نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استادیار زمین شناسی، دانشگاه تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Travertine results in the accumulation of calcium carbonate on karst springs, hot springs, small rivers and marshes. Badab Sourt is the travertine-maker spring that located in Mazandaran province and is the second natural place in Iran. It has two springheads with different characteristics and different colors and different sediments that give unique beauty to spring. Travertine is a good model to study the relationship between environment and microorganisms. This study centered on the influence of microorganisms on precipitation of calcium carbonate and isolation of microorganisms that have precipitation potential.
Materials and methods: Here, to assess effects of microorganisms on mineralization were used microscopic and culture methods; from stone samples, photos have gotten with SEM and polarizing microscope and from water sample bacteria were isolated. Mineralization function of bacteria was investigated with culturing them on B4 medium and mineralization potential was approved by polarizing microscope.
Results: SEM photos showed microorganisms have effect on mineralization and can act as a nucleus in beginning of crystal production. Finally, five strains Bss-3, Bsw-28d, Bss-11a, Bsw-1c1, and Bsw-39b were isolated, which have ability to precipitate calcium carbonate. In between strain Bss-3 that has 99.6% similarity with taxon Labrenzia aggregate IAM 12614T was the first report that has the ability to precipitate calcium carbonate and among the strains, strain Bsw-28d with precipitation of 45.6 mg / ml CaCO3 was the best strain.
Discussion and conclusion: Microorganisms are important in the formation and evolution of their surrounding environments, thereby native microbes must be concerned for conserving and restoring the environments.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
واژه تراورتن برگرفته شده از واژه ایتالیایی تیورتیون[1] و نام محلی است که تراورتن به شکل رسوب بیرونی تشکیل شده است (1). تراورتن حاصل تجمع کربنات کلسیم در چشمه‌های کارستی، چشمه‌های آبگرم، رودخانه‌های کوچک و باتلاق‌هاست. مهمترین عامل رسوبگذاری در تراورتنها عوامل شیمیایی مانند تبخیر، خارج شدن CO2، افت فشار و ... است و میکروارگانیسمها در کنار عوامل شیمیایی در رسوبگذاری تاثیرگذار هستند (2). سیمونز در سال 1951 تراورتنهای چشمه‌ای که در محل خروج چشمهها تشکیل می‌شود را معرفی کرد، که تراورتنهای چشمه بادآب سورت در کیاسر مازندران از این نوع هستند (3). در حقیقت، تراورتن نوعی سنگ رسوبی کربناته است که در محل چشمه‌های آهک ساز تشکیل می‌شود. یک چشمه کربناته معمولاً در کف حوضچههای کم عمق تشکیل می‌شود و می‌توان گفت تراورتن معمولاً حاصل رسوب مواد آهکی در آبهای روان است (3).
چشمه تراورتن ساز بادآب سورت اورست در استان مازندران، شهرستان ساری و یک کیلومتری شرق روستای اورست در ارتفاع 1840 متری از سطح دریا واقع شده است (شکل 1). چشمه سورت شامل دو سرچشمه با فاصله اندک بین هم است که از لحاظ ترکیب شیمایی، رنگ و مزه از هم متفاوت هستند (جدول 1). یکی از سرچشمههای اصلی سرچشمه شرقی (شکل 1، الف) است که دارای آب‌دهی بیشتر است و شوری بالاتری را نشان میدهد و در انتهای آن لجن سیاه رنگ دیده می‌شود که خاصیت درمانی دارد، درحالیکه سرچشمه غربی (شکل 1، ج) دارای آبی ترش مزه با رنگ قرمز- نارنجی است؛ رنگ قرمز آن به علت وجود ترکیبات آهن اکسیده است.
این چشمه هم اکنون فعال است و قسمتهای قدیمی هم در حومه آن دیده می‌شود (شکل 1، ب). چشمه بادآب سورت با ایجاد شکلهای ژئومورفولوژی منحصر به فرد همراه با رنگهای گوناگون و به ویژه رنگهای قرمز، یکی از جاذبههای زمین شناختی استان مازندران محسوب می‌شود. مجموعه تراورتنی بادآب سورت هم زمان با آخرین چین‌خوردگی البرز در پلیوسن و پلیستوسن (دوران چهارم زمین‌شناسی) شکل گرفته است. این چشمه در سال 1387دومین اثر طبیعی ملی بعد از قله دماوند توسط سازمان میراث فرهنگی و گردشگری تعیین شد.
در شکل 3 موقعیت قرارگیری و خروج سرچشمههای بادآب سورت و رابطه سن آن با واحدهای زیرین خود نشان داده شده است.
چشمه‌های تراورتن ساز به علت وجود فعالیت میکروارگانیسمها در رسوبگذاری مدل مناسبی برای بررسی رابطه میکروبها و محیط است. کربناتهای میکروبی و تودههای میکروبی مهمترین مدل بررسی رابطه میکروب- محیط هستند (4). زمان آغاز حیات میکروبی حدود 1/4 میلیارد سال پیش در نظر گرفته می‌شود (5) که محیط آن دارای شرایط با 150 درجه سانتیگراد، قلیایی و حاوی بی سولفید و آهن است و نخستین نشانههای تودههای میکروبی در حدود 5/3 میلیارد سال پیش در آفریقای جنوبی و استرالیا گزارش شده است (6). همان طور که دیده می‌شود موجودات اولیه در زیستگاههای پلیاکستریم حیات داشتهاند (7) که گفته شده ابتدا در حبابهایی نزدیک به سطح آب حیات شکل گرفته و سپس، تکامل جمعیتهای میکروبی و تولید فرآیندها و متابولیسمهای متنوع میکروبی در تودههای میکروبی شکل گرفته است. برای نمونه نخستین فتوسنتزکنندهها در تودههای میکروبی وجود داشتهاند (4).
شکل 1- چشمه بادآب سورت. الف) چشمه شرقی، ب) سرچشمههای قدیمی که در حال حاضر فعالیتی ندارند، ج) چشمه غربی
معدنی شدن به واسطه میکروبها در آغاز حیات میکروبی وجود داشته که با رسوب یافتن کربنات کلسیم، استروماتولیتهای لایهاییی شکل گرفتهاند که جمعیتها کلسیت را رسوب میداده یا اینکه به دام میانداختهاند (8). به این شکل میکروارگانیسمهایی که در زیستگاههای کربناته تکامل یافتهاند توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند، حتی یوکاریوتی مثل مرجانها که به شکل فعال توسط فرآیندی آنزیمی کلسیت را روی خود رسوب میدهند (9). این کار سبب شده نیچهای مناسب برای ادامه حیات ایجاد شود مثل کاری که در بیوفیلمها رخ میدهد. با تشکیل تودههای میکروبی ارگانیسمهای مختلف در کنار هم قرار گرفته و تحمل شرایط سخت محیطی برای آنها افزایش مییافته در نتیجه شانس ادامه حیات افزایش مییافته است.
معدنی شدنی که توسط مرجانها انجام می‌شود فرآیند معدنی شدن زیستی نام دارد. دو فرآیند دیگر به نام معدنی شدن تحریک شونده زیستی[2] و معدنی شدن تحت تاثیر زیستی[3] وجود دارند (10) که باکتریها در کنار فرآیندهای فیزیکی رسوبگذاری مثل انتشار، بخارشدن و آزادشده گاز روی رسوبگذاری تأثیر میگذارند. مشخص شده است که در محیطهای دریایی دو عامل درونی و بیرونی (11) در رسوبگذاری تاثیرگذار هستند (12). عوامل درونی مانند برهمکنشهای اکولوژیکی، تولید و مصرف مواد آلی و غیرآلی است که دو مکانیسم کلی آن یکی تولید پلیساکاریدهای خارج سلولی است که در نتیجه آن میکروارگانیسمها به عنوان هسته اولیه هنگام آغاز رسوبگذاری عمل میکنند و مکانیسم بعدی موتور قلیالیت[4] نام دارد (9) که به فعالیتهای متابولیکی سلولها اشاره دارد تغییرات اسیدیته میتواند از 6 تا 10 باشد، با این تغییر میکرومحیطهایی برای تولید رسوب فراهم آورده می‌شود (9). با توجه به اینکه فعالیتهای میکروبها متنوع است، تاثیر آنها بر رسوبگذاری میتواند یا منفی باشد. برای نمونه سیانوباکترها با گرفتن کربن دی اکسید از آب، سبب تسهیل رسوب یافتن کربنات کلسیم میشوند در حالی که اکسیداسیون سولفید سبب اسیدی شدن محیط می‌شود که اثر منفی بر رسوبگذاری دارد (13). عوامل بیرونی مانند نور، مواد غذایی، فضا، هیدرودینامیک و لایهگذاری هستند (14). همانطور که دیده می‌شود این دو عامل بیرونی و درونی را باید در کنار هم در نظر گرفت زیرا در محیطهای مختلف ممکن است یک عامل اصلی در رسوبگذاری کلسیت وجود داشته باشد.
در پژوهش حاضر تلاش شد در درجه اول تنوع میکروبی و رابطه بین میکروب و محیط با روش‌های میکرسکوپی و کشت بررسی شود و در مرحله بعد میکروارگانیسمهای رسوب دهنده کربنات کلسیم جداسازی شوند. این میکروارگانیسمها کابردهای مختلفی مانند کاهش آلودگیهای فلزی خاک و آبهای زیرزمینی (15)، افزایش استحکام خاک (16)، کاهش حفرات ساختهای زمین‌شناسی (17)، حفاظت و استحکام به ساختهای سیمانی (18) و حفاظت از سنگهای ساختمانی (19) دارند که هر یک از نظر اقتصادی مهم هستند.
مواد و روشها.
موقعیت چشمه بادآب سورت در ایران و لایههای سنگی منطقه کیاسر (شکل 2) از روی نقشه زمین‌شناسی منطقه کیاسر (مقیاس 20000/1) با استفاده از نرم افزار کورل درا ایکس [6]6 رسم شد و نقشه توپوگرافی و لایههای محدوده چشمه از طریق نرم افزارهای گوگل ارث[7]، سرفر 10[8] و کورل درا ایکس 6 و با استفاده از نقشه زمین‌شناسی منطقه کیاسر با مقیاس 20000/1 رسم شد.
شکل 2- موقعیت چشمه بادآب سورت در (a) مکان چشمه در ایران و نقشه راههای دسترسی به چشمه و (b) نقشه زمین‌شناسی و موقعیت چشمه بادآب سورت نمایش داده شده است. (رسم شده با استفاده از نقشه زمین‌شناسی منطقه کیاسر با مقیاس 20000/1 و نرم افزار Corel Draw X6)
شکل 3- نقشه توپوگرافی و توالی لایههای تشکیل شده در محدوده چشمه بادآب سورت (رسم شده با نرم افزار Surfer 10 و Corel Draw X6)
طراحی محیط کشت و کشت باکتریها:نمونههای آب ابتدا توسط دستگاه جذب اتمی مدل پرکین المر [9]100 برای کاتیونها و تیتراسیون برای آنیونها تحلیل شیمیایی شد(جدول 1). با توجه به نوع و مقدار نمکها محیط کشت متناسب با محیط طراحی شد (جدول 2). با توجه به اینکه مشخص شده استفاده از محیط کشت فقیر غذایی سبب افزایش میزان جداسازی می‌شود، در پژوهش حاضر از این نوع محیط استفاده شد. زیرا در محیطهای طبیعی ماده غذایی به وفور دیده نمیشود و جمعیتها در محیط طبیعی در حالت متابولیسمی نیمه فعال وجود دارند (24). محتوی نمکی از تغییر میزان نمک استفاده شده در محیط هالوفیلیک نسبی[10] MH بهدست آمد (25).
جدول 1- ویژگیهای فیزیکی و میزان عناصر سرچشمههای چشمه بادآب سورت
|
رنگ |
غلظت یونها (گرم بر لیتر) |
دما (آب) |
دما محیط) |
اسیدیته |
شوری |
نقطه |
|||||||
|
CO32- |
SO42- |
Cl- |
Mg2+ |
Ca2+ |
K+ |
Na+ |
Fe2+ |
||||||
|
قرمز، خاکستری، سیاه |
7/0> |
1/3 |
5/36 |
25/0 |
5/16 |
014/0 |
12 |
0012/0 |
19 |
24 |
39/7 |
2/56 |
A شرقی |
|
قرمز |
68/1> |
96/0> |
7/1 |
011/0 |
05/0 |
02/0 |
06/0 |
000023/0 |
18 |
24 |
15/7 |
42/3 |
Bغربی |
جدول 2- محیط کشت و شرایط گرماگذاری استفاده شده برای جداسازی و خالصسازی باکتریها
|
محیط B2 |
محیط A1 |
|
|
1000 |
1000 |
آب مقطر (میلیلیتر) |
|
8/0 |
8/0* |
نوترینت براث |
|
- |
8/4 |
MgSO4 7H2O |
|
- |
2/3 |
MgCl2 6H2O |
|
- |
1 |
KCl |
|
- |
5/40 |
NaCl |
|
- |
015/0 |
NaHCO3 |
|
- |
09/0 |
CaCl2 2H2O |
|
15 |
15 |
آگار |
|
34 |
**34 |
دما (درجه سانتیگراد) |
|
7 |
5/7 |
اسیدیته |
* مقادیر بر حسب گرم بر لیتر
** استفاده از دمای بین 30 تا 34 درجه سانتیگراد گستره جداسازی باکتریها را افزایش میدهد.
1 محیط طراحی شده برای سرچشمه شرقی1
2 محیط طراحی شده برای سرچشمه غربی2
پس از تلقیح، محیطها در دمای 34 درجه سانتیگراد به مدت 6 ماه گرماگذاری شدند و جداسازی و خالصسازی به روش کشت خطی انجام شد.
کشت سویه‌های جدا شده روی محیط B4 و تایید رسوب گذاری: برای بررسی تأثیر باکتریها بر رسوبگذاری، باکتریهای خالص شده روی محیط کشت B4 (کلسیم استات 25/0 درصد، گلوکز 1 درصد، عصاره مخمر4/0 درصد، نمک به میزان مورد نیاز سویهها و آگار 5/1 درصد برای محیط جامد) کشت داده شدند (26). به محیط چند قطره از فنل رد به عنوان شناساگر اضافه شد (مقدار 0025/0 درصد حل شده در سدیم هیدروکسید 1/0 نرمال) و با توجه به اینکه مشخص شده رسوبگذاری کربنات کلسیم در اسیدیتههای بالاتر از 8 رخ میدهد، اسیدیته محیط روی 8 تنظیم شد (27)، سویهها در دمای 34 درجه سانتیگراد به مدت 1 هفته تا یک ماه گرمخانهگذاری شدند.
تأیید رسوبگذاری کلسیت توسط میکرسکوپ پلاریزان انجام شد، بدین صورت که بلورهای کلسیت در زیر نور پلاریزه به رنگ بژ تا خاکستری دیده میشوند، در حالی که بلورهای نمک یا هالیت[11] به علت اینکه زاویه بلور 90 درجه دارند به اصطلاح خاموش میشوند یعنی تیره هستند و دیده نمیشوند. زاویه بلور کلسیت 120 درجه است به همین علت زیر نور پلاریزه به رنگ بژ یا خاکستری دیده میشوند زیرا میتوانند نور را از خود عبور دهند (شکل 5).
شناسایی مولکولی و رسم درخت فیلوژنتیکی: برای شناسایی مولکولی جدایهها، ابتدا از آنها بیومس گرفته شد. استخراج DNA به روش جوشاندن انجام شد و واکنش PCR با پرایمرهای عمومی 27F
(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') و 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGCTT-3') با برنامه (دناتوراسیون اولیه 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه در یک چرخه، دناتوراسیون 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه در 30 چرخه، اتصال 56 درجه سانتیگراد به مدت 50 ثانیه در 30 چرخه، گسترش 72 درجه سانتیگراد به مدت 50 ثانیه در 30 چرخه و گسترش نهایی به مدت 7 دقیقه در یک چرخه) انجام شد. محصول PCR برای تعیین توالی از طریق شرکت ژن فن‌آوران به شرکت ماکروژن[13] تحویل داده شد و توالی بهدست آمده با استفاده از نرم افزار کرماس پرو [14]4/1 اصلاح شد. سپس، با استفاده از ابزار بلاست[15] توالی با توالیهای ثبت شده در پایگاههای داده اطلاعات ژنوم NCBI و Eztaxon مقایسه و میزان شباهت آن با سویه‌های مختلف ثبت شده تعیین شد (31).
تحلیل فیلوژنتیک سویه‌های منتخب و سویه‌های مشابه آن با استفاده از نرم افزارهای Clustal X2، Bioedit و Mega6 انجام شد و شکل 6 فیلوژنتیک با استفاده از روش‌های Neighbor-joining انجام گرفت (32). بررسی میزان اعتبار شاخهها در درخت رسم شده با استفاده از الگوریتم BootstrapAnalysis و با 1000 بار نمونهگیری انجام شد (33 و 34).
نتایج.
مقاطع تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان بررسی شدند و سپس، تصویر SEM از نمونههای مناسب گرفته شد (شکل 4 تا 9).
شکل 4- تصاویر نمونه سنگ RS-1 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) پیزوئیدها دارای الگوی رسوبی دایرهای متحد المرکز هستند، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به شکل گنیدهایی به رنگ بژ دیده می‌شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که دیاتومهها به خوبی دیده میشوند.
شکل 5- تصاویر نمونه سنگ RS-2 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه دارای الگوی رسوبی لایهای است ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که ترکیبات آهن به رنگ قرمز و ترکیبات آلی به رنگ قهوهای و سیاه دیده می‌شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگ که باکتریهای باسیلی شکل به وضوح دیده می‌شود.
شکل 6- تصاویر نمونه سنگ RS-3 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) الگوی رسوبی لایهای در نمونه دیده می‌شود و همچنین رسوبات آهن دار که به رنگ قرمز دیده میشوند، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که ترکیبات آهن دار به رنگ قرمز در کنار بلورهای کلسیت به رنگ بژ دیده میشوند و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که بلورهای کلسیت دیده شده و همچنین باکتریهای کوکسی شکل دیده میشوند.
شکل 7- تصاویر نمونه سنگ RS-4 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه دارای الگوی رسوبی لایهای بوده و روی سنگ نشانههایی از رسوبات ثانویه و همچنین فعالیت ارگانیسمها دیده می‌شود، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به رنگ بژ، رسوبات آهن به رنگ قرمز دیده میشوند، زمینه سیاه رنگ به علت استفاده از چسب اپوکسی است.
شکل 8- تصاویر نمونه سنگ RS-5 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) پیزوئیدها دارای الگوی رسوبی دایرهای متحد المرکز هستند،
ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به شکل گنبدهایی به رنگ بژ دیده می‌شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که باکتری کوکسی شگل در نمونه دیده می‌شود.
شکل 9- تصاویر نمونه سنگ RS-6 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه الگوی رسوبی لایهای داشته و روی آن رنگهای سیاه دیده می‌شود که به علت فعالیت ارگانیسمهایی مثل جلبکها و گلسنگها است، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به رنگ بژ دیده می‌شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی.
146 جدایهای که در مرحله جداسازی بهدست آمده بود بر روی محیط B4 کشت داده و پس از یک ماه بررسی شدند. مشاهده شد که 5 جدایه Bss-3، Bsw-28d، Bss-11a، Bsw-1c1 و Bsw-39b توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند (شکل 10). میزان شباهت آنها به نزدیکترین تاکسون در جدول 3 آورده شده است.
شکل 10- مشاهده بیومس میکروبی با میکروسکوپ نوری (شکل الف) و میکروسکوپ پلاریزان (شکل ب)، در شکل ب مکعبهای نمک در نور پلاریزه به رنگ تیره دیده میشوند. رسوب کربنات کلسیم در زیر میکروسکوپ پلاریزان به رنگ بژ و خاکستری دیده می‌شود که شکل ب نمایان است و با فلش نشان داده شده است. در مرکز آن مکعبهای مشکی رنگ هالیت نمایان است.
جدول 3- ویژگیهای سویههایی که توانایی رسوب کلسیت در محیط B4 را داشتنند
|
نام سویه |
تاکسون مشابه |
درصد شباهت |
واکنش گرم |
مورفولوژی |
|
Bss-3 |
Labrenzia aggregate IAM12614T |
6/99 |
منفی |
باسیل |
|
Bss-11a |
Bacillus cohenii DSM6307T |
7/99 |
مثبت |
باسیل |
|
Bsw-1c1 |
Bacillus safensis FO-036bT |
9/99 |
مثبت |
باسیل |
|
Bsw-28d |
Marinobacter flavimaris SW-145T |
100 |
منفی |
باسیل |
|
Bsw-39b |
Marinobater adhaerens HP15T |
100 |
منفی |
باسیل |
شکل 11- درخت فیلوژنتیک مربوط به سویه مربوط به سویه‌های رسوب دهنده کربنات کلسیم با استفاده از روش Neighbor-joining.
ضریب بوت استرپ 1000 و Ferroplasmaacidarmanusfer1 به عنوان برون گروه استفاده شده است.
در بین این سویهها، این توانایی برای نخستین بار است که برای Bss-3 گزارش شده است.
درخت فیلوژنی سویهها با روش نیبر جوینینگ[16] و ضریب بوت استرپ[17] 1000 رسم شد.
Ferroplasmaacidarmanusfer1 به عنوان برون گروه انتخاب شد و در شکل 11 آورده شده است.
سویه Bss-3 برای انتخاب دمای مناسب رسوبگذاری انتخاب شد و آزمایش نشان داد که دمای مناسب 30 درجه سانتیگراد است (شکل 12).
سپس، میزان رسوب و تغییرات اسیدیته برای 5 سویه در دمای 30 درجه سانتیگراد در 21 روز بهدست آورده شد (شکل 13 و 14).
شکل 12- میزان رسوب کربنات کلسیم در 4 دمای 15، 20، 30 و 40 درجه سانتیگراد برای سویه Bss-3، نتایج نشان میدهد که مناسبترین دما 30 درجه سانتیگراد است که برای انجام آزمایشهای بعدی استفاده شد، ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.
شکل 13- تغییرات اسیدیته محیط کشت 4B مایع برای سویه‌های رسوب دهنده کننده کربنات کلسیم، ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.
شکل 14- تغییرات رسوب کربنات کلسیم در محیط کشت B4 مایع برای سویه‌های رسوب دهنده کربنات کلسیم ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.
بحث و نتیجه گیری.
در ابتدا توالی لایههای سنگهای رسوبی منطقه بررسی شد (شکل 2)، لایههای سنگی مربوط به دوران سوم زمین‌شناسی، دوره کواترنری و سری پلیوستوسن و پلیوسن هستند که مربوط به 6/1 میلیون سال پیش است. بیشتر تراورتنها در این دوره شکل گرفته اند که با دادههای قبلی مطابقت دارد (1). سپس، موقعیت مکانی و زمانی چشمه بادآب سورت مشخص شد (شکل 3). همانطور که مشاهده می‌شود، چشمه محدوده کوچکی دارد و سرچشمههای قدیمی هم در کنار آن دیده میشوند. زمانی که تشکیل رسوبات مانع از خارج شدن آب نشود چشمه به فعالیت خود ادامه میدهد و در نهایت، با مسدود شدن راه خروج آب چشمه از فعالیت میافتد (شکل 1، ب) در شکلهای 2 و 3 گسلها و شکستگیهایی دیده می‌شود. این نشان دهنده آن است این منطقه از نظر فعالیت تکتونیکی منطقه فعالی است به همین علت ترتیب لایهها در منطقه یکسان نیست (1).
سرچشمهها میتوانند از دو منشا باشند. یا از لایههای آهکی و دولومیتی باشند و یا از تودههای تخریبی[xviii] منشا گرفته باشند. بر همین اساس ترکیب یونی متفاوت خواهد شد. سرچشمههایی که منشا دولومیتی و آهکی داشته باشند، غنی از کلسیم و منیزیم هستند و اسیدیته قلیایی دارند که پتانسیل رسوب کربنات کلسیم در این حالت بیشتر است. چشمههایی سنگهای میزبان آنها از نوع ماسه سنگی و شیلی است، غنی از گوگرد، ذغال، آهن و سیلیس هستند و به علت وجود گوگرد اسیدی می‌شود. سرچشمه غربی این شرایط را دارد، البته اسیدی بودن میتواند به علت CO2 باشد که میتواند منشا کربناتی داشته باشد. دادههای تحلیل یونی (جدول 1) این موضوع را تأیید میکند. این دادهها نشان میدهد که سرچشمه شرقی از سنگ منشأهای آهکی، و سرچشمه غربی از سنگ میزبان شیلی سرچشمه گرفته اند. رنگ قرمز چشمه به علت وجود ترکیبات آهن است که منشا تخریبی دارد و رنگ سیاه ناشی از حضور سولفید آهن FeS است که در شرایط بی هوازی توسط فعالیت باکتریهایی مثل SRBها تولید میشوند. نتایج تحلیل نشان میدهد که هر دو سرچشمه حاوی آهن هستند که رنگ قرمز چشمه را تأیید میکند. در سرچشمه غربی ابتدا آهن رسوب کرده و رسوبات بعدی خاکستری رنگ دیده میشوند، به این علت که ترکیبات آهن زودتر رسوب میکنند. با توجه به اینکه فاصله کمی بین دو سرچشمه است می‌توان نتیجه گرفت که منشا آب سرچشمهها متفاوت بوده و اینکه لایههای سنگی مسیر عبوری آبهای زیرزمینی سبب شده تا ترکیب یونی تغییر کند.
بررسی رابطه میکروب- محیط در ابتدا با روش میکرسکوپی انجام شد نتایج در شکل 4 تا 9 آمده است. الگوی رسوبی سنگها به شکل لایهای (RS-2,3,4) و دایرهای متحدالمرکز (RS-1,5) بودند که به (RS-1,5) پیزوئید گفته می‌شود. اینها در حوضچهها تشکیل میشوند و نیاز به یک هسته اولیه برای تشکیل و گسترش دارند (2) که میکروارگانیسمها ممکن است این نقش را ایفا کنند. در شکل 6 (RS-3) لایههایی به طور هماهنگ وجود دارد که نشان دهنده تغییرات روزانه بوده است (35)، این در شکل 4 هم دیده می‌شود که این به علت فعالیت سیانوباکترهاست. آنها با جذب کربن دی اکسید شرایط را برای رسوب یافتن کلسیت فراهم میآورند (36). همانطور که مشاهده می‌شود لایههای رسوبی میتوانند به شکل دایرهای متحدالمرکز و لایههای روی هم باشد (شکل 4 و 6)، این نشان از شرایط تشکیل میدهد به این شکل که اگر به صورت لایههای متحدالمرکز باشد، نشان میدهد هسته اولیه وجود داشته و این هسته دارای حرکتی روبه جلو و عقب بوده. ولی زمانی که لایهها روی هم باشد و حلقهای نباشد، به این معناست که سطحی برای رسوب وجود داشته و این سطح ثابت بوده است.
در شکل 4 و تصویر پلاریزان (RS-1) رسوبات گنبدی (هرمی) شکل کربنات کلسیم دیده می‌شود، که به رنگ بژ دیده می‌شود. هرچه اینها شفافتر باشند نشان میدهد جنس رسوبات و سیمان شباهت بیشتری به هم داشتهاند. رسوبات کلسیت را می‌توان در شکل 8 و 9 (RS-5 و RS-6) نیز مشاهده کرد. در تصویر پلاریزان شکل 7 ((RS-4 بلورهای کلسیت در کنار رسوبات دیگر دیده می‌شود این رسوبات با رنگهای مختلف نیلی، قرمز دیده می‌شود، رسوبات قرمز رنگ به علت وجود آهن در ترکیبات آنهاست.
در تصویر پلاریزان شکل 5 و 6 (RS-2 و RS-3) دایرههای قرمز رنگ دیده می‌شود، اینها رسوبات آهن هستند. البته نواحی قهوهای رنگ میتواند به علت وجود ترکیبات آلی (سیانوباکترها و جلبک ها) باشد. در مقاطع نازک میکروسکوپی در نور پلاریزان دایرههای سیاه رنگ هم دیده می‌شود که این به علت حضور کاربراندوم است. این پودر زمان ساییدن لایه نازک سنگ استفاده می‌شود. در لام ممکن است فضاهای خالی به رنگ سیاه دیده شود (RS-3,4، شکل 6 و 7) که این به علت استفاده از چسب است، به طور معمول برخی از سنگهای کربناته جنس سستی دارند که برای جدا نشدن و از هم پاشیده نشدن بافت سنگ با چسب اپوکسی اشباع میشوند. قطر لایهها کمتر از 2 میلیمتر است (RS-1، شکل 4) که نشان از سرعت بالای رسوبگذاری در این چشمه است.
در شکل 7 (RS-4) دیده می‌شود که لایههای تشکیل شده دارای رسوبات آهن هستند که میتواند به علت وجود باکتریهای اکسیدکننده آهن باشد. عکس SEM نیز وجود باکتریهای کروی را تایید میکند (20).
در بررسی تاثیرگذاری میکروارگانیسمها در رسوبگذاری با توجه به عکسهای گرفته شده از میکرسکوپ الکترونی، باکتریها و دیاتومهها در بلورهای کلسیت مشاهده میشوند، این نشان میدهد که میکروارگانیسمها میتوانند به عنوان هسته اولیه تشکیل بلور عمل کنند و با تولید پلیساکاریدهای خارج سلولی سبب پیشرفت بلور شوند که در مطالعات دیگر نیز گزارش شده است (22).
در پژوهش حاضر، در بررسی با استفاده از کشت میکروبی روی تأثیر باکتریهای هتروتروف در رسوبگذاری کلسیت، مشخص شد که 5 سویه Bss-3، Bsw-28d و Bsw-39b، Bss-11a و Bsw-1c1 توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند. این 5 سویه بیشترین شباهت را به تاکسونهایLabrenzia aggregate IAM 12614T، Marinobacter flavimaris SW-145T، MarinobateradhaerensHP15T، BacilluscoheniiDSM6307T و BacillussafensisFO-036bT داشتند. در مطالعات پیشین مشخص شده که باکتریهای Bacillus، Shewanella، Pseudomonas و Micrococcus در رسوبگذاری تاثیر دارند (37) (38) ولی در مورد سویه Bss-3، نخستین بار است که این توانایی برای آن گزارش شده است. ویژگیهای ریختشناختی و درخت فیلوژنی سویه‌های رسوب دهنده کربنات کلسیم در جدول 3 و شکل 11 نشان میدهد که سویه‌های جداشده، همگی شکل باسیلی داشته و 3 سویه گرم منفی بودهاند.
پس از تایید وجود رسوب کربنات کلسیم (شکل 10) ابتدا دمای مناسب تولید رسوب برای سویه Bss-3 بهدست آمد که دمای 30 درجه بود (شکل 11)، میزان تولید بلور در دمای پایین کم است که این را می‌توان به واکنشهای رشد ربط داد. بیشترین میزان تولید بین دماهای 20 و 30 درجه است که اشاره به دمای مناسب رشد دارد و اینکه دمای آب و چشمه هم بین 18 تا 25 درجه سانتیگراد بود که تایید کننده دمای مناسب رشد است.
سپس، میزان تولید رسوب و تغییرات اسیدیته توسط سویهها در دمای 30 درجه محاسبه شد. با توجه به دادههای بهدست آمده مشاهده شد که در همان هفته اول به بالاترین میزان تولید کلسیت میرسد و پس از آن میزان آن کم می‌شود که این میتواند با متابولیسم سلول ربط داشته باشد به همین علت باید تغییرات سلولهای زنده و دارای فعالیت با این دادهها همراه شود.
دادههای تغییرات اسیدیته (شکل 13) نشان میدهد که در نسبت با اسیدیته اولیه تغییرات متفاوت بوده است (اسیدیته قبل از اتوکلاو روی 8 تنظیم شد که پس از اتوکلاو روی 4/7 برای نمک 3 درصد و 6/7 برای نمک 5 درصد مشاهده شد). سویه Bss-3 پس از یک هفته اسیدیته را روی 8 برده و این افزایش تا اسیدیته حدود 4/8 ادامه پیدا میکند. در صورتی که دو سویه Bsw-28d و Bsw-39b، اسیدیته محیطشان قلیاییتر شده و حتی اسیدیته 9 هم برای روز 21 مشاهده شد. این در حالی است که اسیدیته محیط دو سویه Bsw-1c1 و Bss-11a به سمت اسیدی شدن حرکت کرده و تا حدود 5/5 برای سویه Bsw-1c1 مشاهده و گزارش شد، این نتایج با دادههای زامارنو[xix] مطابقت دارد. در این مطالعه تغییرات اسیدیته هم افزایش و هم کاهش را نشان میدهد ولی میزان تغییرات کمتر از دادههای این پژوهش است (29). با توجه به اینکه رسوب کلسیت با تغییرات اسیدیته که توسط متابولیسم باکتریایی انجام می‌شود ربط دارد (9)، می‌توان نتیجه گرفت که سه سویه Bss-3، Bsw-28d و Bsw-39b با تغییر اسیدیته سبب رسوب کلسیت میشوند، ولی دو سویه Bss-11a و Bsw-1c1 از راه دیگری سبب رسوب کلسیت میشوند. با توجه به اینکه پس از 21 روز سلولها وارد فاز سکون و مرگ میشوند احتمالا این تغییرات متابولیکی سلولها سبب کاهش میزان رسوب کلسیت میشوند به طوری که اندازه بلورهای کلسیت را تغییر میدهند (29). در مطالعه زامارنو در تمام سویهها مقدار سلولهای فعال از روز اول تا هفته اول افزایش یافته بود و سپس، تا هفته سوم کاهش را نشان میداد (29).
نمودار تغییرات رسوب کربنات کلسیم در طول 21 روز (شکل 14) نشان میدهد که دو سویه Bss-11a و Bsw-1c1 مقدار کمی تولید میکنند که این میتواند به علت اسیدی شدن محیط باشد. دو سویه Bsw-28d و Bsw-39b بیشترین میزان رسوب را داشته، 6/45 و 5/37 میلیگرم که این مقادیر در همان هفته اول بوده و در روزهای بعد میزان رسوب کاهش مییابد. سویه Bss-3 بیشترین میزان رسوب را در هفته دوم داشته، 6/29 میلیگرم که باز هم در هفته آخر این میزان کاهش مییابد. این دادهها در ابتدا نشان میدهد که میزان تولید رسوب رابطه مستقیم با فعالیت متابولیکی سلولها دارد زیرا سلولها با گذشت زمان از فاز لگاریتمی رشد خارج شده و وارد فاز سکون و مرگ میشوند. البته اسیدیته محیط باز هم افزایش مییابد که این نشان دهنده تمام شدن ماده غذایی و استفاده سلولها از ذخیرههای پروتئینی است که این سبب افزایش اسیدیته شده ولی سبب کاهش رسوب می‌شود که علت آن نامشخص است. البته این دادهها برای تایید بیشتر باید با آزمایشهای دیگر مانند تحلیل XRD و SEM تایید و میزان تغییرات سلولهای دارای فعالیت (سلولهای زنده) و تغییرات فاز رشد انجام شود. همچنین، آزمایش میتواند در کشت ثابت و مداوم مقایسه شود.
دادههای بهدست آمده از پژوهش نشان میدهد محیط و میکروبها در کنار هم تکامل مییابند. محیط و میکروارگانیسمها از ابتدای حیات در کنار هم بودهاند و سبب تکامل یکدیگر شدهاند و برای ثبات و ماندگاری هر دو باید در کنار هم وجود داشته باشند. بنابراین، برای حفظ زیستگاههای طبیعی باید این نکته را در نظر داشته باشیم. با افزایش فعالیتهای بشری و دست ورزی زیستگاهها که سبب تغییر شرایط محیطی زیستگاهها و متعاقب آن تغییر جامعه میکروبی می‌شود در آینده نه چندان دور میکروارگانیسمهای سازگاریافته با محیط از بین رفته و میکروارگانیسمهای دیگر جایگزین میشوند که این حفاظت زیستگاه را به خطر میاندازد. البته حیات انسان هم وابستگی شدیدی به حیات اکوسیستم اطراف دارد. در انتها باید بیان کرد که باکتریهای رسوب دهنده کلسیت کاربردهای بیوتکنولوژیک زیادی دارند (15- 19) و از آنها می‌توان در احیای محیطهای کربناته از فعالیت افتاده استفاده کرد (22).
نگارندگان از همکاران خود در آزمایشگاه دانشگاه تهران و مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران بخش میکروبی تشکر و قدردانی میکنند.
[1]- Tivertion
[2]- Biologically-induced mineralization
[3]- Biologically-influenced mineralization
[4]- Alkanity engine
[5]- Olympus
[6]-Corel Draw X6
[7]- Google earth
[8]- Surfer 10
[9]- Perkin Elmer 100
[10]- Moderate halophilic medium
[11]- Halite (NaCl)
[12]- در مقالههای بررسی شده واحد اندازهگیری کلسیت به شکل میلیگرم بود که به علت نامشخص بودن در این پژوهش از واحد میلیگرم بر میلیلیتر استفاده شد. به علت مناسب نبودن روش ممکن است در محاسبه کلسیت اشتباهی رخ دهد که اجتنابتاپذیر است، البته این روش بیشتر برای مقایسه کربنات کلسیم در بین سویههاست و ضریب خطا برای همه محاسبه می‌شود.
[13]- Macrogene
[14]- Chromas Pro 1.4
[15]- BLAST
[16]- Neighbor-joining
[17]- Boot Strap
[xviii]- Shale
[xix]- ZamarreŇo
)