتیکی بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی و نیز معرفی و پیشنهاد این باکتری‌ها در پیشگیری و درمان عفونت‌های ادراری انجام گرفت.
مواد و روش ها.
جمع آوری و تهیه نمونه ها: ابتدا تعداد 40 نمونه ادرار از افراد مبتلا به عفونت ادراری از بیمارستانهای استان سمنان (بیمارستان امام حسین و خاتم الانبیا در شهرستان شاهرود و بیمارستان امام رضا در شهرستان دامغان) جمعآوری شد. پس از کشت روی محیط ائوزین متیلن بلو[4] و مشاهده کلونیهای دارای جلای فلزی، آزمونهای بیوشیمیایی متداول، رنگ آمیزی گرم و مشاهده میکروسکوپی، حضور 30 ایزوله یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در بین نمونهها تایید شد. دو سویه[5] لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس[6] PTCC 1643 و لاکتوباسیلوس کازهای [7]PTCC 1608 از مرکز کلکسیون میکروبی علمی صنعتی ایران خریداری شد. سپس، به منظور فعالسازی، سویهها در محیط MRS براث[8] و MRS آگار[9] در شرایط بیهوازی کشت داده شدند. اشرشیاکلی PTCC1399 که در این پژوهش به عنوان شاهد بهکار رفت از مرکز کلکسیون میکروبی علمی صنعتی ایران خریداری شد.
.بررسی چگونگی تشکیل بیوفیلم باکتری .یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی با استفاده از روش میکروتیتر پلیت[10]96 خانهای: ابتدا 1 میلیلیتر از سوسپانسیون باکتری تازه کشت یافته به لوله آزمایش حاوی 10 میلیلیتر محیط استریل لوریا برتانی[11] تلقیح شد. سپس، مقدار 200 میکرولیتر از محیط 10 میلیلیتری به داخل چاهکهای میکروتیتر پلیت ریخته شد. در چاهک شاهد فقط محیط کشت استریل لوریا برتانی ریخته شد. پس از گذاشتن درب پلیت، گرماگذاری به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از گذشت این مدت، محتویات چاهکها خالی و با سرم فیزیولوژی استریل 3 بار شستشو داده شد. 200 میکرولیتر اتانول 96 درصد برای تثبیت سلولها به چاهکها اضافه شد. پس از گذشت 15 دقیقه، محتویات چاهکها تخلیه و در دمای آزمایشگاه سطح پلیت خشک شد. در مرحله بعد، هر چاهک با 200 میکرولیتر از کریستال ویوله 2 درصد به مدت 5 دقیقه رنگآمیزی شد. چاهکها با آب شهری به آرامی شسته و با استیکاسید 33 درصد به عنوان حلال پر شدند. پس از 15 دقیقه گرماگذاری، پلیت در دمای 37 درجه سانتیگراد، جذب نوری چاهکها در 492 نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر مدل[12] (اسات فاکس 3200) ساخت شرکت آمریکا خوانده شد (9).
.بررسی اثر ضد میکروبی کشت کامل پروپیوتیکها با روش کشت دولایه[13] اصلاح شده: برای بررسی آثار ضد میکروبی پروبیوتیک ها، تعداد 20 ایزوله یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی که دارای قدرت بالا در تشکیل بیوفیلم و در نتیجه دارای توانایی اتصال و بیماریزایی بالا نیز بودند، انتخاب شدند. ابتدا 50 میکرولیتر از لاکتوباسیلوس پروبیوتیکی تازه رشد یافته، در مرکز پلیت MRS آگار قرار داده شد. پس از 24 ساعت گرماگذاری و رشد لاکتوباسیلوس، محیط مولر هینتون آگار[14] مذاب بر روی آن ریخته و اجازه داده شد تا ببندد. سپس، از سوسپانسیون نیم مک فارلند باکتری پاتوژن بر روی این محیط، کشت متراکم داده شد و به مدت 24 ساعت در 37 درجه گرماگذاری شد. این آزمایش برای 20 نمونه باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی و نمونه شاهد در حضور هر دو لاکتوباسیلوس بهطور جداگانه انجام و نمونهها از لحاظ هاله عدم رشد ایجاد شده، بررسی شدند (10).
.بررسی اثر ضد میکروبی سوپرناتانت پروبیوتیک‌ها با روش رقتسازی: به منظور تهیه مایع رویی کشت سلولی[15] از لاکتوباسیلوسها، ابتدا کشت تازه از آنها در محیط MRS براث تهیه شد. سپس، محیط کشت در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور[16] 10000 در دقیقه سانتریفیوژ و برای اطمینان از عدم وجود هرگونه سلول میکروبی از فیلتر (22/0 میکرون) عبور داده شد (2). سپس، 10 لوله محتوی 5 میلیلیترمحیط مولر هینتون براث[17] تهیه واز هر کدام از لولههای 1 تا 10 به ترتیب 100 تا 1000 میکرولیتر از محیط کشت خارج و به همان میزان سوپرناتانت اضافه شد. در نهایت، 50 میکرولیتر از سوسپانسیون نیم مک فارلند باکتری پاتوژن به لولهها اضافه و 24 ساعت در 37 درجه گرماگزاری شد. آزمایش برای 20 نمونه پاتوژن در حضور سوپرناتانت هر دو لاکتوباسیلوس و نیز هر نمونه به تنهایی به عنوان شاهد، به شکل جداگانه انجام و لولهها از برای کدورت محیط کشت حاصل از رشد بررسی شدند (11).
.بررسی تجمعپذیری پروبیوتیک‌ها با باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی: ابتدا کشت تازه از باکتریهای پاتوژن و لاکتوباسیلوسهای پروبیوتیکی در محیط مایع تهیه و از رسوب باکتریایی سوسپانسیون معادل نیم مک فارلند در بافر فسفات سالین[18] تهیه شد. 500 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریهای پروبیوتیک و باکتریهای پاتوژن در یک اپندورف استریل با یکدیگر مخلوط و بلافاصله جذب نوری آن در طول موج 660 نانومتر با دستگاه اﺳﭘﮐﺗوفوتومتر اندازه گیری شد. اپندورفهای حاوی مخلوط باکتری‌ها به مدت 4 ساعت در 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. پس از مدت زمان یاد شده، مایع رویی هر اپندورف از نظر میزان جذب نوری در طول موج 600 نانومتر بررسی و میزان تجمع یافتن بر اساس فرمول زیر محاسبه شد:
|
100× |
A1- A2 |
= درصد تجمع یافتن |
|
A1 |
A1 میزان جذب نوری بلافاصله پس از مخلوط کردن باکتری‌ها و A2 میزان جذب نوری پس از 4 ساعت است. آزمون برای 20 نمونه باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی ونمونه شاهددر حضور هر دو لاکتوباسیلوس پروبیوتیکی به شکل جداگانه انجام شد (12).
.بررسی اثر ضد اتصالی سوپرناتانت پروبیوتیک‌ها با استفاده از میکروتیترپلیت 96 خانه ای: به منظور بررسی اثر ضد اتصالی پروبیوتیک‌ها از میکروتیتر پلیت پلیاستیرنی 96 خانه استفاده شد. ابتدا 75 میکرولیتر از سوپرناتانت باکتریهای پروبیوتیک و سپس، 75 میکرولیتر از سوسپانسیون نیم مک فارلند نمونه باکتری پاتوژن به چاهکها اضافه شد.
میکروتیترپلیت به مدت 24 ساعت در 37 درجه گرماگذاری شد. در چاهکهای شاهد تنها باکتریهای پاتوژن و محیط کشت استریل ریخته شد. سپس، محتویات چاهکها خارج و هر چاهک سه بار توسط بافرفسفات شستشو داده شد. برای تثبیت سلولها از اتانل 96 درصد به مدت 15 دقیقه و به منظور رنگآمیزی از کریستال ویوله 2 درصد به مدت 10 دقیقه استفاده شد. سپس، میکروتیترپلیت با جریان ملایم آب شیر شسته شد. پس از خشک شدن چاهکها در معرض هوا، استیکاسید 33 درصد به عنوان حلال به چاهکها اضافه و میزان جذب نوری در طول موج 490 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر برای هر چاهک اندازهگیری شد. آزمایش برای هرکدام از نمونههای پاتوژن در مجاورت هردو پروبیوتیک 2 بار تکرار و بهطور جداگانه انجام شد. در نهایت، میزان کاهش اتصال از فرمول زیر محاسبه شد:
|
100× |
ODa – ODb |
= درصد کاهش اتصال |
|
ODa |
ODa بیانگر جذب نوری چاهک کنترل و ODb جذب نوری چاهک مورد آزمایش است (3).
مقایسه عملکرد ضد میکروبی پروبیوتیک‌ها در آزمونهای میکروبی انجام شده، با استفاده از روش‌های آماری و به کمک نرم افزار SPSS بررسی و نتایج گزارش شد.
نتایج.
نتایج ارزیابی تشکیل بیوفیلم باکتریهای اشریشیاکلای یوروپاتوژنیک نشان داد که از میان 30 باکتری تشکیل دهنده بیوفیلم، 25 درصد قدرت ضعیف، 5/42 درصد قدرت متوسط و50 درصد دارای قدرت بسیار بالا برای اتصال و تشکیل بیوفیلم بودند که آزمونهای میکروبی در حضور باکتریهای پروبیوتیک روی آنها انجام شد (شکل 1).
شکل 1- تشکیل بیوفیلم اشریشیاکلای یوروپاتوژنیک در میکروتیتر پلیت 96 خانهای براساس شدت رنگ کریستال ویوله در چاهکها
در آزمون کشت کامل باکتریهای پروبیوتیک، میانگین قطرهاله عدم رشد اشریشیاکلی یوروپاتوژن توسط لاکتوباسیلوس کازهای 7/42 میلیمتر و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس5/29 میلیمتر بود ومیانگین قطرهاله عدم رشد اشرشیاکلی شاهد در حضور لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به ترتیب 34 و 22 میلیمتر بهدست آمد (شکل 2).
همچنین، بررسی نتایج آزمون تی مستقل (T test) نشان داد در سطح خطای 1 درصد تفاوت معناداری بین لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس وجود دارد. نتایج نشان داد که اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازهای برروی اشریشیاکلی یوروپاتوژن در حالتی که از کشت کامل باکتریهای پروبیوتیک استفاده میشود، به مراتب بیشتر از حالت مشابه در لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بود (شکل 3).
شکل 2- هاله عدم رشد اشریشیاکلی یوروپاتوژن در حضور لاکتوباسیلوس کازه ای (سمت راست) و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (سمت چپ)
شکل 3- نمودار میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری اشریشیاکلی یوروپاتوژن و شاهد اشرشیاکلی (PTCC1399)در حضور لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (A) و لاکتوباسیلوس کازهای (C) بر حسب میلیمتر
در آزمون بررسی اثر ضد میکروبی سوپرناتانت، بررسی کدورت لولهها در نمونههای یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی نشان داد، میانگین حداقل غلظت مهارکننده رشد سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازهای 12 درصد و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 18 درصد است. بنابراین، اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازهای در مقایسه با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوسدر حالتی که از سوپرناتانت پروبیوتیکی استفاده میشود نیز بیشتر بود.
نتایج آزمایش بررسی تجمعپذیری لاکتوباسیلوسها نشان داد که هر دو باکتری پروبیوتیک قادر به تجمع با باکتریهای یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی با درصد بالایی بودند که از این میان لاکتوباسیلوس کازهای با میانگین 9/61 درصد نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با میانگین 7/46 درصد، دارای تجمعپذیری بیشتری با یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی بود. میزان تجمعپذیری لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با اشرشیاکلی شاهد به ترتیب 53 و 26 درصد بهدست آمد. همچنین، نتایج بررسی آزمون تی مستقل نشان داد در سطح خطای 1 درصد تفاوت معناداری بین دو لاکتوباسیلوس وجود دارد (شکل 4).
شکل 4- نمودار میانگین درصد تجمعپذیری لاکتوباسیلوس کازهای (C) و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (A) با باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی و شاهد اشرشیاکلی (PTCC1399)
بررسی اثر ضد اتصالی پروبیوتیک‌ها بر باکتری بیماریزا، از این جهت که سبب جلوگیری از شروع بیماری میشود دارای اهمیت است. نتایج نشان داد که سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازهای با میانگین 7/46 درصد دارای اثر ضد اتصالی بیشتری نسبت به سوپرناتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با میانگین 6/25 درصد است. همچنین، نتایج بررسی آزمون تی مستقل نشان داد در سطح خطای 1 درصد تفاوت معناداری بین دو لاکتوباسیلوس وجود دارد (شکل 5).
شکل 5- نمودار میانگین کاهش اتصال باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در حضور سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه ای (C) و
لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (A)
بحث و نتیجه گیری.
عفونت دستگاه ادراری یکی از متداول‌ترین عفونت‌های انسانی است. باکتری اشریشیاکلی یکیاز شایعترین عوامل ایجاد کننده عفونت مجاری ادراری در افراد با دستگاه ادراری سالم است و مسؤول 90 درصد از کل عفونت مجاری ادراری باکتریال اکتسابی از جامعه است (13). از آنجا که ایـن باکتری مقـاوم بـه درمان آنتیبیوتیکی شده است، روش‌های ضـد میکروبی غیر آنتیبیوتیکی نظیر پروبیوتیک‌ها بسیـار مـورد توجـه است. پژوهش حاضر به منظور بررسی خواص ضد میکروبی و ضد اتصالی باکتریهای پروبیوتیک (لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس) بر پاتوژن شایع دستگاه ادرای (اشریشیاکلی)، انجام شد.
روش‌های متعددی برای بررسی ویژگی ضد میکروبی باکتریهای پروبیوتیک علیه باکتریهای بیماریزا با استفاده از کشت کامل و سوپرناتانت آنها وجود دارد. بهترین روش برای بررسی اثر کشت کامل پروبیوتیک‌ها روشی است که توسط مک گیون و تگ[xix] در سال 1971 با عنوان Spot on – lawn method ارایه شد که در سال 2001 مایا[xx] نام آن را به روش کشت دو لایه[xxi] تغییر داد و در سال 2010 ارباب سلیمانی[xxii] و همکاران این روش را با کمی اصلاح با نام روش کشت دو لایه اصلاح شده[xxiii] عنوان کردند. در این روش اثر ضد میکروبی کشت کامل پروبیوتیک با وجود هاله عدم رشد باکتریهای یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در لایه دوم محیط کشت به خوبی قابل مشاهده بود (10). درپژوهش حاضر نیز از روش کشت دولایه اصلاح شده استفاده شد و نتایج نشان داد که اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازهای بر روی یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بیشتربود. در سال 2001 اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازهای سویه شیروتا علیه اشرشیاکلی توسط آساهارا[xxiv] گزارش شد (7). در سال 2008 آناس[xxv] و همکارانش اعلام کردند کشت کامل باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم[xxvi] دارای آثار ضد میکروبی علیه باکتریهای بیماریزای اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس[xxvii] است (14). ارباب سلیمانی و همکاران نیز در سال 2010، نشان دادند کشت کامل لاکتوباسیلوس کازهای دارای بیشترین اثر ضد میکروبیبر روی یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در میان سایر باکتریهای پروبیوتیک مورد آزمایش بود. (10).
اثر ضد میکروبی سوپرناتانت حاصل از باکتریهای پروبیوتیک را میتوان به تولید اسید لاکتیک نسبت داد زیرا در طی رشد باکتریهای پروبیوتیک، اسیدیته محیط به شدت اسیدی شده و باکتریهای بیماریزا بهطور طبیعی به شرایط اسیدی حساس بوده و در اسیدیته پایین از بین می‌روند (15 و 16). در این مطالعه بررسی حداقل غلظت بازدارنده از سوپرناتانت باکتریهای پروبیوتیک نشان دادکه سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه ایدر غلظت پایین تر (12 درصد) دارای اثر ضد میکروبی بیشتر بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (18 درصد)بود. در سال 2003 اگانبانو[xxviii] و همکاران نشان دادند سوپرناتانت حاصل از دو پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس برویس[xxix] دارای فعالیت ضد میکروبی علیه باکتریهای اشریشیا کلی، باسیلوس سرئوس[xxx]و یرسینیا انتروکلی تیکا[xxxi] بوده و از رشد آنها جلوگیری میکند (17). ارباب سلیمانی و همکاران در سال 2010 غلظت 5 درصد از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازهای را برای مهار رشد باکتریهای یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی جدا شده از ادرار افراد مبتلا به عفونت ادراری، گزارش کردند (10).
توانایی باکتریهای اسیدلاکتیک برای تجمع با باکتریهای رودهای در شرایط in vitro و in vivo از دیرباز بسیار مورد توجه بوده و به عنوان مکانیسم کارامدی برای جلوگیری از عفونت مطرح شده است (18). در پژوهش حاضر، اثر مهاری این مکانیسم بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی آزمایش شد. درصد تجمعپذیری لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی به ترتیبدر حدود 60 و 45 درصد بهدست آمد که لاکتوباسیلوس کازهای دارای اثر بهتری بود. راید[xxxii] و همکارانش در سال 1988 اثر مهاری لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس رامنوزوس[xxxiii] سویه GR-1 و اثر تجمعپذیری این باکتری‌ها را با اشرشیاکلی جدا شده از دستگاه ادراری گزارش کردند (19). در سال 2002، ساسکوویچ[xxxiv] قابلیت تجمع یافتن لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را با باکتریهای پاتوژن اشرشیاکلی حدود 4/19 درصد بیان کرد. همچنین، در سال 2010 ارباب سلیمانی و همکارانش در پژوهشی اثر تجمعپذیری لاکتوباسیلوس کازهای با اشرشیاکلی را بیش از سایر پروبیوتیک‌ها اعلام کردند (10 و 20).
با بررسی اثر ضد اتصالی سوپرناتانت باکتریهای پروبیوتیک بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در این مطالعه، این نتیجه حاصل شد که هر دو لاکتوباسیلوس دارای اثر ضد اتصالی مناسبی بودند که از این میان لاکتوباسیلوس کازهای اثر ضد اتصالی (7/46 درصد) بیشتری را نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (6/25 درصد)، بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی اعمال کرد. عابدی[xxxv] و همکارانش در سال 2013 اعلام کردند که لاکتوباسیلوسهای پروبیوتیکی دارای اثر ضد اتصالی هستند. بر اساس گزارش آنها لاکتوباسیلوس دلبروکی قادر بود حدود 80 درصد از اتصال اشرشیاکلی به سلولهای Caco-2 جلوگیری کند و مکانیسم آنرا جایگزینی رقابتی دانستند. یکی از علتهای تفاوت نتیجه بهدست آمده در پژوهش حاضر با نتیجه بهدست آمده از پژوهش عابدی و همکارانش تفاوت سطوح اتصال است. در کشت سلولی Caco-2 در رقابت میان لاکتوباسیلوس پروبیوتیکی و باکتری اشرشیاکلی برای اتصال به گیرنده سلولی لاکتوباسیلوس موفقتر بوده و با اشغال این جایگاه از اتصال باکتری بیماریزا جلوگیری میکند اما در میکروتیتر ﭘلیت ﭘلی استیرنی شرایط کشت سلولی محیا نیست (21). بهطور کلی در مطالعات انجام شده نشان داده شده است، درشرایطی که از کشت کامل باکتریهای پروبیوتیک استفاده میشود نسبت به استفاده از سوپرناتانت آنها، اثر ضد اتصالی بیشتری بر باکتریهای بیماریزا اعمال میشود. میتوان چنین استنباط کرد که در کشت کامل اثر ضد اتصالی پروبیوتیک به علت تولید متابولیتهای ضد میکروبی و در برخی موارد به واسطه رقابت مستقیم با پاتوژن برای جایگاه اتصال، علاوه بر ایجاد شرایط اسیدی است. چنانچه اینگراسیا[xxxvi] و همکارانش در سال 2005 اثر ضد اتصالی کشت کامل لاکتوباسیلوس کازهای سویه
DN-114001 را بر اشرشیاکلی در شرایط in vitro بررسی و حدود 57 درصد گزارش کردند (10 و 22).
بر اساس یافتههای این مطالعه میتوان چنین نتیجهگیری کردکه کشت کامل و سوپرناتانت حاصل از لاکتوباسیلوس کازهای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس دارای آثار مهاری علیه اشرشیاکلی یوروﭘاتوژنیک هستند و این باکتریهای پروبیوتیک قادرند از اتصال و در نهایت، تشکیل بیوفیلم این باکتری جلوگیری کنند. یکی از مکانیسمهایی که امروزه به عنوان برتری لاکتوباسیلوسهای پروبیوتیکی مطرح است قدرت به دام انداختن باکتری بیماریزا بر اساس تجمعپذیری است. اگر چه در گذشته پژوهشگران بر این باور بودند که تجمعپذیری باکتریهای پروبیوتیک با عوامل بیماریزا به ویژگی ضد میکروبی آنها مربوط است اما در سالهای اخیر ارتباط میان تجمعپذیری این باکتری‌ها و قدرت ضد اتصالی مطرح شده است. بر اساس یافتههای پژوهش حاضر مشخص شد هر چقدر قدرت ضد میکروبی و تجمعپذیری لاکتوباسیلوسهای پروبیوتیکی بیشتر میشود قدرت ضد اتصالی آنها نیز افزایش مییابد و شاید بتوان این فرضیه را مطرح کرد که تجمعپذیری میتواند در ارتباط با هر دو عامل ضد میکروبی و ضد اتصالی باشد. امید است که بتوان با پژوهشهای بیشتر و درک بهتر از مکانیسم ضد اتصالی باکتریهای پروبیوتیک بتوان از آنها در درمان و پیشگیری از عفونت دستگاه ادراری استفاده کرد و از پیدایش سویهای مقاوم به آنتیبیوتیک جلوگیری کرد.
[1]- Uropathogenic Escherichia coli
[2]- Urinary Tract Infection
[3]- Coaggregation
[4]- Eosin Methylene Blue
[5]- Persian Type Culture Collection
[6]- Lactobacillus acidophilus
[7]- Lactobacillus casei
[8]- Man Rogasa Sharp Broth
[9]- Man Rogasa Sharp Agar
[10]- Microtiter Plate
[11]- Luria Bertani
[12]- Stat Fax 3200
[13]- Modified Double Layer Method
[14]- Muller Hinton Agar
[15]- Cell Free Supernatant
[16]- RPM
[17]- Muller Hinton Broth
[18]- Phosphate Buffer Saline
[xix]- Mc given and Tagg
[xx]- Maya
[xxi]- Double layer method
[xxii]- Arbab Soleimani
[xxiii]- Modified double layer method
[xxiv]- Asahara
[xxv]- Anas
[xxvi]- Lactobacillus plantarum
[xxvii]- Staphylococcus aureus
[xxviii]- Ogunbanwo
[xxix]- Lactobacillus brevis
[xxx]- Bacillus cereus
[xxxi]- Yersinia enterocolitica
[xxxii]- Reid
[xxxiii]- Lactobacillus rhamnosus
[xxxiv]- Šušković
[xxxv]- Abedi
[xxxvi]- Ingrassia
)