نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری کنترل زیستی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران
2 استاد کنترل زیستی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران
3 استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشکده پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران،کرج، ایران
4 کارشناس ارشد بیماری‌شناسی گیاهی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Plant probiotic bacteria like fluorescent pseudomonads are worldly used against soil-borne pathogens through mechanisms such as production of bacterial metabolites and enzymes. These bacteria can also help plants to tolerate environmental stresses. Ectoine is a compatible solution which plays an important role in environmental osmotic stresses.
Materials and methods: Tolerance of 24 bacterial strains to salt and heat was tested and 6 tolerant strains were chosen. Then dual culture of Fusarium solani and bacteria grown in presence of ectoine and hydroxy ectoine with 3 NaCl concentrations (0, 150 and 300 mM) was done and Pseudomonas fluorescens UTPF5 was selected. Finally the effect of ectoine, hydroxyectoine and NaCl on bacterial population, lipase, protease, siderophore and hydrogen-cyanide production and biofilm formation was investigated.
Results: In 300 mM NaCl, the bacterium grown in presence of ectoines, increased the inhibition percentage 5- times more than control. NaCl had a positive effect on bacterial population in water and ectoine, hydrogen-cyanide production in all treatment and biofilm formation in ectoine and hydroxyectoine and negative effect on bacterial population in hydroxyectoine, protease and siderophore production in all treatments and biofilm formation in water. On the other hand, ectoine increased lipase and hydrogen-cyanide production and biofilm formation in 300 mM NaCl and siderophore production in 150 mM. Hydroxyectoine had similar effects with little differences.
Discussion and conclusion: Ectoine and hydroxyectoine moderate the biocontrol reduction in presence of NaCl through positive effect on lipase and hydrogen-cyanide production and biofilm formation.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
بیش از 70 سال است که روشهای کنترل زیستی بیمارگرهای گیاهی خاکزاد توسط باکتریها به عنوان یک روش جایگزین برای روشهای کنترل شیمیایی معرفی شدهاند (1). ریزوباکتریهای محرک رشد گیاه[1] در کنترل دامنه وسیعی از قارچهای بیماریزای ریشه مؤثر هستند (2). این گروه از باکتریها توانایی کلنیزه کردن ریشههای گیاه را دارند، رشد گیاه را تحریک می‌کنند و وقوع بیماریهای گیاهی را کاهش میدهند. هر سویه باکتریایی که حداقل دارای دو ویژگی از سه ویژگی یاد شده باشد در گروه ریزوباکتریهای محرک رشد گیاه قرار میگیرد (3). در میان باکتری‌هایی که این ویژگی را دارند چندین سویه[2] از سودوموناس فلورسنس به منظور کنترل زیستی بیمارگرهای خاکزاد استفاده شدهاند (4- 6). ساز وکارهای این کنترل بیشتر شامل رقابت برای مواد غذایی، تولید متابولیتهایی از قبیل سیدروفورها (7)، آنتیبیوتیکها (8)، مواد فرار (مانند سیانید هیدروژن) (9) و آنزیمهای لیز کننده خارج سلولی (10) هستند. به علاوه مشخص شده است که تشکیل بیوفیلم در باکتریها رشد گیاه را تحریک و از گیاه در برابر بیمارگرهای گیاهی محافظت می‌کند (11). نقش سیدروفور پیووردین تولید شده توسط بسیاری از گونههای سودوموناس در کنترل گونههای پیتیوم و فوزاریوم مشخص شده است (12). در شرایط "در شیشه"[3]سیانید هیدروژن تولید شده توسط کشت سودوموناس فلورسنس[4] روی محیط جامد، اثر بازدارندگی بر برخی از قارچهای بیماریزا دارد (13). یکی دیگر از نقشهای مهم باکتری‌های پروبیوتیک گیاهی[5] افزایش تحمل گیاه برای مقابله با تنشهای محیطی است (14). اکتوئین (تتراهیدرو-2-متیل-4- پیریمیدین کربوکسیلیک اسید) از مشتقات پیریمیدینها و یکآمینواسید حلقوی است که به طور طبیعی توسط باکتریها تولید می‌شود (15). این ماده که به عنوان یک اسمولیت نقش مهمی در تحمل به تنشهای اسمزی محیط ایفا می‌کند، نخستین بار در باکتری نمک دوست اکتوتیورودوسپیرا هالوکلریس[6] شناسایی و پس از آن در تعداد زیادی از باکتری‌های نمک دوست دیگر یافت شد (16). این ترکیب تا کنون در باسیلوس سوبتیلیس[7]، ایشرشیا کولی[8]، پانتوئئا اگلومرانس[9]و گونههایی از سودوموناس، برویباکتریوم و استرپتومایسس (17) دیده شده است. مشتق هیدروکسیله اکتوئین (هیدروکسیاکتوئین) نیز دارای ویژگیهای مشابه اکتوئین است. این ترکیب در باکتری‌های گرم مثبت عمومیت بیشتری دارد (18). پژوهش حاضر با هدف بررسی تأثیر اکتوئین و هیدروکسی اکتوئین خارجی بر فعالیت ضد قارچی سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5) در تنش شوری و در شرایط "در شیشه"انجام شده است. فعالیت ضد قارچی این سویه در شرایط غیر شور در مطالعات قبلی بررسی شده بود (19).
. مواد و روشها.
تهیه و نگهداری سویههای باکتری: تعداد 21 سویه باسیلوس سوبتیلیس، 1 سویه باسیلوس آمیلولیکوئیفشنس[10]و دو سویه سودوموناس فلورسنس ازکلکسیون باکتری‌های آنتاگونیست گروه گیاهپزشکی دانشگاه تهران دریافت و نگهداری شد. ویژگیهای این باکتریها در جدول 1 ثبت شده است.
جدول 1- ویژگیهای 24 سویه باکتریایی آنتاگونیست که در این پژوهش از آن‌ها استفاده شده است.
|
جنس و گونه |
محل نمونه برداری |
منبع |
نام سویه |
|
Bacillus subtillis |
قزوین |
چغندر قند |
UTB10 |
|
Bacillus subtillis |
کرمانشاه |
چغندر قند |
UTB11 |
|
Bacillus subtillis |
کرمانشاه |
چغندر قند |
UTB12 |
|
Bacillus subtillis |
کردستان |
چغندر قند |
UTB13 |
|
Bacillus subtillis |
تهران |
چغندر قند |
UTB14 |
|
Bacillus subtillis |
تهران |
چغندر قند |
UTB15 |
|
Bacillus subtillis |
کرمانشاه |
چغندر قند |
UTB16 |
|
Bacillus subtillis |
همدان |
چغندر قند |
UTB17 |
|
Bacillus subtillis |
اصفهان |
چغندر قند |
UTB18 |
|
Bacillus subtillis |
تهران |
چغندر قند |
UTB19 |
|
Bacillus subtillis |
مرکزی |
چغندر قند |
UTB20 |
|
Bacillus subtillis |
مرکزی |
چغندر قند |
UTB21 |
|
Bacillus subtillis |
مرکزی |
چغندر قند |
UTB22 |
|
Bacillus subtillis |
لرستان |
چغندر قند |
UTB23 |
|
Bacillus subtillis |
فارس |
چغندر قند |
UTB24 |
|
Bacillus subtillis |
تهران |
چغندر قند |
UTB25 |
|
Bacillus subtillis |
قزوین |
چغندر قند |
UTB26 |
|
Bacillus subtillis |
تهران |
چغندر قند |
UTB27 |
|
Bacillus subtillis |
فارس |
چغندر قند |
UTB28 |
|
Bacillus subtillis |
اصفهان |
چغندر قند |
UTB29 |
|
Bacillus subtillis |
کرمانشاه |
چغندر قند |
UTB30 |
|
Bacillus amyloliquefaciens |
- |
- |
UTB96 |
|
Pseudomonas fluorescens |
کرج |
پیاز |
UTPF5 |
|
Pseudomonas fluorescens |
مازندران |
کلزا |
UTPF68 |
. میزان تحمل سویههای باکتری به شوری و دما: سویههای باکتری در محیط کشت نوترینت آگار[11] با غلظت‌های مختلف کلرید سدیم (5، 7، 10، 11، 12 و 13 درصد) کشت و بیشترین غلظت نمک قابل تحمل برای هر سویه مشخص شد. در مرحله بعد میزان رشد 24 سویه در سه دمای مختلف (10، 28 و 45 درجه سانتیگراد) و در حضور کلرید سدیم (برای باسیلها غلظت 10درصد و برای سودوموناس‌ها غلظت 7 درصد) و غیاب آن بررسی و با هم مقایسه شد.
. کشت در محیط حاوی اسمولیتها و کلرید سدیم:برای تمام آزمایشاتی که در ادامه میآید استوک اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین یکمیلیمولار (در محیط مایع) و دو میلیمولار (در محیط جامد) تهیه و پس از عبور از فیلتر میلیپور 2/0 میکرون به محیطهای در حال سرد شدن اضافه شد. به محیطهای شاهد آب مقطر سترون اضافه شد. در تمام آزمایشات غلظت‌های صفر، 150 و 300 میلیمولار کلرید سدیم استفاده شد.
آزمون کشت متقابل: برای این آزمایش از روش کیل[12] و همکاران (20) با تغییراتی به شرح زیر استفاده شد. به این ترتیب که باکتری (از کشت 24 ساعته) به شکل نقطه‌ای روی محیط کشت پوتیتو دکستروز آگار[13] به فاصله 5/0 سانتی متر از لبه تشتک پتری کشت داده شد. به شکل همزمان قطعهای از محیط کشت حاوی قارچ فوزاریوم سولانی[14] (کشت 7 روزه) نیز در وسط تشتک پتری قرار گرفت. هر تیمار در چهار تکرار انجام شد. پس از اینکه کلونی شاهد پتری را پر کرد، درصد بازدارندگی برای هر تیمار مطابق فرمول زیر محاسبه شد:
|
100× |
میزان رشد قارچ درون پتری حاوی باکتری – میزان رشد قارچ درون پتری شاهد |
= درصد بازدارندگی |
|
میزان رشد قارچ درون پتری شاهد |
. تعیین جمعیت باکتری با استفاده از روش اسپکتروفوتومتری: میزان مشخصی از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت نوترینت براث[15] به ارلنهای حاوی محیطهای تازه (حاوی غلظت‌های مختلف نمک و اسمولیتها) اضافه شد. ارلنها به مدت 24 ساعت داخل شیکر انکوباتور در دمای 28 درجه سانتیگراد و 120 دور در دقیقه قرار گرفتند. سپس، یک میلی‌لیتر از محتوای هر ارلن به ویالهای سترون منتقل و به مدت 10 دقیقه در g 8000 و در دمای چهار درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. مایع رویی خالی شد، به هر ویال یک میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی استریل اضافه، از هر تیمار 100 میکرولیتر به چاهکهای میکروپلیت اضافه و جذب هر تیمار در طول موج 625 نانومتر با دستگاه پلیت ریدر خوانده شد.
بررسی تولید لیپاز: بر اساس روش شاد[16] و همکاران (21) محیطی شامل 10 گرم پپتون، 5 گرم کلرور سدیم، 1/0 گرم کلرور کلسیم، 15 گرم آگار در یک لیتر آب تهیه شد. 10 میلی‌لیتر تویین 80 اتوکلاو شده به محیط در حال سرد شدن (قبل از توزیع در تشتکپتریها) افزوده شد. باکتری به شکل خطی کشت داده شد. پس از 48 ساعت وجود هاله رسوبی در اطراف هر یک از کلونیها که نشان دهنده فعالیت لیپازی باکتری است، بررسی شد.
بررسی تولید پروتئاز: به منظور بررسی توانایی تولید آنزیم پروتئاز در باکتریها مطابق روش مارهوفر[17] و همکاران (22) از محیط اسکیم میلک آگار[18]حاوی 15 گرم پودر شیر، 5/0 گرم عصاره مخمر و 13/9 گرم آگار در یک لیتر آب مقطر استفاده شد. باکتریها روی این محیط به شکل نقطه‌ای کشت شدند. تشکیل هاله بیرنگ در اطراف کلونی باکتریها نشانه فعالیت پروتئازی باکتری است.
بررسی تولید سیانید هیدروژن: این آزمایش از روش آلستروم و برنز[19] (23) انجام شد. بدین منظور ابتدا 100 میکرولیتر از سوسپانسیون کشت 24 ساعته هر یک از باکتریها در تشتکهای پتری حاوی محیط کشت نوترینت آگار همراه با اسید آمینه گلایسین به طور یکنواخت پخش شد. سپس، کاغذهای صافی آغشته به محلول معرف شامل: کربنات کلسیم دو درصد و اسید پیکریک 5/0 درصد در قسمت درب تشتک پتری قرار داده شد. تشتکها توسط نوار پارافیلم کاملا درزگیری شدند تا از خروج هر گونه متابولیت فرار و گازی شکل از جمله سیانید هیدروژن جلوگیری شود. این ظروف به شکل واژگون به مدت 72 ساعت درون انکوباتور در دمای 28 درجه سانتیگراد قرار داده شد. یک تشتک پتری نیز به عنوان شاهد بدون تلقیح با باکتری در نظر گرفته شد. در صورت تولید سیانید هیدروژن کاغذ صافی آغشته به معرف از رنگ زرد اولیه به رنگ کرم (+) قهوه‌ای روشن (++) قهوه‌ای تیره (+++) و آجری (++++) تغییر رنگ پیدا می‌کند.
. اندازهگیری میزان تولید سیدروفور به روش اسپکتروفوتومتری: این آزمون بر اساس روش کاستاندا[20] و همکاران (24) انجام گرفت. مقدار 100 میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتریها در محیط مایع سوکسینات به ارلنهای 100میلیلیتری حاوی 20میلی‌لیتر محیط کشت تازه سوکسینات منتقل شد. این محیطها به مدت 40 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد و 120 دور در دقیقه روی شیکر نگهداری شد. سلولهای باکتری با سانتریفیوژ کردن در g10000 به مدت 10 دقیقه رسوب داده شد. پس از حذف رسوب باکتری میزان جذب مایع رویی در طول موج 400 نانومتر و با استفاده از دستگاه پلیت ریدر خوانده شد. دادههای به دست آمده با استفاده از فرمول زیر به مول در لیتر تبدیل شد.
A = میزان جذب e = ضریب جذب مولی
B = قطر کوت C = غلظت ماده
. مقایسه میزان تشکیل بیوفیلم با استفاده از روش. میکروتیترپلیت: این آزمون بر اساس روش میکروتیترپلیت (25) با تغییراتی به شرح زیر انجام شد.
کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت نوترینت براث در دمای 30 درجه سانتیگراد تهیه شد. سپس، یک میلی‌لیتر از این محیط کشت به 10 میلی‌لیتر از محیط سترون اضافه و کدورت آن از طریق خواندن جذب نوری سوسپانسیون بین 09/0 تا 1/0 در طول موج 625 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر تنظیم شد. این سوسپانسیون حاوی حدود 106 کلونی باکتری در هر میلی‌لیتر است. سپس، از این سوسپانسیون 250 میکرولیتر به هر چاهک میکروپلیت انتقال داده شد. در این صورت در هر چاهک نزدیک به 105 ×5/2 واحد تشکیل دهنده کلونی[21] باکتری موجود است. چاهکهای شاهد تنها حاوی محیط سترون بودند. سطح پلیتها پوشیده شد و انکوباسیون به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از گذشت 24 ساعت، محلول مواد غذایی و سوسپانسیون میکروبی از چاهکها خارج شد و هر چاهک سه مرتبه توسط 300 میکرولیتر سرم فیزیولوژیک استریل شسته شد. همچنین، پلیتها به منظور حذف سلولهای غیرمتصل[22] در حین شستن به شدت تکان داده شدند. سپس، باکتری‌های متصل به دیواره و کف چاهک، با 250 میکرولیتر اتانول 96 درصد تثبیت شدند. پس از 15 دقیقه، محتویات چاهکها تخلیه و پلیتها هوا خشک شدند. پلیتها به مدت پنج دقیقه با 200 میکرولیتر رنگ کریستال ویوله دو درصد رنگآمیزی شدند. پس از گذشت این مدت زمان، رنگهای اضافی از طریق قرار دادن پلیتها در مسیر جریان آب لوله شهری شسته و در دمای آزمایشگاه هوا خشک شدند. پس از خشک شدن پلیتها، تشکیل بیوفیلم به شکل حلقههای ارغوانی رنگی درون چاهکها قابل مشاهده است. در نهایت، 200 میکرولیتر استیکاسید 33 درصد به هر چاهک اضافه و جذب نوری[23] رنگ کریستال ویوله موجود در حلال رنگبر در طول موج 492 نانومتر توسط دستگاه پلیت ریدر خوانده شد.
محاسبات آماری: تمام آزمایشات به شکل فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین صفات به روش حداقل تفاوت معنادار (05/0P value< ) با استفاده از نرم افزار SAS انجام گرفت. در مواردی که روش
ال اس دی[24] قادر به جداسازی میانگینها نبود همچون، مواردی که تعداد میانگینها کم یا نامتعادل بود از روش چند دامنهای دانکن در سطح آماری 05/0 استفاده شد. نرمال بودن پراکنش دادهها قبل از تحلیل آماری با نرمافزار MINITAB آزمایش شد.
. نتایج
. میزان تحمل سویههای باکتری به شوری و دما: نتایج این پژوهش نشان داد که تمام سویههای آزمایششده تحمل خوبی به شوری داشتند و علاوه بر دمای بهینه 28 درجه سانتیگراد در دماهای 10 و 45 درجه سانتیگراد نیز قادر به رشد بودند (جدول 2). 6 سویه برای انجام آزمایشات بعدی انتخاب شد. سویههای UTB16، UTB27، UTB96 و UTPF68 قادر به تحمل غلظت بیش از 10 درصد کلرید سدیم بودند و همچنین رشد آن‌ها در دمای 10 و 45 درجه سانتیگراد در حضور نمک بیشتر از سایر سویهها بود. رشد سویه UTPF5 بر خلاف بقیه سویهها در دمای 10 درجه سانتیگراد بیشتر از دمای 45 درجه سانتیگراد بود. میزان تحمل به نمک و رشد در دماهای کم و زیاد در سویه UTB14 نسبت به سایر سویهها کمتر بود.
جدول 2- میزان رشد 24 سویه باکتری در 3 دمای مختلف و در حضور نمک و عدم حضور آن و بیشترین میزان نمک قابل تحمل برای هر سویه
|
رشد در حضور یا عدم حضور نمک در دماهای مختلف |
میزان تحمل نمک (درصد) |
نام سویه |
|||||
|
45 درجه سانتیگراد |
28 درجه سانتیگراد |
10 درجه سانتیگراد |
|||||
|
+کلرید سدیم |
-کلرید سدیم |
+کلرید سدیم |
-کلرید سدیم |
+کلرید سدیم |
-کلرید سدیم |
||
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB10 |
|
0 |
2 |
0 |
3 |
0 |
3 |
5 |
UTB 11 |
|
0 |
3 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 12 |
|
1 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 13 |
|
0 |
3 |
0 |
3 |
0 |
3 |
5 |
UTB 14 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 15 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
1 |
2 |
13 |
UTB16 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 17 |
|
0 |
3 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 18 |
|
0 |
3 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 19 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 20 |
|
0 |
2 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 21 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 22 |
|
0 |
2 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 23 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 24 |
|
0 |
2 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 25 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
13 |
UTB 26 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
1 |
2 |
13 |
UTB 27 |
|
0 |
2 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 28 |
|
0 |
2 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 29 |
|
0 |
3 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTB 30 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
0 |
2 |
11 |
UTB 96 |
|
0 |
1 |
0 |
3 |
0 |
2 |
5 |
UTPF5 |
|
2 |
3 |
2 |
3 |
1 |
2 |
12 |
UTPF68 |
اعداد صفر، 1، 2 و 3 به ترتیب نشاندهنده عدم رشد، رشد کم، رشد متوسط و رشد زیاد باکتری هستند.
جدول 3- درصد بازدارندگی از رشد فوزاریوم سولانیتوسط 5 سویه باکتری در سه غلظت نمک و در حضور آب مقطر، اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین
|
|
بازدارندگی از رشد (درصد) |
|
نام سویه |
||||||
|
(300 میلیمولار) کلرید سدیم |
(150 میلیمولار) کلرید سدیم |
(صفر میلیمولار) کلرید سدیم |
|||||||
|
هیدروکسی اکتوئین |
اکتوئین |
آب مقطر |
هیدروکسی اکتوئین |
اکتوئین |
آب مقطر |
هیدروکسی اکتوئین |
اکتوئین |
آب مقطر |
|
|
3/34 |
30 |
6/28 |
3/34 |
4/31 |
7/35 |
4/31 |
7/25 |
4/31 |
UTB16 |
|
85/42 |
1/37 |
1/37 |
3/34 |
6/38 |
85/42 |
85/42 |
40 |
85/42 |
UTB27 |
|
40 |
40 |
3/34 |
85/42 |
7/35 |
40 |
7/35 |
85/42 |
40 |
UTB96 |
|
85/22 |
6/28 |
7/5 |
85/42 |
85/42 |
40 |
7/45 |
85/42 |
85/42 |
UTPF5 |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
6/28 |
3/14 |
6/28 |
UTPF68 |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
UTB14 |
. تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر درصد بازدارندگی: همانطور که در جدول 3 مشاهده می‌شود، سویه UTPF5 که در محیط کشت حاوی اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین رشد یافته بود، در غلظت 150 و 300 میلیمولار کلرید سدیم درمقایسه با شاهد (باکتری رشد یافته در محیط حاوی آب مقطر) ویژگی بازدارندگی بیشتری بر رشد قارچ فوزاریوم سولانیداشت به گونهای که در غلظت 300 میلیمولار کلرید سدیم درصد بازدارندگی تیمار اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین (به ترتیب 6/28 و 85/22) 5 برابر تیمار شاهد (7/5) بود. با توجه به این نتیجه، سویه UTPF5 برای انجام آزمونهای بعدی انتخاب شد.
. تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر جمعیت باکتری با استفاده از روش اسپکتروفوتومتری: همانطور که در شکل 1 دیده می‌شود اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و دو غلظت 150 و 300 میلیمولار کلرید سدیمتأثیر مثبت معناداری بر جمعیت باکتری داشتند. تأثیر مثبت شوری در حضور اکتوئین افزایش یافت. در صورتیکه در حضور هیدروکسی اکتوئین عکس این مطلب صادق بود و تیمار توام شوری و هیدروکسیاکتوئین تأثیر منفی بر جمعیت باکتری داشت.
شکل 1- تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر جمعیت سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)
. تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید لیپاز: در غلظت صفر میلیمولار کلرید سدیم، اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین میزان تولید لیپاز را در مقایسه با شاهد (آب مقطر) به طور معناداری افزایش دادند و این افزایش در مورد هیدروکسیاکتوئین بیشتر بود. در غلظت 150 و 300 میلیمولار کلرید سدیمنیز اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین باعث افزایش تولید لیپاز شدند (شکل 2).
تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید پروتئاز: به طور کلی شوری تأثیر منفی بر تولید پروتئاز در هر سه تیمار آب مقطر، اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین داشت و همانطور که در شکل مشهود است اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین در هر سه غلظت میزان تولید پروتئاز را نسبت به شاهد کاهش دادند (شکل 3).
. تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید سیانید هیدروژن: تأثیر 300 میلیمولار کلرید سدیم بر تولید سیانید هیدروژن در هر سه تیمار اسمولیت مثبت بود. اکتوئین در هر سه غلظت نمک میزان تولید سیانید هیدروژن را افزایش داد. در حالیکه افزودن هیدروکسیاکتوئین به محیط کشت حاوی نمک و یا بدون نمک تأثیری بر تولید سیانید هیدروژن نداشت (جدول 4).
جدول 4- تأثیر اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید سیانید هیدروژن در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)
|
مواد حل شونده سازگار |
غلظت نمک طعام (میلیمولار) |
||
|
هیدروکسیاکتوئین |
اکتوئین |
آب مقطر |
|
|
+ |
++ |
+ |
0 |
|
+ |
++ |
+ |
150 |
|
++ |
+++ |
++ |
300 |
تولید سیانید هیدروژن: تولید اندک: +، تولید متوسط: ++،
تولید زیاد: +++
شکل 2- تأثیر اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید لیپاز در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)
.
شکل 3- تأثیر اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید پروتئاز در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)
. تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید سیدروفور: شوری تأثیر منفی در خور توجه و معناداری بر تولید سیدروفور در هر سه تیمار اسمولیت داشت. در غلظت 150 میلیمولار کلرید سدیم، اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین میزان تولید سیدروفور را نسبت به شاهد به طور معناداری افزایش دادند و این افزایش در مورد هیدروکسیاکتوئین بیشتر بود (شکل 4).
شکل 4- تأثیر اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تولید سیدروفور در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)
شکل 5- تأثیر اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تشکیل بیوفیلم در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)
. تأثیر اکتوئین، هیدروکسیاکتوئین و شوری بر تشکیل بیوفیلم: تاثیر نمک، اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین بر تشکیل بیوفیلم منفی بود، اما اثر متقابل اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین و شوری باعث افزایش معنادار تشکیل بیوفیلم شد. بدین ترتیب که در غلظت صفر میلیمولار کلرید سدیم اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین باعث کاهش میزان تشکیل بیوفیلم نسبت به شاهد شدند، اما در غلظت‌های 150 و 300 میلیمولار کلرید سدیم، اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین تشکیل بیوفیلم را در مقایسه با شاهد به طور معناداری افزایش دادند (شکل 5).
. بحث و نتیجهگیری
توانایی رشد سودوموناس‌ها (26 و 27) و باسیلوس‌ها (28 و 29) در غلظت‌های زیاد نمک گزارش شده است. مطابق نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر توانایی تحمل نمک به شکل رشد در محیط کشت حاوی 13 و 12 درصد نمک به ترتیب برای باسیلوس‌ها و سودوموناس‌ها دیده شد. اگرچه توانایی بازدارندگی قارچ بیمارگر فوزاریوم در میان باکتری‌های بررسی شده در این پژوهش دیده شد، اما تأثیر منفی نمک بر ویژگی بازدارندگی باکتری‌های مورد مطالعه یکسان نبود. دامنه این تأثیر منفی از 9 تا 100 درصد متغیر بود. تأثیر منفی نمک بر توانایی بازدارندگی در میان باسیلوس‌ها و سودوموناس‌هایی با میزان متفاوتی از تحمل به نمک دیده می‌شود. در مطالعات انجام شده بر روی توانایی بازدارندگی سودوموناس‌ها در شرایط شور و غیرشور این تنوع دیده شده است (30). اگرچه توانایی رشد باکتری‌های مورد مطالعه در غلظت‌های افزایشی نمک کاهش یافت اما غلظت‌های کمتر نمک (150 تا 300 میلیمولار) موجب افزایش جمعیت باکتری شد. مطابق نتایج نشان داده شده در شکل 1 تأثیر نمک بر رشد سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5) مثبت بود. تأثیر متفاوت نمک بر رشد باکتری‌های متحمل به نمک در جنس استرپتومایسس نیز گزارش شده است (17). توانایی بازدارندگی این سویه در حضور نمک 87 درصد کاهش یافت، در صورتیکه رشد باکتری در حضور همین مقدار نمک به میزان 10 درصد افزایش یافت. اگرچه افزایش توانایی بازدارندگی در حضور نمک در سودوموناس‌ها (30) و استرپتومایسس‌ها (31) گزارش شده است، اما به نظر می‌رسد ساز و کار تأثیر نمک بر بازدارندگی و رشد جمعیت باکتری متفاوت است. گزارشهای اندکی مبنی بر پتانسیل تولید متابولیتهای ضد میکروبی در باکتری‌های محرک رشد در تنش شوری وجود دارد. مطابق گزارش خاره[xxv] و همکاران (26)، بازدارندگی از رشد ماکروفومینا فازئولینا[xxvi] توسط سویهای از سودوموناس فلورسنس در شرایط شوری (400 میلیمولار کلرید سدیم) گویای توانایی این سویه برای بقا و تولید متابولیتهای بازدارنده در چنین شرایطی است. پژوهش حاضر برای نخستین بار به بررسی ارتباط میان اکتوئین و مشتق هیدروکسیله آن (هیدروکسیاکتوئین) با میزان بازدارندگی از رشد قارچ توسط باکتری در شرایط تنش شوری میپردازد. بر اساس نتایج به دست آمده از این پژوهش، اکتوئین و هیدروکسی اکتوئین اگرچه خود به تنهایی موجب افزایش کنترل زیستی نمیشوند، اما در صورت اعمال شوری (غلظت 300 میلیمولار) که خود کاهش دهنده کنترل زیستی است، این کاهش را تعدیل می‌کنند. ممکن است علت این تعدیل، تأثیر اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین بر یکی از ساز و کارهای کنترل زیستی در شرایط تنش شوری باشد. در پژوهشی که توسط کریمی[xxvii] و همکاران (31) انجام شد، شوری تأثیر مثبت بر ویژگی کنترل زیستی دو جدایه استرپتومایسس متحمل به نمک داشت. یکی از این دو جدایه تولیدکننده اکتوئین بود (17). نتایج نشان میدهند که شوری تأثیر چندانی بر تولید لیپاز در تیمار شاهد ندارد. اما اثر مثبت تیمار اکتوئین و هیدروکسی بر تولید لیپاز را کاهش میدهد. اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین صرف نظر از شوری موجب افزایش میزان لیپاز میشوند و همین افزایش میتواند علت افزایش ویژگی بازدارندگی باکتری رشدیافته در حضور اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین در مقایسه با آب مقطر باشد. در مورد پروتئاز شوری باعث کاهش تولید پروتئاز در هر سه تیمار می‌شود و میتواند یکی از علتهای کاهش بازدارندگی باشد. اکتوئین در هر سه غلظت شوری موجب کاهش تولید پروتئاز نسبت به شاهد شدند و بنابراین، تولید پروتئاز ساز و کاری نیست که از طریق آن اکتوئین بازدارندگی را در شرایط شوری تعدیل می‌کند. در پژوهش حاضر، شوری 300 میلیمولار باعث افزایش تولید سیانید هیدروژن در هر سه تیمار شد. دشوال و کومار[xxviii] (32) گزارش کردند که گونههای مختلف سودوموناس در غلظت‌های صفر تا یک درصد کلرید سدیم سیانید هیدروژن را به میزان بهینه تولید می‌کنند اما با افزایش غلظت کلرید سدیم از 25/1 به 25/2 درصد زمان تولید این متابولیت از 24 ساعت به 48 ساعت می‌رسد. اکتوئین به همراه نمک (300 میلیمولار) بیشترین تأثیر مثبت را بر تولید سیانید هیدروژن میگذارد. بنابراین، تولید سیانید هیدروژن هم میتواند یکی از علتهای افزایش ویژگی بازدارندگی باکتری رشد یافته در حضور اکتوئین در مقایسه با آب مقطر باشد. شوری باعث کاهش شدید و ناگهانی سیدروفور در هر سه تیمار اسمولیت شد. دشوال و کومار (32) نیز گزارش کردند که در گونههای مختلف سودوموناس تولید سیدروفور در غلظت‌های بیشتر از یک درصد کلرید سدیم به تأخیر میافتد. در پژوهشی که توسط تانک و ساراف[xxix] (33) انجام شد، تولید سیدروفور توسط گونههایی از سودوموناس حتی در حضور 6 درصد کلرید سدیم انجام شد، اما زمان تولید سیدروفور از 30 ساعت به 72 ساعت افزایش یافت که میتواند توسط تأثیر کلرید سدیم بر رشد جدایهها توجیه شود. مطابق گزارش خاره و همکاران (26)، با افزایش غلظت کلرید سدیم (از صفر تا 500 میلیمولار) کاهش رشد باکتری به کاهش تدریجی غلظت سیدروفور تولیدشده توسط سویه UTPF5 منجر شد. اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین اگر چه این کاهش را در غلظت 150 میلیمولار نمک تعدیل می‌کنند، اما توانایی تعدیل آن را در غلظت 300 میلیمولار ندارند. اگرچه شوری تشکیل بیوفیلم توسط باکتری را کاهش داد، اما تیمار اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین همراه با نمک موجب افزایش تشکیل بیوفیلم شد. بنابراین، ممکن است یکی دیگر از علتهای تعدیل ویژگی بازدارندگی باکتری رشدیافته در حضور اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین در مقایسه با آب مقطر در غلظت 300 میلیمولار تأثیر مثبت این دو اسمولیت بر تشکیل بیوفیلم باشد. به طور کلی، میتوان نتیجه گرفت که اکتوئین و هیدروکسیاکتوئین احتمالا با تأثیر بر تولید لیپاز، سیانید هیدروژن و تشکیل بیوفیلم موجب تعدیل کاهش کنترل زیستی ایجادشده در اثر شوری میشوند. انتقال ژن‌های سنتزکننده اکتوئین به باکتری‌هایی که توانایی بازدارندگی خوبی در شرایط غیرشور دارند و یا استفاده از آنتاگونیستهایی که تولیدکننده اکتوئین نیز هستند ممکن است آثار منفی ناشی از تنش شوری یا حتی سایر تنشهای محیطی بر ویژگیهای بازدارندگی را کاهش دهد.
[1]- Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR)
[2]- Strain
[3]- In vitro
[4]- Pseudomonas fluorescens
[5]- Plant probiotic bacteria
[6]- Ectothiorhodospira halochloris
[7]- Bacillus subtilis
[8]- Escherichia coli
[9]- Pantoea agglomerans
[10]- Bacillus amyloliquefaciens
[11]- Nutrient Agar (NA)
[12]- Keel
[13]- Potato Dextrose Agar (PDA)
[14]- Fusarium solani
[15]- Nutrient Broth (NB)
[16]- Shad
[17]- Maurhofer
[18]- Skim Milk Agar (SMA)
[19]- Alstrom and Burnz
[20]- Castaneda
[21]- cfu
[22]- Planktonic
[23]- OD
[24]- LSD
[xxv]- Khare
[xxvi]- Macrophomina phaseolina
[xxvii]- Karimi
[xxviii]- Deshwal and Kumar
)