نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران
2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان
3 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Oil is one of the most important energy sources that contain variety of organosulfur compounds that are combustible and can produce sulfur dioxide which will cause pollution over the atmosphere and the soil. Dibenzothiophene (DBT) is often used as a model for biodesulfurization studies and surfactant Tween80 increases the solubility of DBT in water that leads to higher consumption by microorganisms.
Materials and methods: DBT specific UV spectrophotometry at a wavelength of 323 nm was used to evaluate the ability of isolated Exophiala spinifera fungus in removal of DBT. The effect of various concentrations of surfactant Tween80 on the growth of the fungus and DBT utilization was studied.
Results: Exophiala spinifera was able to remove 100% DBT after 7 days of incubation at 30 ° C and 180 rpm shaking. The effect of different concentrations of surfactant Tween80 on growth and DBT utilization by this fungus was examined and it was observed that the presence of surfactant in the culture medium increased the growth and removal of DBT, therefore the amount of DBT utilized with 0.4% concentration of the surfactant was about 30% more than that utilized without surfactant. However, higher concentrations of surfactant Tween80 decreased the growth and consumption of DBT by fungi.
Discussion and conclusion: Exophiala spinifera was isolated from oil contaminated soil and able to utilize toxic compound DBT as a sulfur source in the presence of other carbon sources such as glucose. So this isolated strain could be a good candidate for the petroleum desulfurization and it is the first report about desulfurization of DBT by fungus Exophiala spinifera. Growth and removal of DBT by fungus increased in the presence of surfactant Tween80. It can be concluded that the surfactant increases the total DBT transfer between the organic and aqueous phases and has a potential application in DBT bioremediation system by the studied fungus biocatalyst.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
پس از غذا، سوخت مهمترین منبع انرژی بشر است بهطوری که 85 درصد انرژی از سوخت‌های فسیلی، 8 درصد از انرژی هسته‌ای و 7 درصد از منابع دیگر که بهطور کلی برق آبی و چوب است، تأمین می‌شود. زغال‌سنگ، نفت و گاز طبیعی سه سوخت اصلی هستند که نفت40 درصد، زغال سنگ حدود 24 درصد و گاز طبیعی هم 12 درصد از مصرف کل جهان را در بر می‌گیرند (1). بر این اساس، نفت مهمترین این سوخت‌هاست که بهطور کلی از هیدروکربن تشکیل شده است که پس از کربن و هیدروژن، گوگرد سومین عنصر فراوان در آن است (2).
استفاده از سوخت‌های فسیلی به عنوان منبع انرژی موجب آلودگی محیطی با ترکیباتی با منشا غیر زیستی شده است زیرا این سوخت‌های فسیلی محتوی گوگرد هستند که سوختن مستقیم آن‌ها موجب آزادسازی مقدار فراوانی از اکسید گوگرد به اتمسفر می‌شود (3). اکسید گوگرد تولیدی مسؤول کیفیت بد هوا، باران اسیدی و کاهش لایه اوزون است (4). علاوه بر این، اکسید گوگرد موجب به خطر افتادن سلامتی انسان می‌شود به گونه‌ای که مشکلاتی از قبیل: سرطان دستگاه تنفسی، بیماری‌های قلبی و تنفسی را به همراه خود دارد (5).
روش رایج برای حذف گوگرد نفت در پالایشگاه‌ها در حال حاضر به شکل فیزیکی- شیمیایی[i] (HDS) است که در این روش اتم گوگرد در حضور گاز هیدروژن و کاتالیزور به سولفید هیدروژن احیا می‌شود و بسته به میزان گوگردزدایی و نوع هیدروکربن HDS در درجه حرارت 200 تا 425 درجه سانتیگراد و فشار 150 تا250 پوند بر اینچ مربع گاز هیدروژن انجام می‌شود (6 و 7)، اگرچه در فرآیند HDS ترکیبات گوگردی از قبیل: تیول، سولفید و دی‌سولفید بهطور مؤثری حذف می‌شوند اما بسیاری از ترکیبات آروماتیک گوگرددار از قبیل: دیبنزوتیوفن[ii] (DBT) به این فرآیند مقاوم هستند و پس از گوگردزدایی در نفت باقی می‌مانند (8). بنابراین، به علت مقاومت بالای ترکیبات تیوفنی و ترکیبات هتروسیکلیک آروماتیک گوگرددار به HDS و همچنین، هزینه بالای آن برای ایجاد فشار و دمای زیاد، گوگرددزایی زیستی[iii] (BDS) به عنوان یک روش مکمل و یا جایگزین فرآیند گوگردزدایی هیدروژنی استفاده شده است (9).
امروزه پژوهشهای بسیاری برای توسعه گوگردزدایی زیستی انجام شده است که در تمامی این پژوهشها از DBT به عنوان ترکیب مدل استفاده شده است (10).
تا به امروز چندین جنس که دارای فعالیت گوگردزدایی هستند گزارش شده است که بیشتر آن‌ها به جنس رودوکوکوس متعلق هستند که شاخص‌ترین آن‌ها رودوکوکوس اریتروپولیس سویه IGTS8 است (11). از میان یوکاریوت‌ها هم قارچ Cunninghamella elegans قادر به گوگردزدایی DBT است. این قارچ DBT را به DBT-5-oxide و DBT-5-dioxide بدون تولید بی‌فنیل تبدیل می‌کند. علاوه بر این، قارچ Paecylomyces موجب اکسیداسیون اختصاصی DBT می‌شود و در نهایت، دی‌هیدروکسی‌بی‌فنیل تولید می‌شود (12).
سورفکتانت‌ها ترکیباتی آمفی فیلیک (دارای هر دو ویژگی هیدروفوبیک و هیدروفیلیک) هستند که به علت داشتن ویژگی‌های برجسته و مطلوبی از قبیل: افزایش حلالیت، کاهش کشش سطحی و...... در صنعت استفاده می‌شوند. گزارش‌های محدودی در مورد کاربرد سورفکتانت در گوگردزدایی توسط میکروارگانیسم‌ها وجود دارد (13). مارزونا[iv] و همکارانش در سال 1997 دریافتند که اتصال DBT و بنزوتیوفن به سورفکتانت سیکلودکسترین حلالیت این ترکیبات را در آب افزایش می‌دهد (14).
هدف از پژوهش حاضر، بررسی توانایی مصرف DBT در قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده از خاک آلوده به نفت مناطق حفاری چاه در خوزستان و مطالعه اثر سورفکتانت توئین 80 بر رشد و فعالیت مصرف DBT این قارچ است.
مواد و روش ها.
مواد شیمیایی: تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش ساخت کارخانجات سیگما و مرک برای کاربرد آزمایشگاهی است.
محیط کشت پایه معدنی[v] BSM: این محیط کشت حاوی 4 گرم Na2HPO4، 4 گرم KH2PO4، 2 گرمNH4Cl، 2/0 گرم MgCl2.6H2O، 001/0 گرم CaCl2.2H2O، و 001/0 گرم FeCl3.6H2O، در یک لیتر آب دو بار تقطیر بوده است. گلوکز به میزان 1 گرم در لیتر به آن اضافه و اسیدیته محیط با استفاده از HCl 6 نرمال بین 6 تا 7/6 تنظیم شد (15).
بررسی مصرف DBT: در این قسمت ابتدا قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا (با شماره دسترسی KC952672) در محیط BSM حاوی 1 درصد گلوکز به عنوان منبع کربن و 3/0 میلیمولار از DBT حل شده در اتانول به عنوان منبع گوگرد کشت و در یک انکوباتور شیکردار با 180 دور در دقیقه و دمای 30 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا زمانی که یک سوسپانسیون کنیدی با کدورت معادل 5/0 بهدست آمد و سپس، 1 میلی‌لیتر از این سوسپانسیون به 50 میلی‌لیتر از محیط کشت BSM حاوی 1 درصد گلوکز و 3/0 میلیمولار DBT در ارلن 250 میلیلیتری اضافه شد و انکوباسیون به مدت 14 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد روی شیکر180 دور در دقیقه انجام شد. در زمان‌های صفر، 3، 5، 7، 10 و 14 روز برای بررسی مصرف و کاهش غلظت DBT از محیط کشت یاد شده نمونهبرداری شد. به این شکل که 3 میلی‌لیتر از محیط کشت به لوله آزمایش منتقل و اسیدیته آن با استفاده از اسید کلریدریک 6 نرمال اسیدی شد و سپس، به میزان حجم مساوی به آن اتیل استات اضافه شد. در نهایت، جذب UV نمونه‌های استخراج شده در طول موج 200 تا 600 نانومتر بهدست آمده، ماکزیمم جذب اختصاصی DBT در طول موج 323 نانومتر تعیین شد و با استفاده از نمودار استاندارد غلظت DBT باقیمانده در محیط بهدست آمد (15 و 16).
.بررسی اثر سورفکتانت Tween80 بر رشد قارچ:غلظت‌های مختلف از سورفکتانت Tween80 به محیط BSM حاوی 3/0 میلیمولار DBT و 1 درصد گلوکز افزوده و سپس، محیط در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد. پس از سرد شدن محیط از سوسپانسیون کنیدی با کدورت معادل 5/0 به میزان 1 میلی‌لیتر به تمامی ارلن‌ها اضافه شد. ارلن‌ها در دمای 30 درجه سانتیگراد با 180 دور در دقیقه انکوبه و بررسی رشد پس از 96 ساعت انجام شد. به این شکل که 1 میلی‌لیتر از تمامی ارلن‌ها در زمان 96 ساعت سانتریفیوژ، رسوب حاصل به مدت 24 ساعت در داخل آون با دمای 60 درجه سانتیگراد انکوبه و در نهایت، وزن توده‌های سلولی محاسبه شد (17 و 27).
.بررسی اثر سورفکتانت Tween80 بر مصرف DBT:برای انجام این بخش، از ارلن‌های حاوی غلظت‌های مختلف سورفکتانت پس از 96 ساعت انکوباسیون، به میزان سه میلی‌لیتر برداشت و به حجم مساوی به آن اتیل استات اضافه شد. سپس، به منظور جدا کردن فاز آلی سانتریفیوژ به مدت 5 دقیقه در 3000 دور در دقیقه انجام، پس از آن فاز آلی جدا و کاهش میزان DBT با دستگاه اسپکتروفتومتر UV در طول موج 200 تا 600 نانومتر بررسی شد (17 و 27). نمونه‌های شاهد شامل BSM حاوی DBT بدون قارچ و محیط BSM حاوی قارچ بدون سورفکتانت در کنار نمونه‌های آزمون استفاده شد.
تحلیل آماری نتایج:تمام آزمایش‌ها به شکل دو بار تکرار انجام شده و نتایج، میانگین تکرار‌هاست. معنادار بودن و نبودن تغییرات عاملهای یاد شده بر رشد و فعالیت گوگردزدایی قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا با استفاده از نرمافزار16.0 SPSS، روش One Way Anova و آزمون دانکن بررسی شد.
نتایج.
بررسی مصرف DBT: قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده از خاک آلوده به نفت (17) قادر به رشد بر DBT به عنوان منبع گوگرد و حذف آن بود، بهطوری که با بررسی جذب UV مربوط به DBT در طول موج 323 نانومتر در زمان‌های مختلف مشاهده شد که پس از 168 ساعت، جذب اختصاصی مربوط به DBT در طول موج 323 نانومتر از بین رفته است. این امر بیانگر مصرف کامل این ترکیب سمی توسط قارچ یاد شده است. در شکل 1 نتیجه بررسی حذف DBT توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا نشان داده شده است.
A
B
C
شکل 1- طیف جذبی قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در محیط BSM حاوی 1درصد گلوکز و 3/0 میلیمولار DBT طی زمان‌های مختلف انکوباسیون با شیکر rpm 180 و دمای 30 درجه سانتیگراد.
A: لحظه صفر، B: 96 ساعت، C: 168 ساعت.
همانطور که در شکل 1 مشاهده می‌شود قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده، قادر به مصرف کامل DBT موجود در محیط کشت به عنوان تنها منبع گوگرد است، بهطوری که با مقایسه شکل‌های A 1 و
B 1 و C 1 مشاهده می‌شود که قارچ یاد شده پس از 96 ساعت انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm 180 قادر به مصرف 67 درصد از DBT موجود در محیط کشت و پس از گذشت 7 روز از انکوباسیون در شرایط یاد شده، موجب حذف کامل DBT در محیط کشت شد. بهطوری که پیک مربوط به DBT در شکل C1 مشاهده نمی‌شود و این امر بیانگر مصرف کامل آن توسط قارچ جداسازی شده است.
اثر سورفکتانتTween80 بر رشد و گوگردزدایی: اثر سورفکتانت بر رشد قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در شکل 2 آورده شده است. همانطور که در شکل مشاهده می‌شود میزان رشد قارچ بر حسب میلیگرم بر میلی‌لیتر وزن خشک سلول (18) (DCW mg/ml) طی 4 روز انکوباسیون در حضور غلظت‌های مختلف سورفکتانت نسبت به شاهد که فاقد سورفکتانت میباشد، افزایش یافته است. بهطوری که بیشترین میزان رشد در حضور 4/0درصد سورفکتانت توئین 80 است. اما میزان رشد در غلظت 1 درصد از سورفکتانت نسبت به شاهد کمتر شده است. بنابراین، می‌توان استنباط کرد که افزایش بیش از حد سورفکتانت موجب کاهش رشد قارچ یاد شده می‌شود.
میزان رشد در حضور غلظت‌های مختلف سورفکتانت Tween80 نسبت به شاهد با تحلیل دانکن دارای تفاوت معناداری است (در سطح معنادار 05/0).
شکل 2- اثر غلظت‌های مختلف سورفکتانت Tween80 بر رشد قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در محیط BSM حاوی 1درصد گلوکز و 3/0 میلیمولار DBT طی 4 روز انکوباسیون با شیکر rpm 180 و دمای 30 درجه سانتیگراد. (مقادیر با حروف متفاوت نسبت به هم اختلاف معنادار ندارند ولی مقادیر با حروف متفاوت دارای اختلاف معناداری هستند به گونه‌ای که غلظت 2/0 و 4/0 دارای اختلاف معناداری نیستند. به این معنا که افزایش غلظت بیش از این بازه افزایش چشمگیری را در فعالیت قارچ یاد شده به همراه نخواهد داشت)
اثر سورفکتانت توئین 80 بر مصرف DBT توسط قارچ جداسازی شده در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان می‌دهد که میزان کاهش غلظت DBT و مصرف آن توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در حضور سورفکتانت Tween80 نسبت به شاهد فاقد سورفکتانت بیشتر است. با بهکارگیری تحلیل دانکن مشاهده شد که درصد حذف DBT در حضور غلظت‌های 1/0، 2/0 و 4/0 درصد از سورفکتانت نسبت به شاهد دارای سطح معناداری هستند. اما غلظت 1 درصد سورفکتانت توئین 80 نسبت به شاهد فاقد سورفکتانت، معنادار نیست. بنابراین، می‌توان گفت وجود سورفکتانت در محیط موجب افزایش مصرف DBT می‌شود. اما غلظت‌های بالای آن کاهش فعالیت قارچ را سبب می‌شود بهطوری که میزان مصرف این ترکیب سمی در نبود سورفکتانت نسبت به غلظت‌های بسیار بالای آن بیشتر است.
شکل 3- اثر غلظت‌های مختلف سورفکتانت Tween80 بر میزان مصرف DBT توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا در محیط BSM حاوی 1درصد گلوکز و 3/0 میلیمولار DBT طی 4 روز انکوباسیون با شیکر rpm 180و دمای 30 درجه سانتیگراد
بحث و نتیجه گیری.
پس از کربن و هیدروژن، گوگرد سومین عنصر فراوان در نفت است و بسته به منبع از 05/0 تا 5 درصد نفت خام را شامل می‌شود. وجود ترکیبات گوگردی در نفت از نگرانی‌های بشر در دهه‌های اخیر بشمار می‌رود (19)، زیرا احتراق ترکیبات گوگرددار در سوخت‌های فسیلی همراه با تولید اکسید گوگرد بوده که نقش مهمی در ریزش باران‌های اسیدی و آلودگی هوا دارد. اما حذف گوگرد نیاز به زمان زیاد و فرآیند‌های طولانی دارد. این مسائل باعث جلب توجه به ترانسفورماسیون میکروبی ترکیبات گوگردی شده و گوگردزدایی میکروبی برای حذف گوگرد و دست‌یابی به سوخت‌هایی با مقدار پایین گوگرد استفاده شد (20 و 21). اما تاکنون بیشترین مطالعات در این زمینه بر روی باکتری‌ها انجام شده است و پژوهشهای کمتری در مورد قارچ‌ها یافت می‌شود، در حالیکه قارچ‌ها از طریق سیتوکروم P-450 و آنزیم‌های خارج سلولی خود قادر به متابولیزه کردن طیف وسیعی از مواد شیمیایی و هیدروکربن‌ها هستند. از این آنزیم‌های خارج سلولی تولید شده توسط قارچ‌ها به علت دارا بودن ویژگی‌های گسترده‌ای از قبیل: توانایی اتصال به سوبستراهایی با وزن مولکولی بالا و امکان ایجاد تغییرات شیمیایی درآن‌ها برای افزایش تحمل و پایداری، می‌توان به عنوان کاتالیزورهای زیستی استفاده کرد (22). علاوه بر این، قارچ‌ها به علت دارا بودن مزیت‌هایی از قبیل: قابلیت رشد در اسیدیته پایین و شرایط فقرغذایی (در صورتی که رشد باکتری دراین شرایط محدود می‌شود)، حمل ونقل آسان، دستکاری ژنتیکی راحت و تولید در مقیاس وسیع، می‌توانند کاندیدای مناسبی برای گوگردزدایی از نفت باشند (23). همچنین، نتایج این پژوهش نشان می‌دهد که قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا هم قادر به مصرف DBT به عنوان منبع گوگرد به شکل کومتابولیسم با سایر منابع کربنی همانند گلوکز است. این نخستین گزارش از توانایی گوگردزدایی DBT در قارچ اگزوفیالا است. فاسیون[vi] و همکارانش در سال 1991 به این نتیجه رسیدند که قارچ Paecylomyces بر روی DBT رشد کرده و طی مسیر اکسیداسیون اختصاصی گوگرد، DBT را به دی هیدروکسی بی فنیل تبدیل می‌کند (24). بنابراین، از آنجا که ایران از جمله کشور‌هایی است که دارای بالاترین مقدار ترکیبات آلی گوگرددار در ذخایر نفتی خود است، استفاده از قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا با توانایی مصرف DBT می‌تواند در پاکسازی زیستی این آلاینده بسیار راهگشا باشد.
حلالیت هیدروکربن‌های آروماتیک پلی‌سیکلیک همانند DBT در محلول‌های آبی بسیار کم بوده و دسترسی زیستی این ترکیبات یک عامل محدود کننده برای حمله قارچی و میکروبی به آنهاست و به همین منظور اضافه کردن سورفکتانت‌هایی از قبیل: توئین 80 موجب افزایش حلالیت و دسترسی زیستی این ترکیبات می‌شود (13). بهطوری که مشاهده شده است سرعت اکسیداسیون این ترکیبات توسط قارچ Bjerkandera sp. BOS55 در حضور سورفکتانت‌های مختلف 2 تا 5 برابر افزایش می‌یابد (25). همچنین، فاسیون و همکاران در پژوهش خود بر روی گوگردزدایی توسط قارچ Paecilomyces sp. TLI برای پراکندگی یکنواخت DBT در فاز آبی و افزایش گوگردزدایی آن، سورفکتانت توئین 80 را بهکار بردند (24).
در مطالعات انجام شده بر گوگردزدایی باکتریایی DBT، نتایج مشابهی مرتبط با بهکارگیری سورفکتانت‌ها در افزایش دسترسی زیستی DBT و گوگردزدایی آن بهدست آمده است که به مواردی از آن در ادامه مطالب اشاره می‌شود.
هو[vii] و همکاران اثر سورفکتانت‌ها را در افزایش گوگردزدایی بررسی کردند. آن‌ها توانستند 72 درصد از گوگرد آلی نفت خام را طی 72 ساعت با استفاده از توئین 80 توسط سودوموناس دلافیلدی سویه R-8 حذف کنند (26).
وانگ[viii] و همکاران از میان سورفکتانت‌های مورد بررسی خود شامل توئین 80، سیکلودکسترین، تریتون X100 و بریج، بیشترین توانایی حل کردن DBT را در توئین 80 تشخیص داده و آن را به عنوان سورفکتانت مناسب انتخاب کردند. این سورفکتانت، رشد کورینه باکتریوم سویه ZD-1 را به علت افزایش جذب و تجزیه DBT توسط باکتری و تامین منبع گوگرد کافی برای رشد افزایش داده است (27). اعتمادیفر[ix] و همکاران تاثیر توئین 80 را بر افزایش 27 درصدی گوگردزدایی از دیبنزوتیوفن توسط رودوکوکوس اریتروپولیس سویه R1 در غلظت 1 گرم بر لیتر از سورفکتانت با افزایش قابلیت زیستی آن نشان دادند (28).
در پژوهش حاضر نیز نتایج مشابهی با مطالعات قبلی بهدست آمد بهطوری که قارچ اگزوفیالا اسپینیفرای جداسازی شده در حضور غلظت‌های مختلف توئین 80 کشت داده شد و طبق نتایج بهدست آمده مشاهده شد که رشد و گوگردزدایی قارچ یاد شده در حضور این سورفکتانت افزایش یافته است. همانطور که قبلا اشاره شد، سورفکتانت‌ها با افزایش حلالیت DBT در آب، انتقال DBT را بین دو فاز آلی و آبی تقویت، و قابلیت دسترسی آنرا افزایش می‌دهند، اما به علت اثر متفاوتشان بر سویه‌های مختلف، بهطور متفاوتی بر گوگردزدایی اثر می‌گذارند.
در پژوهش حاضر نشان داده شده که DBT به عنوان یکی از آلودگی‌های مقاوم در سوخت‌های فسیلی توسط قارچ اگزوفیالا اسپینیفرا جداسازی شده از خاک آلوده به نفت به شکل کومتابولیسم با سایر منابع کربنی قابل مصرف است و با بهکارگیری سورفکتانت توئین 80 می‌توان میزان فعالیت این قارچ را تا 30 درصد افزایش داد. این نخستین گزارش از توانایی مصرف DBT در قارچ اگزوفیالا است. بنابراین، این قارچ می‌تواند کاندیدای مناسبی در گوگردزدایی از سوخت‌های فسیلی باشد.
)