نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، جهرم، ایران
2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، جهرم، ایران
3 دانشیار ژنتیک مولکولی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، ایران
4 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، ایران
چکیده
مقدمه: اینتگرونها عناصر ژنتیکی متحرکی هستند که توانایی کسب و درج کاستهای ژنی مقاومت آنتیبیوتیکی را دارند و نقش مهمی در گسترش مقاومت دارویی ایفا میکنند. هدف از این پژوهش، ارزیابی نقش اینتگرون کلاس 1 در مقاومت دارویی جدایههای اشریشیاکلی اسهالزا در کودکان زیر 5 سال است.
مواد و روش ها: 164 جدایهی اشریشیاکلی اسهالزا در کودکان زیر 5 سال از نظر حضور ژنintI1 و کاست ژنی درج شده در اینتگرون کلاس یک ارزیابی شد. همچنین، مقاومت آنتیبیوتیکی با استفاده از استاندارد CLSI بررسی شد.
نتایج: میزان شیوع ژن intI1 و کاست ژنی در جدایههای اشریشیاکلی به ترتیب 73/70 و 63/64 درصد بود. اندازه کاستهای ژنی در این نمونهها از 750 تا 2000 جفت باز متغییر بود. همچنین، بین حضور اینتگرون کلاس 1 و کاست ژنی آن و مقاومت نسبت به استرپتومایسین، جنتامایسین، کانامایسین، آمیکاسین، کلرامفنیکل، تتراسایکلین، نالیدیکسیکاسید و کوتریموکسازول ارتباط معناداری به دست آمد.
بحث و نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان داد که اینتگرون کلاس 1 و کاستهای ژنی درج شده در آن، در بین اشریشیاکلیهای اسهالزا در منطقه مورد پژوهش شیوع در خور توجهی دارد. با توجه به امکان شیوع گسترده سویههای مقاوم به دارو، ضرورت پایش مولکولی جدایههای اشریشیاکلی در سایر مناطق کشور وجود دارد.
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Monitoring of class1 integrons in diarrheagenic E. coli strains isolated from children in Yasouj
نویسندگان [English]
- Mohammad Kargar 1
- Zahra Mohammadalipour 2
- Abbas Doosti 3
- Shahrokh Lorzadeh 4
- Fataneh Moein Jahromi 2
1 Associate Professor of Microbiology, Jahrom Branch, Islamic Azad University, Jahrom, Iran
2 M.Sc. of Microbiology, Jahrom Branch, Islamic Azad University, Jahrom, Iran
3 Associate Professor of Molecular genetics, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
4 M.Sc. of Biotechnology, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
چکیده [English]
Introduction:Integrons are mobile genetic elements able to acquire and integrate the antibiotic resistance gene cassettes and play an important role in the development of the drug resistant. This study assessed the contribution of class 1 integron in drug resistant diarrheagenic Escherichia coli strains, in children under 5 years.
Materials and methods: 164 diarrheagenic E. coli strains isolated from children under 5 were evaluated to investigate intI1 gene and gene cassette. Furthermore the antibiotic resistance was determined using CLSI critria.
Results: The rate of intI1 gene and gene cassette in Escherichia coli isolates were 70.73 % and 64.63 %, respectively. In these samples, gene cassette sizes varied from 750 to 2000 bp. There was a significant correlation between the presence of class 1 integron and resistance to streptomycin, gentamicin, kanamycin, amikacin, chloramphenicol, tetracycline, nalidixic acid and cotrimoxazole.
Discussion and conclusion: The present study elucidates that the rampancy of class 1 integron and the incorporated gene cassettes is quite high among diarrheagenic E. coli in our area of research. Hence, considering the prospect of widespread break out of the drug-resistant strains of E.coli, further molecular analysis in different regions of the country is essential.
کلیدواژه‌ها [English]
- Diarrheagenic E. coli
- Class 1 integron
- Gene cassette
- drug resistance
مقدمه
اشریشیاکلی[1] یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده گاستروانتریت به ویژه در کودکان است. بیماریهای اسهالی در همه گروههای سنی و در تمام مناطق جغرافیایی جهان شایع است. عوامل باکتریایی حدود 24 درصد از موارد اسهال را ایجاد میکنند و بیش از 70 درصد مرگ و میر کودکان زیر 5 سال در اثر بیماریهای اسهالی اتفاق میافتد (1).
مقاومت آنتیبیوتیکی یک پدیده طبیعی در پاسخ به استفاده از عوامل ضدمیکروبی است (2). انتشار ژنهای مقاومت آنتیبیوتیکی در بین سویههای باکتریایی در حال افزایش است که به پیچیدگی درمان بیماریهای عفونی منجر میشود (3- 5). گسترش مقاومت به آنتیبیوتیکها، کشف بسیاری از عناصر ژنتیکی متحرک مانند ترانسپوزونها و پلاسمیدها را به دنبال داشته است (6). همچنین، در مطالعات اخیر مکانیسمهای دیگری نیز برای انتشار ژنهای مقاومت شناسایی شده است (3). ژنهای مقاومت میتوانند درون عناصر متحرک DNA به نام اینتگرون[2] درج شوند. اگرچه اینتگرونها به تنهایی متحرک نیستند، اما به علت حضور در پلاسمیدها و ترانسپوزونها میتوانند به شکل افقی در بین سویههای باکتریایی منتقل شوند (4 و 7). مهمترین بخشهای اینتگرونها، جایگاه درج شدن در کاستهای ژنی (attI) ،اینتگراز (واسطه انتقال و درج شدن در کاست ژنی) و پروموتر (Pc) به منظور بیان اپرون هستند. اینتگراز یکی از اعضای خانواده ریکامبینازهای واجد تیروزین در جایگاه اختصاصی[3] هستند که موجب درج شدن و بیان DNA در اینتگرون میشوند. بر همین اساس، چهار کلاس از اینتگرونها شناسایی شدهاند (2، 3 و 8). اینتگرونهای کلاس 1 متداولتر و شناخته شدهتر از سایر اینتگرونها هستند. این اینتگرونها، در سویههای بالینی انسانی و حیوانی باکتریهای خانواده انتروباکتریاسه انتشار گستردهای دارند (8- 10). این پژوهش با هدف ارزیابی نقش اینتگرون کلاس 1 در مقاومت داروبی جدایههای اشریشیاکلی اسهالزا در کودکان زیر 5 سال شهر یاسوج انجام شد.
.مواد و روشها
این پژوهش به شکل مقطعی- توصیفی بر روی 164 جدایه اشریشیاکلی اسهالزا جدا شده از نمونههای مدفوع کودکان زیر 5 سال مبتلا به اسهال شهرستان یاسوج در سالهای 1390 تا 1391 انجام شد. به منظور جداسازی اشریشیاکلی، نمونهها بر روی محیط ائوزین متیلن بلو آگار[4] (Merck, Germany) کشت داده شد. سپس، کلونیهای مشکوک به اشریشیاکلی با استفاده از آزمونهای متداول بیوشیمیایی (TSI، SIM، MR/VP، LIA، Citrate و Urea) تایید شدند و تا زمان استفاده در محیط کشت تریپتیکاز سوی براث[5] (مرک، آلمان[6]) حاوی 20 درصد گلیسرول در دمای منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از شناسایی و تعیین هویت اشریشیاکلی آنتیبیوگرام به روش استاندارد CLSI[7] انجام شد. میزان حساسیت باکتریها به آنتیبیوتیکهای جنتامایسین (10 میکروگرم)، سفالکسین (30 میکروگرم)، آمپیسیلین (10 میکروگرم)، تریمتوپریم- سولفامتوکسازول (25/1+75/23 میکروگرم)، نالیدیکسیک اسید (30 میکروگرم)، کلرامفنیکل (30 میکروگرم)، کانامایسین (30 میکروگرم)، تتراسایکلین (30 میکروگرم)، آمیکاسین (30 میکروگرم)، استرپتومایسین (10 میکروگرم) با اندازهگیری قطر هاله بازدارندهی رشد با توجه به دستور شرکت سازنده دیسک (پادتن طب، ایران) ارزیابی شد. از سویه اشریشیاکلی ATCC 25922 به عنوان کنترل استفاده شد.
شناسایی اینتگرون کلاس 1 و تکثیر ناحیه متغییر آن به روش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلر[8] انجام شد. آزمون PCR در حجم 25 میکرولیتر حاوی یک میکرولیتر DNA الگو، یک میکرولیتر از پرایمرهای اختصاصی، یک میکرولیتر MgCl2، 5/0 میکرولیتر dNTPs، 25/0 آنزیم Taq پلیمراز انجام شد. از پرایمرهای اختصاصی IntI1-F/IntI1-R و 5′CS/3′CS به ترتیب برای تکثیر ژن IntI1 و ناحیه متغییر حاوی کاست ژنی استفاده شد (جدول 1) (11). تمامی واکنشگرها و پرایمرها از شرکت سیناژن تهیه شدند. محصولات PCR بر روی ژل آگاروز یک درصد واجد اتیدیوم برماید و به وسیله دستگاه ترانس الیمیناتور بررسی شدند. سپس، ارتباط جدایههای مقاوم واجد اینتگرون توسط نسخه 15، نرم افزار SPSS و آزمونهای آماری مربع کای و دقیق فیشر بررسی شد. سطح معناداری در 05/0 > P value در نظر گرفته شد.
جدول 1- توالی پرایمرها و شرایط PCR برای شناسایی اینتگرونهای کلاس 1 و کاست ژنی درج شده در آن
پرایمر |
توالی پرایمر (5′→3′) |
اندازه آمپلیکون(bp) |
شرایط PCR |
IntI1-F |
GGT CAA GGA TCT GGA TTT CG |
436 |
1 سیکل 5 دقیقه 94 درجه سانتیگراد، 32 سیکل1 دقیقه 94 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه 62 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه 72 درجه سانتیگراد، 1 سیکل 8 دقیقه 72 درجه سانتیگراد |
IntI1-R |
ACA TGC GTG TAA ATC ATC GTC |
||
5′CS |
GGC ATC CAA GCA GCA AG |
متغییر |
1 سیکل 5 دقیقه 94 درجه سانتیگراد، 35 سیکل1 دقیقه 94 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه 60 درجه سانتیگراد، 2 دقیقه 72 درجه سانتیگراد، 1 سیکل 10 دقیقه 72 درجه سانتیگراد |
3′CS |
AAG CAG ACT TGA CCT GA |
.نتایج
از مجموع جدایههای تایید شده اشریشیا کلی 106 (63/64 درصد) مورد مربوط به پسران و 58 (37/35 درصد) مورد مربوط به دختران بود که در این بین 51/69 درصد مورد درمان سرپایی و 49/30 درصد بیماران بستری شده بودند. بیشتر بیماران مربوط به گروه سنی 6 تا 8ماه (49/30 درصد) و کمترین آنها در گروههای سنی 18 تا 23 ماه و 36 تا 47 ماه (22/1 درصد) قرار داشتند. در بین سویههای مورد بررسی، تنها 44/2 درصد جدایهها به تمامی آنتیبیوتیکهای مورد پژوهش حساسیت کامل داشتند و در سایر موارد به یک یا تعداد بیشتری از آنتیبیوتیکها مقاومت وجود داشت. نتایج مربوط به آزمون حساسیت آنتیبیوتیکی در شکل 1 نشان داده شده است. به منظور افزایش احتمال شناسایی ارتباط وجود ژنهای مقاومت در سویههای نیمه حساس، همه آنها در محاسبات آماری به عنوان مقاوم در نظر گرفته شدند.
از 164 جدایه اشریشیا کلی در 116 مورد (73/70 درصد) ژنintI1 شناسایی شد. تنها در 106 (63/64 درصد) سویه ناحیه متغییر وجود داشت. توالیهای کاست ژنی بین 750 تا 2000 جفتباز متغییر بودند (شکل 2). شیوع اینتگرون کلاس 1 در بین سویههای اسهالزای جدا شده از کودکان در جدول 2 نشان داده شده است.
شکل 1- الگوی حساسیت به آنتیبیوتیکها در سویه های اشریشیاکلی جدا شده از کودکان
(الف) (ب) (ج)
شکل 2- (الف) قطعات 436 جفت باز حاصل از تکثیر ژن IntI1، M: سایز مارکر bp 100، 1 و 2: نمونههای مثبت، 3: کنترل منفی
(ب) قطعات حاصل از تکثیر ناحیه متغییر اینتگرون کلاس 1،M : سایز مارکر kb 1، 1: کاست ژنی 750 جفت باز، 2: کنترل منفی،
3: کاست ژنی 700 جفت باز
(ج) قطعات حاصل از تکثیر ناحیه متغییر اینتگرون کلاس 1، M: سایز مارکر kb 1، 1: کنترل منفی، 2: کاست ژنی 2000 جفت باز،
3: کاست ژنی 1000 جفت باز
جدول 2- فراوانی و نسبت درصد مقاومت به آنتیبیوتیکها بر اساس اینتگرون کلاس 1 و کاست ژنی (164=n)
آنتی بیوتیک |
مقاومت |
IntI1 |
Pvalue |
Cassette1 |
Pvalue |
آمپیسیلین |
98 (76/59) |
70 (68/42) |
949/0 |
66 (24/40) |
472/0 |
نالیدیکسیک اسید |
124 (61/75) |
84 (22/51) |
200/0 |
74 (12/45) |
*032/0 |
استرپتومایسین |
76 (34/46) |
62 (80/37) |
*008/0 |
58 (37/35) |
*006/0 |
کانامایسین |
58 (37/35) |
44 (83/26) |
374/0 |
44 (83/26) |
*040/0 |
کوتری موکسازول |
56 (15/34) |
46 (05/28) |
*033/0 |
42 (61/25) |
068/0 |
تتراسایکلین |
46 (05/28) |
42 (61/25) |
*0 |
40 (39/24) |
*0 |
سفالکسین |
44 (83/26) |
36 (95/21) |
090/0 |
34 (73/20) |
062/0 |
جنتامایسین |
32 (51/19) |
28 (07/17) |
*029/0 |
28 (07/17) |
*002/0 |
آمیکاسین |
24 (63/14) |
20 (20/12) |
223/0 |
20 (20/12) |
*040/0 |
کلرامفنیکل |
10 (10/6) |
10 (10/6) |
*035/0 |
10 (10/6) |
*015/0 |
*= ارتباط معنادار
.بحث و نتیجه گیری
بیماری اسهال دومین عامل مرگ و میر پس از عفونتهای تنفسی در جهان است. تخمین زده شده است 4 تا 6 میلیون کودک در هر سال به علت بیماری اسهال به ویژه در کشورهای درحال توسعه میمیرند. در ایران، طبق آمار سازمان بهداشت جهانی میزان مرگ و میر در اثر اسهال در کودکان زیر 5 سال 7/9 مورد به ازای هر 1000 تولد زنده است. یکی از مشکلات اصلی تمامی کشورهای دنیا، استفاده گسترده از آنتیبیوتیکها و شیوع باکتریهای مقاوم به چند دارواست (12 و 13). نتایج این پژوهش نشان داد که بیشترین مقاومت آنتیبیوتیکی مربوط به نالیدیکسیکاسید (61/75 درصد)، آمپیسیلین (76/59 درصد) و استرپتومایسین (32/46 درصد) و کمترین آن مربوط به کلرامفنیکل (10/6 درصد) است. در مطالعهای سو[ix] و همکارانش در سال 2006 نیز نتایجی مشابهی گزارش شده است (14). همچنین، فونگ پیچیت[x] و همکارانش در سال 2008 بیشترین مقاومت جدایههای اشریشیاکلی را نسبت به استرپتومایسین و آمپیسیلین گزارش کردند، اما برخلاف مطالعه حاضر کمترین میزان مقاومت نسبت به نالیدیکسیک اسید گزارش شد (15). علت اختلاف در میزان مقاومت در مناطق مختلف جهان میتواند تفاوت در موقیعیت جغرافیایی، ویژگیهای بالینی و میزان رواج مصرف هر آنتیبیوتیک در هر کشور باشد. شیوع اینتگرون کلاس 1 در این مطالعه 73/70 درصد بود. به طور مشابه، شیوع اینتگرون کلاس 1 در سال 2004 در تایلند در نمونههای بالینی 99 درصد و نمونههای جدا شده از افراد سالم 87 درصد (16)، در سال 2005 در تایوان 61 درصد (17)، در سال 2006 در اردن 67 درصد (18)، در سال 2008 در چین 61 درصد (19)، در سال 2010 در تونس 22/22 درصد (20)، در سال 2011 در مالزی 8/57 درصد (21)، در سال 2011 در پاکستان 56/43 درصد (22) و در سال 2012 در تهران در بین سویههای EPEC و non-EPEC به ترتیب 82 و 8/68 درصد (23)گزارش شده است. علاوه بر این، در این مطالعه، در 63/64 درصد نمونهها توالیهای متغییر 750 تا 2000 جفت بازی کاست ژنی مشاهده شد. همچنین، در مطالعه مارتینزفریجیو[xi] در سال 1998 (24) و اسمیتز[xii] در سال 2001 (25) و ماچادو[xiii] در سال 2007 (26) نتایج مشابهی به دست آمد. مشابه با پژوهشهای پیشین در این مطالعه نیز ارتباط معناداری بین اینتگرون کلاس 1 و مقاومت به کلرامفنیکل،استرپتومایسین، تتراسایکلین، جنتامایسین، کوتریموکسازول، کانامایسین، آمیکاسینو نالیدیکسیکاسید مشاهده شد. این مساله میتواند احتمالا نشان دهنده قرارگرفتن ژنهای مقاومت نسبت به آنتیبیوتیکهای یاد شده در درون اینتگرون باشد (13، 14 و 17- 36).
در برخی از پژوهشها به منظور شناسایی اینتگرون از پرایمرهای اختصاصی ناحیه متغییر استفاده شده است. اما نتایج این پژوهش نشان داد که برخی از سویهها با وجود داشتن ژن اینتگراز، امکان دارد که ناحیه متغییر را نداشته باشند. همچنین داوز[xiv] و همکارانش در سال 2010 نشان دادند که در صورت درج نشدن کاست ژنی در اینتگرون امکان شناسایی آنها با استفاده از PCR توالیهای کوتاه وجود خواهد داشت (4). به این ترتیب میتوان علت اختلاف نتایج PCR در شناسایی اینتگرون در نمونهها را به تغییر در ناحیه ′3 اینتگرون و محل اتصال پرایمر نسبت داد.
نتایج این مطالعه شیوع اینتگرون کلاس 1 و ژنهای مقاومت آنتیبیوتیکی در منطقه مورد پژوهش را نشان داد. این مساله میتواند منعکس کننده تهدید جدی شیوع مقاومت ضدمیکروبی و پیچیدگی درمان عفونتها در آینده باشد. از این رو ضرورت پیش بینی تدابیر لازم به منظور درمان بیماران و کنترل مقاومت در باکتریها و جلوگیری از انتشار اینتگرونها وجود دارد. همچنین، پایش مستمر شیوع اینتگرونها و الگوی مقاومت آنتیبیوتیکی در گروههای مختلف سنی در مناطق مختلف کشور به ویژه نوزادان و افراد سالخورده پیشنهاد میشود.با توجه به این که اینتگرونها ژنهای مقاومت زیادی را حمل میکنند، پتانسیل بالقوهای برای انتقال کاست ژنی مقاومت در بین تمامی باکتریهای خانواده انتروباکتریاسه دارند. بنابراین، ژنهای مقاومت در بین آنتیبیوتیکهای متداول در کشور میتواند در تصمیمگیری در مورد رژیم درمانی و پروتکلهای درمانی اهمیت داشته باشد.
تشکر و قدردانی
نگارندگان مقاله از معاون محترم پژوهشی و تمامی کارکنان مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد و معاون محترم پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی جهرم برای پشتیبانی اجرایی در انجام این پژوهش تشکر و قدردانی میکنند.
[1]- Escherichia coli
[2]- Integron
[3]- Tyrosin site-specific recombinase
[4]- Eosin Methylene Blue Agar (EMB)
[5]- Trypticase soy broth
[6]- Merck, Germany
[7]- Clinical and laboratory standards institute
[8]- Mastercycler Gradient eppendorf
[ix]- Su
[x]- Phongpaichi
[xi]- Martinez-Freijo
[xii]- Schmitz
[xiii]- Machado
[xiv]- Dawes
)