نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
2 استادیار گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
3 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: The aim of present study was isolation of polyhydroxybutyrate producing Bacillus species from oil refinery waste water, Isfahan, Iran and primarily optimization of production condition. Petroleum wastes are rich of carbon sources and have low amounts of nitrogen and phosphorus sources. AS the most important factor in production of intracellular inclusions is increasing the C/N ratio, it seemed that polyhydroxybutyrate producing microorganisms will be found in these wastes.
Materials and methods: Bacillus species were isolated and purified from oil refinery wastewater. The polymer was verified using different staining procedures. Polymer was extracted by digestion method and the optimum production conditions were investigated in minimal salt medium with the organic carbon source by submerged fermentation. Production of polyhydroxybutyrate was studied using dry weight and optical density measurement.
Results: Between various isolated Bacillus strains, two of them (B1 and B2) were polyhydroxybutyrate producers. Maximum PHA production based on dry weight and concentration were obtained for strain B1 after 72 hours incubation, at 31°C, in the presence of glucose as carbon source and yeast extract as nitrogen source, pH=7, and aeration in 120 rpm and for strain B2 in the same condition, except optimal temperature which was 32°C. The most production amounts were 367 mg.ml-1 for B1 and 473 mg.ml-1 for B2 isolates. Also the most polymer percentage was 52/16 and 58.43 for B1 and B2 isolates respectively.
Discussion and conclusion: The results showed that the production of polyhydroxybutyrate was increased by optimization of the conditions in both isolates. Using petroleum wastes as well as production of biodegradable plastics, leads to decontamination of theses wastes.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
امروزه بیشتر پلاستیکهای تولید شده در بازار از فرآوردههای نفتی و زغال سنگ به دست میآیند و برگشت آنها به محیط چند هزار سال طول میکشد (1). علت اصلی زیست تخریبناپذیر بودن این پلاستیکها توسط موجودات تجزیه کننده، طویل بودن طول مولکول پلیمر و پیوند قوی بین مونومرهای آن است (2). بنابراین، پژوهشگران در پی جایگزین کردن پلاستیکهای زیستی یا تجزیهپذیر با این پلاستیکها هستند.
پلیهیدروکسیبوتیرات[1] متداولترین گروه پلیاسترهای تجزیهپذیر یا همان پلی هیدروکسیآلکانواتها[2] است که توسط تخمیر باکتریایی قند یا چربی تولید میشود و به شکل درون سلولی توسط طیف وسیعی از میکروارگانیسمهای پروکاریوت از جمله گونههای باسیلوس[3]، ازتوباکتر[4]، آلکالیجنز[5]، سودوموناس[6] و ریزوبیوم[7] در شرایطی مانند محدود بودن نیتروژن، فسفر، سولفات و بالا بودن میزان کربن ساخته میشوند. این پلیمرها که در واقع پلیاسترهای میکروبی به حساب میآیند (3). چگالی بیشتری نسبت به آب دارند، به قسمتهای عمیق انتقال یافته و به وسیله میکروارگانیسمهای موجود در رسوبات تجزیه میشوند. همچنین، به علت قابلیت تجزیهپذیری، غیرسمی بودن، انعطافپذیری و ترموپلاستیک بودن نسبت به سایر پلیاسترهای زیستتخریبپذیر مورد توجه بیشتری قرار گرفتهاند (4).
پلیهیدروکسیبوتیرات (رایجترین پلیهیدروکسیآلکانوات) در سال 1926، در مؤسسه پاستور پاریس در سیتوپلاسم باسیلوس مگاتریوم[8] کشف شد. در سال 1960، روش اسپکتروفتومتری به عنوان روشی آسان و دقیق برای سنجش کمی پلیهیدروکسیبوتیرات معرفی شد (5). پلیهیدروکسیبوتیرات به عنوان دانههای ذخیره شده در سلول باکتری که دارای عملکرد کمابیش مشابه نشاسته و گلیکوژن است، در سال 1973 به رسمیت شناخته شد (3). در سال 1981، فرآیند تولید زیستی کوپلیمرهای پلیهیدروکسیبوتیرات از منابع کربن متفاوت ارایه شد (6). در آن زمان، پلیمر حاصل، بیوپل[9] نامیده شد. پس از آن، پلیهیدروکسیآلکانوات درکاربردهای پزشکی مانند اندامهای مصنوعی، نخهای بخیه و روکش کپسولهای خوراکی استفاده شد (4). برای تعیین تولید پلیهیدروکسیآلکانوات از رنگآمیزی با سودان سیاه به عنوان روش غیر اختصاصی تأیید پلیمر استفاده میشود (7). برای استخراج پلیمر روشهای مختلفی پیشنهاد شده است که از جمله آنها استخراج با کلروفرم و یا از طریق اسیدی کردن پالایه محیط کشت است (8- 10).
در گذشته مطالعات فراوانی در زمینه تولید پلیهیدروکسیآلکانواتها در دنیا و در ایران انجام شده است. در بررسی مختارانی[10] و همکاران در سال 2008 از میکروارگانیسمهای لجن فعال فاضلاب برای تولید پلیهیدروکسیآلکانواتها، بدون جداسازی باکتریهای تولید کننده استفاده شده است. بهینهسازی منابع ازت و کربن موجب افزایش تولید پلیمر شده است (11). در بررسی گودرزی[11] و همکاران در سال 2011، جدایهای از باسیلوس ترنجینسیس از خاک آلوده به پساب کارخانه دلسترسازی شناسایی شد (12). در سال 2008 محسنپور[12] و همکاران، جداسازی ژن بتاکتوتیولاز که تولید کننده آنزیم یک مرحله کلیدی در تشکیل کوپلیمرهای تجزیهپذیر زیستی است را از باکتری رالستونیا اوتروفا[13] انجام دادند. این جداسازی با هدف اصلاح ویژگیهای پلاستیکهای تجزیهپذیر زیستی برای بهتر شدن کیفیت و کمتر شدن عیوب این پلاستیکها مانند شکنندگی و کم استقامت بودن آنها بود (13).
با توجه به این که روی تولید پلیهیدروکسیبوتیرات توسط باکتریهای موجود در پسابهای نفتی مطالعه منتشر شدهای به ویژه در ایران یافت نشد و با وجود غنی بودن این پسابها از ترکیبات کربنی، پژوهش حاضر با هدف تهیه جدایههای تولید کننده این پلیمر از پساب پالایشگاه نفت اصفهان انجام شد. همچنین، پس از بررسی تولید پلیمر، افزایش توانایی تولید توسط جدایهها در کشت غوطه ور، با مناسبسازی اولیه زمان تولید، منابع کربن و نیتروژن، اسیدیته و سرعت همزنی بررسی شد.
مواد و روشها.
جداسازی باکتریها: از آن جا که پسابهای نفتی از منابع کربن غنی و منابع نیتروژن و فسفر ضعیف هستند، در پژوهش حاضر، از پساب پالایشگاه اصفهان (حوضچه هوادهی) به عنوان نمونه برای جداسازی باکتریهای مولد پلیهیدروکسیبوتیرات استفاده شد. انواع باسیلوس با استفاده از شوک حرارتی و کشت بر روی محیط کشت نوترینت آگار (شارلو، اسپانیا) در دمای 30 درجه سانتیگراد جداسازی شدند. باکتریهای جداسازی شده با رنگ آمیزی گرم بررسی و با آزمونهای بیوشیمیایی مانند همولیز بر روی آگار خوندار، هیدرولیز لسیتین، متیل رد، وژپرسکوئر، اکسیداز، تخمیر قندها، مصرف سیترات، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کازئین و مشاهده اجسام کنار اسپور شناسایی شدند.
.بررسی تولید پلیهیدروکسیبوتیرات در محیط کشتهای مختلف: به منظور تولید پلیمر سه محیط کشت لوریا برتانی براث[14]، E2 و حداقل نمکی با منبع کربن آلی بررسی شد. این محیطهای کشت هر یک شامل مواد و شرایط متفاوتی هستند و در پژوهشهای قبلی پیشنهاد شده بودند. یکی از اهداف پژوهش حاضر بررسی بهترین محیط کشت از میان این سه محیط کشت بوده است.
محیط کشت لوریا برتانی براث شامل ترکیبات گلوکز 10 گرم در لیتر (مرک، آلمان)، کلرید سدیم 10 گرم در لیتر (مرک، آلمان)، عصاره مخمر 5 گرم در لیتر (شارلو، اسپانیا)، تریپتون 10 گرم در لیتر (شارلو، اسپانیا) با اسیدیته 7 است (14). محیط کشت E2 مایع نیز شامل ترکیبات فسفات آمونیوم هیدروژن سدیم، 4 آب 5/3 گرم در لیتر، فسفات دی هیدروژن پتاسیم 7/3 گرم در لیتر، فسفات منو هیدروژن پتاسیم 7/5 گرم در لیتر، سولفات منیزیم 7 آب 2/0 گرم در لیتر و گلوکز 10 گرم در لیتر و یک میلیلیتر از محلول فلزی شامل ترکیبات سولفات آهن 7 آب 78/2 گرم در لیتر، کلرید کلسیم 2 آب 47/2 گرم در لیتر، کلرید منگنز 4 آب 98/1 گرم در لیتر، کلرید کبالت 6 آب 38/2 گرم در لیتر، کلرید مس 2 آب 17/0 گرم در لیتر و سولفات روی 7 آب 29/0 گرم در لیتر با اسیدیته 7 (همه مواد از شرکت مرک آلمان) است (15). محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی شامل فسفات منو هیدروژن پتاسیم یک گرم در لیتر، فسفات دی هیدروژن پتاسیم 2/0 گرم در لیتر، کلرید سدیم یک گرم در لیتر، کلرید کلسیم 2 آب 002/0 گرم در لیتر، سولفات آمونیوم 1 گرم در لیتر، سولفات منیزیم 7 آب 5/0 گرم در لیتر، سولفات مس 5 آب 001/0 گرم در لیتر، سولفات روی 7 آب 001/0 گرم در لیتر، سولفات منگنز یک آب 001/0 گرم در لیتر، سولفات آهن 7 آب 001/0 گرم در لیتر و گلوکز 10 گرم در لیتر با اسیدیته 7 (همه مواد از شرکت مرک آلمان) است. به علت اضافه شدن قند گلوکز، باکتریهای هتروتروف هم در آن قادر به رشد هستند (14). شایان ذکر است با محاسبه نسبت مولکولها، نسبت کربن به نیتروژن (C/N) در محیطهای کشت یاد شده برابر با 2 در محیط کشت لوریا برتانی براث، 5 در محیط کشت E2 و 15 در محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی است. محیطهای کشت یاد شده به علت جلوگیری از تجزیه قند موجود در آنها، در دمای 110 درجه سانتیگراد استریل شدند.
یک کلونی خالص از کشت باکتریایی توسط لوپ به محیط نوترینت براث (شرکت شارلو) تلقیح شد و تا زمان رسیدن به کدورت نیم مک فارلند (حدود 18 ساعت) در دمای 30 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. پس از آن یک میلیلیتر از محیط کشت یاد شده برداشته و به محیط کشتهای تولید پلیمر در ارلنهای 250 میلیلیتر اضافه شد. ارلنها در دمای 30 درجه سانتیگراد و هوادهی 120 دور در دقیقه، در انکوباتور شیکردار (شرکت شاین سینگ[15]) انکوبه شدند. نمونهبرداری برای تعیین وزن خشک سلولی و تولید پلیهیدروکسیبوتیرات در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت انجام شد.
.ردیابی پلیهیدروکسیبوتیرات تولید شده در جدایهها.
رنگ آمیزی سودان سیاه: بر روی گستره خشک شده سلولی، رنگ سودان سیاه[16] (مرک، آلمان) ریخته و پس از 15 دقیقه با زایلل[17] (مرک، آلمان) شسته شد. سپس، به مدت 10 ثانیه سافرانین[18] (مرک، آلمان) اضافه و با آب شستشو داده شد. پس از خشک شدن، دانههای پلیهیدروکسیبوتیرات با رنگ سیاه در سلولهای باکتری با رنگ قرمز قابل مشاهده بود (15).
.رنگ آمیزی نیل بلو برای مشاهده میکروسکوپی: برای رنگ آمیزی، 100 میکرولیتر از محیط کشت تولید برداشته و با 10 میکرولیتر از رنگ نیل بلو مخلوط شد. گرانولهای پلیهیدروکسیآلکانوات با درخشش آبی توسط میکروسکوپ فلئورسنت مشاهده شد (16).
.رنگآمیزی نیل بلو به شکل مستقیم بر روی کلونیهای زنده: ابتدا محیط کشت جامد حداقل نمکی با منبع کربن آلی با محتویاتی که پیش از این شرح داده شد به علاوه 5/1 درصد آگار و رنگ نیل بلو با غلظت 25/0 میلیگرم در میلیلیتر در حلال دیمتیلسولفوکساید ساخته شد. کلونی باکتریهای تلقیح شده، پس از طی شدن 72 ساعت دوره گرمخانهگذاری در 30 درجه سانتیگراد در معرض نور فرابنفش با طول موج 460 نانومتر قرار گرفت و درخشش فلئورسنت آنها بررسی شد (16).
.استخراج و خالصسازی پلیهیدروکسیبوتیرات: 50 میلیلیتر از محیط کشتهای یاد شده برای تولید پلیمر با سرعت 9300 بر اساس واحد g و به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به رسوب حاصل 20 میلیلیتر محلول سدیم هیپوکلریت اضافه شد. گرمخانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه انجام گرفت. پس از سانتریفوژ با سرعت 2300 بر اساس واحد g و به مدت 30 دقیقه، رسوب سفید رنگ حاصل توسط الکل و استون به نسبت دو به یک شسته و به طور کامل در دمای 50 درجه سانتیگراد خشک شد. سپس، برای استخراج پلیهیدروکسیبوتیرات، به رسوب سفید رنگ 10 میلیلیتر کلروفرم اضافه شد و در 50 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت قرار گرفت (17). پس از سرد شدن، محلول پلیهیدروکسیبوتیرات در کلروفرم در یک بشقابک تمیز ریخته شد و برای تبخیر کلروفرم در زیر هود شیمیایی قرار گرفت. پلیهیدروکسیبوتیرات به شکل یک لایه نازک در ته لوله باقی ماند که به راحتی قابل جدا شدن بود (18).
سنجش پلیهیدروکسیبوتیرات: برای سنجش کمی پلیهیدروکسیبوتیرات پس از استخراج و خالصسازی، پلیمر به دست آمده توسط ترازوی دقیق عددی توزین شد. درصد پلیمر طبق رابطه زیر به دست آمد (19).
×100 |
مقدار وزن خشک پلی هیدروکسی بوتیرات |
= درصد پلی هیدروکسی بوتیرات |
مقدار وزن خشک رسوب سلولی |
همچنین، برای تعیین غلظت پلیهیدروکسی بوتیرات یک میلیلیتر از محیط کشت تولید پلیمر با سرعت 9300 بر اساس واحد g و به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به رسوب حاصل یک میلیلیتر محلول سدیم هیپوکلریت یک درصد اضافه شد. گرمخانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه انجام گرفت. سپس، سانتریفوژ و شستشوی رسوب سفید رنگ توسط آب مقطر انجام شد. افزون بر این، رسوب حاصل توسط الکل و استون به نسبت دو به یک شسته و در نهایت، در دمای 50 درجه سانتیگراد به طور کامل خشک شد. سپس، یک میلیلیتر سولفوریک اسید 98 درصد به آن اضافه شد و در دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه در حمام جوش قرار گرفت. سولفوریک اسید غلیظ، پلیهیدروکسیبوتیرات را تبدیل به کورتونیک اسید[19] میکند. پس از سرد شدن محلول، جذب نوری کورتونیک اسید در طول موج 235 نانومتر در مقابل سولفوریک اسید غلیظ به عنوان شاهد توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مجهز به نور فرابنفش خوانده و غلظت پلیهیدروکسیبوتیرات براساس منحنی استاندارد این پلیمر بررسی شد (5).
رسم منحنی استاندارد پلیهیدروکسیبوتیرات: برای رسم منحنی استاندارد غلظتهای 1 تا 7 میلیگرم در میلیلیتر از پلیهیدروکسیبوتیرات خالص به یک میلیلیتر محلول سدیم هیپوکلریت یک درصد اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. سپس، جذب نوری کورتونیک اسید تولید شده در طول موج 235 نانومتر اندازهگیری شد (5). منحنی استاندارد ترسیم شده در شکل 1 مشاهده میشود.
شکل 1- منحنی استاندارد پلیهیدروکسیبوتیرات بر اساس جذب نوری غلظتهای مختلف در طول موج 235 نانومتر
.مناسبسازی رشد توده زیستی سلولی و تولید پلیهیدروکسیبوتیرات: برای هر مرحله از مناسبسازی، محیط کشت با شرایط آزمایش مورد نظر ساخته شد و تعداد 108x3 سلول باکتری (بر اساس استاندارد 5/0 مک فارلند) به 250 میلیلیتر این محیط تلقیح شد. مراحل مناسبسازی بر اساس نوع محیط کشت (لوریا برتانی براث، E2 و حداقل نمکی با منبع کربن آلی)، زمان تولید (8، 16، 24، 32، 40، 48، 56، 64، 68، 72 و 76 ساعت)، دما (25، 28، 30، 31، 32، 33، 35، 37 و 39 درجه سانتیگراد)، منابع کربن (گلوکز، ساکارز، مانیتول، لاکتوز، فروکتوز، گزیلوز و ملاس به میزان 10 گرم در لیتر)، منابع نیتروژن (تریپتون، عصاره مخمر، کلرید آمونیوم، سولفات آمونیوم به مقدار یک گرم در لیتر)، اسیدیته محیط (5، 6، 7، 8 و 9) و دور شیکر (100، 120، 140، 200 و 250 دور در دقیقه) انجام شد. نحوه چینش آزمایشها بر اساس روش یک متغیر در یک زمان تعیین شد (11).
نتایج.
شناسایی جدایهها: پس از انجام آزمونهای بیوشیمیایی برای شناسایی دو جدایه B1 و B2 نتایج در جدول 1 گزارش شد. بر اساس آزمایشهای بیوشیمیایی انجام شده، جدایه B1 باسیلوس تورنجنسیس و B2 باسیلوس سرئوس شناسایی شد. با توجه به شکلهای 2 و 3، گرانولهای PHAتوسط رنگآمیزی سودان سیاه و نیل بلو رؤیت شد. در شکل 4 کلونیهای حاوی پلیهیدروکسیبوتیرات به شکل آبی درخشان مشاهده شد.
جدول 1- نتایج آزمونهای بیوشیمیایی دو جدایه B1و B2
تولید لستیناز |
تخمیر مانیتول |
تخمیر گلوکز |
تخمیر گزیلوز |
مصرف سیترات |
هیدرولیز کازیین |
هیدرولیز نشاسته |
اجسام کنار اسپور |
اندول |
ژلاتیناز |
تولید اکسیداز |
MR |
VP |
همولیز |
آزمونهای بیوشیمیایی |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
β |
B1 |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
β |
B2 |
شکل 2- رنگآمیزی سودان سیاه باسیلوسها: گرانولهای سیاه رنگ پلیهیدروکسیآلکانوات در باکتریهای قرمز مایل به صورتی در جدایههای B1 و B2 (الف و ب) زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 1000 برابر
شکل 3- رنگآمیزی نیل بلو باسیلوسها: دانههای درخشان پلیهیدروکسیآلکانوات در جدایههای B1(الف) وB2 (ب) زیر میکروسکوپ فلئورسنت با بزرگنمایی 1000 برابر
شکل 4- رنگآمیزی نیل بلو به شکل مستقیم بر روی کلونیهای زنده در جدایههای B1 و B2: کلونیهای B1 و B2 موجود در بشقابک حاوی رنگ نیل بلو قبل(1) و پس (2) از قرار دادن در معرض اشعه فرابنفش با طول موج 460 نانومتر
شکل 5- نمودار بررسی وزن خشک پلی هیدروکسیبوتیرات استخراج شده (mg.L-1) از محیط کشتهای لوریا برتانی براث (LB)، E2 و حداقل نمکی (Minimal) در جدایههای B1 و B2 بر اساس زمان (ساعت)
شکل 6- نمونه پلیهیدروکسیبوتیرات خالص شده: پلیمر به شکل پودر سفید رنگی به دست آمد.
بر اساس شکل 5، نمودار مناسبسازی محیط نشان داد، محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی بهترین محیط برای تولید پلیمر در باسیلوسهای جدا شده بود. این محیط کشت دارای بیشترین نسبت کربن به نیتروژن (C/N) نسبت به محیطهای دیگر است و همین مورد میتواند از علتهای اصلی تولید زیاد پلیمر در آن باشد. در این بررسی، پلیهیدروکسیبوتیرات به شکل پودر خالص شده به دست آمد. ظاهر پلیمر در شکل 6 نشان داده شده است.
بهترین زمان تولید پلیمر بر اساس وزن خشک برای هر دو جدایه 72 ساعت پس از گرمخانهگذاری بود (شکل 7).
شکل 8 نشان میدهد که بهترین دمای تولید پلیهیدروکسیبوتیرات برای جدایه B1 31 درجه سانتیگراد و برای جدایه B2 32 درجه سانتیگراد بوده است.
شکل 9 نشان میدهد بهترین اسیدیته برای تولید پلیمر در هر دو جدایه، 7 بوده است.
بر اساس شکل 10 در هوادهی 120 دور در دقیقه بیشترین میزان تولید در هر دو جدایه گزارش شد.
بر اساس شکلهای 11 و 12 گلوگز به عنوان بهترین منبع کربن و عصاره مخمر به عنوان بهترین منبع نیتروژن گزارش شد.
شکل 7- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلیهیدروکسیبوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایههای B1 و B2 بر اساس زمان، در شرایط دمای 30 درجه سانتیگراد، منبع کربن گلوکز، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.
شکل 8- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلیهیدروکسیبوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایههای B1 و B2 در شرایط دمایی متفاوت، منبع کربن گلوکز، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانهگذاری، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.
شکل 9- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلیهیدروکسیبوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایههای B1و B2در شرایط اسیدیته مختلف، منبع کربن گلوکز، دمای 30 درجه سانتیگراد، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانهگذاری.
شکل 10- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلیهیدروکسیبوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایههای B1 و B2 در شرایط همزنی مختلف، منبع کربن گلوکز، دمای 30 درجه سانتیگراد، اسیدیته 7 و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانهگذاری.
شکل 11- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلیهیدروکسیبوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایههای B1 و B2 بر اساس منابع کربن. در شرایط دمایی به ترتیب 31 و 32 درجه سانتیگراد، منبع کربن متفاوت، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانهگذاری، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.
شکل 12- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلیهیدروکسیبوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایههای B1و B2 بر اساس منابع نیتروژن. در شرایط دمایی به ترتیب 31 و 32 درجه سانتیگراد، منبع کربن گلوکز، منبع نیتروژن متفاوت، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و 72 ساعت گرمخانهگذاری، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.
بحث و نتیجه گیری.
تولید پلیهیدروکسیبوتیرات در گونههای مختلف باسیلوس در مطالعات قبلی بررسی شده است. یاکسدگ[xx] و همکاران در سال 2004 تولید پلیهیدروکسیبوتیرات را در باسیلوس مگاتریوم و باسیلوس سوبتیلیس بررسی کردند (20). آنها بیشترین میزان تولید را مقدار 101 و 162 میلیگرم بر لیتر پس از 45 ساعت گرمخانهگذاری گزارش نمودند که پس از گذشت 48 ساعت تولید کاهش یافت. در پژوهش حاضر محیط حداقل نمکی به عنوان بهترین محیط تولید گزارش شد که 72 ساعت پس از گرمخانهگذاری، تولید پلیمر توسط جدایه B1 به مقدار 67/366 میلیگرم بر میلیلیتر و توسط جدایه B2، برابر با 473 میلیگرم بر میلیلیتر بود. رحمان[xxi] و همکاران در سال 2006 بیشترین مقدار پلیمر را در این محیط 350 میلیگرم بر میلیلیتر اعلام کردند (21) به علت این که در مطالعات قبلی نیز از محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی استفاده شده است، پژوهش حاضر نشان دهنده افزایش میزان تولید پلیمر است. این افزایش میتواند به علت توانایی بالاتر جدایههای مورد استفاده و حفظ قدرت تولید پلیمر با گذشت زمان گرمخانهگذاری باشد. در سال 2010 سانتانام و سیدهرن[xxii]، برای مشاهده گرانولهای پلیهیدروکسی بوتیرات از رنگ آمیزی سودان سیاه استفاده کردهاند (15). در این مطالعه با استفاده از این روش گرانولهای سیاه رنگ موجود در جدایهها مشاهده شد.
از دیگر روشهای رنگآمیزی، روش اختصاصی نیل بلو بود. در سال 2012 پریتی[xxiii] و همکاران، با استفاده از این روش گرانولهای درخشان پلیهیدروکسی بوتیرات را مشاهده کردند. از مزایای این روش نسبت به استفاده از سودان سیاه، سهولت بیشتر رنگ آمیزی است و به علت این که این رنگ مانع رشد باکتری نمیشود، میتوان آن را قبل از رشد به محیط کشت اضافه و تولید پلی مر را در کلونیها با استفاده از نور UV ردیابی کرد (16). در این پژوهش نیز توسط میکروسکوپ فلئورسنت این گرانولها مشاهده شد.
در پژوهش حاضر از روش جیسیلان[xxiv] و همکاران برای استخراج پلیهیدروکسی بوتیرات استفاده شد (17). در این روش از حلالهای سدیم هیپوکلریت، الکل و استون و کلروفرم استفاده شد. گرمخانهگذاری در دمای 37 درجه سانتیگراد و سانتریفوژ با سرعت 9300 بر اساس واحد g و به مدت 15 دقیقه انجام شد. خالصسازی پلیمر از روش هان[xxv] و همکاران و با استفاده از کلروفرم انجام گرفت (18).
بیشترین میزان درصد پلیهیدروکسیبوتیرات برای جدایههای B1 و B2، 72 ساعت پس از گرمخانهگذاری به ترتیب میزان 43 درصد و 43 درصد اعلام شد. سودش[xxvi] و همکاران در سال 2012 درصد پلیهیدروکسیبوتیرات را برای باسیلوس سوبتیلیس به میزان 18 درصد و برای باسیلوس مگاتریوم به میزان 15 درصد اعلام کردند (22). در محیط حداقل نمکی نسبت توده زیستی سلولی به تولید پلیمر تعیین کننده درصد پلیمر بود. در پژوهش حاضر درصد تولید نسبت به پژوهشهای سودش و همکاران افزایش یافت، زیرا نسبت توده زیستی سلولی به تولید پلیمر در مطالعه آنها بیشتر از پژوهش حاضر بود و باعث کاهش درصد تولید شد.
برای تعیین شرایط مناسب دما فواصل دمایی دوتایی در نظر گرفته شد. دمای مناسب تولید پلیهیدروکسیبوتیرات در جدایه B1، 31 درجه سانتیگراد، با میزان تولید 47 درصد و در جدایه B2، 32 درجه سانتیگراد با میزان تولید 47 درصد گزارش شد. پس از رسم پروفایل دما، آزمایش یافتن منبع کربن مناسب انجام گرفت. منبع کربن گلوگز به عنوان بهترین منبع برای تولید پلیمر تعیین شد که بیشترین درصد تولید برای جدایههای B1 و B2، 85/47 و 16/50 درصد اعلام شد. سودش و همکاران تولید در حضور منبع کربن گلوکز را به مقدار 15 و 19 درصد گزارش کردند (22). برکا و تهودی[xxvii] نیز، گلوکز را به عنوان بهترین منبع کربن برای توده سلولی و تولید پلی مر، به میزان 35 درصد گزارش کردند (9). منبع کربن در پژوهش حاضر نیز گلوکز بود، اما مقدار درصد تولید پلیمر بیشتر گزارش شد.
همچنین، اسیدیته مناسب تولید برای جدایههای B1 و B2، 7 بود که بیشترین درصد تولید در جدایهها به ترتیب 16/52، 40/58 به دست آمد. دور شیکر مناسب رشد و تولید پلیمر برای جدایههای B1 و B2، هوادهی 100 دور در دقیقه و 120 دور در دقیقه اعلام شد و بیشترین درصد تولید پلیمر برای جدایههای B1 و B2 به ترتیب، 16/52، 43/58 گزارش شد.
برای سنجش کیفی پلیمر از روش اسپکتروفتومتری استفاده شد که با استفاده از آن، غلظت پلیمر تعیین شد. غلظت پلیهیدروکسیبوتیرات برای جدایههای B1 و B2، پس از 72 ساعت گرمخانهگذاری به میزان 3/1 و 5/1 میلیگرم بر میلیلیتر (بیشترین مقدار تولید پلیمر) گزارش شد. در سال 2009 راماداس[xxviii] و همکاران، بیشترین غلظت پلیهیدروکسیبوتیرات را یک میلیگرم بر میلیلیتر برای گونههای باسیلوس اعلام کردند (23).
محیط تولید با منابع نیتروژن مختلف قرار گرفت که برای جدایههای B1 و B2، عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژن مناسب انتخاب شد. همچنین، بیشترین درصد تولید پلیهیدروکسی بوتیرات نیز مربوط به همین منابع نیتروژنی بود که برای جدایههای B1 و B2، به ترتیب 16/52 و 40/58 درصد به دست آمد. در مطالعهای در ترکیه با بهینه کردن منبع نیتروژن تولید پلیهیدروکسیبوتیرات به وسیله مخمرهای جداسازی شده از چای کمبوجا به 25 درصد وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلول افزایش یافت (24). در بررسی دیگری، با استفاده از سویههای کلکسیونی باسیلوس سابتیلیس و باسیلوس مگاتریوم، با تغییر زمان گرمخانهگذاری و منبع نیتروژن، تولید تا 77 درصد وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلول افزایش یافته است (20).
در مطالعه حاضر، نتایج به دست آمده از سنجش کمی پلیهیدروکسی بوتیرات بر اساس وزن خشک (میلی گرم بر لیتر) و سنجش بر اساس روش اسپکتروفتومتری (تعیین غلظت آن بر اساس میلیگرم بر میلیلیتر) نشان داد که این دو نوع سنجش کمابیش بر هم منطبق بود و نتایج مشابهی گزارش شد.
نتایج پژوهش حاضر نشان داد بیشترین درصد تولید پلیمر برای جدایههای B1 و B2 باسیلوس به دست آمده از پساب پالایشگاه به ترتیب، 16/52، 43/58 و بیشترین میزان غلظت پلی مر تولید شده 66/1 و 92/1 میلیگرم بر میلیلیتر است.
بررسی مطالعات انجام شده در زمینه بهینهسازی شرایط تولید پلی هیدروکسی آلکانوات به وسیله جدایههای باکتریایی بومی یا کلکسیونی نشان دهنده نتایج مختلفی است. بررسی تأثیر ترکیبات ازت بر تولید پلیهیدروکسیآلکانواتها با استفاده از لجن فعال توسط مختارانی و همکاران در سال 2008 انجام شد، آنها بیشترین میزان تولید این پلی استر را هنگام استفاده از عصاره مخمر به عنوان منبع ازت و به میزان 23 درصد بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلول معرفی کردند (11). خسروی دارانی[xxix] و همکاران در سال 2003 با بهینه کردن شرایط تولید از نظر منابع کربن و نیتروژن، هم زنی، دما و زمان تولید توسط باکتری کلکسیونی رالستونیا اتروفا (ATCC 17699) که به عنوان یکی از تولید کنندههای قدرتمند پلیهیدروکسی آلکانوات شناخته شده است، توانستند تولید پلیهیدروکسیبوتیرات را به حداکثر 18/50 درصد بر اساس وزن خشک پلیمر نسبت به وزن خشک سلول افزایش دهند (25). همین پژوهشگران در طراحی آزمایش دیگری توانستند موجب افزایش بیشتری در تولید (85 درصد) به وسیله همان باکتری شوند (26). مقایسه این دو مطالعه، اهمیت روشهای طراحی آزمایش در تولیدات میکروبی را نشان میدهد. در بررسی دیگری گودرزی و همکاران در سال 2011، تولید پلی هیدروکسی آلکانوات توسط باسیلوس ترنجینسیس جداسازی شده از خاک آلوده به پساب کارخانه دلسترسازی را با مناسبسازی دما، اسیدیته و هوادهی تا 35 درصد افزایش دادند (12). با وجود این که نتایج بررسی حاضر از میزان تولید در برخی پژوهشهای دیگر بیشتر است، در مطالعات دیگر، نتایج بالاتری با استفاده از میکروارگانیسمهای توانمند غیر بومی به دست آمده است. با این وجود که باکتری های مولد پلی هیدروکسی آلکانوات در گزارش قبلی از خاک های آلوده به نفت در مسجد سلیمان توسط کفیل زاده و همکاران جداسازی شدهاند (27)، بررسی حاضر برای نخستین بار بر روی پساب نفتی انجام گرفت و نشان داد باکتریهای بومی جداسازی شده از این محیطها توانایی در خور توجهی برای تولید پلی استرهای میکروبی دارند که با طراحی آزمایش دقیقتر و بهینهسازی بیشتر شرایط، میتوان تولید توسط آنها را افزایش داد و با استفاده از آنها میتوان در ضمن تولید پلیمرهای زیستی، در زمینه کاهش آلایندگی زیستی ترکیبات نفتی اقدام کرد.
تشکر و قدردانی
از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان برای در اختیار قرار دادن امکانات آزمایشگاهی و از مدیریت و کارکنان پالایشگاه نفت اصفهان برای همکاری در تهیه نمونه، تشکر و قدردانی میشود.
[1]- Polyhydroxybutyrate (PHB)
[2]- Polyhydroxyalkanoates (PHAs)
[3]- Bacillus
[4]- Azotobacter
[5]- Alcaligenes
[6]- Pseudomonas
[7]- Rhizobium
[8]- Bacillus megaterium
[9]- Biopol
[10]- Mokhtarani
[11]- Goudarzi
[12]- Mohsenpoor
[13]- Ralstonia eutropha
[14]- Leuria Bertani Broth
[15]- Shin Saeng
[16]- Black Sudan
[17]- Xylene
[18]- Safranin
[19]- Crotonic acid
[xx]- Yüksekdag
[xxi]- Rehman
[xxii]- Santhanam and Sasidharan
[xxiii]- Preethi
[xxiv]- Jeyaseelan
[xxv]- Hahn
[xxvi]- Sudesh
[xxvii]- Berekaa and Thawadi
[xxviii]- Ramadas
[xxix]- Khosravi-Darani