نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استادیار بیوتکنولوژی، پژوهشگاه صنعت نفت، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Phenolic compounds are toxic environmental pollutants. Removal of phenol from wastewaters is very important. Phenol biodegradation is generally preferred to common physico- chemical methods. The aim of this study is to enrich and isolate haloalkaliphilic phenol-degrading bacteria and evaluate their potential for caustic wastewater treatment in consortium and pure cultures.
Materials and methods: Soil and water samples were collected from hydrocarbon polluted areas. Samples were enriched in the mineral medium with phenol as the only carbon and energy source. Phenol degrading strains were isolated and identified using morphological and phylogenic techniques. Isolates were screened based on phenol removal ability and key parameters such as pH, temperature and various salt (NaCl, NaNO3, NH4Cl and KCl) and phenol concentration were evaluated for optimizing biodegradation activity of the selected strain.
Results: Three phenol-degrading strains were isolated from Yadavaran oilfield sample, which belong to bacterial genera Halomonas, Janibacter and Pseudomonas. The strain Janibacter sp.YF3 was selected due to its high phenol-degrading rate. The strain was gram positive coccus whose optimal growth condition was 30 ºC, Nacl 5 % (w/v), pH 8.5 and phenol 400 ppm. The results showed that this strain could thrive in highly saline conditions and preferred NaNO3among other salts.
Discussion and conclusion: Isolate entitled Janibacter sp. strain YF3 was a polyextremophile which could tolerate harsh conditions (NaCl concentration up to 10 % and pH 9.5) and could utilize phenol at high concentration up to 1000 ppm. These results showed that this strain could be potentially applicable for phenol removal from haloalkaline industrial wastewaters such as spent caustic.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
آلاینده‌های محیطی با اثرات سمی خود بر روی ارگانیسم‌های زنده، اکوسیستم‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهند. در میان این آلاینده‌ها، ترکیبات آروماتیک به علت پایداری ترمودینامیکی بالای حلقه بنزنی یکی از بزرگ‌ترین مشکلات زیست محیطی به شمار می‌آیند (1). یکی از این ترکیبات آروماتیک فنل است که طبق گزارش آژانس حفاظت محیط زیست آمریکا در گروه سمی‌ترین آلاینده‌ها قرار می‌گیرد (2).
پساب‌های تولید شده از سوخت‌های فسیلی، پالایشگاه‌ها، صنایع داروسازی، کارخانه‌های رنگسازی و حشرهکشها مهم‌ترین منابع برای تولید آلودگی‌های فنلی هستند (3). روش‌های فیزیکی- شیمیایی حذف فنل شامل: اکسیداسیون شیمیایی، جذب کربن فعال، استخراج با حلال و تجزیه فتوکاتالیستی است که انجام این روش‌ها با مشکلاتی روبروست (3- 4). این روش‌ها هزینه زیادی در بر دارند و با انجام آن‌ها معمولا فنل به محیطی دیگر منتقل شده یا به مادهای با سمیت کمتر تبدیل می‌شود که خود به عنوان یک آلاینده شناخته می‌شود. اما تجزیه زیستی فنل روشی است که علاوه بر سازگاری با محیط زیست و هزینه پایین، به علت تجزیه کامل فنل به مواد معدنی (آب و دی اکسید کربن) بر سایر روش‌ها ترجیح داده می‌شود (5- 6). تجزیه زیستی فرآیندی است که بسیاری از عاملهای زیستی و غیرزیستی بر روی آن تأثیر می‌گذارند. عاملهای زیادی وجود دارد که با جلوگیری و یا تحریک رشد میکروارگانیسم می‌تواند بر روی توانایی تجزیه یا متابولیسم آن تأثیرگذار باشد. این عاملها شامل: دما، اسیدیته، غلظت سوبسترا، ویژگی‌های فیزیکی آلاینده و میزان اکسیژن و دسترسی به آن است (7). مطالعات زیادی در زمینه تجزیه زیستی فنل انجام شده است. یکی از باکتری‌های مهم در زمینه تجزیه زیستی فنل Pseudomonas putida است که تاکنون گزارش‌های متعددی درباره تجزیه فنل توسط این باکتری در شرایط مختلف از جمله حالت تثبیت شده و یا در بیورآکتورهای متفاوت ارائه شده است (8- 10). بیش‌ترین غلظتی که این باکتری توانایی تجزیه آن را داراست، 1000 میلی‌گرم در لیتر گزارش شده است (11). باکتری‌های دیگری از جمله جنس‌های Halomonas، Acinetobacter، Alcaligenes و Ewingella در رابطه با تجزیه زیستی فنل گزارش شده‌اند. پساب‌های صنعتی شور و قلیایی که دارای فنل هستند، به علت شرایط فیزیکی خاص آن‌ها یکی از مشکلات صنایع برای تصفیه زیستی هستند. یکی از انواع این پساب‌ها که در حین تصفیه نفت خام تولید می‌شود، اسپنت کاستیک[1] نامیده می‌شود (12). شرایط اکستریم موجود در این پساب‌ها، می‌تواند باعث مرگ یا مهار رشد سویه‌های غیر اکستریم شود. هدف این مطالعه، تجزیه زیستی فنل در شرایط اکستریم است که به این منظور جداسازی، شناسایی و بررسی شرایط رشد میکروارگانیسم‌های نمک-قلیادوست[2] تجزیه کننده فنل در دستور کار قرار گرفت تا با کمک آن‌ها بتوان پساب‌های صنعتی شور-قلیایی را تصفیه کرد.
. مواد و روش ها
به منظور جداسازی سویه‌های نمک- قلیادوست تجزیه کننده فنل نمونهگیری از خاک‌های شور و آلوده به نفت پالایشگاه تهران، خاک‌های شور قم، خاک‌های شور و آلوده به نفت جزیره خارک و آب مخزن میدان نفتی یادآوران انجام شد. نمونه‌ها در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجه سانتیگراد نگه‌داری شدند. میزان شوری، TDS و اسیدیته نمونه‌ها توسط دستگاه مالتی‌متر MettlerToledo اندازهگیری شد. غنی‌سازی نمونه‌ها بر روی محیط پایه معدنی که فنل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی به آن افزوده شد، انجام شد (13). درصد شوری محیط 5 درصد و اسیدیته محیط کشت بر روی 5/8 تنظیم شد. این محیط پایه معدنی شامل مونوپتاسیم فسفات 1 گرم در لیتر، دی آمونیوم هیدروژن فسفات 1 گرم درلیتر، پتاسیم نیترات 1 گرم درلیتر، منیزیم سولفات 2/0 گرم درلیتر و فریک کلرید 05/0 گرم درلیتر بود. فنل به عنوان تنها منبع کربن به میزان 200 میلی‌گرم در لیتر افزوده شد.
جداسازی کشت مخلوط میکروبی: یک گرم از نمونه‌های خاک و آب مناطق مختلف، در ارلن 100 میلیلیتری با 20 میلیلیترمحیط کشت حاوی 200 میلی‌گرم در لیتر فنل به مدت دو روز در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور شیکر rpm 150 انکوبه شد. بعد از 2 روز مخلوطسازی،200 میکرولیتر از محیط اولیه به محیط جدید منتقل شد و به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور شیکر rpm 150 گرمخانهگذاری شد. پاساژ دادن نمونه‌ها در محیط حاوی فنل تا 5 دور انجام شد. در نهایت، محیط‌هایی که رشد میکروبی مشخص در آن‌ها مشاهده شد، برای جداسازی سویه‌های خالص از کشت مخلوط میکروبی تجزیه کننده فنل انتخاب شدند.
خالصسازی: برای جداسازی سویه‌های خالص، رقت‌های متوالی تا 6-10 از کشت مخلوط تهیه و به محیط R2A آگار منتقل شد و با استفاده از میله L شکل در داخل پلیت پخش شدند. R2A آگار محیطی کمابیش فقیر با تنوع ترکیات منبع کربن برای جداسازی بیشتر باکتری‌های محیطی است. ترکیبات این محیط کشت (گرم بر لیتر) شامل پپتون 5/0، کازآمینواسید 5/0، دکستروز 5/0، نشاسته 5/0، سدیم پیرووات 3/0، دی پتاسیم فسفات 3/0، منیزیم سولفات 05/0 و سدیم کلراید 50 است (14). پلیتها به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. بعد از این مدت تک کلونی‌های رشد کرده، به روش خطی در محیط جدید R2A آگار کشت داده شد.خالصسازی جدایهها براساس اختلافات ریختشناسی (شکل و رنگ کلونی و ...) انجام شد. تجدید کشت تا زمان اطمینان از خالص بودن سویه‌ها انجام شد (15).
انتخاب سویه برتر: بعد از خالصسازی سویه‌ها، برای اطمینان از اینکه هر سویه به تنهایی قابلیت تجزیه فنل را داراست، سویه‌ها به محیط کشت مایع پایه معدنی تلقیح شدند. به این شکل که سوسپانسیون با کدورت نیم مک فارلند از سویه‌ها تهیه شد و به محیط پایه معدنی با غلظت 200 میلی‌گرم درلیتر فنل تلقیح شد. در این مرحله بهترین سویه از نظر رشد و تجزیه کنندگی فنل در مقایسه با سایر سویه‌ها انتخاب شد و بهینهسازی شرایط رشد برای سویه مورد نظر انجام گرفت (16).
بهینهسازی شرایط رشد سویه برتر: مهم‌ترین شاخصها برای فعالیت سویه برتر، میزان تحمل سدیم کلراید و قلیایی بودن و میزان تحمل فنل با توجه به سمیت بالای این ترکیب بود.
برای بهینهسازی غلظت سدیم کلراید، محیط کشت پایه معدنی با غلظت 200 میلی‌گرم در لیتر فنل با درصدهای متفاوتی(صفر، 5، 10، 15 و 20 درصد) در ارلنهای 100 میلیلیتری تهیه شد. برای مطالعه اثر اسیدیته روی رشد باکتری، اسیدیتههای 5/6، 5/7، 5/8، 5/9 و 5/10 بررسی شد. در مورد بهینهسازی شرایط رشد در حضور فنل، غلظت‌های 50 تا 1000 میلی‌گرم بر لیتر فنل تهیه شد. علاوه بر عوامل یاد شده، دو عامل دیگر یعنی دما (15، 20، 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتیگراد) و تأثیر نمک‌های مختلف (NaNO3، KCl، Na2SO4و NaCl) در غلظت 5 درصد حجمی- وزنی نیز با توجه به شرایط فرآیند تصفیه پساب بررسی شد.
سنجش حذف فنل: به منظور بررسی میزان حذف فنل در هر آزمایش، یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی به ویال منتقل شد و به مدت 10 دقیقه در دور
g11500 سانتریفوژ شد. پس از آن محلول رویی برای خواندن جذب در270 نانومتر (طول موجی که در آن ترکیبات آروماتیک دارای پیک جذب نوری هستند.) به کووتهای کوارتز منتقل شد. جذب نمونه‌ها در برابر محیط کشت بدون فنل به عنوان شاهد خوانده شد. تمام آزمایش‌ها با سه با تکرار انجام شد (16- 19).
به منظور تایید حذف فنل، از روش HPLC استفاده شد. بدین منظور در ابتدا و انتهای آزمایش یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی به ویال منتقل شد و به مدت 10 دقیقه در دورg 11500 سانتریفوژ شد. برای استخراج ترکیبات فنلی از محلول رویی، سه بار همحجم آن حلال تریکلرومتان افزوده و استخراج انجام شد. با قرار دادن حلال تریکلرومتان حاوی ترکیبات فنلی در دمای محیط، این حلال فرار به سرعت تبخیر شد و در نهایت، رسوب باقیمانده در بافر پتاسیمفسفات به اندازه همان حجمی از مخلوط واکنش که استخراج شده بود، حل شد (20).
برای تحلیل HPLC نمونه‌ها از ستون [3] C18 به عنوان فاز سکون و از آب و متانول با نسبت حجمی 50 درصد استفاده شد. دستگاه مجهز به UV detector 2500 مدل Knauer بوده و برای تشخیص ترکیبات فنلی از طول موج 270 نانومتر استفاده و 20 میکرولیتر از نمونه‌های استخراج شده به دستگاه تزریق شد (20).
.شناسایی مولکولی سویه‌های تجزیه کننده فنل: شناسایی مولکولی سویه‌های تجزیه کننده فنل با تکثیر و تعیین توالی ژن 16S rRNA سویه‌ها انجام شد. برای این منظور ابتدا از سویه‌ها زیست توده تهیه و سپس استخراج DNA براساس روش اصلاح شده Marmur انجام شد (20). پس از تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با روش‌های اسپکتروفتومتری و الکتروفورز، از این DNA برای انجام PCR و تکثیر ژن مربوط به زیر واحد کوچک ریبوزومی استفاده شد. این تکثیر با استفاده از پرایمرهای عمومی 16S rRNA، 27F (پرایمر رفت) با توالی 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' و 1492 R (پرایمر برگشت) با توالی
5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' و از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز انجام شد. تکثیر ژن
16S rRNA با استفاده از الکتروفورز تایید شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم نهایی 30 میکرولیتر انجام شد که 3 میکرولیتر بافر 10X PCR با غلظت برابر 1X، 1-2 میکرولیتر MgCl2 با غلظت برابر 50 میلیمولار، dNTP با غلظت 4/0 میلیمول در حجم نهایی، 1میکرولیتر از پرایمرهای رفت و برگشت با غلظت 100 پیکومولار، آنزیم Taq پلیمراز 50U/2 میکرولیتر و DNA به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه نسبت به سایرنمونهها که در آن به جای DNA الگو از آب دیونیزه استریل استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برنامه تکثیری واکنش زنجیرهای پلیمراز طبق برنامه ذیل انجام شد: واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، سپس 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت با دمای 95 درجه سانتیگراد و اتصال با دمای 57 درجه سانتیگراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 50 تا 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه. محصول نهایی واکنش زنجیره ای پلیمراز توسط روش دی‌داکسی به شکل رفت و برگشت تعیین ترادف شد. نتایج حاصل با استفاده از نرم افزار Chromas pro ویرایش شده و با کمک ابزار BLAST با توالی‌های معتبر ثبت شده در پایگاه ژنی EzTaxon مقایسه و نزدیک‌ترین سویه از نظر مشابهت در توالی ژن 16S rRNA شناسایی شد. تحلیل فیلوژنتیک سویه منتخب با استفاده از نرم افزارهای ClustalX و Mega6 و رسم درخت فیلوژنتیک مربوط به این سویه با استفاده از الگوریتم Neighbour Joining انجام شد (21- 24).
.نتایج
ویژگی‌های فیزیکی نمونه‌ها سنجیده شد و نتایج آن در جدول 1 آورده شده است.
در مرحله غنی‌سازی، فقط کشت حاصل از نمونه آب مخزن یادآوران به ایجاد کدورت منجر شد. با توجه به حضور فنل به عنوان تنها منبع کربن در محیط، ایجاد کدورت نشان دهنده توان میکروارگانیسمها در تجزیه فنل است که نتایج HPLC نیز حذف فنل از محیط کشت را تایید کرد (شکل 1).
جدول 1- شوری و اسیدیته نمونه‌های مورد بررسی
|
نمونه‌ها |
شوری |
اسیدیته |
|
خاک پالایشگاه تهران |
8 درصد |
5/7 |
|
آب مخزن یادآوران |
12 درصد |
7/7 |
|
خاک شور قم |
15 درصد |
5/7 |
|
خاک پالایشگاه خارک |
5 درصد |
2/7 |
شکل 1- تایید حذف فنل در کشت به دست آمده از نمونه آب مخزن یادآوران با کمک HPLC
در ادامه کار سه سویه با توانایی تجزیه فنل از نمونه کشت غنیشده جدا شدند. برای انجام مراحل بعدی پژوهش انتخاب سویه براساس توانایی تحمل غلظت بالای فنل و میزان حذف آن انجام شد. همانطور که در شکل 2 مشاهده می‌شود، جدایه YF3 با 97 درصد تجزیه فنل پس از سه روز گرماگذاری به عنوان سویه برتر انتخاب شد.
بهینهسازی شرایط رشد سویه YF3:برای اینکه سویه برتر بیش‌ترین بازدهی در تجزیه فنل را داشته باشد، شرایط رشد بهینهسازی شد. تمام نتایج بعد از 72 ساعت تلقیح خوانده شد. همانطور که در شکل3 قابل مشاهده است، بهینه نمک برای رشد سویه YF3 غلظت 5 درصد وزنی- حجمی سدیم کلراید است . اما این سویه قادر به رشد در غلظت‌های سدیم کلراید بالاتر از 10 درصد نبود. همچنین، سویه YF3 توانایی رشد در محیط بدون نمک را نداشت.
با توجه به شکل 4، اسیدیته بهینه برای رشد سویه YF3،5/8 است. در طی این آزمایش مشاهده شد که این سویه در محیط پایه معدنی دارای فنل، توانایی رشد در شرایط قلیایی بالاتر از 5/9 را ندارد.
بیش‌ترین رشد و حذف فنل، درغلظت 400 میلی‌گرم بر لیتر فنل در شکل 5 قابل مشاهده است. کمترین غلظت مورد بررسی 50 میلی‌گرم بر لیتر بود. البته سویه YF3 قادر به رشد تا غلظت 1000 میلی‌گرم بر لیتر فنل نیز است.
شکل 2- میزان رشد و درصد تجزیه فنل جدایههای تجزیه کننده فنل در حضور ppm 200 فنل، اسیدیته 5/8 و دمای 30 درجه سانتیگراد
شکل 3- بهینهسازی غلظت سدیم کلراید در حضور ppm200 فنل، اسیدیته5/8 و دمای 30 درجه سانتیگراد
شکل 4- بهینهسازی اسیدیته در حضورppm 200 فنل و سدیم کلراید 5 درصد و دمای 30 درجه سانتیگراد
شکل 5- بهینهسازی غلظت فنل در اسیدیته 5/8 و سدیم کلراید 5 درصد (W/V)و دمای 30 درجه سانتیگراد
شکل 6- بهینهسازی دما در اسیدیته 5/8 و سدیم کلراید 5 درصد (W/V)وppm 200 فنل
شکل 7- تأثیر نمک‌های مختلف با غلظت 5 درصد حجمی- وزنی در رشد سویه YF3
همچنین با مشاهده شکلهای 6 و 7 مشاهده می شود که این سویه بیش‌ترین میزان رشد و حذف فنل را در دمای 30 درجه سانتیگراد و در حضور نمک NaNO3 دارد.
نتایج حاصل از تعیین توالی ژن 16S rRNA سه سویه موردنظر و مقایسه آن‌ها با داده‌های ثبت شده در پایگاه EzTaxon در جدول 2 مشخص شده است. در این میان سویه YF6 با30/99 درصد شباهت، بیش‌ترین میزان شباهت را داراست.
درخت فیلوژنتیک سویه‌های شناسایی شده بر پایه روش neighbor joining و با استفاده از نرم افزار MEGA6 ترسیم شد.
جدول 2- مقایسه میزان شباهت ژن 16S rRNA سویه‌ها با سویه‌های استاندارد
|
نام سویه |
شماره دستیابی |
درصد شباهت |
سویه استاندارد با بیش‌ترین میزان شباهت |
|
YF3 |
KP027471 |
9/98 |
Janibacter cremeus HR08-44 |
|
YF6 |
KP027470 |
3/99 |
Halomonas aidingensis Ad-1 |
|
YF7 |
KP027472 |
7/97 |
Pseudomonas pelagia CL-AP6 |
شکل 7- درخت فیلوژنتیک سویه‌های تجزیه کننده فنل بر پایه روش neighbour joining
. بحث و نتیجه گیری
در سال‌های اخیر، با توجه به افزایش رو به رشد صنایع و حجم بالای آلودگی تولید شده ناشی از پساب‌های صنعتی، جوامع صنعتی و نیمه صنعتی با مشکلات زیست محیطی بسیاری رو به رو هستند. آلودگی آب، خاک، هوا، رسوبات و آب‌های زیرزمینی با آلاینده‌های شیمیایی و سمی یکی از مهم‌ترین مشکلات این جوامع محسوب می‌شود (25). پساب‌های صنعتی معمولا توسط روش‌های فیزیکی- شیمیایی مرسوم تصفیه می‌شوند. اما ناکارآمدی و هزینه‌های بالای این روش‌ها، باعث توجه به روش‌های جایگزین شده است.
باکتری‌های کلیدی در مسیر تجزیه فنل، سودوموناسها هستند که توانایی متابولیکی بالایی در تجزیه انواع ترکیبات آروماتیک دارند. در این مطالعه سه سویه تجزیه کننده فنل، از اعضای جنس Halomonas، Pseudomonas و Janibacter بودند. در مورد توانایی تجزیه فنل توسط دو جنس نخست، مطالعات زیادی انجام شده است. اما در مطالعه حاضر سویه برتر تجزیه کننده فنل، از جنس Janibacter بود. این مطالعه نخستین گزارش در مورد توانایی اعضای این جنس از اکتینوباکتریا در زمینه تجزیه زیستی فنل است. این سویه، با 9/98 درصد به Janibacter cremeus شباهت دارد و قادر به تجزیه فنل در غلظت‌های بالای این ترکیب آروماتیک است. به طور کلی جنس Janibacter با توانایی آن‌ها در تجزیه ترکیبات پلی آروماتیک شناخته می‌شوند. در بررسیهایی که انجام شده است، سویه باکتریایی مربوط به اعضای جنس Janibacter قادر به تجزیه گروهی از ترکیبات پلی آروماتیک از جمله آنتراسن، فنانترن، دی بنزوتیوفن و فلوئورن بودند (26- 27).
مطالعات محدودی در مورد تجزیه زیستی فنل در شرایط اکستریم (شوری و قلیایی) وجود دارد. فنل به عنوان یک ترکیب هیدروکربنی آروماتیک و بسیار سمی هدف بسیاری از این مطالعات در شرایط نمکی بوده است. در مطالعه بوستس[iv] و همکاران سویه باکتریایی جدا شده قابلیت تجزیه فنل در غلظت 6/5 درصد سدیم کلراید و تا بیشینه غلظت فنل 700 میلی‌گرم بر لیتر را دارا بود (28). در زمینه تجزیه فنل در شرایط قلیایی نیز گزارش‌های کمی موجود است که یک مورد آن مطالعه کناکار[v] و همکاران است. در این مطالعه چهار سویه قلیادوست جدا شده، برای تصفیه پساب‌های صنعتی در اسیدیته 10 استفاده شدند که بیش‌ترین میزان حذف فنل توسط این سویه‌ها 660 میلی‌گرم درلیتر بود (29).
در مطالعه حاضر، سویه برتر قابلیت تحمل و رشد در شرایط اکستریم را داراست. بیشینه اسیدیته رشد سویه 5/10 و بیشینه غلظت نمک سدیم کلراید 10 درصد است. از این رو سویه YF3 به عنوان یک باکتری نمک- قلیادوست شناسایی می شود. بالاترین دمای رشد سویه 35 درجه سانتیگراد است. آنزیم کلیدی مسیر تجزیه فنل، فنل هیدورکسیلاز است که به دمای بالاتر از 35 درجه سانتیگراد حساس است و به طور درخور توجهی فعالیت خود را از دست می دهد (30). به نظر می رسد عدم رشد سویه YF3 در دمای بالاتر از 35 درجه سانتیگراد نیز به خاطر کاهش فعالیت این آنزیم است.
همچنین مشخص شد نمک بهینه برای رشد سویه YF3 در این پژوهش سدیم نیترات بود. از میان نمک‌های سدیمی و پتاسیمی مورد بررسی، این سویه نمک‌های سدیمی را ترجیح می دهد.
معدودی از مطالعات در زمینه تجزیه زیستی فنل در غلظت‌های بالای این ترکیب آروماتیک انجام شده‌اند که از جمله آن‌ها می‌توان به گزارشی اشاره کرد که بالاترین غلظت قابل تحمل برای میکروارگانیسم مورد بررسی، Candida tropicalis، 2000 میلی‌گرم بر لیتر مشاهده شد (31). شایان ذکر است هیچ کدام از شرایط آزمایش اکستریم نبود.
در مطالعه حاضر با وجود شرایط اکستریم حاکم بر آزمایش، بیش‌ترین میزان تجزیه غلظت فنل توسط سویه YF3، 1000 میلی‌گرم در لیتر بود. با توجه به اینکه میزان فنل موجود در پساب‌های کمتر از این میزان است، این سویه می‌تواند نقشی کاربردی در تصفیه پساب‌های فنلی ایفا کند.
)