نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 استادیار پژوهشی، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی اصفهان، ایران
2 کارشناس ارشد علوم دامی، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Environmental factors and diet are of the most important factors that affect the microbial population of the gastrointestinal tract and there are many antimicrobial systems in honey bees and their foods naturally. The purpose of this study was to investigate the effect of dietary acetic acid and concentrated mixture of probiotic and antibiotics of oxytetracycline and neomycin on population coliform bacteria and lactobacilli changes in honey bee pupae.
Materials and methods: The experimental treatments consisted of different levels of acetic acid 5 % (10, 20 and 30 g/l), protexin probiotic, Oxytetracycline 20 % and Neomycin 20 % antibiotics with levels of 0.1, 0.2 and 0.3 g/l and sugar syrup 50 % and honey syrup 50 % was performed in a completely randomized design with four replications for 20 days. After feeding the experimental groups, one gram of 18 day old worker bees' pupae samples of each colony was poured into 9 ml of physiological solution. After preparing different dilutions, each sample was inoculated on MRS agar and MacConkey agar medium. Lactobacillus and coliform colonies were counted after finishing incubation period.
Results: The results showed that the highest population of coliform bacteria treated with sugar syrup (2.58 log CFU/g) and the lowest in treatments 0.2 and 0.3 g Neomycin, Oxytetracycline, and probiotic that were equal to zero (P value <0.05). The highest population of Lactobacillus bacteria belonged to 0.2 g probiotic treatment (4.05 log CFU/g) and the lowest was for 0.2 and 0.3 g Neomycin treatment which was equal to zero (P value <0.05).
Discussion and conclusion: This study showed that the addition probiotic in sugar syrup for feeding larvae resulted in increasing population of Lactobacilli in the body of the bee pupae than the control groups.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
توسعه اقتصادی نگهداری زنبورعسل به طور مستقیم به سلامت کلونیهای زنبورعسل بر میگردد. تا کنون چندین بیماری باکتریایی مؤثر بر کندوهای زنبورعسل شناسایی شدهاند که از آن جمله میتوان به بیماری لوک آمریکائی[1] و لوک اروپایی[2] اشاره کرد. عوامل این 2 بیماری به ترتیب باکتریهای پانی باسیلوس لاروا لاروا[3]و ملیسوکوکوس پلوتون[4] هستند (1). با وجود این تاکنون مطالعات کمی در مورد میکروفلورای موجود در کندوهای زنبورعسل انجام شده (2)، ولی مشخص شده است که تعداد باکتریهای موجود در شانهای نوزادان کمتر از باکتریهای موجود در نمونههای زنبور بالغ (105- 101 در مقایسه با 108 - 103) هستند (3). تخمهای تولیدی ملکه زنبور عسل، زنبورانی که در مرحله پیش شفیرگی یا شفیرگی هستند و یا زنبوران عسل کارگر تازه متولد شده معمولاً عاری یا دارای تعداد اندکی میکروارگانیسم در داخل اندامهای داخلی هستند (4- 6). سیستمهای ضد میکروبی بسیاری به طور طبیعی در زنبوران عسل و غذای آنها وجود داشته (7 و 8) و بدون شک نقشی در حفظ این فضای کمابیش عاری از میکروب در نوزادان دارند. به هر حال بعضی از لاروها میکروارگانیسمهایی را از زنبوران بالغ، گرده گل، شانها و یا در طی بلعیدن غذای آلوده دریافت میکنند (9). به طور کلی عوامل محیطی و تغذیهای از جمله مهمترین عوامل تأثیرگذار بر فلور میکروبی دستگاه گوارش زنبور عسل هستند (10). در این ارتباط از نخستین منابع تغذیهایی که به عنوان افزودنیهای غذایی مورد توجه قرار گرفتند آنتی بیوتیکها و عوامل ضد باکتریایی بودند (11). این داروها در غلظتهای پایین همراه با غذا به عنوان محرک رشد و در غلظتهای درمانی نیز برای مبارزه با بیماریها به کار میروند. البته مشخص شده که استفاده نامنظم و زیاد از آنتیبیوتیکها در غذای حیوانات، با هدف پیشگیری از بروز بیماری میتواند به مقاومت در برابر آنتی بیوتیک منجر شود (11). در ارتباط با زنبور عسل نیز پژوهشهای انجام شده نشان داده که تعداد زیادی از میکروبهای مفید از جمله لاکتوباسیلویها شناخته شده در فعل و انفعالات بدن زنبور عسل شرکت دارند. بدین ترتیب استفاده بیرویه ازآنتی بیوتیکها ممکن است این میکروارگانیسمهای مفید را نیز از بین برده و زنبور عسل را از مزایای آنها بیبهره سازد (10). علاوه بر این، آنتیبیوتیکها دارای خطرات سمیت برای زنبورها بوده و احتمال آلوده شدن عسل نیز وجود دارد (3 و 12). به همین علت در کشورهایی که استفاده از آنتی بیوتیک ممنوع میباشد، بیشتر کلونیهای مبتلا به بیماری باید معدوم شوند (13). به طور کلی تأثیر آنتیبیوتیکها بر نتیجه درمان بیماری، بیشتر به جمعیت میکروبی دستگاه گوارش مربوط است. بنابراین، هر نوع پژوهش روی تغییرات حاصل از اعمال یک رژیم غذایی خاص بر جمعیت باکتریایی در میکروفلور دستگاه گوارش، به عنوان نقطه آغازی برای یافتن جایگزینهای مناسبی برای آنتی بیوتیک است (14). اجرای مدیریت تغذیهای به کمک برخی از باکتریهایی که به تازگی به عنوان پروبیوتیکها ارزیابی شدهاند، میتواند اثرات سودمندی در بهبود سلامتی ایفا کند. در حال حاضر استفاده از پروبیوتیکها در تغذیه دام و طیور رایج و متداول شده است (15- 18). در رابطه با زنبور عسل نیز نتایج مطالعات مختلف بیان کننده قابلیت باکتریهای غیربیماریزا و مفید به عنوان تحریک کننده سیستم دفاعی زنبور عسل است. در این ارتباط برخی از پژوهشگران افزایش قابل توجه سطوح رونوشت پپتید ضد باکتریایی آباسین[5]در همولنف زنبور عسل را پس از 12 ساعت ازشروع تغذیه با پروبیوتیک گزارش کردهاند (13 و 19).
اسیدهای آلی نیز ترکیبات دیگری هستند که دارای فعالیت ضد میکروبی بوده و به عنوان جایگزین بالقوه برای آنتی بیوتیکها پیشنهاد میشوند. این اسیدها میتوانند به دیواره سلولی باکتریایی مضر نفوذ کرده و عملکردهای طبیعی انواع مشخصی از آنها شامل سالمونلا[6]، اشریشیاکلی[7]، کلستریدیا[8]، لیستریا[9]و برخی از انواع کلی فرم[10] را تخریب سازند. البته اسیدیکنندهها تأثیرات متفاوتی بر انواع میکروبهای روده ای دارند. این تفاوتها در نتیجه استفاده از انواع و سطوح مختلف اسیدهای آلی در رژیمهای غذایی ممکن است متغیر باشد (20). واردال[11] گزارش کرد که اسیدیته روده نوزادان زنبور عسل بین 5 تا 2/7 متغیر است (21)، در حالی که بیگنل و هیس[12] بیان کردند که اسیدیته روده بین 6/6 تا 8/6 در نوسان است (22). همچنین، واردال گزارش کرد که ایجاد تغییر در اسیدیته روده نوزادان زنبور عسل میتواند بر تکثیر باکتری ملیسوکوکوس پلوتون در دستگاه گوارش و در نتیجه ابتلای نوزادان به بیماریلوک اروپایی تاثیر گذار باشد (21). در بررسیهای انجام گرفته مشخص شده است که این باکتری به خوبی روی محیط کشت با اسیدیته6/6 رشد میکند (23)، اما نمیتواند روی محیطهای کشت با اسیدیته 4 یا 8 رشد و تکثیر داشته باشد (24). او همچنین اثبات کرد که جمعیت باکتریها در روده نوزادان زنبور عسل در پاسخ به اسیدیته متغیر خواهند بود. این پژوهشگر به طور مؤثری بیماری لوک اروپایی را از طریق تغذیه کردن نوزادان با گردههای دارای اسیدیته بالا کنترل کرد (21).
با توجه به موارد بیان شده مربوط به تعاملات بین گونههای مختلف باکتریایی درون کندوها و پویایی جمعیت باکتریایی دستگاه گوارش زنبور عسل میتوان از این موضوع برای توسعه راهکارهای جدید به منظور کنترل بیماریها و اجتناب از استفاده مواد ضدمیکروبی تجاری مثل آنتیبیوتیک استفاده کرد. بدین ترتیب پژوهش حاضر به منظور مقایسه اثرات تغذیهای سطوح مختلف اسید استیک، پروبیوتیک و آنتی بیوتیکهای اکسی تتراسیکلین و نئومایسین بر جمعیت باکتریهای کلی فرم و لاکتوباسیل موجود در کل بدن شفیره زنبور عسل انجام گرفت، تا غلطت تأثیر گذاری هر کدام از مواد آزمایشی مورد مطالعه نیز مشخص شود.
.مواد و روشها
در این آزمایش از نمونههای زنبورعسل اروپایی[13] استفاده شد تیمارهای آزمایشی شامل سطوح مختلف اسید استیک 5 درصد (10، 20 و 30 گرم در لیتر)، کنسانتره مخلوط پروبیوتیکی[14] (1/0، 2/0 و 3/0 گرم در لیتر) به نام تجاری پروتوکسین و ساخت کشور انگلستان، آنتیبیوتیک اکسی تتراسیکلین 20 درصد (1/0، 2/0 و 3/0 گرم در لیتر) از شرکت داملران رازک، آنتیبیوتیک نئومایسین 20 درصد (1/0، 2/0 و 3/0 گرم در لیتر) از شرکت داملران رازک و شربت شکر 50 و شربت عسل 50 درصد (به عنوان گروههای شاهد) بودند. برای ممانعت از ترکیب عناصر و یونهای موجود در آب با مواد افزودنی نیز از آب مقطر استفاده شد. بدین ترتیب آزمایش حاضر با 14 تیمار و 4 تکرار در قالب یک طرح کاملاً تصادفی انجام شد. کلونیهای تحت آزمایش با 4 قاب جمعیت زنبور بالغ که حاوی لاروهای زنبور عسل بودند نیز به صورت روزانه از مواد آزمایشی مورد نظر به مدت 20 روز و در ماه مهر تغذیه شدند. سپس، از هر کلونی یک قطعه شان سر بسته به ابعاد 10×10 سانتیمتر که حاوی شفیرههای زنبوران کارگر با سن 18 روز که از زمان تخم گذاری ملکه علامتگذاری شده بودند انتخاب شدند تا اثر مصرف مواد آزمایشی در پایان دوره نوزادی و قبل از تولد زنبوران مشخص شود. سطح شانهای منتقل شده به آزمایشگاه، ابتدا با الکل 70 درصد ضد عفونی شد و سپس، شفیرهها از سلولهای شان خارج و در ظرف استریل کاملاً له شد. سپس یک گرم از نمونه داخل 9 سی سی محلول فیزیولوژی ریخته و با کمک شیکرکاملاً مخلوط شد. پس از تهیه رقتهای 1- 10،
2-10، 3- 10، 4-10 و 5-10، از هر نمونه در محیط کشت اختصاصی کلی فرمها (مک کانکی آگار[15]) و محیط کشت اختصاصی لاکتوباسیلوسها (ام آر اس آگار[16]) تلقیح شد. تمامی محیطهای کشت ام آر اس ابتدا داخل شیشه بیهوازی حاوی گاز پک قرار داده و به همراه بقیه محیطهای کشت در انکوباتور با دمای37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. کلونیهای کلی فرم بعد از 24 ساعت و کلونیهای لاکتوباسیل بعد از 72 ساعت توسط شمارشگر الکترونیکی شمارش شد (25 و 26).
اطلاعات حاصل از این پژوهش نیز با استفاده از بسته نرم افزاری SAS (27) و با کاربرد مدل آماری طرحهای کاملاً تصادفی تجزیه و تحلیل آماری شد. مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون چند دامنه دانکن (28) انجام شد.
.نتایج
مقایسه میانگینهای مربوط به اثر تغذیهای تیمارهای آزمایشی بر جمعیت باکتریهای کلی فرم و لاکتوباسیل شفیرههای زنبور عسل در جدول 1 نشان داده شده است. نتایج حاصل از آزمایش حاضر بیانگر آن است که بیشترین جمعیت باکتری کلی فرم مربوط به تیمار شربت شکر (58/2 لگاریتم واحد تشکیل کلونی بر گرم) و کمترین یا به عبارتی مقادیر عددی صفر جمعیت کلیفرمی مربوط به تیمارهای 2/0 و3/0گرم نئومایسین، اکسی تتراسیکلین، و پروبیوتیک میباشد
(05/0>P value). علاوه بر این، به موازات افزایش غلظت آنتیبیوتیکها و پروبیوتیک از میزان جمعیت کلی فرم به میزان زیادی کاسته شد. استفاده از سطوح مختلف استیک اسید و شربت عسل نیز سبب کاهش جمعیت کلی فرمها شد ولی این کاهشها نسبت به تیمار شربت شکر معنادار نبود.
با مراجعه به جدول 1 میتوان مشاهده کرد که تیمارهای آزمایشی آثار معناداری روی باکتریهای لاکتوباسیل داشتند (05/0>P value)، به نحوی که بیشترین جمعیت لاکتوباسیلوس مربوط به تیمار 2/0 گرم پروبیوتیک (05/4 لگاریتم واحد تشکیل کلونی بر گرم) و کمترین جمعیت مربوط به تیمارهای 2/0 و3/0 گرم نئومایسین و برابر صفر بود. استفاده از غلظت 10 گرم در لیتر استیک اسید 5 درصد نیز سبب افزایش لاکتوباسیلوس در شفیره زنبور عسل نسبت به گروههای آنتی بیوتیک و شاهد شد.
جدول 1- مقایسه میانگین جمعیت باکتریهای کلی فرم و لاکتوباسیل موجود در شفیره زنبور عسل (لگاریتم واحد تشکیل کلونی بر گرم)
(Log CFU/g)
|
تیمار |
عامل |
جمعیت کلی فرمها (لگاریتم واحد تشکیل کلونی بر گرم) |
جمعیت لاکتوباسیلوسها (لگاریتم واحد تشکیل کلونی بر گرم) |
|
استیک اسید 5 درصد |
10 گرم در لیتر |
ab83/0 |
ab91/3 |
|
استیک اسید 5 درصد |
20 گرم در لیتر |
ab65/1 |
abc38/2 |
|
استیک اسید 5 درصد |
30 گرم در لیتر |
ab83/0 |
bc16/1 |
|
پروبیوتیک |
1/0 گرم در لیتر |
ab83/0 |
bc25/1 |
|
پروبیوتیک |
2/0 گرم در لیتر |
b00/0 |
a05/4 |
|
پروبیوتیک |
3/0 گرم در لیتر |
b00/0 |
ab84/3 |
|
نئومایسین 20 درصد |
1/0 گرم در لیتر |
ab83/0 |
c83/0 |
|
نئومایسین 20 درصد |
2/0 گرم در لیتر |
b00/0 |
c00/0 |
|
نئومایسین 20 درصد |
3/0 گرم در لیتر |
b00/0 |
c00/0 |
|
اکسی تتراسیکلین 20 درصد |
1/0 گرم در لیتر |
ab65/1 |
c83/0 |
|
اکسی تتراسیکلین 20 درصد |
2/0 گرم در لیتر |
b00/0 |
c06/1 |
|
اکسی تتراسیکلین 20 درصد |
3/0 گرم در لیتر |
b00/0 |
abc32/2 |
|
شاهد |
شربت شکر (1:1) |
a58/2 |
c98/0 |
|
شاهد |
شربت عسل (1:1) |
ab83/0 |
c83/0 |
|
خطای استاندارد |
|
01/1 |
47/1 |
a-c در هر ستون میانگینهای با حروف متفاوت، با یکدیگر تفاوت معناداری دارند (05/0>P value).
.بحث و نتیجه گیری
در پژوهش حاضر مشاهده شد که برخی از سطوح مواد آزمایشی مورد استفاده سبب کاهش جمعیت کلیفرمها شدند. با توجه به اینکه لاروهای جوان (1 تا 3 روزه) فقط از ژله رویال تغذیه شده و لاروهای مسن (4 تا 6 روزه) از مخلوط عسل رقیق شده (یا شربت شکر) و گرده تغذیه میشوند، این نتایج نشان میدهد که ترکیب جیره غذایی در طی دوره لاروی زنبور عسل بر میزان جمعیت کلی فرمهای آن تأثیرگذار بوده است. مطالعات ال لیتی[xvii] و همکاران نیز نشان داد که تغذیه منبع تأثیرگذار بر جمعیت میکروبی زنبور عسل است (10). اسمولسکا زیمکاوسکا[xviii] نیز گزارش کرد که استفاده از آنتیبیوتیک فوماژیلین سبب کاهش جمعیت کلیفرمها در زنبور عسل شد (29). البته استفاده از سطوح مختلف استیک اسید نیز سبب کاهش جمعیت کلی فرمها نسبت به تیمار شربت شکر شد ولی این کاهش معنادار نبود (جدول 1). نتایج حاصل از آزمایشهای دیگر پژوهشگران نیز نشان داده که اسیدیکنندهها آثار متغیری بر جمعیت میکروبی روده داشته و این تغییرات ممکن است در نتیجه استفاده انواع مختلف و سطوح متفاوت اسیدهای آلی به اندازه تغذیه آنها با رژیمهای غذایی متنوع متغیر باشد (16). البته برخی پژوهشگران نیز اظهار داشتهاند که در محیط آزمایشگاه، نوزادان زنبورعسل قادرند غلظت یونی (بافری) غذای خود را ثابت نگه داشته و در نتیجه، تحت تأثیر تغییرات اسیدیته غذا قرار نمیگیرند (21 و 24). در آزمایش حاضر مقایسه دو گروه کنترل مثبت با یکدیگر نیز نشان داد که اگر چه استفاده از شربت عسل در مقایسه با شربت شکر جمعیت کمتری از کلیفرمها را در شفیرههای زنبوران نشان میدهد اما این کاهش از نظر آماری معنادار نیست و به نظر میرسد علت این کاهش با حضور مواد ضدمیکروبی درون شهد و عسل قابل توجیه باشد (30).
در این پژوهش استفاده از سطوح 2/0 و 3/0 گرم در لیتر پروبیوتیک به علت داشتن طیف وسیعی از باکتریهای لاکتوباسیل بر خلاف سطوح مختلف آنتیبیوتیک نئومایسین به طور مؤثری سبب افزایش معنادار آنها در شفیره زنبور عسل شد. بهجتیان اصفهانی[xix] و همکاران نیز نشان دادند که استفاده از پروبیوتیکها سبب افزایش جمعیت لاکتوباسیلوسها و آنتی بیوتیک سبب کاهش آنها در دستگاه گوارش زنبوران بالغ شد (31). همچنین، استفاده از استیکاسید 5 درصد با غلظت 10 گرم در لیتر نیز سبب افزایش جمعیت باکتریهای لاکتوباسیل در شفیره زنبور در مقایسه با گروههای شاهد شده است.
با توجه به نتایج پژوهش حاضر به نظر میرسد با استفاده از یک اسیدی کننده مناسب همانند استیکاسید 5 درصد (سرکه معمولی) و یا به واسطه استفاده از پروبیوتیک در تغذیه زنبوران عسل میتوان نسبت به افزایش جمعیت لاکتوباسیلوسها در نوزادان زنبور عسل اقدام کرد.
[1]- American foul brood (AFB)
[2]- European foul brood (EFB)
[3]- Peanibacilluslarvae larvae
[4]- Melissoccus pluton
[5]- Abaecin
[6]- Salmonella spp
[7]- Escherichia coli
[8]- Clostridia spp
[9]- Listeria spp
[10]- Coli forms
[11]- Wardall
[12]- Bignell and Heath
[13]- Apis mellifera L.
[14]- پروبیوتیک پروتوکسین به شکل کنسانتره مخلوط 109×2 و دارای مجموعهای از سویههای گوناگون از باکتریهای سودمند شامل Lactobacillus plantaroum، Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus، Lactobacillus acidophilus، Lactobacillus rhamnosusوBifidobacteriumbifidumبود و در داروخانه دامپزشکی موجود است.
[15]- MacConkey agar
[16]- MRS agar
[xvii]- El-Leithy
[xviii]- Smolska-Szymczewska
[xix]- Behjatian Esfahani
)