نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Biofilms are communities of microorganisms embedded in a self-produced extracellular polymeric matrix. Bacterial cells are protected from antimicrobial agents in biofilm structure. Biofilms formation cause many problems in industry, medicine and microbial drug resistance; thus it is essential to find new techniques for removing and inhibiting biofilms. This study aimed to examine the antimicrobial effect of Tamarix hispida alcoholic extracts against six pathogenic bacteria in planktonic and biofim forms.
Materials and methods: Antimicrobial activities of the plant extracts against the planktonic form of bacteria were evaluated by using the disc diffusion method. MIC and MBC values were determined by a macrobroth dilution technique. Anti-biofilm effects were assessed by microtiter plate method.
Results: The results of this study confirmed high ability of T. hispida extracts against the biofilm of tested bacteria and their free-living forms. Methanolic extracts better inhibited bacterial growth and biofilm formation than ethanolic extracts. Anti-biofilm effects of plant extracts were depended on the solvent and extract concentration. The maximum inhibitory effects of T. hispida extracts on biofilm formation, demolish of biofilm structure and inhibition of metabolic activity of bacteria in the biofilm were observed for S. aureus (87/35 %), S. pneumonia (74/49 %) and B. ceruse (88/34 %) respectively.
Discussion and conclusion: In this study the capacity of herbal extracts to encountering whit biofilm was demonstrated and it was confirmed that these extracts have interesting potentiality to become active agents of new drugs.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
بیوفیلمها اجتماعات میکروبی سازمانیافتهای هستند که درون ماتریکسی از پلیمرهای آبدار خارج سلولی محصور شده و بر سطوح جاندار و یا بیجان تشکیل میشوند (1). علاوه بر سطوح طبیعی، بر سطح تجهیزات صنعتی مانند سطوح درگیر در تهیه مواد غذایی، سیستمهای توزیع و مخازن نگهداری آب، سیستمهای تهویه هوا و مخازن نفتی نیز میتوان ساختارهای بیوفیلمی را مشاهده کرد. تشکیل این ساختارها توسط ارگانیسمهای پاتوژن بر سطوح تجهیزات پزشکی، ابزارهای کاشتنی و اعضای مصنوعی نیز مشکلات بالینی بسیاری را ایجاد کرده است (2). افزون بر این، مقاومت یک میکروارگانیسم نسبت به عوامل ضدمیکروبی زمانیکه این سلول در ساختاریک بیوفیلم وارد میشود، هزاران بار بیشتر از فرم منفرد خود شده و از اینرو بیوفیلمها یکی از علتهای مهم بروز و گسترش مقاومتهای دارویی محسوب میشوند (3).
در دهههای اخیر گسترش مقاومتهای دارویی درمیان میکروارگانیسمهای پاتوژن از یک سو و آثار زیانبار ناشی از مصرف آنتیبیوتیکها از سوی دیگر، موجب شده تا پژوهشهای بسیاری به منظور دستیابی به ترکیبات ضدمیکروبی جدید انجام شود (4). در این راستا ترکیبات زیستی و به ویژه، گیاهان دارویی بسیار مورد توجه پژوهشگران بودهاند. سابقه طولانی کاربرد گیاهان دارویی در طب سنتی و شناسایی بسیاری از خواص درمانیشان طی سالهای متمادی، همچنین مقبولیت عام، دسترسی آسان، هزینه پایین تولید و عدم بروز مشکلات زیست محیطی همه از مزایایی هستند که این گروه از مشتقات زیستی را به یکی از گزینههای مناسب برای مهار سویههای میکروبی مقاوم تبدیل کرده است (5).
گیاه گز با نام علمی hispida Tamarixو به خانواده Tamaricaceae متعلق است. گز درختچهای کوتاه با انشعابات زیاد و سخت بوده که گاه به علت جستهای پاجوش به شکل درختچه در میآید. این گیاه بیشتر در اراضی شورهزار و مناطق خشک و نیمه خشک جهان و به ویژه ایران میروید. پوست درخت گز دارای مقادیری از تانن و اسید گالیک بوده و در برگهای آن اسکولین یافت میشود. پلی ساکارید گزنگبین نیز از این گیاه استخراج میشود. افزون بر برگهای گیاه یاد شده، صمغ گزانگبین نیز خواص درمانی دارد. از برگهای گز برای درمان اسهال، زخمهای سوختگی، قطع خونریزی و التیام جوشهای صورت استفاده میشود. گزانگبین نیز برای تسکین دل درد کودکان، رفع تنگی نفس و سر درد مفید است (6 و 7). در مطالعات بسیاری خواص ضدمیکروبی گونههای مختلف گیاه گز بررسی شده است. پژوهشهای یاد شده بیشتر با تکیه بر فرم منفرد میکروارگانیسمها انجام شده و به ساختارهای بیوفیلمی توجه کمتری شده است. برای مثال مشخص شده که عصارهی گیاه T. diocia اثر مهاری مناسبی بر قارچهای آسپرژیلوس فلاووس، کاندیدا آلبیکنس و کاندیدا گلبراتا داشته (8) و عصارههای گیاه T. macrocapra نیز باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس و کاندیدا آلبیکنس را به خوبی مهار میکند (9). برای مثال قابلیت مهاری عصاره T. diociaبر قارچهای آسپرژیلوس فلاووس، کاندیدا آلبیکنس و کاندیدا گلبراتا تایید (8) و همچنین، مشخص شده که گونه T. macrocapra قادر است باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس و کاندیدا آلبیکنس را به خوبی مهار کند (9).
این پژوهش به منظور ارزیابی خواص ضد میکروبی عصارههای اتانولی و متانولی گونه جدیدی از گیاه گز (T. hispida) بر فرم منفرد و ساختارهای بیوفیلمی 6 باکتری پاتوژن در آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه شهید باهنر کرمان انجام شد. میکروارگانیسمهای یاد شده شامل 3 باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس و استرپتوکوکوس پنومونیه و 3 باکتری گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا، اشرشیاکلی و کلبسیلا پنومونیه بودند. باکتریهای یاد شده همگی از پاتوژنهای مهم انسانی محسوب میشوند که در دهههای اخیر با کسب مقاومتهای دارویی مشکلات بسیاری را ایجاد کردهاند.
.مواد و روشها.
جمعآوری، شناسایی و تهیه عصارههای گیاهی: گیاه گز از درختچههای حومه شهر رفسنجان جمعآوری و در هرباریوم دانشکده علوم دانشگاه شهید باهنر از نظر علمی شناسایی شد. ساقههای نازک و برگهای گیاه گز در سایه خشک و سپس، به کمک آسیاب برقی و الک تا حد ممکن پودر شد. 50 گرم از پودر گیاه گز به ترتیب به ارلنهای حاوی 500 میلیلیتر اتانول 80 درصد و 500 میلیلیتر متانول 96 درصد افزوده و درب ارلنها با ورقه آلومینیومی، کامل بسته شد. به منظور استخراج ترکیبات موثر گیاه گز، ارلنها به مدت 24 ساعت به دستگاه شیکر با سرعت 180 دور در دقیقه و دمای 38 درجه سانتیگراد منتقل و سپس، برای حذف قطعات اضافی، محلول از کاغذ صافی عبور داده شد. محلول فیلتر شده برای تبخیر حلال اضافی در دستگاه روتاری وارد و سپس، در آون 40 درجه سانتیگراد به پودر خشک عصاره تبدیل شد. مقدار 100 میلیگرم از پودر خشک هر عصاره در حجم مناسبی از دی متیل سولفوکساید حل و سپس، با عبور از فیلتر میلیپور استریل شد. پس از این محلول یاد شده با افزودن آب مقطر استریل به حجم یک میلیلیتر رسانده شده و این محلول به عنوان محلول ذخیره عصاره (100 میلیگرم / میلیلیتر) تا زمان مصرف در ظروف شیشهای استریل و تیره در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد (10).
میکروارگانیسمهای مورد بررسی: بررسی خواص ضدمیکروبی T. hispida بر باکتریهای گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس و استرپتوکوکوس پنومونیه و همچنین، باکتریهای گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه انجام شد. استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه سویههای جداسازی شده از بیماران بوده و از آزمایشگاه میکروبشناسی دانشگاه علوم پزشکی کرمان تهیه شدند. باسیلوس سرئوس سویه جداسازی شده از دام بوده و از دانشکده دامپزشکی دانشگاه باهنر تهیه شد. سودوموناس آئروژینوزا نیز سویه جداشده از خاک بوده و از دانشکده علوم دانشگاه باهنر تهیه شد. از هر میکروارگانیسم یک سویه انتخاب و کشت مرجع آن در یخچال نگهداری شده و هر ماه در نوترینت آگار تجدید کشت شد. در مورد استرپتوکوک پنومونیه از محیط بلاد آگار استفاده شد.
.بررسی اثر ضدمیکروبی عصارهها بر فرم منفرد به روش انتشار دیسک: تعیین قابلیت مهاری عصارههای الکلی T. hispida بر باکتریهای انتخابی در ابتدا به کمک آزمون انتشار دیسک انجام شد. برای این منظور 5 عدد دیسک بلانک استریل در شرایط آسپتیک به محلول ذخیره عصاره (100 میلیگرم / میلیلیتر) وارد و به مدت 2 ساعت در آن باقی ماند. سپس، دیسکها به یک پلیت استریل منتقل و حلال اضافه هر دیسک در آون 40 درجه تبخیر شد (11). در این بررسی دیسک آنتیبیوتیک کلرامفنیکل (30 میکروگرم / دیسک) شاهد مثبت بود. برای اطمینان از عدم تأثیر هریک از حلالهای به کاررفته در عصارهگیری و حل کردن مجدد عصارهها، دیسکهای آغشته به اتانول، متانول و دی متیل سولفوکساید به عنوان شاهد منفی آزمایش انتخاب شدند.
برای انجام آزمون انتشار دیسک، از محیط مرجع هر باکتری در محیط نوترینت براث[1]کشت 24 ساعته تهیه و سپس، هر سوسپانسیون تا رسیدن به کدورتی معادل 5/0 مک فارلند[2]رقیق شد. از سوسپانسیونهای یاد شده کمک سوآب استریل در محیط مولر هینتون آگار[3] کشت سفرهای انجام شد. پس از این دیسکهای آغشته به عصاره، حلال و آنتیبیوتیک در شرایط آسپتیک و با فاصلههای منظم بر سطح پلیت قرار گرفته و پلیتها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجهی سانتیگراد انکوبه شدند. قطر هالههای مهاری هر دیسک پس از انکوباسیون با خطکش میلیمتری اندازهگیری شد (12).
.تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصارههای گیاهی: به منظور دستیابی به حداقل غلظت مهارکننده[4]عصارههای گیاه گزاز روش ماکروبراث دایلوشن و طبق پروتکلCLSI [5] استفاده شد (10). بدین جهت 10 غلظت 50 تا 02/0 میلیگرم / میلیلیتر از محلول ذخیره عصاره و به شیوه رقیق سازی متوالی (13) تهیه شد. 10 لوله آزمایش استریل انتخاب و به هریک مقدار یک میلیلیتر محیط نوترینت براث استریل افزوده شد. سپس، به لوله اول یک میلیلیتر از محلول ذخیره عصاره وارد و به خوبی مخلوط شد تا غلظت نهایی عصاره در لوله اول50 میلیگرم / میلیلیتر به دست آید. یک میلیلیتر از این محلول در شرایط آسپتیک به لوله دوم منتقل و به خوبی مخلوط شد تا غلظت عصاره نصف لوله اول و 25 میلیگرم / میلیلیتر شود. به همین ترتیب غلظتهای سوم تا دهم عصاره در لولههای بعدی تهیه شد.
سپس، به هر غلظت مقدار یک میلیلیتر از کشت 24 ساعته باکتری در محیط نوترینت براث که به کدورتی معادل 5/0 مک فارلند رسانده شده بود، افزوده شد. در این آزمون، لولههای کنترل مثبت حاوی سوسپانسیون میکروبی و آنتیبیوتیک سیپروفلوکساسین (2 میلیگرم / میلیلیتر) (ثامن دارو، مشهد، ایران)، لولههای کنترل منفی حاوی سوسپانسیون میکروبی و آب مقطر استریل و در نهایت، لولههای شاهد عصاره حاوی غلظت مورد نظر از عصاره و محیط نوترینت براث بودند. تمامی مراحل یاد شده در شرایط آسپتیک انجام و لولهها به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجهی سانتیگراد انکوبه شدند. پس از انکوباسیون کدورت ایجاد شده در لولههای آزمون با کدورت کنترل منفی و شاهد عصاره مقایسه و کمترین غلظتی که رشد باکتری در آن مهار شده بود به عنوان MIC انتخاب شد.
برای محاسبه حداقل غلظت کشندگی[6]عصارههای گیاه گز از لولههای مورد بررسی در آزمونMIC، در محیط مولر هینتون آگار فاقد عصاره گیاهی کشت انجام شده و کمترین غلظتی که باکتری در آن رشد نکرد به عنوان MBC تعیین شد.
.ارزیابی قابلیت مهاری عصارههای گیاهی بر پدیده تشکیل بیوفیلم: قدرت مهار پدیده تشکیل بیوفیلم در تیمار با عصارههای T. hispida به کمک روش میکروتیتر پلیت بررسی شد. در ابتدا یک لوپ از کشت مرجع هر باکتری در محیط تریپتیکاز سوی براث[7]منتقل و پس از 18 ساعت انکوباسیون تا رسیدن به کدورتی معادل یک مک فارلند رقیق شد. غلظتهایی از عصاره که در این آزمون انتخاب شد شامل سه غلظت 50 تا 5/12میلیگرم / میلیلیتر بود که به روش رقیقسازی متوالی و از محلول ذخیره عصاره با افزودن محیط تریپتیکاز سوی براث استریل تهیه شد. مقدار 100 میکرولیتر از هر غلظت در شرایط آسپتیک به چاهکهای آزمون میکروپلیت 96 خانه استریل وارد و سپس، به هریک از این چاهکها 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی اضافه شد. در این آزمون چاهک کنترل مثبت، کنترل منفی و چاهک شاهد عصاره همانند آزمون تعیین MICدر نظر گرفته شدند. میکروپلیت به مدت 24 ساعت و در دمای 37 درجه سانتیگراد، بدون حرکت انکوبه شد (14).
به منظور بررسی اثر مهاری عصارهها پس از انکوباسیون از روش رنگآمیزی کریستال ویوله استفاده شد. در ابتدا محتویات چاهکهای میکروپلیت به آرامی آسپیره و هر چاهک دو مرتبه با بافر سالین فسفات شسته شد. سپس، برای تثبیت ساختارهای بیوفیلمی 150 میکرولیتر متانول به مدت 15 دقیقه به چاهکها افزوده شد. پس از آسپیره متانول، 200 میکرولیتر کریستال ویوله (محلول یک درصد جرمی- حجمی در اتانول 90 درصد) به چاهکها وارد و میکروپلیت به مدت 20 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد انکوبه شد. رنگ اضافی هر چاهک با جریان آرام آب شیر شسته شده و پس از خشک شدن پلیت، جذب نوری هر چاهک با افزودن 160 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال 33 درصد در طول موج 630 نانومتر و با دستگاه الایزا ریدر معین شد (15). درصد مهار تشکیل پدیده تشکیل بیوفیلم در تیمار با عصارههای T. hispida به کمک فرمول زیر محاسبه شد (16):
.. 100 *= percent Inhibition.
در این فرمول C میانگین جذب نوری چاهکهای کنترل منفی، B میانگین جذب نوری چاهکهای کنترل محیط، T میانگین جذب نوری چاهکهای آزمون در غلظت مورد نظر و E میانگین جذب نوری چاهکهای شاهد عصاره همان غلظت است.
.بررسی قابلیت عصارههای گیاهی در تخریب ساختارهای بیوفیلمی: به منظور بررسی قابلیت عصارههای گیاه گز در تخریب ساختارهای بیوفیلمی باکتریهای انتخابی، ابتدا بیوفیلم هر باکتری تشکیل و سپس، غلظتهای مختلف عصاره (50 تا 5/12 میلیگرم / میلیلیتر) بر این ساختارها اثر داده شد. در این آزمون نیزچاهک کنترل مثبت، کنترل منفی و چاهک شاهد عصاره همانند آزمون تعیین MIC در نظر گرفته شدند. این بررسی به روش سانداسی[8] (17) انجام و در آن برای تشکیل بیوفیلم، 100 میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتریها در محیط تریپتیکاز سوی براثکه به کدورتی معادل یک مک فارلند رسانده شده بود به چاهکهای آزمون و کنترل منفی میکروپلیت وارد و پلیت یاد شده به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه بدون حرکت انکوبه شد. شایان ذکر است که به چاهکهای شاهد محیط کشت و شاهد عصاره این میکروپلیت نیز 100 میکرولیتر محیط تریپتیکاز سوی براث استریل افزوده شده بود. پس از گذشت زمان انکوباسیون، محتویات چاهکها به آرامی و در شرایط آسپتیک آسپیره شد. به منظور حذف سلولهای پلانکتونیک، چاهکها دو مرتبه با بافر سالین فسفات شسته شدند و سپس، به چاهکهای آزمون و شاهد عصاره مقدار 100 میکرولیتر از هر غلظت اضافه و پلیت یاد شده برای 24 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتیگراد و بدون حرکت انکوبه شد. پس از این مدت میکروپلیت با روش رنگآمیزی کریستال ویوله بررسی و درصد تخریب ساختارهای بیوفیلمی به کمک فرمولی که پیشتر اشاره شد محاسبه شد.
.سنجش قابلیت عصارههای گیاهی در مهار فعالیت متابولیکی ساختارهای بیوفیلمی: در این بررسی نیز به همان طریق که در بخش قبل شرح داده شد، ابتدا ساختارهای بیوفیلمی تشکیل و سپس، غلظتهای مورد نظر از عصاره (50 تا 5/12 میلیگرم / میلیلیتر) بر این ساختارها اثر داده شد. پس از گذشت زمان انکوباسیون به چاهکهای تیمار و شاهد مقدار 50 میکرولیتر از رنگ TTC[9] افزوده و میکروپلیت به مدت سه ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. پس از این مدت جذب نوری چاهکها در طول موج 490 نانومتر تعیین شد (18).
.تحلیل آماری یافتهها: همه آزمونها در این بررسی با سه تکرار انجام شده، اختلاف بین دادهها با آزمون تحلیل واریانس (آنوا[10]) و در نرم افزار اس. پی. اس. اس [11]18 مقایسه و اعداد دارای مقدار P[12] کمتر از 05/0 معنادار فرض شدند. سپس، اختلافات حقیقی بین گروهها در آزمون انتشار دیسک به کمک آزمون دانکن[13]بررسی شد. در آزمونهای انجام شده بر ساختارهای بیوفیلمی به علت فاکتورهای متعدد مؤثر در آزمایش و فزونی دادهها، از آوردن دستهبندیهای آزمون یاد شده صرف نظر شده و آثار متقابل فاکتورهای مؤثر در هر آزمایش با آزمون ال. اس. دی[14]بررسی شد.
نتایج
.قابلیت عصارههای گیاهی در مهار فرم منفرد باکتریهای مورد بررسی: قطر هالههای مهاری هریک از عصارههای اتانولی و متانولی T. hispida در شکل 1 و مقادیر MIC و MBC عصارههای یاد شده در جدول 1 آمده است. بر این اساس قدرت مهاری عصاره اتانولی بر فرم منفرد بیشتر از نوع متانولی آن است. در آزمون انتشار دیسک عصارههای گیاه گز قادر به مهار باکتریهای مورد مطالعه در سطح معناداری یک درصد بودند(P value<0/01). البته شایان ذکر است که قابلیت مهاری عصارههای T. hispidaبر باکتری استرپتوکوکوس پنومونیه در سطح 5 درصد معنادار نیست (P value=0/086). بزرگترین هالهی مهاری در آزمون یاد شده بر باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس و کلبسیلا پنومونیه تشکیل شد.
در محیط مایع نیز همانند محیط جامد به کار رفته در آزمون انتشار دیسک کلبسیلا پنومونیه بیشترین و استرپتوکوکوس پنومونیه کمترین حساسیت را به عصارههای گیاه گز نشان دادند.
شکل 1- مقایسه قطر هاله مهاری عصارههای گیاه گز و آنتیبیوتیک شاهد (میلیمتر). حروف مشابه a, b, c, … بر اساس آزمون دانکن با یکدیگر در سطح 5 درصد اختلاف معنادار ندارند.
جدول 1- مقادیر MIC و MBC عصارههای T. hispida(میلیگرم / میلیلیتر)
باکتری |
MIC عصاره متانولی |
MIC عصاره اتانولی |
MBC عصاره متانولی |
MBC عصاره اتانولی |
استافیلوکوکوس اورئوس |
12/3 |
56/1 |
5/12 |
12/3 |
باسیلوس سرئوس |
56/1 |
78/0 |
12/3 |
56/1 |
استرپتوکوکوس پنومونیه |
25/6 |
12/3 |
25 |
5/12 |
سودوموناس آئروژینوزا |
12/3 |
78/0 |
5/12 |
12/3 |
اشریشیا کلی |
12/3 |
56/1 |
25/6 |
25/6 |
کلبسیلا پنومونیه |
78/0 |
39/0 |
56/1 |
78/0 |
.قابلیت عصارههای گیاهی در مهار ساختارهای بیوفیلمی باکتریهای مورد بررسی: قدرت مهاری هریک از غلظتهای انتخابی عصارههای T. hispida در مهار پدیده تشکیل بیوفیلم، تخریب ساختارهای بیوفیلمی و مهار فعالیت متابولیکی این ساختارها به ترتیب در شکلهای 2، 3 و 4 آمده است. با توجه به آزمون تحلیل واریانس انجام شده بر دادههای آزمونهای یاد شده، اثر مهاری عصارههای گیاه گزدر این آزمونها در سطح یک درصد معنادار است (P value <0/01). بر این اساس در آزمونهای مهار تشکیل بیوفیلم و مهار فعالیت متابولیکی ساختارهای یاد شده، نوع باکتری، نوع عصاره و غلظت بر قابلیت مهاری آن در سطح یک درصد نیز اثر معنادار بوده (P value <0/01) و آثار متقابل هریک از عوامل یاد شده نیز در سطح یک درصد معنادار است (P value <0/01). در تخریب ساختارهای بیوفیلمی تشکیلشده نیز تمامی عوامل یاد شده اثر معناداری بر قدرت مهاری عصاره در سطح یک درصد داشتند
(P value <0/01). البته در آزمون یاد شده نوع عصاره (P value = 0/077)، اثر متقابل نوع عصاره و غلظت آن (P value = 0/144) که بر قدرت تخریبی عصارهها در سطح 5 درصد اثر معناداری نداشت.
شکل 2- مقایسه اثر مهاری غلظتهای متفاوت عصارههای الکلی گیاه گز بر تشکیل بیوفیلم باکتریهای انتخابی
* نشاندهنده مهار معنادار غلظت مورد بررسی در سطح 5 درصد و ** نشاندهنده مهار معنادار غلظت مورد بررسی در سطح یک درصد است.
در بیشتر آزمونهای انجام شده بر ساختارهای بیوفیلمی، اثر مهاری انواع اتانولی عصارههای
T. hispidaبیشتر از نوع متانولی آن بود. بر اساس میانگین قابلیت غلظتهای مختلف عصاره در هریک از آزمون انجام شده بر ساختارهای بیوفیلمی، بیشترین مهار پدیده تشکیل بیوفیلم در باکتری استافیلوکوکوساورئوس (35/87 درصد) مشاهده شد. با وجود این عصارهی متانولی گیاه گز در غلظت 5 میلیگرم / میلیلیتر قادر به مهار تشکیل بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا نبوده و عصاره T. hispidaکمترین اثر بخشی خود را درآزمون یاد شده بر باکتریهای باسیلوس سرئوس و سودوموناس آئروژینوزا نشان داد.
شکل 3- مقایسه قابلیت غلظتهای متفاوت عصارههای الکلی گیاه گز در حذف ساختارهای بیوفیلمی باکتریهای انتخابی
* نشاندهنده مهار معنادار غلظت مورد بررسی در سطح 5 درصد و **نشاندهنده مهار معنادار غلظت مورد بررسی در سطح یک درصد است.
بیشترین تخریب ساختارهای بیوفیلمی در تیمار با عصارههای T. hispida در استرپتوکوکوس پنومونیه (71/62 درصد) مشاهده شد. این در حالی است که نوع اتانولی عصارهی گیاه گز در غلظت 5 میلیگرم / میلیلیتر قادر به تخریب بیوفیلمهای استافیلوکوکوس اورئوس نبوده و نوع متانولی غلظت یاد شده بر تخریب ساختارهای بیوفیلمی باسیلوس سرئوس، سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه نیز بیاثر بود. فعالیت متابولیکی بیوفیلمها نیز در تیمار با عصارههای
T. hispidaبه حد درخور توجهی کاهش یافت که باسیلوس سرئوس بیشترین کاهش (34/88 درصد) و سودوموناس آئروژینوزا کمترین کاهش (64/39 درصد) را در این آزمون نشان دادند.
شکل 4- مقایسه اثر غلظتهای متفاوت عصارههای الکلی گیاه گز در مهار فعالیت متابولیک بیوفیلم باکتریهای انتخابی
* نشاندهنده مهار معنادار غلظت مورد بررسی در سطح 5 درصد و ** نشاندهنده مهار معنادار غلظت مورد بررسی در سطح یک درصد است.
.بحث و نتیجه گیری.
ظهور سویههای میکروبی مقاوم به دارو و گسترش روز افزون مقاومتهای دارویی موجب شده تا مقابله با بیماریهای عفونی امروزه به یکی از مشکلات اصلی حوزه درمان تبدیل شود. افزون بر این عوارض ناشی از مصرف آنتیبیوتیکها در بیماران و مشکلات زیست محیطی حاصل از این گروه دارویی همه سبب شده تا بررسی روشهای جدید مقابله با سویههای میکروبی مقاوم بسیار مورد توجه پژوهشگران باشد. در این میان توجه ویژه به بیوفیلمهای میکروبی به علت نقش مهمی که این ساختارها در بروز مقاومتهای دارویی ایفا میکنند، بسیار ضروری است (4 و 19). بیوفیلمها اجتماعاتی از سلولهای میکروبی سازمانیافته در ماتریکسی از پلیمرهای خارج سلولی هستند که تشکیل این ساختارها بر سطوح مختلف موجب بروز مشکلات بسیاری در صنعت و پزشکی شده است (1). در راستای دستیابی به ترکیبات جدید ضدمیکروبی، مشتقات زیستی و به ویژه گیاهان دارویی با توجه به مقبولیت عام و ماهیت طبیعی خود یکی از اصلیترین انتخابهای پژوهشگران هستند (5). از اینرو در این مطالعه خواص ضدمیکروبی T. hispidaبر باکتریهای انتخابی معین و مشخص شد چنانچه پس از عصارهگیری به روش ماسراسیون، تغلیظ انجام شود خاصیت مهاری عصاره افزایش چشمگیری خواهد داشت.
در آزمون انتشار دیسک قابلیت عصارههای
T. hispidaدر مهار فرم منفرد باکتریهای انتخابی تایید شد. اگرچه در آزمون یاد شده تنها در باکتریهای استرپتوکوکوس پنومونیه و کلبسیلا پنومونیه قدرت مهاری عصاره برابر و حتی اندکی بیشتر از آنتیبیوتیک شاهد بود؛ هاله مهاری بسیار کوچکتری پیرامون دیسکهای آغشته به عصاره بر کشت سایر باکتریها در مقایسه با آنتیبیوتیک انتخابی مشاهده شد. در محیط مایع به کاررفته در آزمون MIC عصارههای T. hispidaدر غلظتی بسیار کمتر (25/6 تا 39/0 میلیگرم / میلیلیتر) از غلظت به کاررفته در تهیه دیسک (100میلیگرم/ میلیلیتر) رشد باکتریهای مورد بررسی را مهار کردند و از اینرو قابلیت مهاری عصارههای گیاه گز در محیط مایع چندین برابر محیط جامد است. بنابراین، میتوان چنین نتیجهگیری کرد که ترکیبات موثر عصارههای T. hispidaهمانند بسیاری از عصارههای گیاهی دیگر قابلیت انتشاری اندکی در محیط جامد داشته و بر این اساس برای اثرگذاری مطلوب در این محیط به غلظتی بسیار بیشتر از غلظت موثر در محیط مایع نیاز است. در مقابله با ساختارهای بیوفیلمی نیز عصارههای T. hispida بسیار کارآمد بوده و اثر مهاری هر عصاره به غلظت و نوع حلال آن و همچنین، نوع باکتری مورد بررسی وابسته است. قابلیت عصارههای گیاه گزدر مهار پدیده تشکیل بیوفیلم باکتریهای انتخابی بیشتر از قدرت تخریبی آنها بود. البته شایان ذکر است که در سودوموناس آئروژینوزا قابلیت عصارههای یاد شده در تخریب ساختارهای بیوفیلمی بیشتر از قدرت مهاری آنها در تشکیل بیوفیلم و یا سرکوب فعالیت متابولیکی این ساختارهاست. در این باکتری و همچنین، استرپتوکوکوس پنومونیه تفاوت محسوسی در قابلیت مهاری عصارههای T. hispida بر پدیده تشکیل بیوفیلم و مهار فعالیت متابولیکی ساختارهای یاد شده مشاهده نشد. در باسیلوس سرئوس عصارههای گز فعالیت متابولیکی ساختارهای بیوفیلمی را بهتر از پدیده تشکیل بیوفیلم مهار کردند. این در حالی است که در استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه عکس پدیده یاد شده مشاهده شد. در میان باکتریهای یاد شده تنها در اشریشیا کلی مهار فعالیت آنزیم دهیدروژناز سلولها بسیار ضعیفتر از تخریب ساختارهای بیوفیلمی بوده و در دو باکتری دیگر عکس این پدیده مشاهده شد. با توجه به مکانیسمهای متفاوت دخیل در تشکیل و گسترش بیوفیلمهای هرکدام از باکتریهای مورد مطالعه، مکانیسمهای مهاری متفاوتی نیز از عصارههای
T. hispida برای هر باکتری انتظار میرود. برای مثال عصارههای یاد شده ممکن است حاوی ترکیبات موثرهای باشند که با فرآیند تشکیل بیوفیلم به خوبی تداخل نموده اما قدرت تخریبی کمی بر این ساختارها داشته باشد. با توجه به اینکه ترکیبات موثره عصارههای گیاه گز و مکانیسم اثر مهاری آنها بر ساختارهای بیوفیلمی در این مطالعه بررسی نشده و به مطالعات بعدی موکول شده است، میتوان با شناسایی عناصر یاد شده و با توجه به مولکولهای کلیدی متفاوت که در فرآیند تشکیل بیوفیلم باکتریهای مورد مطالعه دخیل هستند، اختلافات مشاهده شده را تحلیل کرد.
در مطالعات دیگر نیز خواص ضدمیکروبی گونههای مختلف گیاه گز تایید شده که این بررسیها بیشتر بر فرم منفرد باکتریها بوده و تاکنون مطالعهای برقابلیت گیاه گز در مهار ساختارهای بیوفیلمی انجام نشده است. برای مثال مشخص شده که فلاونوئیدهای مشتق از گونه
T. gallica بر استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه، سودوموناس آئروژینوزا و آسپرژیلوس نایجر اثر مهاری مناسبی دارد. در بررسی اشاره شده سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه حساسترین و آسپرژیلوس نایجر مقاومترین میکروارگانیسمها به عصارههای T. gallica بوده و با افزایش غلظت عصاره قابلیت مهاری آن افزایش مییابد (20). در بررسی دیگری که بر همین گونه از گیاه گز انجام شده مشخص شد که عصارههای آبی قدرت مهاری بیشتری نسبت به عصارههای متانولی داشته و عصارههای یاد شده اثر مهاری مناسبی بر فرم منفرد باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیاکلی، کلبسیلا پنومونیه، سودوموناس آئروژینوزا و کاندیدا آلبیکنس دارند (21).
خواص ضد میکروبی گونه T. aphylla نیز بر میکروارگانیسمهای مختلف تایید شده است. برای مثال در پژوهشی مشخص شده که عصارههای این گونه قابلیت مهاری مناسبی بر باکتریهای استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس، اشریشیا کلی، پروتئوس میرابیلیس و پروتئوس ولگاریس دارند اما اثر مهاری ضعیفی بر سودوموناس آئروژینوزا داشته و بر سالمونلا تیفی بیاثر هستند (22). در مطالعه دیگری اثر ضدقارچی همین گونه از گیاه گز بر آلترناریا تایید شده است (23). همچنین، پتانسیل ضد انگلی T. Aphyllaبر لیشمانیا تروپیکا در بررسی دیگری تایید و مشخص شده است که قدرت مهاری گیاه یاد شده با غلظت عصاره به کاررفته و مدت زمان تیمار اثر مستقیم دارد (24).
با توجه به نتایج حاصل در این پژوهش و بررسیهای انجام شده بر گونههای مختلف گیاه گز، خواص ضدمیکروبی این گیاه تایید شده و عصارههای آن گزینههای مناسبی در مهار میکروارگانیسمهای پاتوژن هستند. از آنجا که عصارههای الکلی T. hispida در این بررسی اثر مهاری مناسبی بر فرم منفرد و ساختارهای بیوفیلمی باکتریهای مورد مطالعه در شرایط آزمایشگاهی نشان دادند، مطالعات بیشتر بر خواص ضدبیوفیلمی گیاه گز توصیه میشود. به علاوه میتوان با بررسی و تخلیص ترکیبات موثره عصارههایT. hispida و همچنین، سنجش میزان اثربخشی این عصارهها در حیوانات آزمایشگاهی از عصارههای یاد شده به عنوان یک منبع ضدمیکروبی مناسب در مقابله با میکروارگانیسمهای پاتوژن، به ویژه در شکل بیوفیلمی بهره گرفت.
[1]- Nutrient broth, NB
[2]- 0.5 Mac farland
[3]- Muller Hinton Agar, MHA
[4]- Minimum Inhibitory Concentration, MIC
[5]- The Clinical and Laboratory Standards Institute
[6]- Minimum Bactericidal Concentration, MBC
[7]- Tryptic Soy Broth, TSB
[8]- Sandasi
[9]- TriphenylTetrazolium Chloride
[10]- ANOVA
[11]- SPSS
[12]- value P
[13]- Duncan