نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه ایلام، ایران
2 دانشیار زیست شناسی، میکروبیولوژی، دانشگاه مازندران، بابلسر، ایران
3 دانشیار زیست شناسی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Cyanobacteria have been identified as a new and rich source of bioactive compounds. Attention to the properties of cyanobacteria as a good source of secondary metabolites in the past was very low but today has been shown that these microorganisms have many applications in the medical field and pharmaceutical products.
Materials and methods: In this experimental study, the cyanobacteria of Synechococcus elangatus ISC 106, Fischerella ambigua ISC67 and Schizothrix vaginata ISC108were obtained from the algal culture collection of research institute of applied science, ACECR, Tehran, Iran. Extraction was performed by adding the solvent to cyanibacteria biomass and then filtering and drying the mixture. Disk diffusion method was used to study the effect of antimicrobial and broth microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration.
Results: The results showed that the methanol extract of Synechococcus elangatus had no significant effect on the bacteria, but the methanol extract of Fischerella ambigua showed antibacterial activity. Aqueous extract of Fischerella ambigua had significant effect on Gram-positive bacteria, so that maximum antibacterial activity was against Staphylococcus aureus (PTCC 1112) which the average zone diameter around it was 33.33 mm. Among tested extracts, only methanol extract of Fischerella ambigua had inhibitory effects against four plant pathogenic fungi. The effect of aqueous extract Fischerella ambigua on Staphylococcus aureus (PTCC1112) and Staphylococcus epidermidis (PTCC1114) was more effective than all of the affecting antibiotics. The highest antibacterial activity of cyanobacteria was related to aqueous extract of Synechococcus elangatus and maximum effect of antifungal activity was related to methanol extract of Fischerella ambigua.
Discussion and conclusion: Among the three species of cyanobacteria, two species of cyanobacteria Fischerella ambigua, and Synechococcus elangatus had antimicrobial activity, thus it can be a good candidate for the extraction of antimicrobial compounds and many compounds found in these extracts can be used to monitor and inhibit many diseases.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
سیانوباکتریها[1] قدیمیترین پروکاریوتهای فتوسنتزکننده روی زمین هستند (1). این میکروارگانیسمها بهطور گسترده در خاکهای طبیعی، آبهای شیرین و زیستگاههای دریایی توزیع شدهاند و دارای تنوع ریخت شناسی قابل ملاحظهای هستند (2). تاریخچه تکاملی طولانی این میکروارگانیسمها به شکل در خور توجهی گواهی بر موفقیت سیانوباکتریها برای زنده ماندن در زیستگاههای متعدد و قدرت تحمل اکولوژیکی بالای آنهاست (3). علاوه بر این، سیانوباکتریها با قدرت تحمل اکولوژیکی بالا با دما، نور، شوری، رطوبت و شرایط قلیایی توسعه یافتهاند و دارای بسیاری از ویژگیها و سازگاریها هستند که توزیع گسترده و موفقیت آنها در بقا را توضیح میدهد (4). اصطلاح "متابولیسم سیال یا لغزنده"، کوتاه ترین و در عین حال گویاترین توجیهی است که برای این گستردگی به کار میرود. نوعی انعطافپذیری متابولیک که شاید منحصر به فرد باشد و تنها در مورد زیستگاهها صدق نمیکند (5). هنوز مکانیسم خوگیری و سازگاریهای خاص سیانوباکتریها به شرایط محیطی و سیالیتهایی که برای مثال در تغییر آرایش سیستمهای فتوسنتزی و رنگیزههای این موجودات در مواجهه با تغییرات سریع شرایط محیطی به وقوع میپیوندد، برای صاحبنظران روشن نیست. طبقهبندی تاکسونومیک سیانوباکتریها بسیار پیچیده است. سیانوباکتریها در گذشته تنها براساس صفات ریختشناسی و بر طبق کدهای بین المللی نامگذاریگیاهی[2] طبقهبندی میشدند. این طبقهبندی که تنها بر اساس ویژگیهای ریختشناسی است، با وجود این واقعیت که ریختشناسی سیانوباکتریها در مقایسه با بسیاری از میکروبهای پروکاریوتی پیچیده است و صفات ریختشناسی در پاسخ به شرایط زیست محیطی مختلف تغییر پذیرند، لزوما نمیتواند یک طبقهبندی فیلوژنتیکی معتبر باشد (6). از سوی دیگر سیانوباکتریها براساس کدهای بینالمللی نامگذاری پروکاریوتی[3] نیز طبقهبندی شدهاند. امروزه این طبقهبندی براساس روشهای مولکولی و ویژگیهای فنوتیپی، شموتیپی و ژنوتیپی یک کشت خالص از سیانوباکتریهاست که به اصطلاح روشپلیفازیک[4] نامیده میشود (7). ترکیب طبقهبندی ریختشناسی گذشته و طبقهبندی بر اساس روشهای مولکولی به منظور دستیابی به کلیدهای شناسایی معتبر، یک چالش مهم برای زیستشناسان محسوب میشود، با این حال، کوشش برای متحد ساختن این دو سیستم طبقهبندی همچنان ادامه دارد. درحال حاضر سیستم نامگذاری باکتریولوژیکی سیانوباکتریها به طور گستردهای پذیرفته شده است. در ایران نیز پژوهش‌های فراوانی در زمینه شناسایی سیانوباکتریها بر اساس کلیدهای ریختشناسی و مولکولی انجام شده که از جمله مهمترین آنها میتوان به گزارش سلطانی[5] و همکاران در سال 1378 در منطقه فیروزکوه اشاره کرد. آنها 20 گونه سیانوباکتری را در خاکهای منطقه فیروزکوه در شرق تهران شناسایی کردند (8). گزارشهای مربوط به سیانوباکتریهای ایران بیشتر مربوط به نمونههای آبزی بوده است، برای مثال گونههای کروکوکوس[6]، لینجبیا[7]، آنابنا[8]، سینکوکوس[9] و اوسیلاتوریا[10] که از دریاچه ارومیه جداسازی و شناسایی شدهاند (9)، از سوی دیگر نمونههای خاکزی که شناسایی شدهاند بیشتر به خاک شالیزارها متعلق بودهاند مانند: گونههای استیگونما[11]، آنابائنوپسیس[12]، نوستوک[13] و کالوتریکس[14] که در مزارع شمال کشور شناسایی شدهاند (10).
تنوع بسیار زیاد در این گروه از میکروارگانیسمها، جدا از تنوع ریختشناسی و دامنه وسیعی از زیستگاهها، در میزان سنتز محصولات طبیعی توسط آنها نیز منعکس شده است. سیانوباکتریها برای تولید مجموعه متنوعی از متابولیتهای ثانویه تکامل یافتهاند که به بقای گونهها در این نیچهای اکولوژیکی گوناگون و بسیار رقابتی کمک کرده است (11).
امروزه ترکیباتطبیعی (متابولیتهای ثانویه) منبع مهمی از داروهای جدید و ترکیبات دارویی مؤثر هستند (12). فرآوردههای طبیعی نه تنها به عنوان دارو در مسیر درست خود بهکار گرفته میشوند، بلکه ممکن است به عنوان مدلهای ساختاری برای ایجاد آنالوگهای مصنوعی و نیز به عنوان مدلهایی در مطالعات ساختار فعالیت بهکار روند (13). فرآوردههای طبیعی از طیف گستردهای از گونههای متنوع جداسازی و برای فعالیتهای مختلف زیستی آزمایش شده است. بیشتر این فرآوردههای طبیعی از منابعی همچون استرپتومیسسها، باکتریها، قارچها و گیاهان مشتق شدهاند. مشکل اصلی در تمرکز بر این منابع برای دستیابی به مولکولهای فعال زیستی جدید، کشف مجدد محصولاتی است که قبلا از منابع دیگری شناخته شدهاند. یک راه برای به حداقل رساندن این مشکل، توسعه روشهای زیستی شناسایی فرآوردههای طبیعی و بررسی قابلیت درمانی جدید آنهاست. رویکرد دیگر این است که به منابع جدید و مختلف از محصولات طبیعی توجه شود. در میان این میکروارگانیسم ها، سیانوباکتریها نشان دهنده چنین منابعی هستند. مطالعات ریچار موور[15] در دانشگاه هاوایی نشان داد که سیانوباکتریها میتوانند منبع غنی از متابولیتهای ثانویه باشند (14). متابولیتهای سیانوباکتریها طیف قابل توجه و باورنکردنی از فعالیتهای زیستی را نشان میدهند. برای مثال فعالیتهای ضد میکروبی، ضد سرطان، ضد ویروس، مهارکننده سیستم ایمنی، حشرهکشی و ضد التهابی با مهار فعالیت پروتئیناز که از اهداف قابل توجه پژوهش‌های پزشکی هستند (15- 17). توجه به خواص سیانوباکتریها به عنوان منبع سرشار از متابولیتهای ثانویه، در گذشته بسیار کم بوده است اما امروزه نشان داده شده که این میکروارگانیسمها دارای کاربردهای فراوانی در زمینه پزشکی، تولید سوخت زیستی، تولید متانول و همچنین، پاکسازی زیستی هستند و از نظر مصارف غذایی نیز کاربرد دارند (18). تنوع بسیار زیاد فعالیتهای زیستی و شیمیایی متابولیتهای ثانویه سیانوباکتریها، این میکروارگانیسمها را به عنوان یک منبع قابل توجه از داروهای جدید برای استفاده در مناطق درمانی گوناگون توصیه میکند. با وجود زیستگاهها و منابع فراوان سیانوباکتریها در ایران در مقایسه با سایر کشورها، مطالعات اندکی در مورد خواص ضدمیکروبی عصاره سیانوباکتریها انجام شده است. از جمله مهمترین پژوهش‌های انجام شده در این زمینه در ایران میتوان به گزارشهای زرینی [16] و همکاران در سال 1390 و قاسمی [17] و همکاران در سال 2003 اشاره کرد (10 و 19). با توجه به مقاومت روز افزون باکتریهای بیماریزا به آنتیبیوتیکها و گرایش عمومی به ترکیبات طبیعی، شناسایی سیانوباکتریهای توانمند برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی و بررسی اثرات ضد میکروبی اهمیت خاصی دارد. هدف اصلی این پژوهش، بررسی اثرات ضدمیکروبی برخی از گونههای سیانوباکتریها علیه باکتریها و قارچهای بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی است.
مواد و روشها.
کشت و نگهداری از نمونهها: در این مطالعه تجربی، سویههای سیانوباکتری Fischerella ambigua ISC67، Synechococcus elangatus ISC106و Schizothrix vaginata ISC108از کلکسیون ریزجلبکها در پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاد دانشگاهی، دانشگاه شهید بهشتی تهران تهیه شد. ابتدا برای اطمینان از خالص بودن نمونهها خالصسازی سیانوباکتریها به روش پلیت آگار بر روی محیط کشت جامد BG11انجام شد (20). به این صورت که ابتدا محیط مایع BG11 تهیه شد. ترکیب محیط کشت BG11 مورد استفاده برای سیانوباکتریها در هر لیتر 150 میلیگرم NaNO3، 75 میلیگرم MgSO4.7H2O، 36 میلیگرم CaCl2.2H2O، 6 میلیگرم Citric Acid، 6 میلیگرم Ferric ammonium citrate، 1 میلیگرم EDTA (TriplexIII)، 20 میلیگرم Na2CO3 و یک میلیلیتر محلول trace metal mix شامل 86/2 میلیگرم در لیتر H3Bo3، 81/1 میلیگرم در لیتر MnCl2.4H2O، 222/0 میلیگرم در لیتر ZnSO4.7H2O، 39/0 میلیگرم در لیتر Na2MoO4.2H2O، 079/0 میلیگرم در لیتر CuSO4.5H2O، 049/0 میلیگرم در لیتر Co(NO3).6H2O دارا میباشد (21). سپس برای تهیه محیطکشت جامد، 15گرم آگار به محیط کشت مایع BG11 اضافه، 20 دقیقه در دمای 120 درجه سانتیگراد اتوکلاو و پس از اندکی خنک شدن به ظروف پتری منتقل شد. پس از سرد شدن محیط کشت جامد، کلونیهای سیانوباکتریها توسط لوپ به شکل زیگزاگی روی آن کشت داده شد. این کار برای به دست آوردن کلونیهای خالص سیانوباکتریها چندین بار تکرار شد و هر بار کلونیهایی که باید دوباره کشت داده میشدند، توسط تهیهی اسلاید و بررسی میکروسکوپی انتخاب شدند. بعد از اطمینان از خالص بودن کلونیهای موجود در کشت جامد، کلونیها به محیط کشت مایع BG11 منتقل و در اتاقک رشد تحت هوادهی و تابش نور مداوم و همچنین دمای 2±28 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
عصارهگیری از سیانوباکتریها: عصارهگیری به روش وال[18] و همکاران انجام شد. برای این منظور 500 میلیلیتر از کشت مایع BG11 رشدیافته نمونههای سیانوباکتریایی 30 روزه در دمای 2±28 درجه سانتیگراد، برای 15دقیقه در5000 دور سانتریفوژ شد. مایع رویی حاصل پس از خشک شدن در دمای40 درجه سانتیگراد در آون، به عنوان عصاره آبی نگهداری شد. بیومس به دست آمده ابتدا در 60 درجه سانتیگراد کاملاً خشک شد. برای تهیه عصارههای متانولی بر روی بیومس حاصل به مقدار 30 میلیلیتر متانول اضافه شد. سپس، مخلوط حاصل به مدت 20 دقیقه روی شیکر با سرعت 150دور در دقیقه قرار داده شد. عصارههای حاصل به وسیله کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف وسپس در دمای 40 درجه سانتیگراد در آون کاملاً خشک شد. بدینترتیب عصاره متانولی تهیه شد. تمام عصارههای خشک شده در فالکونهای استریل جمع آوری و تا زمان انجام آزمایشهای بعدی در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (22).
میکروارگانیسم‌های مورد بررسی: در این پژوهش، 5 گونه باکتری گرم مثبت بیماریزا شامل: استافیلوکوکوس اورئوس[19] (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس اپیدرمیس[20] (PTCC 1114)، باسیلوس سرئوس[21] (PTCC 1247)، انتروکوکوس فیکالیس [22] (PTCC 1237) و استرپتوکوکوس پایوژنز[23] (PTCC 1447) و 5 گونه باکتری گرم منفی شامل: اشریشیا کلی[24] (PTCC 1338)، پروتئوس ولگاریس[25] (PTCC 1312)، سودموناس آئروژینوزا[26] (PTCC 1430)، سالمونلا تیفی[27] (PTCC 1609) و یرسینا پستیس[28] از مرکز کلکسیون قارچها و باکتریهای سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران و بانک میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه علوم پزشکی ایلام تهیه شد. همچنین، 4 گونه قارچ بیماریزای گیاهی شامل: فوزاریوم سولانی[29]، راینکوسپوریوم سکالیس[30]، بوتریتیس سینره آ[31] و فوزاریوم اوکسیسپوروم[32] از آزمایشگاه بیماریهای گیاهی دانشگاه ایلام تهیه شد.
.تهیه سوسپانسیون نیم مک فارلندی از باکتریها و قارچها: برای تهیه سوسپانسیون نیم مک فارلندی از باکتریها (108×1 واحد سارنده کلونی در میلیلیتر) و قارچها (106×1 واحد سارنده کلونی در میلیلیتر)، ابتدا باکتریها و قارچها را به طور جداگانه، به ترتیب روی محیط کشتهای مولر هینتونآگار و سابوردکستروز آگار کشت و به مدت 24 ساعت (برای باکتریها) و 48 ساعت (برای قارچها) در انکوباتور قرار داده شد. سپس، به اندازه تعداد میکروارگانیسمها لوله استریل تهیه و داخل هر لوله به مقدار 10 میلیلیتر سرم فیزیولوژی ریخته شد. به وسیله آنس حلقوی از کلونیهای باکتریها و قارچها برداشته و داخل لولهها انتقال داده شد و به مدت 10 دقیقه ورتکس شد. برای به دست آوردن غلظت نیم مکفارلندی از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد. دستگاه روی طول موج 620 نانومتر تنظیم و با سرم فیزیولوژی صفر شد. سپس، از سوسپانسیون ورتکس شده در کوئیتهای شیشهای مخصوص دستگاه ریخته و جذب نوری آنها تعیین شد. به منظور تهیه کدورت نیم مک فارلندی باید مقدار جذب نوری در طول موج 620 نانومتر برابر 08/0 تا 1/0 شود. در نهایت از تمام باکتریها و قارچها غلظت نیم مک فارلندی تهیه شد (23).
بررسی اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی: به منظور بررسی اثر ضدباکتریایی و ضدقارچی عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتریها از روش انتشار در دیسک (کربی-بائر[33]) استفاده شد، زیرا این روش یکی از متداولترین و مقرون به صرفهترین روشهای زیستی برای ارزیابی خواص ضدمیکروبی است (24) به این شکل که ابتدا از عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتریها، به وسیله دیمتیل سولفوکساید10 درصد، رقتهای 125، 250، 500 و 1000 میلیگرم بر میلیلیتر تهیه شد. به تعداد باکتریها (10 گونه باکتری) و قارچها (4 گونه قارچ) دیسک کاغذی بلانک 6 میلیمتری تهیه شده از شرکت پاتن طب (ایران) در داخل رقتهای مختلف از هر عصاره ریخته شد. پس از 10 دقیقه که حداقل زمان لازم برای جذب است، دیسکهای کاملاً آغشته شده به عصاره از داخل عصارهها خارج و به طور جداگانه در آون 40 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا حلال آن بخار و دیسکها خشک شود. دیسکها قبل و بعد از ترکیب با عصارهها وزن شد و اختلاف وزن آن دو، مقدار عصارهای بود که دیسکها در رقتهای مختلف هر عصاره جذب کرده بودند. مقدار عصاره جذب شده توسط هر دیسک در رقتهای مختلف عصارههای فعال در جدول 1 آمده است. به این ترتیب دیسکها برای بررسی خواص ضد باکتریایی و ضد قارچی آماده شد (25). با استفاده از سوآب استریل از سوسپانسیون نیم مکفارلندی باکتریها برداشته و در محیط کشت مولر هینتون آگار (مرک آلمان) به صورت چمنی کشت داده شد.
جدول 1- مقدار عصاره جذب شده توسط دیسکها در غلظتهای مختلف از عصارههای فعال متانولی و آبی سیانوباکتریها
|
سیانوباکتریها |
|
غلظت عصارهها* |
|
|
|
125 |
250 |
500 |
1000 |
|
|
عصاره متانولی Synechococcus elangatus |
8/4 |
1/10 |
1/19 |
4/28 |
|
عصاره متانولی Fischerella ambigua |
5 |
8/9 |
19 |
3/31 |
|
عصاره آبی Synechococcus elangatus |
3/4 |
4/9 |
5/18 |
2/29 |
|
عصاره آبی Fischerella ambigua |
1/4 |
2/9 |
6/19 |
5/29 |
* تمام اعداد در جدول بر حسب میلیگرم بر میلیلیتر است.
بر اساس روش استاندارد انتشار دیسک، دیسکهای آغشته به عصاره در فاصله استاندارد (5/1 سانتیمتری) از یکدیگر در محیط کشتها قرار داده شدند (24). محیط کشتها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجهسانتیگراد در انکوباتور قرار داده و بعد از 24 ساعت قطر هالهها با استفاده از خطکش معمولی اندازهگیری شد. از سوسپانسیون نیم مک فارلندی قارچهای خالص شده روی محیط سابورودکستروزآگار کشت داده شد. سپس، دیسکهای آغشته به عصاره در فاصله استاندارد (5/1 سانتیمتری) از یکدیگر روی محیط کشتها قرار داده شد. محیط کشتها به مدت 48 ساعت در دمای 24 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار داده و پس از 24 ساعت قطر هالهها با استفاده از خطکش معمولی اندازهگیری شد. تمام آزمایشها سه بار تکرار شد (26). در این پژوهش از دیمتیلسولفوکساید 10 درصد به علت اینکه تأثیری بر روی باکتریهای مورد بررسی ندارد به عنوان کنترل منفی استفاده شد. همچنین، از آنتیبیوتیکهای جنتامایسین، استرپتومایسین، نالیدیکسیک اسید، کلرامفنیکل و پنیسیلین به عنوان کنترل مثبت برای باکتریها و از آنتیبیوتیک نیستاتین به عنوان کنترل مثبت برای قارچها استفاده شد. تمامی آنتیبیوتیکها از شرکت پاتن طب (ایران) تهیه شد.
تعیین مقدار MIC و MBC: حداقل غلظت مهارکننده (MIC) عصارههای سیانوباکتریهایی که دارای اثر ضدباکتریایی بودند، با استفاده از پلیتهای 96 خانهای استریل و روش براث میکرودیلوشن[34] طبق دستورالعمل [35]CLSI تعیین شد (27). به این ترتیب که ابتدا به هر یک از چاهکها 50 میکرولیتر محیط نوترینت براث به اضافه50 میکرولیتر از رقتهای تهیه شده عصاره (125 تا 1000 میلیگرم بر میلیلیتر) اضافه شد. سپس، مقدار 50 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده باکتری به چاهکها اضافه شد. سپس، پلیتها به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد و بعد از این مدت کف پلیت زیر نور در آینه مشاهده و وجود کدورت را که نشان دهنده رشد یا عدم رشد باکتری است، در جدول یادداشت شد. با مقایسه کدورت چاهکهای تحت تیمار با چاهکهای شاهد میزان حداقل غلظت مهارکننده مشخص شد. نخستین چاهک بدون کدورت به عنوان حداقل غلظت مهارکننده به شکل میلیگرم بر میلیلیترگزارش شد (23). حداقل غلظت کشندگی (MBC) عصارهها با توجه به نتایج حداقل غلظت مهارکننده تعیین شد. از چاهکهایی که رشد باکتری در آنها کاملا متوقف شده بود با سوآپ استریل نمونهبرداری و روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده و در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شد. پس از 24 ساعت کمترین غلظتی از عصاره که باکتریها در آن رشد نکرده بودند به عنوان مقادیر حداقل غلظت کشندگی گزارش شد (28). نتایج آزمایشهای بدست آمده از نظر آماری به شکل توصیفی با یکدیگر مقایسه شد. تمام آزمایشها سه بار تکرار شدند.
تحلیلهای آماری: به منظور تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها از نرم افزار اس پی اس اس[36] نسخه 20 استفاده شد. تجزیه واریانس داده‌ها با استفاده ازآزمون یک طرفه آنووا[37] و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن[38] در سطح یک درصد انجام شد. همچنین، برای توصیف متغیرهای پژوهش از آمار توصیفی مانند میانگین و انحراف معیار استفاده شد.
نتایج.
نتایج به دست آمده نشان داد که هیچ یک از عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتری Schizothrix vaginataدارای فعالیت ضد باکتریایی و ضدقارچی نبودند. نتایج حاصل از تأثیر عصاره آبی و متانولی دو گونه سیانوباکتریFischerella ambigua ، Synechococcus elangatusبر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که عصاره متانولی گونه Synechococcus elangatusبر روی باکتریها اثر در خور توجهی نداشت، اما عصاره متانولی گونه Fischerella ambiguaفعالیت ضدباکتریایی نشان داد. همچنین، نتایج بدست آمده از تأثیر عصارههای آبی سیانوباکتریها نشان داد که عصاره آبی سیانوباکتریهای Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatusفعالیت ضدباکتریایی معناداری علیه باکتریهای مورد بررسی داشتند. تجزیه و تحلیل داده‌ها در سطح یک درصد نشان داد که خطای محاسبه شده تقریباً برابر صفر است (01/0 P value ). با توجه به میانگین قطر هالههای عدم رشد حاصل از تأثیر غلظتهای 125 تا 1000 میلیگرم بر میلی لیتر عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaعلیه باکتریهای گرم مثبت، میتوان گفت که از بین باکتریهای گرم مثبت تنها باکتری باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) و باکتری انتروکوکوس فیکالیس (PTCC 1237) و از بین گرم منفیها تنها باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 11312) به عصاره متانولی این سیانوباکتری حساس بودند و سایر باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت نسبت به این عصاره مقاومت نشان دادند. نتایج حاصل از تأثیر عصارهآبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaبر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که این عصاره بر روی بر روی هر دو گروه باکتریهایگرممثبت و گرم منفی اثر ضدباکتریایی داشت. نتایج نشان داد که عصاره آبی این سیانوباکتری اثر چشمگیری بر روی باکتریهای گرم مثبت داشت، به طوری که بیشترین تأثیر را بر روی باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) با قطر هاله 33/33 میلیمتر داشت (شکل 1). از بین 5 گونه باکتری گرم مثبت مورد بررسی تنها باکتری استرپتوکوکوس پایوژنز (PTCC 1447) نسبت به عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaمقاوم بود. این عصاره بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1431) و استافیلوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114) تقریباً اثر یکسان داشت. با این وجود، از بین باکتریهای گرم منفی مورد بررسی عصاره آبی Fischerella ambiguaتنها بر روی باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) اثر ضدباکتریایی داشت و سایر باکتریهای گرم منفی نسبت به این عصاره مقاوم بودند. تحلیل آماری داده‌ها در سطح یک درصد نشان داد که خطای محاسبه شده برابر صفر است بنابراین، فعالیت ضدباکتریایی عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaعلیه باکتریهای گرم مثبت به طور معناداری بیشتر از باکتریهای گرممنفی بود.
نتابج به دست آمده پس ار تأثیر عصارهآبی سیانوباکتری Synechococcus elangatusبر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که عصاره آبی این سیانوباکتر دارای اثر ضدباکتریایی در خور توجهی علیه باکتریهای مورد بررسی بود. بیشترین قطر هاله عدم رشد حاصل از تأثیر این عصاره بر روی باکتریهای گرم مثبت مربوط به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) به اندازه 33/26 میلیمتر بود، در صورتی که بیشترین قطر هاله عدم رشد در بین باکتریهای گرممنفی مربوط به باکتری سودموناس آئروژینوزا (PTCC 1430) با قطر هاله 33/22 میلیمتر بوده است (شکل 1). در بین باکتریهای گرم مثبت تنها باکتری باسیلوس سرئوس (PTCC 1247)، و در بین باکتریهای گرم منفی تنها باکتری سالمونلا تیفی (PTCC 1609) نسبت به این عصاره مقاوم بودند. تأثیر این عصاره بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی تقریبا یکسان بود به طوری که تحلیل آماری داده‌ها در سطح یک درصد، خطای محاسبه شده برابر 02/0 بود، بنابراین، اختلاف معناداری بین تأثیر عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی مشاهده نشد.
شکل 1- تأثیر غلظتهای مختلف (گرم بر لیتر) عصاره آبی سیانوباکتریهای Fischerella ambigua و Synechococcus elangatusبر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس
جدول 2- میانگین قطر هالههای عدم رشد (برحسب میلیمتر) و انحراف معیار حاصل از تأثیر عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaو عصاره آبیSynechococcus elangatus علیه باکتریهای گرممنفی و گرم مثبت
*: مقدار عصاره جذب شده (میلی گرم بر میلیلیتر)
نتایج حاصل از اثر ضدقارچی عصارهها بعد از 48 ساعت گرمخانهگذاری نشان داد که عصاره متانولی گونههای Fischerella ambiguaو Synechococcus elangatusو عصاره آبی Synechococcus elangatusفعالیت ضدقارچی نشان دادند (جدول 3).
تجزیه و تحلیل داده‌ها در سطح یک درصد نشان داد که خطای محاسبه شده تقریباً برابر صفر است
(01/0 P value ). بنابراین، اثر غلظتهای مختلف عصاره متانولی گونههای Fischerella ambiguaو Synechococcus elangatusو عصاره آبی Synechococcus elangatusبر روی قارچهای بیماریزای گیاهی معنادار است. نتایج به دست آمده نشان داد که از بین عصارههای مورد آزمایش تنها عصاره متانولی Fischerella ambiguaبر روی هر 4 گونه قارچ بیماریزای گیاهی اثر مهاری داشت (شکل 2). این عصاره بیشترین تأثیر را بر روی قارچ راینکوسپوریوم سکالیس داشت به طوری که قطر هاله حاصل از تأثیر عصاره متانولی این سیانوباکتری اطراف آن 67/30 میلیمتر بود. عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی قارچهای فوزاریوم سولانی و فوزاریوم اوکسیسپوروم تأثیر تقریباً یکسانی داشت. همچنین، نتایج نشان داد که عصاره متانولی سیانوباکتری Synechococcus elangatusتنها بر روی قارچ فوزاریوم سولانی تأثیر داشت. به طوری که این قارچ به دیسکهای حاوی 4/28 و 1/19 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره این سیانوباکتری حساسیت نشان داد. عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی قارچ راینکوسپوریوم سکالیس، بوتریتیس سینرهآ و فوزاریوم اوکسیسپوروم هیچ تأثیری نداشت.
شکل 2- تأثیر غلظتهای مختلف (گرم بر لیتر) عصاره متانولی سیانوباکتریFischerella ambigua برروی قارچ بوتریتیس سینرهآ
نتایج حاصل از تأثیر کنترلهای مثبت (آنتیبیوتیکهای رایج) و مقایسه تأثیر آنها با عصارههای سیانوباکتریایی بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که تمام باکتریهای گرم منفی به آنتیبیوتیکهای جنتامیسن، استرپتومایسین و کلرامفنیکل حساس بودند. مؤثرترین عصاره بر روی باکتریهای گرم منفی عصاره آبی Synechococcus elangatusو مؤثرترین عصاره بر روی باکتریهای گرم مثبت عصاره آبی Fischerella ambiguaبود.کماثرترین آنتیبیوتیکها علیه باکتریهای گرممنفی مربوط به آنتیبیوتیک پنی سیلین بود. تأثیر عصاره متانولی Fischerella ambigua(19 میلیگرم بر میلیلیتر) بر روی باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) از تمام آنتیبیوتیکهای مؤثر بر روی این باکتری بیشتر بود.
جدول3- میانگین قطر هالههای عدم رشد (برحسب میلیمتر) و انحراف معیار حاصل از تأثیر عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaو عصاره متانولیSynechococcus elangatusعلیه 4 گونه قارچ بیماریزای گیاهی.
|
|
Botrytis cinerea |
Fusarium solani |
Rhynchosporium secalis |
Fusarium oxysporum |
|
|
کنترل مثبت |
نیستاتین |
28±1 |
17±0 |
67/35±57/0 |
67/22±15/1 |
|
عصاره متانولی Fischerella ambigua |
*3/31 |
20±1 |
33/14±57/0 |
33/32±57/0 |
33/15±57/0 |
|
19 |
33/18 ±57/0 |
67/12±57/0 |
67/25±57/0 |
67/14±15/1 |
|
|
8/9 |
67/15 ±57/0 |
67/11±15/1 |
67/22±57/0 |
33/13±57/0 |
|
|
5 |
33/14±57/0 |
33/9±57/0 |
67/18±57/0 |
33/11±57/0 |
|
|
عصاره آبی Fischerella ambigua |
5/29 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
67/10±57/0 |
|
6/19 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
67/9±57/0 |
|
|
2/9 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
33/8±57/0 |
|
|
1/4 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
|
|
عصاره متانولی Synechococcus elangatus |
4/28 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
33/11±57/0 |
|
1/19 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
33/10±57/0 |
|
|
1/10 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
33/7±57/0 |
|
|
8/4 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
67/6±57/0 |
|
*: مقدار عصاره جذب شده (میلی گرم بر میلیلیتر)
از بین عصارهها و آنتیبیوتیکهای مؤثر بر روی باکتری سودوموناس آئروژینوزا (PTCC 1430) بیشترین تأثیر را عصاره آبی Synechococcus elangatus(2/29 میلیگرم بر میلیلیتر) داشت. مؤثرترین آنتیبیوتیکها علیه باکتریهای گرم مثبت، آنتیبیوتیک کلرامفنیکل و مؤثرترین عصاره علیه باکتریهای گرم مثبت عصاره آبیFischerella ambiguaبود. تأثیر عصاره آبی Fischerella ambigua(5/29 میلیگرم بر میلیلیتر) بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC1114) از تمام آنتیبیوتیکهای مؤثر بر آنها بیشتر بود. کماثرترین آنتیبیوتیک مؤثر بر روی باکتریهای گرم مثبت، آنتییبوتیک پنی سیلین بود. نتایج بررسی قطر هاله حاصل از تأثیر آنتیبیوتیکها علیه باکتری باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) نشان داد که مؤثرترین آنتیبیوتیک بر روی این باکتری، آنتیبیوتیک کلرامفنیکل و مؤثرترین عصاره بر روی این باکتری عصاره آبی Fischerella ambigua(5/29 میلیگرم بر میلیلیتر) بود. نتایج همچنین نشان داد که دی متیل سولفوکساید به عنوان کنترل منفی هیچ گونه اثر ضدباکتریایی نداشت.
مقادیر مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره آبی و متانولی سیانوباکتری های Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatusبر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی بیماری زا در جدول 4 مشخص شده است. این نتایج نیز نشان می دهندکه عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaدر غلظت 125 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی باکتریهای پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) و باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) اثر کشندگی و بر روی باکتری انتروکوکوس فیکالیس (PTCC 1237) اثر بازدارندگی داشت. عصاره متانولی این سیانوباکتری در غلظت 250 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی باکتری انتروکوکوس فیکالیس (PTCC 1237) اثر کشندگی داشت. تحلیلهای آماری در سطح یک درصد نشان داد که اختلاف معناداری بین اثر این عصاره بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی وجود ندارد. همچنین، مشخص شد که عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaدر غلظت 125 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114)، انتروکوکوس فیکالیس (PTCC 1237) و باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) اثر کشندگی و بر روی پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) اثر بازدارندگی داشت. این عصاره در غلظت 250 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی باکتریهای پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) اثر کشندگی داشت. تحیلی داده‌ها در سطح یک درصد نشان داد که اثر این عصاره بر روی باکتریهای گرم مثبت به طور معناداری بیشتر از باکتریهای گرم منفی بود (01/0 P value ). عصاره آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatusدر غلظت 125 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی باکتری سودوموناس آئروژینوزا (PTCC 1430) اثر کشندگی و بر روی باکتریهای اشریشیاکلی (PTCC 1338)، استرپتوکوکوس پایوژنز (PTCC 1447)، یرسینا پستیس، پروتئوس ولگاریس(PTCC 1312)، استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114) اثر بازدارندگی داشت. غلظت 250 میلیگرم بر میلیلیتر این عصاره بر روی باکتریهای استرپتوکوکوس پایوژنز (PTCC 1447)، پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312)، استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114) اثر کشندگی و بر روی باکتری انتروکوکوس فیکالیس (PTCC 1237) اثر بازدارندگی داشت.
جدول 4- مقادیر حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتری Fischerella ambigua و آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatus علیه باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی بیماریزا (میلیگرم بر میلیلیتر)
|
عصاره متانولی Fischerella ambigua |
عصاره آبی Fischerella ambigua |
عصاره آبی Synechococcus elangatus |
باکتری ها |
|||
|
حداقل غلظت مهارکنندگی |
حداقل غلظت کشندگی |
حداقل غلظت مهارکنندگی |
حداقل غلظت کشندگی |
حداقل غلظت مهارکنندگی |
حداقل غلظت کشندگی |
|
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
125 |
125 |
250 |
Staphylococcus aureus PTCC 1112 |
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
125 |
125 |
250 |
Staphylococcus epidermidis PTCC 1114 |
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
125 |
250 |
500 |
Enterococcus faecalis PTCC PTCC 1237 |
|
125 |
125 |
125 |
125 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
Bacillus cereus PTCC 1247 |
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
250 |
Streptococcus pyogenes PTCC 1447 |
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
500 |
Escherichia coli PTCC 1338 |
|
500 |
1000 |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
125 |
Pseudomonas aeruginosa PTCC 1430 |
|
125 |
125 |
125 |
250 |
125 |
250 |
Proteus vulgaris PTCC 1312 |
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
Salmonella typhi PTCC 1609 |
|
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
عدم تأثیر |
125 |
500 |
Yersinia pestsi |
بحث و نتیجه گیری.
با توجه به مقاومت روز افزون میکروارگانیسمها به آنتیبیوتیکها و گرایش عمومی به ترکیبات طبیعی در نواحی متعددی از دنیا، شناسایی میکروارگانیسم‌های توانمند و بررسی اثرات ضد میکروبی آنها اهمیت خاصی دارد. در طی دهه اخیر سیانوباکترها به عنوان منبع غنی از ترکیبات آنتیبیوتیکی، ویتامینها، سوخت و تولیدات دارویی مورد توجه پژوهشگران قرار گرفتهاند (18). با این حال، تاکنون درکشور ایران در مقایسه با سایر کشورها در زمینه شناخت ترکیبات آنتیبیوتیکی و بررسی خواص دارویی سیانوباکتریها مطالعات کاربردی اندکی انجام شده است.
نتایج حاصل از بررسی خواص ضدباکتریایی عصارههای متانولی 3 گونه سیانوباکتری Fischerella ambigua ISC67، Synechococcus elangatus ISC106و Schizothrix vaginata ISC108 در این پژوهش نشان داد که تنها عصاره متانولی سیانوباکتریFischerella ambigua دارای فعالیت ضدباکتریایی است و عصاره متانولی گونههای دیگر دارای اثر ضدباکتریایی معناداری نیست. ساکتیول[xxxix] و همکاران نیز ضمن بررسی خواص ضدباکتریایی سیانوباکتریها نشان دادندکه متانول بهترین حلال برای استخراج متابولیتهای ثانویه ضدمیکروبی از سیانوباکتریهاست (15). آنها همچنین نشان دادند که متانول برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی برخی از سیانوباکتریها سینکوکوس الانگاتوس[xl] و اوسیلاتوریا ویلیه[xli] حلال مناسبی نیست. با بررسی خواص ضدباکتریایی سیانوباکتری Fischerella ambigua مشخص شد که این سیانوباکتری از بین باکتریهای گرممثبت بر روی باکتریهای باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) و انتروکوس فیکالیس (PTCC 1237) اثر داشته و سایر باکتریهای گرم مثبت نسبت به این عصاره مقاوم بودند. همچنین، مشخص شد که عصاره متانولی این سیانوباکتری از بین باکتریهای گرم منفی بیشترین تأثیر را بر روی پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) داشته است. قاسمی و همکاران نیز در پژوهش خود نشان دادند که عصاره متانولی سیانوباکتریها دارای در خور قابل توجهی علیه باکتریهای پاتوژن است و بیشترین تأثیر را بر وری باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و پروتئوس ولگاریس دارد. آنها در نتیجه پژوهش خود، با توجه به مطالعات و تحقیقات زیادی که در این زمینه توسط پژوهشگران در سراسر دنیا انجام شده بود، گزارش کردند که، ترکیبات زیادی، از جمله، فیشرلین[xlii] و آمبیگوئین[xliii] از این سیانوباکتری تولید میشود که این ترکیبات دارای فعالیت ضد میکروبی هستند (10).
اگرچه در بیشتر مطالعات عصارههای به دست آمده از سیانوباکتریها علیه باکتریهای گرم منفی مانند اشریشیاکلی و پروتئوس ولگاریس مؤثر هستند، اما در این پژوهش مشخص شدکه عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaبر روی باکتری اشریشیاکلی هیچ اثری ندارد. این نتیجه با با نتایج زندی و همکاران و قاسمی و همکاران مطابقت دارد ولی با یافتههای تیواری[xliv] و شارما مطابقت ندارد (10، 29 و 30)، آنها گزارش دادند که ترکیبات فعال موجود در عصاره متانولی سیانوباکتری فیشرلا[xlv] علیه باکتری اشریشیاکلی مؤثر است. نتایج نشان داد که عصاره متانولی Fischerella ambiguaبر روی هر دو گروه باکتریهای گرم منفی و مثبت مورد بررسی به یک اندازه تأثیر داشت به طوری که اختلاف معناداری بین تأثیر این عصاره بر روی باکتریهای گرم مثبت با گرم منفی دیده نشد (01/0 P value ≥). در مطالعات مشابه، قاسمی و همکاران وهمچنین سلطانی و همکاران نشان دادند که بین تأثیر عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی اختلاف معناداری وجود ندارد (10 و 31).
نتایج به دست آمده از بررسی خواص ضدباکتریایی عصاره آبی سیانوباکتریFischerella ambigua نشان داد که این عصاره دارای اثر در خور توجهی بر روی اکثر باکتریهای گرم مثبت است واز بین باکتریهای گرم منفی تنها باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) نسبت به این عصاره حساس بود. دافی و پاور[xlvi] گزارش کردند که، یک توضیح احتمالی برای این مشاهدات ممکن است به تفاوتهای قابل توجهی که در لایههای بیرونی باکتریهای گرم منفی و مثبت وجود دارد، نسبت داده شود.آنها بیان کردند که باکتریهای گرم منفی دارای یک غشای خارجی و فضای پریپلاسمیک منحصر به فردی هستند که در باکتریهای گرم مثبت وجود ندارند (32). سلطانی و همکاران و قاسمی و همکاران نیز با بررسی خواص ضدباکتریایی عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambigua دریافتند که این عصاره دارای فعالیت ضدباکتریایی علیه باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی است، طوری که تأثیر این عصاره از آنتیبیوتیکهای مؤثر بر این باکتری بیشتر بود (10 و 31). این در حالی است که تیواری و شارما نشان دادن که بر خلاف نتایج به دست آمده در این مطالعه، عصاره آبی سیانوباکتریها فاقد اثر ضدباکتریایی است (30). همچنین، نتایج حاصل از تأثیر عصاره آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatusبر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی نشان دادکه این عصاره دارای اثر در خور توجهی بر روی باکتریهای گرممثبت و گرم منفی است. با این حال، اثر این عصاره علیه باکتریهای گرم مثبت کمتر یا تقریباً یکسان با باکتریهای گرم منفی بود. نتایج حاصل از تأثیر این عصاره با یافتههای مارتینز[xlvii] و همکاران مطابقت دارد، آنها در پژوهش خود ضمن بررسی فعالیت ضدباکتریایی سیانوباکتریهای جنس سینکوسیستیس[xlviii] و سینکوکوس علیه باکتریهای بیماریزای انسان، نشان دادند که عصارههای به دست آمده از سیانوباکتریها دارای فعالیت ضدباکتریایی معناداری علیه باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی است (33). همچنین، در این پژوهش نشان داده شد که عصارههای آبی و متانولی سیانوباکتری Schizothrix vaginataفاقد اثرات ضدباکتریایی و ضد قارچی است. تاکنون پژوهشی مبنی بر اثرات ضدمیکروبی عصاره آبی و متانولی این سیانوباکتری گزارش نشده است.
نتایج حاصل از اثر ضدباکتریایی عصارههای حاصل از سیانوباکتریهای مورد مطالعه در این پژوهش بر روی باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی بیماریزا نشان داد که اثر این عصارهها بر روی باکتریهای گرم مثبت بیشتر از باکتریهای گرم منفی است. نتایج پژوهش‌های زیادی نشان داد که اثرات عصارههای به دست آمده از سیانوباکتریها بر روی باکتریهای گرم مثبت بیشتر از باکتریهای گرم منفی است. برای مثال سلطانی و همکاران در بررسی خواص ضدمیکروبی سیانوباکتری فیشرلا[xlix] تحت تأثیر تنشهای شوری نشان دادند که اثر عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی باکتریهای گرم مثبت استافیلوکوکوس اپیدرمیس و باسیلوس سرئوس بیشتر از اثر این عصاره بر روی باکتریهای گرم منفی مانند اشریشیاکلی و انتروکوکوس فیکالیس (PTCC 1237) است (31). شان[l] و همکاران گزارش کردند که مقاومت باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد ضد باکتریایی مربوط به سطح آب دوست غشای خارجی آنهاست که غنی از مولکولهای لیپوپلیساکارید است، که یک مانع برای نفوذ مولکولهای متعددی از آنتیبیوتیکها و ترکیبات ضدباکتریایی تشکیل میدهند. از سوی دیگر غشا نیز با آنزیمها موجود در فضای پری پلاسمیک، که قادر به شکستن مولکولهای وارد شده از خارج سلولاند، در ارتباط است (34). با این حال، کالمبا و کونیکا[li] بیان کردند که باکتریهای گرم مثبت بر خلاف باکتریهای گرم منفی فاقد غشای خارجی و ساختار دیواره سلولی هستند. آنها نیز گزارش کردند که اثر عصاره سیانوباکتریها بر روی باکتریهای گرم مثبت بیشتر از باکتریهای گرم منفی است و آن را با اختلاف ساختار دیوارهسلولی باکتریهای گرم مثبت با گرم منفی مرتبط دانستند (35). همچنین، در این پژوهش مشخص شد که حساسیت قارچهای مورد بررسی به عصاره متانولی بیشتر از عصاره آبی است. بنابراین، میتوان نتیجه گرفت که متانول بهترین حلال برای استخراج ترکیبات ضدقارچی از سیانوباکتریهاست این یافتهها با نتایج پریادهارشینی[lii] و همکاران نیز مطابقت دارد. آنها نشان دادند که عصاره متانولی سیانوباکتریها دارای فعالیت ضدقارچی بیشتری نسبت به عصاره آبی و استونی هستند (36). این در حالی است که این نتایج با پژوهش قاسمی و همکاران مطابقت ندارد، آنها نشان دادند که فعالیت ضد قارچی عصاره آبی فیشرلا نسبت به عصاره متانولی آن بیشتر است (10). پژوهش‌های زیادی در زمینه شناسایی و جداسازی ترکیبات ضد قارچی سیانوباکتریها انجام شده است. در نخستین مطالعات انجام شده، اسمیتکا[liii] و همکاران نشان دادند که ترکیب آمبیگوئین تولید شده توسط سیانوباکتری فیشرلا دارای فعالیت ضدقارچی مطلوبی برروی قارچهای آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر، کاندیدا آلبیکنز، پنی سیلیوم نوتاتوم و ساکارومایسس سرویزیه است (37).
طبق نتایج به دست آمده مشخص شد که در تمام عصارههای مؤثر بر روی باکتریها و قارچهای بیماریزا، با افزایش غلظت عصارهها میزان قطر هاله مهاری و در نتیجه میزان فعالیت ضدباکتریایی و ضدقارچی عصارهها افزایش مییابد. در مطالعهای مشابه متیوانان[liv] و همکاران نشان دادند که بین قطرهاله عدم رشد و غلظت عصاره سیانوباکتریهای لینجبیا ماجوسکولا[lv] و اوسیلاتوریا پرینسپس[lvi] رابطه مستقیمی وجود دارد (38).
تاکنون متابولیتهای ثانویه فراوانی با فعالیت ضدمیکروبی از سیانوباکتریها جداسازی و شناسایی شدهاند، برای مثال چاندرا[lvii] و راجاشخار[lviii] با بررسی فیتوشیمیایی عصارههای اتانولی، متانولی، کلروفرمی، دی اتیل اتری و آبی چند گونه از سیانوباکتریها نشان دادند که فنول، فلاونوئید و کارتنوئید در تمام عصارههای بهدست آمده وجود دارند، درحالی که آلکالوئیدها و استروئیدها/ تریترپنها در همه عصارهها به جز عصاره آبی سیانوباکتریها وجود داشتند. همچنین، به طور مشابه فیکوسیانینها در تمام عصارهها به استثنای عصاره کلروفرمی موجود بودند. تانینها در تمام عصارهها به جزء عصاره آبی و کلروفرمی وجود داشتند اما ساپونینها و کومارینها در هیچ کدام از عصارهها موجود نبودند. آنها نشان دادند که این ترکیبات دارای فعالیتهای ضدمیکروبی هستند (39). چو[lix] و همکاران نشان دادند که ترکیبات فنولی و ترپنوئیدها دارای فعالیت ضدباکتریایی هستند و قادرند از طریق تخریب غشا از رشد میکروارگانیسمها جلوگیری کنند (40). در مطالعه دیگری کوشینی[lx] و همکاران گزارش کردند که فعالیت ضدمیکروبی فلاونوئیدها احتمالاً ناشی از توانایی آنها برای تشکیل کمپلکسی با پروتئینهای خارج سلولی و محلول و در نهایت، با دیواره سلولی باکتریهاست(41). همچنین، توییت[lxi] در سال 2010 در پژوهش خود در زمینه شناسایی متابولیتهای ثانویه تولید شده توسط سیانوباکتریها، با بررسی عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambigua6 ترکیب تولید شده توسط این سیانوباکتری را جداسازی و شناسایی کرد. این ترکیبات شامل آمبیگوئین D ایزونیتریل[lxii]، آمبیگوئین B ایزونیتریل[lxiii]، دیکلرو آمبیگوئین B ایزونیتریل، فیشیرلینA[lxiv]، همچنین هیدروکسی- ایکوساتترائنوئیک اسید[lxv] و متوکسی- نانادکادنوئیک اسید[lxvi] بودند. توئیت بیان کرد که این ترکیبات دارای فعالیتهای زیستی هستند (42). راوح و کارملی[lxvii] در پژوهش خود نشان دادند که آمبیگوئین D ایزونیتریل و آمبیگوئین B ایزونیتریل دارای اثرات ضد باکتری و ضدقارچی متوسطی هستند (43).
به نظر میرسد با توجه به تولید مواد ضدمیکروبی فراوان توسط سیانوباکتریها، احتمالاً سنتز این متابولیتها نتیجه دفاع سیانوباکتریها در محیط علیه ارگانیسمهای دیگر مثل: باکتری، قارچ، ویروس و ریزجلبکهای یوکاریوتی است که میتواند یک مزیت برای بقای این میکروارگانیسمها در محیط طبیعی باشد (44). در این زمینه زرینی و همکاران گزارش کردند که تولید ترکیات ضدباکتریایی و ضدقارچی توسط سیانوباکتریها میتواند بازتابی از شرایط محیطی و نیز هویت سیانوباکتریها باشد. استعداد سیانوباکتریها به عنوان منبع ترکیبات آنتیبیوتیکی نشانگر اهمیت این میکروارگانیسمها به عنوان عوامل دارویی بالقوه است (19).
در ایران در سال‌های اخیر، رویکرد پژوهش‌های جدید به سمت مسائل زیست محیطی و استفاده از میکروارگانیسمها در صنعت داروسازی و پزشکی بوده است. با این حال، بیشتر پژوهشها متمرکز بر میکروارگانیسم‌های خاصی بوده و سیانوباکتریها با وجود تنوع فراوان در فعالیتهای زیستی به جهت شناخت کمی که نسبت به این میکروارگانیسمها وجود دارد، همچنین دشواری مراحل کشت خالص آنها کمتر مورد توجه قرارگرفتهاند. از سوی دیگر، مطالعات در زمینه استفاده از سیانوباکتریها به عنوان منبعی از ترکیبات ضدمیکروبی و منابع طبیعی برای مقابله با بیماریهای عفونی و باکتریایی نسبتاً کم بوده است. یکی از مهمترین علتهای استفاده کمتر از این میکروارگانیسمها ممکن است اثرت جانبی ناشی از سموم بسیار قوی باشد که توسط برخی از گونههای سیانوباکتریها تولید میشود. این سموم حیات بسیاری از موجودات زنده از جمله آبزیان و دامهای اهلی که از آب رودخانهها و برکهها استفاده میکنند را به خطر میاندازد. از این رو شناسایی سیانوباکتریهای مفید و پژوهش در زمینه استفاده کاربردی از آنها در صنعت و پزشکی امری ضروری به نظر میرسد. مطالعه حاضر، جزو پژوهش‌های انجام گرفته در زمینه کاربردهای پزشکی این میکروارگانیسمها در ایران است. در این مطالعه بررسی فعالیت ضدمیکروبی گونهSchizothrix vaginataبرای نخستین بار در کشور انجام شده است.
بر اساس نتایج به دست آمده از این مطالعه، از میان سیانوباکتریهای مورد بررسی، تنها سیانوباکتری Fischerella ambiguaبود که هر دو عصاره به دست آمده از آن (متانولی و آبی) دارای فعالیت ضدباکتریایی بود و هیچ یک از عصارههای آبی و متانولی Schizothrix vaginataو عصاره متانولی Synechococcus elangatusاثرات ضدباکتریایی نداشتند. بیشترین اثرات ضدباکتریایی سیانوباکتریها مربوط به عصاره آبی Synechococcus elangatusبود. همچنین، در این مطالعه مشخص شد که بیشترین اثر ضد قارچی مربوط به عصاره متانولی سیانوباکتریFischerella ambigua است. با توجه به نتایج این پژوهش میتوان بیان کرد که عصاره آبی Synechococcus elangatusبهترین عصاره برای جداسازی ترکیبات ضدباکتریایی و متانول نیز بهترین حلال برای استخراج ترکیات ضدقارچی از این سیانوباکتری است. همچنین، مشخص شد هیچ کدام از حلالهای مورد استفاده در این پژوهش برای استخراج متابولیتهای ضدمیکروبی Schizothrix vaginataمناسب نیست و از این رو پژوهش‌های بیشتری بر روی این گونه با سایر حلالها پیشنهاد میشود. بنابراین، میتوان نتیجه گرفت که از میان سیانوباکتریهای مورد بررسی، دو گونه سیانوباکتری Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatusدارای فعالیت ضدمیکروبی بوده و میتوانند یک کاندیدای خوب برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی باشند و به نظر میرسد میتوان از ترکیبات موجود در عصاره آنها به عنوان دارو در کنترل و مهار بسیاری از بیماریها استفاده کرد که بررسی بیشتر اثرات آن مستلزم مطالعات بیشتر است.
تشکر و قدردانی
این مقاله برگرفته از پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد با عنوان «بررسی اثرات ضدمیکروبی و تجزیه زیستی نفت خام توسط سیانوباکتریها» مصوب سال 1390 با کد 1065839 است که با حمایت دانشگاه ایلام و همکاری گروه میکروبیولوژی نفت پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاد دانشگاهی دانشگاه شهید بهشتی تهران اجرا شده است.
[1]- Cyanobacteria
[2]- International Code of Botanical Nomenclature
[3]- International Code of Nomenclature of Prokaryots
[4]- polyphasic approach
[5]- Soltani
[6]- Chroococcus
[7]- Lyngbya
[8]- Anabaena
[9]- Synechococcus
[10]- Oscillatoria
[11]- Stigonema
[12]- Anabaenopsis
[13]- Nostoc
[14]- Calothrix
[15]- Richard Moore
[16]- Zarrini
[17]- Soltani
[18]- Val
[19]- Staphylococcus aureus
[20]- Staphylococcus epidermidis
[21]- Bacillus cereus
[22]- Enterococcus faecalis
[23]- Streptococcus pyogenes
[24]- Escherichia coli
[25]- Proteus vulgaris
[26]- Pseudomonas aeruginosa
[27]- Salmonella typhi
[28]- Yersinia pestsi
[29]- Fusarium Solani
[30]- Rhynchosporium secalis
[31]- Botrytis cinerea
[32]- Fusarium oxysporum
[33]- Kirby-bauer
[34]- Broth microdilution
[35]- Clinical and Laboratory Standards Institute
[36]- SPSS
[37]- ANOVA
[38]- Duncan
[xxxix]- Sakthivel
[xl]- Synechococcus elangatus
[xli]- Oscillatoria willei
[xlii]- Fischerellin
[xliii]- Ambiguine
[xliv]- Tiwari
[xlv]- Fischerella
[xlvi]- Duffy and Power
[xlvii]- Martins
[xlviii]- Synechoccystis
[xlix]- Fischerella sp.
[l]- Shan
[li]- Kalemba and Kunicka
[lii]- Priyadharshini
[liii]- Smitka
[liv]- Mathivanan
[lv]- Lyngbiya maguscula
[lvi]- Oscillatoria princeps
[lvii]- Chandra
[lviii]- Rajashekhar
[lix]- Cho
[lx]- Cushinie
[lxi]- Tuyet
[lxii]- ambiguine D isonitrile
[lxiii]- ambiguine B isonitrile
[lxiv]- fischerellin A
[lxv]- hydroxy-eicosatetraenoic acid
[lxvi]- methoxy-nonadecadienoic acid
[lxvii]- Raveh and Carmeli
)