نویسندگان
1 دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران
3 استادیار ژنتیک مولکولی، دانشگاه تحصیلات تکمیلیصنعتی و فناوری پیشرفته کرمان، ایران
4 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه تحصیلات تکمیلیصنعتی و فناوری پیشرفته کرمان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Themetal oxide nanoparticles of ZnO are widely used in industrial, cosmetic and medical applications. Many studies have focused on the antimicrobial activity of nanoparticles, but limited information on the resistance of bacteria to them is available.
Materials and methods: TheZnO nanoparticles resistant Pseudomonas strains were isolated from the collected soils from different areas such as Sarcheshmeh Copper mine in Kerman province of Iran. The selected strain was identified by 16 s rRNA gene sequencing analysis. The effect of ZnO NPs on the bacterial growth kinetic was studied. Release of soluble Zinc ions from ZnO NPs were measured by an atomic absorption spectroscopy. The partial sequence of Zinc resistance gene czcC was amplified and identified by phylogenetic analysis of its protein sequences.
Results: Phylogenetic analysis based on the 16 s rRNA gene sequence showed that the selected strain was Pseudomonas sp. ZnO-2. The growth pattern of selected strain with all studied ZnO NPs concentration was similar to that of control, indicating that ZnO NPs would not affect the growth of isolated strain. During dispersion a substantial amount of zinc ions was quickly released from ZnO NPs. PCR amplification of czcC gene and electrophoresis showed that Pseudomonas sp. ZnO-2 carried this gene.
Discussion and conclusion: Through the evolutionary process, microorganisms have improved their heavy metal resistance mechanisms to adapt to adverse environment. The existence of the czcC gene was confirmed by PCR and it showed high homology with Zinc resistance genes from other bacteria.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
نانو ذرات اکسید فلزی در مقیاس وسیع برای کاربردهای صنعتی و مصارف خانگی تولید میشوند. تولید و استفاده زیاد از این نانو ذرات، خطر آلودگیهای محیطی را افزایش داده و آلودگی خاک، باکتریهای محیطی را تحت تاثیر قرار خواهد داد(1). نانو ذرات اکسید روی (ZnO) در صنایع الکترونیک، نساجی، لوازم آرایشی، اسپریها، پلاستیک، رنگها، فیلمهای محافظ
اشعه ماورا بنفش، حسگرهای شیمیایی و بسته بندی مواد غذایی استفاده میشوند(1، 2 و 3). این نانو ذرات فعالیت ضد میکروبی قوی بر علیه باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی بهویژه عوامل بیماریزای غذایی مهم مثل اشریشیاکولای O157:H7[1]، لیستریا منوسیتوژنز[2]، سالمونلا[3] و استافیلوکوکوس اورئوس[4] دارد (4 و 5). بررسیها نشان داده که ذرات نانو نسبت به یونهای فلزی سمیت سلولی بالاتری دارند، زیرا امکان نفوذ آنها به درون غشای سلولی و رهاسازی یونهای فلزی در درون سلول بیشتر است (6).
سودوموناس جنسی از گاما پروتئوباکترهاست. باکتری گرم منفی، میله ای، هوازی، بدون اسپور، متحرک با تاژک قطبی، اکسیداز و کاتالاز مثبت است (7 و 8). این جنس شامل گونههایی با عملکردهای اکولوژیکی، اقتصادی و پزشکی است که برخی اعضای آن قادرند مواد شیمیایی آلوده کننده را در محیط متابولیزه کنند. در نتیجه میتوانند در تجزیه زیستی[5] استفاده شوند(9). در حالی که فعالیت ضد میکروبی نانو ذرات به فراوانی بررسی شده اما اطلاعات اندکی در مورد مکانیسم مقاومت باکتریها در برابر این ذرات وجود دارد. بر این اساس هدف از این پژوهش، جداسازی و غربالگری جدایههای سودوموناس مقاوم به نانو اکسید روی از خاک و شناسایی ژنهای دخیل در مقاومت است.
مواد و روشها
جمع آوری نمونه
نمونههای خاک (حدود 100 گرم از هر نمونه) از مناطق مختلف از جمله معدن مس سرچشمه، مجتمع مس شهید باهنر و محوطه تصفیه خانه آب و پساب کرمان، از عمق 20 سانتیمتری در فلاسکهای استریل جمع آوری و برای مطالعات بیشتر در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند (10).
تهیه محلول ذخیره[6] نانو اکسید روی[7](ZnO)
نانو ذرات پودری اکسید روی (سیگما، آمریکا) با درجه خلوص بیشتر از 99 درصد، اندازه 35 تا 45 نانو متر، رنگ سفید شیری و تقریباً کروی شکل استفاده شد. این نانو ذرات بهوسیله XRD[8] تحلیل شدند. محلول ذخیره بهوسیله سوسپانسیون نمودن نانوذرات در آب دو بار تقطیر استریل برای تهیه غلظت نهایی 100 میلیگرم بر میلیلیتر فراهم شد. این سوسپانسیون به مدت 30 دقیقه با w 30 اولتراسونیک شده تا این که سوسپانسیون کلوییدی یکنواختی فراهم شد (11 و 12). این محلول در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
غنیسازی و جداسازی سویههای سودوموناس از خاک
یک گرم از هر نمونه خاک در 10 میلیلیتر آب مقطر استریل سوسپانسیون شده، یک دقیقه ورتکس شد. این سوسپانسیون در rpm 2000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده، 1/0 میلیلیتر از سوپرناتانت رقیق شده به پتری دیشهای استریل حاوی محیط PIA[9] دارای غلظت 100 میکروگرم بر میلیلیتر از ZnO اضافه شد. محیطها به مدت 72 ساعت در 30 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. کلونیهای مجزا بر روی محیط انتخابی PIA کشت مجدد داده شده تا کشت خالص و یک دستی از هر کلونی فراهم شود (13).
غربال گری سودوموناسهای مقاوم به ZnO
برای جداسازی جدایههای مقاوم، نمونهها بر روی محیط PIA دارای غلظتهای مختلف ZnO (100 تا 500 میکروگرم بر میلیلیتر) غربال شدند. کشتها 3 تا 5 روز در 30 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند. تمام آزمایشها با سه تکرار انجام شد.
سنجش سرعت رشد باکتری در حضور غلظتهای مختلف ZnO
به منظور بررسی اثر نانو ذرات اکسید روی بر سرعت رشد باکتری، غلظتهای مختلف آن(100 تا400 میکروگرم بر میلیلیتر) استفاده شد. فلاسکهای استریل دارای 50 میلیلیتر محیط کشت آبگوشت LB به مدت 30 دقیقه پس از اضافه نمودن ZnO اولتراسونیک(Tecna 6، ایتالیا) شد. فلاسکها با حدود- 105CFU بر میلیلیتر از کشت تازه باکتری تلقیح شده و در 30 درجه سانتیگراد با دور rpm 200 گرمخانهگذاری شدند. میزان رشد باکتری با اندازهگیری جذب نوری در نانومتر 600 اندازهگیری شد. نمونه کنترل مثبت شامل (فلاسک دارای محیط کشت و نانو ذرات، بدون تلقیح باکتری) و نمونه کنترل منفی شامل (فلاسک دارای محیط کشت و باکتری، بدون نانو ذرات) است(14).
تعیین بیشترین غلظت قابل تحمل MTC[10] نانو اکسید روی
برای تعیین MTC نانو اکسید روی، جدایه مورد نظر بر روی محیط MHA[11] دارای غلظتهای مختلف نانو اکسید (100 تا 900 میکروگرم بر میلیلیتر) کشت داده شده و رشد آن پس از گذشت 48 ساعت در 30 درجه سانتیگراد بررسی شد. MTC بالاترین غلظتی از نانو اکسید است که اجازه رشد پس از 48 ساعت گرمخانهگذاری در 30 درجه سانتیگراد را میدهد (15).
اندازهگیری رهاسازی یونهای روی از ZnO
سوسپانسیون تازه ای از ZnO با غلظتهای 100 و 200 میلیگرم بر لیتر فراهم شده، اسیدیته آن6 و 7 تنظیم شد. این سوسپانسیون به مدت یک ساعت به ملایمت تکان داده شده، سپس 30 دقیقه در g 15000 سانتریفیوژ شد. مایع رویی جمع آوری شده، دوباره به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. غلظت یون روی محلول در مایع رویی ثانویه بهوسیله اسپکتروفتومتری جذب اتمی
(Varian SpectrAA 220، استرالیا) اندازهگیری شد (15). آزمایش با سه تکرار انجام شد.
شناسایی جدایههای باکتریایی
تکثیر ژن 16S rRNA و تحلیل الکتروفورزی
DNA ژنومی باکتری مورد نظر با استفاده از کیت استخراج DNA (سیناژن با شماره کاتالوگ DN8115 C) استخراج شد. دو پرایمر مورد استفاده برای تکثیر ژن
16S rRNA عبارتند از: 8F با توالی
5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´
و 1541 R با توالی:
-3´AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-5´(16)
برنامه PCR با 30 سیکل تکثیر در دستگاه ترموسایکلر به این شکل انجام شد: جداسازی اولیه دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 5 دقیقه،
باز شدن دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 1 دقیقه، اتصال پرایمرها در دمای 56 درجه به مدت 1 دقیقه، طویل شدن رشته هدف در 72 درجه به مدت 2 دقیقه و مرحله طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه. محصول PCR بهوسیله الکتروفورز روی ژل آگاروز یک درصد (مرک، آلمان) جداسازی شده و بهوسیله اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شد. توالی ژن توسط شرکت بیونیر[12] کره جنوبی تعیین شد. این توالی توسط نرم افزارهای مختلف از جمله BioEdit، Finch TV، Gene Runner و سایر... بررسی و تحلیل شد (17). نتایج حاصل از BLAST توالی مورد نظر در سایتهای NCBI[13] و EBI[14] بررسی شده و توسط نرم افزارهای CLC و MEGA5 تحلیل شد (18- 20). درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor joining ترسیم شده، در نهایت، توالی ژن توسط نرم افزار sequin در بانک ژن با شماره دست یابی[15] JX441330 ثبت شد.
تکثیر بخشی از ژن مسئول مقاومت به روی (czcC)
پس از استخراج DNA ژنومی، بخشی از ژن czcC بهوسیله PCR تکثیر شد. پرایمرهای مورد استفاده عبارتند از: پرایمر رفت با توالی
5´-GATGACGTTGTTCGATGG-3´
و پرایمر برگشت با توالی
5´-CGTCGAGGTAGGCAATCA-3´
برنامه PCR با 35 سیکل تکثیر در دستگاه ترموسایکلر به این شکل انجام شد: جداسازی اولیه دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 5 دقیقه،
باز شدن دو رشته در دمای 94 درجه به مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمرها در دمای 56 درجه به مدت 40 ثانیه، طویل شدن رشته هدف در 72 درجه به مدت 45 ثانیه و مرحله طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه به مدت 5 دقیقه. محصول PCR با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد و ولتاژ 80 ولت با استفاده از بافر TBE بررسی شد. محصول PCR تعیین توالی شده و توالی نوکلئوتیدی آن با کمک سرور ExPASy به توالی پروتئین ترجمه شد. این توالی پروتئین به منظور شناسایی نزدیکترین محصولات ژنی czcC بلاست شده و در نهایت، درخت فیلوژنی به روش Neighbor joining با استفاده از مدل دو شاخصی کیمورا [16]رسم شد (21)
نتایج
تعیین ویژگیهای ریختشناسی نانو ذرات اکسید روی
شکل 1 الگوی XRD نانو ذرات اکسید روی را نشان میدهد که با دادههای استانداردی که قبل گزارش شده (22) همخوانی دارد و حالت کریستال بودن آن را تایید میکند.
شکل 1- الگوی XRD نانو ذرات ZnO
جداسازی و غربال گری سویههای مقاوم
در این پژوهش، 5 جدایه مقاوم به نانواکسید روی از خاک جداسازی شد. از میان آنها، 4 جدایه در محیط PIA دارای200 میکروگرم بر میلیلیتر نانو اکسید روی و 2 جدایه در محیط دارای300 میکروگرم بر میلیلیتر نانو اکسید روی رشد کردند. در نهایت، جدایه ZnO-2 (جدا شده از خاک معدن مس سرچشمه) بالاترین مقاومت را نسبت به نانوذرات ZnO نشان داد که برای بررسیهای بیشتر انتخاب شد.
بررسی منحنی رشد باکتری در حضور غلظتهای مختلف ZnO
شکل 2 منحنی رشد جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 در حضور غلظتهای مختلف نانو ذرات ZnO را نشان میدهد. الگوی رشد این باکتری در غلظتهای مختلف ZnO مشابه نمونه کنترل (بدون نانوذرات ZnO) است که نشان میدهد نانو ذرات رشد این باکتری را تحت تاثیر قرار نداده است.
شکل2- منحنی رشدPseudomonas sp. ZnO-2 در حضور غلظتهای مختلف نانو اکسید روی
تعیین MTC نانو ذرات روی
بررسی بالاترین غلظت قابل تحمل نانو ذرات اکسید روی در جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 نشان داد که این جدایه قادر به رشد در غلظتهای بالا تا
600 میکروگرم بر میلیلیتر نانو اکسید است.
رهاسازی یونهای محلول روی از نانو ذرات ZnO
میزان رها شدن یون روی از نانو ذرات ZnO در جدول 1 نشان داده شده است. نتایج نشان میدهد که مقادیر در خور توجهی از یونهای روی سریع در محیط رها میشوند. برای رهاسازی یونهای روی، بر هم کنش معنیداری بین غلظت و اسیدیته وجود دارد.
جدول1- رها سازی یونهای محلول روی از سوسپانسیون 100 و 200 میلیگرم بر لیتر نانو ذرات ZnO
|
اسیدیته 7 |
اسیدیته 6 |
ماده |
||
|
100 میلیگرم بر لیتر |
200 میلیگرم بر لیتر |
100 میلیگرم بر لیتر |
200 میلیگرم بر لیتر |
|
|
یون محلول روی )میلیگرم بر لیتر) |
یون محلول روی )میلیگرم بر لیتر( |
|||
|
003/0± 02/20 |
01/0± 002/32 |
003/0± 18/18 |
003/0± 25/28 |
ZnO |
تحلیل فیلوژنتیکی
وابستگی فیلوژنتیکی جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 بهوسیله تحلیل توالی ژن 16S rRNA مشخص شد. تحلیل فیلوژنی ژن 16S rRNA روشی دقیق و سریع برای شناسایی موقعیت فیلوژنی باکتریهاست.
طول کامل این ژن (حدود 1500 جفت باز) تعیین توالی شده و درخت فیلوژنی رسم شد. شکل 3 ارتباط فیلوژنتیکی این باکتری را با باکتریهای دیگر نشان میدهد.
شکل 3- درخت فیلوژنی رسم شده بر اساس توالی ژن 16S rRNA که وابستگی جدایه Pseudomonas sp. ZnO-2 را با جدایههای دیگر نشان میدهد.
تحلیل فیلوژنتیکی ژن czcC
پرایمرهای استفاده شده برای تکثیر ژن czcC تقریبا یک باند 150 جفت بازی را ایجاد کردند (شکل 4). توالی نوکلئوتیدی به توالی پروتئین ترجمه شده و با توالیهای پروتئین CzcC باکتریهای دیگر مقاوم به روی همتراز[17] شد. درخت فیلوژنی بر اساس توالی پروتئین CzcC رسم شد (شکل 5). مقایسه توالیها، تشابه زیادی با ژن مقاومت به روی در باکتری سودوموناس پوتیدا نشان داد.
شکل 4- الکتروفورز ژل آگاروز محصول PCR ژن czcC
1- نشانگر DNA 2- ژنczcCجدایه Pseudomonas sp. ZnO-2
شکل 5- درخت فیلوژنی رسم شده بر اساس پروتئین CzcC
بحث و نتیجهگیری
آلودگی خاک با فلزات سنگین و ذرات نانو در حال گسترش است که به طور گسترده در نتیجه فعالیتهای بشر مانند معدن کاوی، کشاورزی و صنعت اتفاق میافتد. معدن مس سرچشمه در جنوب غربی استان کرمان طی فعالیت خود در سالهای متمادی باعث آلودگی خاکهای سطحی با فلزات سنگین شده است. این آلودگی میتواند اثرات مهمی بر روی جمعیت میکروبی بومی داشته باشد. برای مثال فلزات سنگین و نانو ذرات میتوانند ترکیب گونهای و تولید مثل میکروبی را محدود کنند. همچنین، ممکن است فعالیتهای میکروبی مثل تثبیت ازت را تحت تأثیر قرار دهند (23). پژوهش حاضر، با هدف شناسایی جدایههای سودوموناس بومی که توانایی مقاومت در برابر نانوذرات اکسید روی را داشته باشند، شروع شد. محیطهای آلوده به فلزات سنگین منابع بالقوهای برای جداسازی این باکتریهای مقاوم هستند.
آزاد شدن یون روی از نانو ذرات ZnO
دیمکپاو همکاران[xviii] نشان دادند که رهاسازی یونهای محلول از ZnO وابسته به اسیدیته و جرم است. به گونهای که همچنان که غلظت افزایش پیدا میکند، میزان یون بیشتری آزاد میشود و یونهای کمتری در اسیدیته 7 نسبت به اسیدیته 6 رها میشود که با نتایج این پژوهش همخوانی دارد (1). پژوهشگران زیادی نشان داده اند که رها شدن یونها از نانو ذرات به سمیت آنها کمک میکند (1، 24 و 25). برای مثال چکل و همکاران[xix] گزارش کردند که آزاد شدن یون روی از نانو ذرات ZnO به فعالیت ضد باکتریایی نانو اکسید روی کمک میکند (26). همچنین، دیمکپا و همکاران نقش بیولوژیکی رها شدن یونها از ذرات نانو را نشان دادند به گونهای که سمیت این ذرات هنگام استفاده از کلاتهکنندههای اختصاصی یونها از بین رفت (1). بنابراین، با توجه به این نتایج ممکن است مکانیسم مقاومت به نانو ذرات روی نیز همان مکانیسمهای مقاومت به فلز روی باشد.
تکثیر ژن دخیل در مقاومت
در طی فرآیند تکامل، میکروارگانیسمها مکانیسمهای مقاومت به فلزات خود را برای سازگاری با محیطهای مختلف بهبود میبخشند. باکتریها مکانیسمهای مختلفی برای مقاومت در برابر عوامل ضد میکروبی دارند. محصولات کد شده بهوسیله ژنهای مقاوم نیز میتوانند سمیت فلزات سنگین را کاهش داده و یا حذف کنند (23). برای مثال، آنزیمهای کد شده بهوسیله ژنهای مسوول مقاومت، عوامل ضد میکروبی را قبل از این که اثر گذار باشند، تخریب میکنند. همچنین، باکتریها امکان دارد پمپهای انتشار به خارج[xx]را کسب نمایند که عوامل ضد میکروبی را قبل از این که به محل هدف برسند، دفع کنند (27). در این پژوهش، مقایسه توالی بخشی از پروتئین CzcC تشابه زیادی با باکتریهای دیگر نشان داد. تحلیل درخت فیلوژنی CzcC نشان داد که Pseudomonas sp. ZnO-2 شاخه فیلوژنتیکی با Pseudomonas putida DOT- T1E تشکیل میدهد. بهترین مکانیسم مقاومت به روی سیستم czc است که مقاومت به کادمیوم، روی و کبالت را باعث میشود. این سیستم به عنوان آنتیپورتر کاتیون/ پروتون پمپ کننده کاتیونها به خارج سلول عمل میکند. CzcC یک پروتئین غشای خارجی است. CzcB و CzcA در فضای پری پلاسمی گسترده هستند و از رها شدن کاتیونهای آزاد جلوگیری میکنند. CzcD در غشای سیتوپلاسمی قرار دارد (28). با توجه به نتایج این پژوهش میتوان نتیجه گرفت که خاکهای آلوده به فلزات سنگین منابع بالقوهای برای جداسازی جدایههای مقاوم به ذرات نانو هستند. از طرفی چون نانوذرات اکسید فلزی مقدار در خور توجهی یونهای فلزی محلول را در محیط آزاد مینمایند که به سمیت آنها کمک میکند، میتوان بیان کرد که ممکن است یکی از مکانیسمهای مقاومت میکروارگانیسمها در برابر ذرات نانو نیز همان مکانیسمهای مقاومت در برابر فلزات باشد.
تشکر و قدردانی
از تمام افرادی که ما را در انجام این پژوهش یاری کردند، بهویژه مسوولین محترم آزمایشگاه بیوتکنولوژی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی دانشگاه تحصیلات تکمیلیصنعتی و فناوری پیشرفته کرمان تشکر و قدردانی میشود.
[1]- Escherichiacoli O157:H7
[2]- Listeria monocytogenes
[3]- Salmonella
[4]- Staphylococcus aureus
[5]- Bioremediation
[6]- Stock solution
[7]- Zinc Oxide Nanoparticles
[8]- X-ray diffraction analysis
(PANalytical XPert Pro Eindhoven, Netherlands)
[9]- Pseudomonas Isolation Agar
[10]- Maximum Tolerable Concentration
[11]- Muller Hinton Agar
[12]- Bioneer
[13]- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
[14]- http://www.ebi.ac.uk
[15]- Accession number
[16]- Kimura’s two-parameter model
[17]- align
[xviii]- Dimkpa et al
[xix]- Scheckel et al
[xx]- Efflux pumps
)