نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، ایران.
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، ایران.
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Mycobacterium marinum is a slow growing nontuberculosis mycobacterium. This organism can cause disseminated granulomatous infections in fish, called ‘fish tuberculosis’. Changes in nutritional components in culture medium and environmental conditions may lead to some changes in growth patterns and biofilm formation having new characteristics. The aim of this study was the evaluation of changes in medium components and environmental factors on the growth pattern and biofilm formation of M. marinum CCUG 20998.
Materials and methods: M. marinum CCUG 20998 was grown in 7H9 broth medium containing different concentrations of Tween 80 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6 % v/v), Oleic Albumin Dextrose Catalase supplement (OADC), (4, 8, 12, and 16 % v/v) and glycerol (30, 35, 40, 45, and 50 % v/v). The changes in growth patterns and biofilm formation were determined by using measurement of optical density and staining by crystal violet.
Results: The obtained results showed that maximum growth was at 0.4 % of Tween 80. Oleic Albumin Dextrose Catalase supplement at different concentrations did not show any significant effect on the growth pattern. Decreasing the glycerol concentration significantly decreased the growth rate. The maximum biofilm formation was obtained in 35 % glycerol without Tween 80 and OADC in culture medium.
Discussion and conclusion: According to the obtained results, Tween 80 and glycerol in the formulation of Middlebrook 7H9 Broth are very critical for M. marinum CCUG 20998 growth. In contrast, Oleic Albumin Dextrose Catalase supplement can be omitted from the medium formulation due to showing no significant effect on the growth pattern.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
مایکوباکتریومها بر اساس طبقهبندی کتاب برجی جزو باکتریهای گرم مثبت با درصد گوانین و سیتوزین بالا هستند. دو ویژگی فیزیولوژیکی مایکوباکتریومها عبارت است از رشد آهسته (حتی مایکوباکتریومهای با رشد سریع، در عرض 3 تا 4 روز رشد میکنند) و ساختمان پوشش سلولی و متابولیسم مایکوباکتریومها که در بین پروکاریوتها منحصر به فرد است. مایکوباکتریومها هوازی اجباری هستند؛ اما در شرایط داخل سلولی، متابولیسم آنها با محدودیت اکسیژن نیز انجام میشود (1). نمونههای محیطی مشکل پسند و اگزوتروف نیستند و برای رشد به اسیدهای چرب نیاز دارند. کشت آنها در محیطهای حاوی اولئیک اسید (میدلبروک) و یا تخم مرغ (لوون اشتاین جانسون) باید انجام شود. زمانی که محیط حداقل باشد، اسیدهای چرب (مانند پالمتیک) به همراه آلبومین و یک دترجنت (مانند توئین80) به محیط اضافه میشود (2). مایکوباکتریوم مارینوم[1]، مایکوباکتریومی غیر توبرکلوزیس[2] است که به کندی رشد میکند و دمای بهینه رشد آن 30 تا 32 درجه سانتیگراد است؛ اما این ارگانیسم به رشد در دماهای پایین نیز سازگار است و عامل عفونت گرانولومایی مشابه به توبرکلوزیس در ماهی و قورباغه میباشد. عفونت در ماهی با نام توبرکلوزیس (سل) ماهی شناخته میشود و در انسان به ندرت اتفاق میافتد. ماهی آلوده به این ارگانیسم میتواند به زخم یا نودولهای پوستی منجر شود؛ اما خوردن ماهی آلوده پخته شده یا آب شور یا شیرین آلوده تاکنون در انسان هیچ نوع بیماری ایجاد نکرده است (3). مایکوباکتریومها قادرند در انواع محیطها بیوفیلم تولید کنند؛ بنابراین، مطالعه آنها اهمیت فوق العادهای دارد، با توجه به اینکه پاتوژنهای مهمی مانند مایکوباکتریوم توبرکلوزیس[3] و مایکوباکتریوم لپرا[4] در این جنس قرار دارند (4) باکتریهای مستقر در بیوفیلم میتوانند بیشتر از 1000 برابر به درمان با آنتیبیوتیک نسبت به ارگانیسمهای مشابه رشد یافته به شکل پلانکتونی مقاوم باشند. همچنین، تشکیل بیوفیلم موجب حفاظت در برابر محیط میشود، مواد غذایی و متابولیکی را در دسترس قرار میدهد و ویژگیهای ژنتیکی جدیدی را برای ارگانیسم کسب میکند (5). شولتز[5] و همکاران در سال 1995 نشان دادند که به غیر از منابع محیطی، مایکوباکتریومهای غیر توبرکلوزیس در بیوفیلمهای تشکیل شده در انواع محیطها مانند: سیستمهای تهیه آب خانگی و دستگاههای دندانپزشکی نیز یافت میشوند (3).
مطالعاتی در زمینه اثر سطوح فیزیکی مختلف (شامل سطوح سیلیکونی، پلی کربنات، پلی اتیلن با دانسیته بالا و پلی وینیل کلراید) بر روی رشد و تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریومها انجام شده است (3، 6- 8). فالکینهام[6]و همکاران در سال 2001 مایکوباکتریوم مارینوم را از سیستمهای توزیع آب جداسازی کردند. رشد بیوفیلم این ارگانیسم با و بدون قرار گرفتن در معرض عوامل ضد میکروبی اندازهگیری، تعیین و با سایر مایکوباکتریومهای غیر توبرکلوزیس شامل مایکوباکتریوم اولسرانس[7] روی بافت گیاهی مقایسه شد. مطالعاتی نیز بر روی شاخصهای مولکولی و بیوشیمیایی تشکیل بیوفیلم مایکوباکتریوم مارینوم با استفاده از رشد در لولههای سیلیکونی انجام شد (9).
امروزه مایکوباکتریوم مارینوم یک مدل آزمایشگاهی مناسب است که برای پژوهش در زمینه مایکوباکتریومها استفاده میشود. در زمینه اثر ترکیبات مختلف محیط کشت و شرایط آن، بر رشد مایکوباکتریوم مارینوم مطالعه زیادی انجام نشده است. همچنین، به علت ارتباط مایکوباکتریوم مارینوم با منابع آبی و شباهت این ارگانیسم با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، ضرورت مطالعه بر اثر ترکیبات مختلف محیط کشت و عاملهای محیطی بر تغییر الگوی رشد و تشکیل بیوفیلم احساس میشود. در این پژوهش اثر ترکیبات مختلف محیط کشت بر روی رشد و تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998[8] بررسی شد.
.مواد و روشها
کشت زنده مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998[9] از مرکز کلکسیون دانشگاه گوتنبرگ [10] تهیه شد. محیط مورد استفاده در این پژوهش میدلبروک 7H9[11] بود. ترکیبات به ازای 900 میلیلیتر شامل: آمونیوم سولفات (5/0 گرم)، L- گلوتامیک اسید (5/0 گرم)،
سدیم سیترات (1/0 گرم)، پیرودوکسین (1 گرم)، بیوتین (5/0 میلیگرم)، دیسدیم فسفات (5/2 گرم)، مونوپتاسیم فسفات (1 گرم)، فریک آمونیوم سیترات (04/0 گرم)، منیزیم سولفات (05/0 گرم)، کلسیم کلرید (5/0 میلیگرم)، سولفات روی (1 میلیگرم) و سولفات مس (1 میلیگرم) بود. ابتدا کشت خالص از مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در محیط کشت میدلبروک 7H9 دارای آگار تهیه شد. کشت به مدت 7 تا 10 روز در انکوباتور 30 درجه سانتیگراد قرارگرفت.
.محیط کشت میدلبروک 7H9 با درصدهای متفاوت توئین80، گلیسرول و OADC: محیط مایع 7H9 با درصدهای مختلف توئین80 شامل: (1/0، 2/0، 3/0، 4/0، 5/0 و 6/0 درصدحجمی/ حجمی) و بدون توئین80 با درصدهای متفاوت گلیسرول (30، 35، 40، 45 و 50 درصد حجمی/ حجمی) و بدون گلیسرول و با درصدهای مختلف OADC (2، 4، 6 و 8 درصد حجمی/ حجمی) و بدون آن تهیه شد. 200 میکرولیتر از محیطهای تهیه شده، داخل چاهکهای میکروپلیت نانک [12] ریخته شد. سپس، 20 میکرولیتر از پیش کشت شده مایکوباکتریوم مارینوم CCUG20998
(با 6/0-4/0=600OD) به هر کدام از چاهکها تلقیح شد. محیطکشت بدون تلقیح و فاقد هر ترکیب مورد بررسی در محیط کشت، به عنوان کنترل انتخاب شد. میکروپلیت در 30 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز انکوبه شد. جذب در طول موج 630 نانومتر توسط دستگاه خواننده میکروپلیت[13] به مدت یک هفته هر 24 ساعت یک بار اندازه گیری و منحنی رشد با نمونه استاندارد مقایسه شد. برای هر نمونه مورد بررسی، آزمایش با 3 تکرار انجام شد.
.سنجش بیوفیلم به روش رنگآمیزی با کریستال ویوله: سنجش بیوفیلم به روش رنگ آمیزی کریستال ویوله انجام شد. این روش سنجش براساس ترکیب رنگ کریستال ویوله با سلولهای چسبیده به سطوح است. ابتدا محیط کشت داخل میکروپلیت بیرون ریخته و چاهکها سه مرتبه به آرامی با محلول نمکی بافر فسفات شسته شدند. پس از آن میکروپلیت به شکل واژگون به مدت 60 دقیقه خشک شد. سپس، کریستال ویوله 1 درصد (حجمی/ حجمی) به میکروپلیت اضافه و چاهکها به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. پس از آن کریستال ویوله بیرون ریخته شد و چاهکها سه بار با محلول نمکی بافر فسفات شسته شدند. کریستال ویوله باقیمانده با اضافه کردن 200 میکرولیتر اتیل الکل/ استون (حجمی/ حجمی) 80:20 خارج شد. مقدار جذب نوری چاهکها در 630 نانومتر (630OD) با دستگاه خواننده میکروپلیت اندازه گیری شد. مقدار میانگین و انحراف استاندارد تعیین شد و میانگین دادههای به دست آمده از 630OD بلانک محیط کشت (200 میکرولیتر) کم شد. سنجش برای هر آزمایش سه بار تکرار شد (3 چاهک) (8 و 10)
.نتایج
نمای میکروسکوپی مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 به روش زیلنلسون و گرم در شکل 1 نشان داده شده است. این ارگانیسم در رنگ آمیزی زیلنلسون، رنگ فوشین و در رنگ آمیزی گرم، رنگ کریستال ویوله را به خود میگیرد. شکل 2 منحنی رشد مایکوباکتریوم مارینوم را در محیط 7H9 نشان میدهد. با توجه به شکل، زمان شروع فاز نمایی رشد از ساعت 48 است و رشد تا 144ساعت ادامه دارد و میتوان اثرات ترکیبات محیط کشت در رشد و تشکیل بیو فیلم را در این محدوده زمانی بررسی کرد. شکل 3 بررسی اثر غلظتهای مختلف توئین 80 و عدم حضور آن را بر روی رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 نشان میدهد. همانطور که در شکل دیده میشود رشد در غلظتهای بالاتر این ماده بهتر انجام میشود. شکل 4 اثر غلظتهای متفاوت OADC و عدم حضور آن را بر روی رشد نشان میدهد. با توجه به شکل غلظتهای متفاوت این ماده تأثیر چندانی بر روی رشد نمیگذارد. در شکل 5، بررسی اثر غلظتهای متفاوت گلیسرول و عدم حضور آن در رشد این باکتری مشاهده میشودکه نشان میدهد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در غلظتهای بالاتر گلیسرول رشد بیشتری دارد.
شکل 1- رنگآمیزی مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 (a) به روش زیلنلسون (b) به روش گرم
شکل 2- منحنی رشد استاندارد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در محیط 7H9 براث
شکل 3- رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 درحضور درصدهای متفاوت توئین 80 و محیط بدون توئین 80.
شکل 4- رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در حضور درصدهای متفاوت OADC و محیط بدون OADC.
تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در میکروپلیت با غلظتهای مختلف ترکیبات محیط کشت با روش رنگآمیزی کریستال ویوله مطالعه شد. نتایج در شکلهای 6، 7 و 8 نشان داده شده است. مقدارهای OD نشان دهنده باکتریهای چسبیده به سطح و تشکیل بیوفیلم است. بیشترین میزان بیوفیلم در عدم حضور توئین 80 و OADC و غلظت 35 درصد گلیسرول تشکیل شد.
شکل 5- رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در حضور درصدهای متفاوت گلیسرول و عدم حضور گلیسرول
شکل 6- اثر درصدهای مختلف توئین 80 و محیط بدون توئین 80 بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998.
شکل 7- اثر درصدهای مختلف OADC و عدم حضور OADC بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998.
شکل 8- اثر درصدهای مختلف گلیسرول و محیط بدون گلیسرول بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998
.بحث و نتیجه گیری
مایکوباکتریومها، اکتینومیستهای مقاوم به اسید بوده که در انسان، حیوانات و محیطهای مختلف مانند خاک و آب یافت میشوند. در محیطهای پر استرس حضور داشته و در برابر شرایط سخت توسط عاملهای مختلف پاسخ میدهند. برای مثال برخی باکتریها مانند باسیلوس سوبتیلیس[xiv] در پاسخ به استرسهای محیطی اسپور تولید میکنند و بسیاری از گونههای میکروبی میتوانند برای زنده ماندن در محیطهای پر استرس از تجمعات سازماندهی شده و متصل به ماتریکس مانند بیوفیلم استفاده کنند. مایکوباکتریومها با اینکه توانایی تولید پلیساکاریدهای خارجی را ندارند، بیوفیلمهای درخور توجهی را تولید میکنند که هم به سطوح جامد و آبگریز متصل میشوند و هم به شکل پلاک به شکل شناور بر روی محیط کشت مایع ایجاد میشوند (4).
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل مولد سل انسانی، توانایی زیادی برای زنده ماندن در برابر استرسهای محیطی مانند آنتیبیوتیکها دارد. این ارگانیسم قادر است بیوفیلمهای مقاوم به دارو تولید کند. در این بررسی مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 به عنوان یک مدل بیماریزا برای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده شد. هدف ساخت داروهای جدید، ممانعت ازتشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریومهاست که این روش در درمان مؤثر است و به این ترتیب میتوان از آنتیبیوتیکها در یک دوره درمانی کوتاهتر استفاده کرد (11).
مایکوباکتریوم مارینوم بعد از 7 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد روی محیط کشت میدلبروک 7H9 دارای آگار به شکل پلاکهای کپک مانند به رنگ زرد رشد میکند. در شکل 1 نمای میکروسکوپی مایکوباکتریوم مارینوم نشان داده شد. همانطور که در تصویر مشخص است سلولهای مایکوباکتریوم مارینوم به هم چسبیدهاند و تمایل به تشکیل توده دارند.
در سال 1947 دوبوس[xv] و میدلبروک[xvi] محیط 7H9 را طراحی کردند که حاوی آلبومین و اولئیک اسید است و موجب افزایش رشد باسیلهای سل و حفاظت آنها در برابر بسیاری از عوامل سمی میشود. محیط میدلبروک 7H9 حاوی سدیم سیترات و فریک آمونیوم سیترات به عنوان منابع کربنی است. از آنجا که مایکوباکتریومها نیازهای رشد ویژهای دارند به این محیط ترکیباتی برای بهتر شدن رشد اضافه میشود. غنی کردن محیط توسط ترکیباتی مانند گلیسرول و توئین 80، به عنوان منبع کربن، موجب تسریع در رشد میشود. گلیسرول یک قند الکلی است که به عنوان منبع کربن به این محیط اضافه میشود. با توجه به شکل 5 اگر محیط بدون گلیسرول باشد، رشد بیش از 50 درصد کاهش مییابد؛ اما تفاوت زیادی بین درصدهای 40 و 50 در میزان رشد توسط این باکتری دیده نمی شود. از آنجا که هدف در این بررسی مقرون به صرفهتر کردن محیط از نظر اقتصادی بود مطالعه بر روی درصدهای کم گلیسرول انجام شد.
با توجه به شکل 3 توئین 80 موجب افزایش رشد میشود. توئین 80 ماده کربنی سخت تجزیهپذیر است و به عنوان یک پاک کننده پایین آورنده کشش سطحی است. همچنین، یکی از عوامل مهم بازدارنده تشکیل تودههای سلولی است. در محیط بدون توئین 80 رشد به شکل تشکیل توده باکتری (کلامپ شده) است؛ اما در حضور توئین 80 رشد به شکل همگن و بدون تشکیل توده رخ میدهد. در حقیقت توئین 80 با پایین آوردن کشش سطحی باکتریها موجب میشود که کمتر تمایل به تشکیل توده داشته باشند و در نتیجه راحتتر تقسیم شده و در نهایت، سبب افزایش رشد میشود. همان طور که در شکل 3 نیز مشاهده میشود، دانسیته جذب نوری نمونهها نشان دهنده رشد سریعتر نمونههای حاوی توئین 80 است.
در محیط کشت بدون توئین 80 و گلیسرول، مشاهده شد که رشد به میزان قابل ملاحظهای کاهش مییابد. در واقع منابع کربنی محیط میدلبروک 7H9 سدیم سیترات و فریک آمونیوم سیترات است که تأثیر چندانی بر روی رشد نمیگذارند و برای تسریع رشد نیاز به منابع خارجی کربن است.
محیط میدلبروک 7H9 هنگامی که با مواد غذایی مانند اولئیک اسید، آلبومین و دکستروز[xvii] غنی میشود، از رشد گونههای مایکوباکتریوم به استثنای مایکوباکتریوم بوویس[xviii] حمایت میکند. آلبومین و دکستروز به همراه سدیم کلرید و کاتالاز توسط میدلبروک OADC غنی شده فراهم میشوند. آلبومین با اتصال به اسیدهای چرب که ممکن است برای گونههای مایکوباکتریوم سمی باشند به عنوان یک حفاظت کننده عمل میکند. در محیط غنی شده، آلبومین را برای حذف لیپاز با گرما حرارت میدهند که ممکن است از توئین 80 اسیدهای چرب آزاد کند؛ کاتالاز پراکسیدهای سمی که ممکن است در محیط حضور داشته باشند را تجزیه میکند و موجب حفاظت از ارگانیسم میشود. دکستروز و اولئیک اسید به عنوان منابع کربنی هستند. در شکل 4 اثر OADC بر روی رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 نشان داده شد. همان طور که مشاهده میشود این ترکیب اثر چندانی بر روی رشد نمیگذارد و میتوان از غلظتهای کمتر (2 میلیلیتر) استفاده کرد.
برای تشکیل بیوفیلم ابتدا باکتریهای پلانکتونی به سطح متصل شده؛ بیوفیلم به شکل میکروکلونی و بعد به شکل ماکروکلونی تشکیل میشود. این سازماندهی سلولهای باکتریایی، ارتباطشان قابل تنظیم است. داخل بیوفیلم مواد غذایی بهینه و رقابت برای کسب این مواد کاهش مییابد. این سازماندهی میتواند به حفاظت از باکتریها در برابر شکار شدن و آسیب توسط مواد موجود در محیط مانند ضد عفونی کنندههای شیمیایی و آنتیبیوتیکها نیز کمک کند. مطالعات مولکولی و سلولی بر روی تشکیل بیوفیلم در چندین گونه مایکوباکتریوم انجام شده است (3 و 12).
کارتر[xix]و همکارانش در سال 2003 اثر سطوح پلیوینیلکلراید[xx]، یونها (منیزیم، کلسیم، آهن و روی)، منابع کربنی (آب، گلوکز، پپتون و هیومیک اسید)، سوپرناتانت کشت و حشرهکشها را بر روی تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم آویوم[xxi] ارزیابی و از روش رنگآمیزی با کریستال ویوله و میکروسکوپ کانونی برای سنجش و مشاهده بیوفیلم استفاده کردند. نتایج نشان داد در حضور کلسیم، منیزیم یا روی، بیوفیلم بیشتری در مقایسه با رشد در آب به تنهایی تشکیل میشود. تولید بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم آویوم در آب همراه با گلوکز و پپتون نسبت به هیومیک اسید بیشتر است (13).
در این پژوهش، اثر ترکیبات مختلف محیط کشت بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 مطالعه شد. بر اساس نتایج، مشخص شد که اثر ترکیبات محیط کشت بر تشکیل بیوفیلم با تأثیر این ترکیبات بر رشد این ارگانیسم تفاوت دارد. شکل 6 اثر توئین 80 را بر تشکیل بیوفیلم نشان میدهد. مایکوباکتریوم مارینوم در محیط فاقد توئین 80 بیوفیلم بیشتری تولید میکند. بدین معنا که در فقدان این ماده که به کاهش کشش سطحی منجر میشود، سلولها به هم میچسبند و تمایل به تشکیل بیوفیلم دارند. هنگامی که میزان توئین 80 در محیط کشت بیشتر میشود، بیوفیلم به میزان کمتری تولید میشود.
همانطور که در شکل 7 مشاهده میشود فقدان OADC در محیط کشت موجب افزایش تشکیل بیوفیلم میشود. این ترکیب حاوی اسیدهای چرب غیر اشباع است که مانع تشکیل بیوفیلم میشود. کمترین میزان تشکیل بیوفیلم در غلظت 2 درصد OADC مشاهده میشود که متفاوت با الگوی رشد آن در این میزان است. گلیسرول یک منبع کربنی است که افزایش آن موجب افزایش رشد میشود (شکل 5). در فقدان گلیسرول بیوفیلم کم و با افزایش غلظت آن بیوفیلم به میزان بیشتری تشکیل میشود. البته با توجه به شکل 8، در غلظتهای بالاتر میزان تشکیل بیوفیلم کاهش مییابد که متفاوت با الگوی رشد ارگانیسم است.
بر اساس نتایج به دست آمده توئین 80 و گلیسرول در ترکیبات محیط میدلبروک 7H9 بر رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 بهترین اثر را دارند؛ اما در مقایسه اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز اثر مهمی بر روی رشد نمیگذارد و از آنجا که این ترکیب گران است، میتوان آن را از ترکیبات محیط کشت حذف کرد. در زمینه تشکیل بیوفیلم نتایج نشان دادند که بیشترین میزان رشد در غلظت 4/0 درصد توئین 80 رخ میدهد. تغییر غلظت اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز تأثیر چندانی بر روی رشد این باکتری ندارد. کاهش گلیسرول به میزان در خور توجهی موجب کاهش رشد میشود. بیشترین میزان تشکیل بیوفیلم هنگامی است که در محیط کشت توئین 80 و اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز وجود نداشته باشد و غلظت گلیسرول 35 درصد باشد.
.تشکر و قدردانی
از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان برای در اختیار قرار دادن تجهیزات آزمایشگاهی برای انجام این پژوهش تشکر و قدردانی میشود.
[1]- Mycobacterium marinum
[2]- Non tuberculosis Mycobacteria (NTM)
[3]- Mycobacterium tuberculosis
[4]- Mycobacterium leprae
[5]- Schulze- Robbecke
[6]- Falkinham
[7]- M. ulcerans
[8]- M. marinumCCUG 20988
[9]- Mycobacterium marinum CCUG 20988
[10]- Culture Collection, University of Goteborg, Sweden
[11]- Middlebrook 7H9 Medium
[12]- nuncTM
[13]- Microplate reader- DANA:
مدل 3200 سیستم میکروپروسسوری و فتومتریک
[xiv]- Bacillus subtilis
[xv]- Dubos
[xvi]- Middlebrook
[xvii]- OADC
[xviii]- M. bovis
[xix]- Carter
[xx]- PVC
[xxi]- M. avium
)