نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Excessive use of tellurite nowadays, has suffered the environment from the toxic effects of the oxyanion. Hence, biological treatment of polluted areas is considered as an environmentally friendly and inexpensive method. Although the toxic effects of tellurite for most microorganisms have been reported, but several species of the bacteria including the halophilic bacteria used in this project can overcome the toxicity of the oxyanion by its reduction to the elemental form. The aim of this study was to identify the mechanism (s) involved in tellurite detoxification.
Materials and methods: In order to enhance and maintain enzymatic activity during purification, the test conditions and enzyme production by the strain were optimized. The optimization was done by One Factor at A Time (OFAT) method. Several factors, including: time, various percentages of inoculum, range of pH, concentration of tellurite and various salts effects were optimized. For assurance tellurite removal was examined during the experiment. The enzyme was purified by various methods, including ammonium sulphate precipitation and hydrophobic interaction column chromatography in which the Concentration of 1.4 M saturated ammonium sulphate was applied. The purity of the enzyme was assessed by SDS-PAGE during each phase.
Results: The optimum conditions obtained showed that at 30 hours, 3% inoculum, pH 7.5, without tellurite and with 5% NaCl the highest enzyme activity and tellurite removal are observed. Purification of the enzyme greatly reduced the concentration of unrelated proteins and caused a concentrated band which could be one subunit of the enzyme targeted. The partially purified enzyme’s fraction was shown to have nitrate and selenite reductase activity other than tellurite reductase activity.
Discussion and conclusion: This study is an approach to the identification of the halophilic microorganisms Physiology and enzymes involved in restoring tellurite. The production of the enzyme responsible for this phenomenon has been optimized and partially purified.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
در دهههای اخیر کاربردهای زیاد تلوریت در کارخانههای باطریسازی، الکترونیک، فیبرنوری و معادن افزایش یافته و به آلودگیهای زیاد زیستمحیطی تلوریت منجر شده است. تلوریوم و سلنیوم نسبت به آنالوگ خود، سولفور، ترکیبات مشابهی ایجاد میکنند ولی خواص و واکنشهای متفاوتی را از خود بروز میدهند و به طور در خور توجهی سمیت بیشتری دارند (1). عاملهای مقاومت به تلوریت زیادی در کروموزوم یا پلاسمید برخی گونههای باکتریایی مشاهده شده است (2 و 3). در کل این عاملها، عامل مقاومت به تلوریت با مکانیسمی ناشناخته هستند.
میکروارگانیسمها راهکارهای مختلفی برای سمیتزدایی فلزات و شبهفلزات دارند ولی همگی آنها در دو فرآیند کلی جای میگیرند:
فرآیند تجمع زیستی غیرفعال است زیرا این فرآیند به تمایل به اتصال بستگی دارد. این در حالی است که فعالیتهای متابولیکی فعال و وابسته به انرژی سلول است (4).
تاکنون در زمینه شناسایی عوامل مؤثر در احیای تلوریت کوششهای اندکی انجام شده است که میتوان از فعالیت تلوریت ردوکتازی نیترات ردوکتازها (5)، مشارکت گلوتاتیون احیا در تشکیل Se0 و Te0(6)، سطوح بالای فعالیت تلوریت وابسته به FADH2 در بخش غشایی (7)، سیتوکرومهای c در غشای خارجی (8) و گزارشی از خالصسازی پروتئینی با فعالیت تلوریت ردوکتازی نام برد (9).
نمک دوستها، میکروارگانیسمهای نیازمند به نمک هستند که در محیطهای با نمک بالا زندگی میکنند. آنها به طور کلی شامل میکروارگانیسمهای پروکاریوتی و یوکاریوتی با توانایی متعادلسازی فشاراسمزی با محیط بیرون و مقاومت در برابر اثرات واسرشتکننده نمکها مانند تجمع با هم پروتئینها هستند. این گروه میکروارگانیسمها، از تنوع بالایی برخوردارند. بسته به غلظت نمک مورد نیاز برای رشد، آنها را به
تحملکننده نمک (صفر تا 5 درصد سدیم کلرید)، نمک دوست ضعیف (2 تا 5 درصدسدیم کلرید)، نمک دوست نسبی (5 تا 20درصدسدیم کلرید)، و نمک دوست افراطی (20 تا 30درصدسدیم کلرید)، تقسیمبندی میکنند. میکروارگانیسمهای نمکدوست نسبی از نظر فیزیولوژی متنوع و دارای جنسهای مختلفی هستند (10).
در مقایسه با دیگر گروههای اکستریموفیل (ترموفیلها و آلکالوفیلها) که به طور گسترده در صنعت استفاده میشوند، کاربردهای بیوتکنولوژیک زیاد میکروارگانیسمهای نمک دوست نسبی و افراطی، معمولاً نادیده گرفته شده است. این نادیده گرفته شدن به ویژه وقتی تنوع گسترده نمک دوستها را در نظر بگیریم، بیشتر مشهود است. این دسته از موجودات در هر سه قلمرو آرکیا، باکتریها و یوکاریوتها یافت میشوند. آنها شامل اعضایی با فیزیولوژی متنوعاند که آنها را قادر میسازد با گستره وسیعی از غلظتهای نمک تا حد اشباع، سازش پیدا کنند. از دیگر مزایای احیا توسط میکروارگانیسمها این است که احیای اکسیآنیونهای بهدست آمده به شکل نانوذره بوده و اهمیت این نانوذرات رو به افزایش است. ترکیبات در مقیاس نانو تلوریوم (Te0) مثل CdTe پتانسیل بالایی در استفاده به عنوان مواد اولیه سلولهای خورشیدی دارند و امروزه مطالعه و بررسیهای زیادی روی آنها انجام میشود (11).
از آنجا که بعضی ارگانیسمهای نمک دوست در درون سلول نیز با استرس اسمزی مقابله میکنند، مقایسه آنزیمهای مشابه در ارگانیسمهای غیرنمک دوست و نمک دوست، اهمیت زیادی دارد. به هر حال عامل این تفاوت هر چه که هست به طور آشکارا اهمیت بنیادی در درک نوع زندگی نمک دوستها دارد. پروتئینهای نمک دوست برای فعال، پایدار و محلول بودن در نمک بالا با چالشهای بسیاری روبهرو هستند. غلظتهای در حد مولار نمک معمولاً برای پروتئینها و دیگر ماکرومولکولها مخرب است. این امر باعث تخریب ساختار سوم و تجمع آنها به خاطر افزایش میانکنشهای هیدروفوب میشود و با میانکنشهای الکتروستاتیک تداخل ایجاد میکند. اگرچه برخی اوقات این سازگاریها باعث میشود تا ماکرومولکولها به طور مطلق برای حفظ یکپارچگی ساختار خود وابسته به نمک بالا باشند (12).
از آنجا که سمزدایی شیمیایی مناطق آلوده به فلزات سمی، گران است و محیط را متحمل اثرات جانبی ناشی از مصرف این مواد میکند، تیمار زیستی این مناطق به عنوان روشی سازگار با محیط زیست و کاهشدهنده هزینهها، مطرح است. نیاز ذاتی میکروارگانیسمهای نمک دوست به نمک و از سوی دیگر همراهی اکسیآنیونها با کاتیونهایی که نیاز میکروارگانیسم نمکدوست را مرتفع میکند، این میکروارگانیسمها را نسبت به همتایان غیرنمک دوست خود در زمینه تحمل و حذف تلوریت تواناتر میسازد. پتانسیل بالای میکروارگانیسمهای نمک دوست در تحمل غلظتهای بالای فلزات سمی چون سلنیوم و تلوریوم و توانایی تیمار زیستی این عناصر در محیطهای نمکی و پسابهای پرنمک، این میکروارگانیسمها را به عنوان کاندیدی مناسب بدین منظور مطرح میکند (13).
Salinicoccus iranensis QW6یک باکتری کوکوس گرم مثبت، غیراسپورزا، فاقد حرکت و هوازی با توانایی تولید اکسیداز و کاتالاز است. کلونیهای آن گرد و صاف بوده و پیگمان قرمز- نارنجی تولید میکند. شرایط بهینه رشد برای این میکروارگانیسم بدین شکل بهدست آمده است (14 و 17):
محدوده نمک (NaCl): 1 تا 25 درصد / بهینه: 5/7 تا10 درصد
محدوده اسیدیته: 6/5 تا 10 / بهینه: 5/7
محدوده دما: 5 تا 45 / بهینه: 34 درجه سانتیگراد
MIC برای تلوریت: 12 میلیمولار
احیای نیترات: مثبت
با توجه به اطلاعات به دست آمده تا کنون هیچ گزارشی از بررسی مکانیسمهای دخیل در احیای تلوریت توسط باکتریهای نمک دوست انجام نشده است. هدف از این پژوهش، بررسی مسیر یا مسیرهایی است که میکروارگانیسم در راستای مقابله با این اکسیآنیون سمی اتخاذ میکند. آنزیم به طور نسبی خالص شده در این تحقیق قادر به احیای تلوریت، سلنیت و نیترات بود.
مواد و روشها
مواد شیمیایی
پتاسیم تلوریت، سدیم سلنیت 5آبه، سدیم کلراید، پتاسیم کلراید، منیزیوم کلراید، آمونیوم سولفات، تریپتون، عصاره مخمر و بتا-مرکاپتواتانول از شرکت مرک (درمشتات، آلمان) [2]; سفادکسG-100، لیزوزیم، Tris–HCl، PMSF (فنیلمتیلسولفونیلفلوراید[3])، NADH 4 آبه، کوماسی برلیانت بلو، دکستران بلو و دیاتیل دیتیوکربامات[4] از شرکت سیگما (سنت لوییس، آمریکا) [5]; فنیل سفارز و Q- سفارز از شرکت بیوتکنولوژی فارمیشیا[6] و سدیم کلراید از شرکت ایرانی دکتر مجللی[7] تهیه شد.
کشت و رشد میکروارگانیسم
سویه Salinicoccus iranensis QW6 پیشتر توسط آموزگار و همکاران[8] از قم جداسازی و شناسایی شده بود (14). این باکتری کوکوس گرم مثبت، هوازی و فاقد تحرک بوده و قابلیت احیای تلوریت و سلنیت را داراست. این باکتری از مرکز ملی ذخایر ژنتیک ایران[9] با شمارهی سویه IBRC-10198 دریافت و با دو روش کشت در محیط شیبدار، با گلیسرول و نیز به شکل لیوفیلیزه نگهداری شد.
برای کشت باکتری Salinicoccus از محیط لوریا برتانی (LB) با غلظت سدیم کلراید 5درصدواسیدیته 5/7 به عنوان محیط پایه استفاده شد. محیطهای مایع در انکوباتور شیکردار با دور rpm 150 و در دمای 34 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. محیطهای کشت پایه پس از تهیه، با حجم 20 میلی لیتر در در فلاسکهای ارلن مایر 100 توزیع و اتوکلاو شدند. محلول های اکسیآنیونها به شکل جداگانه با فیلتر استریل و به محیط پایه پیش از تلقیح افزوده شدند. در این روش میزان جذب نوری سوسپانسیون باکتری در طول موج 620 نانومتر در برابر محیط کشت تلقیح نشده به عنوان شاهد در دستگاه UV-vis اسپکتروفوتومتر[10] خوانده شد. در مواردی که وجود عامل تداخلکننده مانع این نوع سنجش میشد، از غلظت پروتئین به منظور بررسی میزان بیوماس استفاده شد.
بررسی میزان رشد باکتری
برای این منظور از تک کلونی خالص باکتری که روی محیط کشت جامد LB حاوی 5 درصد نمک طعام رشد کرده بود (کشت 48 ساعته)، سوسپانسیون میکروبی معادل کدورت 5/0 مک فارلند تهیه شد و به میزان یک درصد حجم محیط پایه به آن تلقیح و گرماگذاری شد. منحنی رشد مربوط به میکروارگانیسم ترسیم شد تا زمان مناسب (فاز سکون) برای تلقیح از این محیط به محیط پیشکشت تعیین شود. سپس، از باکتریهایی که به فاز سکون رسیدهاند به منظور تلقیح به محیط پیشکشت به میزان 5 درصد حجمی استفاده شد. پس از رسیدن به دانسیته نوری برابر با 5/1[11] از این محیط به عنوان پیشکشت برای تلقیح به محیطهای اصلی استفاده شد. با رسم منحنی رشد، از آن برای تعیین ساعت مناسب برای تلقیح محیط پیشکشت به محیط پایه تولید، در هنگام بررسی اثر عاملهای مختلف روی رشد سویه، فعالیت آنزیم و حذف تلوریت استفاده شد (13). تمام آزمایشها در سه بار تکرار به طور همزمان انجام شدند.
سنجش مقدار پروتئین و تلوریت
برای سنجش مقدار پروتئین از روش برادفورد و با استفاده از آلبومین سرم گاوی[12] به عنوان استاندارد، استفاده شد (14). برای بررسی میزان حذف اکسیآنیون تلوریت از معرف دیاتیلدیتیوکربامات استفاده شد. روشکار بدین طریق بود که 300 میکرولیتر از بافر 500 میلیمولار Tris-HCl, pH 7 و 100 میکرولیتر از معرف دیاتیل دیتیوکربامات (10 میلیمولار) و 100 میکرولیتر از نمونه مورد سنجش با یکدیگر مخلوط شده و جذب آن در طول موج340 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر سنجیده شد. شاهد شامل: 300 میکرولیتر بافر، 100 میکرولیتر معرف، 100 میکرولیتر ازمحیط کشت بدون تلوریت بود (15).
رسم منحنی رشد و بررسی میزان حذف تلوریت Salinicoccus iranensis در حضور غلظتهای مختلف تلوریت
از محیط پیشکشت تهیه شده به منظور تلقیح به محیطهای حاوی اکسیآنیون با غلظتهای مختلف تلوریت استفاده شد. میزان رشد میکروارگانیسم با سنجش غلظت پروتئین بررسی شد. علت استفاده از این روش پراکنش نور توسط اسپکنروفوتومتر برای تولید ذرات تلوریوم طی رشد میکروارگانیسم بود. بدین منظور در طول مراحل رشد باکتری به میزان 5/0 میلیلیتر از محیط کشت در شرایط استریل برداشت شده و در دور g×11000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجهی سانتیگراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی به منظور بررسی میزان حذف تلوریت، بررسی شد. رسوب باکتریایی یکبار با آب نمک درصد 5 شستشو داده شده و سپس، 500 میکرولیتر از سود 1/0 نرمال به آن اضافه شده، 1 ساعت در دمای 96 درجه قرار گرفت. بار دیگر نمونهها با دور g× 13000 اسپین شده و غلظت پروتئین در مایع رویی با استفاده از روش برادفورد[13] سنجیده شد (16 و 17).
آمادهسازی عصارهی سلولی
برای این منظور ابتدا کشتهای میکربی طبق شرایط بهینه کشت داده شده و سپس، برای حذف سلولها و دیگر مواد جامد محیط، در دور g× 4000 در دمای
4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شدند. رسوب حاصل 2بار با آب نمک 5 درصد شستشو داده شده و در بافر لیز (Tris-HCl 50 میلی مولار،, 1mM PMSF) به حالت سوسپانسیون درآمدند. عمل سونیکاسیون در 10 مرحله 30 ثانیهای با 1 دقیقه فاصله بین مراحل انجام شد. باکتری سونیکت شده با دور
g× 14000 در دمای 4 درجهی سانتیگراد به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. خروجی 5/0 و شدت 60 درصد برای دستگاه سونیکاتور تنظیم شد. محلول رویی به عنوان عصاره سلول با دور g× 13500 و به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ و از بقایای سلولی و سلولهای شکسته نشده جدا شد (18).
سنجش فعالیت آنزیمی
فعالیت آنزیمی به روش سینیتیکی و از طریق بررسی کاهش میزان جذب NADH در طول موج 340 نانومتر تعیین شد. بدین منظور دستگاه اسپکتروفتومتر در حالت[14]Rate (Kinetic)، 340 نانومتر و زمان 1 دقیقه تنظیم شد. برای تعیین فعالیت تلوریت ردوکتازی، 470 میکرولیتر بافر 50 میلیمولار (Tris-HCl, pH 8) حاوی تلوریت سدیم و سلنیت سدیم هریک 6 میلیمولار، 25 میکرولیتر نمونه حاوی آنزیم و 5 میکرولیتر NADH (10 میلیمولار) در کووت ریخته شد. تمامی مواد در بافر 50 میلیمولار (Tris-HCl, pH 8) حل شد. تعیین فعالیت در دمای محیط انجام شد. به محض افزودن NADH به محتویات سل، تغییرات جذب بررسی شد (19).
بهبود روشهای کشت و شرایط رشد برای حذف بیشتر تلوریت و تولید بیشتر آنزیم
برای بهبود تولید آنزیم، اثر عوامل مختلف روی رشد سویه QW6، تولید آنزیم و میزان حذف، بررسی و گزارش شد. از روش یک عامل در هر زمان[15]به منظور بهینهسازی استفاده شد. به این شکل که در هر مرحله فقط اثر یک عامل بررسی شده و تمام عوامل دیگر به شکل ثابت در نظر گرفته شدند. مقدار بهینه به دست آمده برای هر عامل، به منظور بررسی عامل بعدی اعمال شد. اسیدیته همه محیطهای کشت قبل از سترونسازی تنظیم شد.
اثر زمان
برای بررسی اثر زمان روی رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت، به محیطهای پایه آماده با شرایط بهینه تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور 34 درجه سانتیگراد با دور rpm 150 گرماگذاری شد. در طی 84 ساعت، هر 6 ساعت سه ارلن به شکل جدا، برای بررسی رشد، تولید آنزیم و میزان حذف تحلیل شد. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.
اثر حجم مایهتلقیح
برای بررسی اثر مایهتلقیح رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت با مقادیر 1، 2، 4، 6، 8 و10 درصد به محیطهای پایه آماده با شرایط بهینه، تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتیگراد با دور rpm 150 گرماگذاری شد. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.
اثر غلظتهای مختلف تلوریت
برای بررسی اثر غلظتهای مختلف تلوریت بر رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیشکشت به محیطهای پایه آماده با شرایط بهینه حاوی 1/0، 25/0، 5/0، 75/0 و 1 میلیمولار تلوریت، تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتیگراد با دور
rpm 150 گرماگذاری شد. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.
اثر اسیدیته
برای دستیابی به اسیدیته بهینه برای رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت به میزان مناسب به محیطهای پایه آماده شده با شرایط بهینه و بااسیدیتههای 5/7، 8، 5/8، 9، 5/9 و 10 تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتیگراد با دور rpm 150 گرماگذاری شد. برای تأمین شرایط ثابت اسیدیته در محیط کشت، از بافرهای استاندارد فسفات، تریس و گلایسین با غلظت 50 میلیمولار به شکل مخلوط استفاده شد. به این شکل که بافرها جایگزین آب مقطر در ترکیب محیط کشت پایه شدند. مقدار بهینه به دست آمده در این مرحله، در مراحل بعدی اعمال شد.
از آنجا که میکروارگانیسم مورد آزمون یک نمکدوست بوده و این میکرو ارگانیسمها بیشتر وابستگی به یون سدیمی و در برخی موارد یون کلرایدی از خود نشان میدهند، تأثیر این یونها بر حذف تلوریت و فعالیت آنزیمی بررسی شد.
اثر نمکهای کلرایدی
برای بررسی اثر نمکهای سدیم کلراید، پتاسیم کلراید و منیزیوم کلراید بر روی رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت به میزان مناسب به محیطهای پایه آماده با شرایط بهینه و غلظتهای 1، 5، 10 و 15 درصد از نمک که جایگزین نمک اصلی در محیط کشت شده بود، تلقیح انجام شد و در شیکرانکوباتور در34 درجه سانتیگراد با دور rpm 150 گرماگذاری شد. مقدار بهینه بهدستآمده نمکها در این آزمایش در آزمایشی مجزا با یکدیگر مقایسه شدند.
اثر نمکهای سدیمی
برای بررسی این عوامل بر رشد، تولید آنزیم و میزان حذف، از محیط پیش کشت به میزان مناسب به محیطهای پایه دارای نمکهای سدیم نیترات، دیسدیمسولفات و سدیماستات با غلظتهای 1 تا 25 درصد تلقیح انجام شد و در شیکر انکوباتور در34 درجه سانتیگراد با دور rpm 150 گرماگذاری شد.
خالصسازی نسبی آنزیم
به منظور خالصسازی پروتئین در نخستین مرحله از آمونیوم سولفات برای بخشبندی[16] پروتئینها استفاده شد. به عصاره سلولی تا 60 درصد اشباع آمونیوم سولفات اضافه شد. بدین وسیله بخشی از پروتئینها از رسوب به وسیلهی سانتریفوژ g× 11500 به مدت 10 دقیقه جدا شدند. رسوب حاصل در حداقل مقدار بافر Tris- HCl pH 8 50 میلیمولار، حاوی 4/1 مولار آمونیوم سولفات (بافر A) حل شده و علیه همین بافر به مدت 12 ساعت و با تعویض بافر هر 4 ساعت دیالیز شد. نمونهی دیالیز شده بر روی ستون فنیل سفارزی که از قبل با بافر 50 میلیمولار Tris- HCl pH 8 حاوی 4/1 مولار آمونیوم سولفات به تعادل رسیده و به دستگاه [17]FPLC)AKTA Prime, Amersham) متصل بود، بارگذاری شد. پس از شستشوی ستون، پروتئینهای متصل شده با گرادیان خطی صفر تا 2 مولار آمونیوم سولفات تهیه شده در بافر Tris-HCl, pH 8 50 میلیمولار (بافرB) شسته شدند. در هنگام کروماتوگرافی جریان 1 میلیلیتر در دقیقه برقرار بود. تنها در هنگام تزریق نمونه به 5/0 میلیلیتر در دقیقه کاهش داده میشد. بخشهای 2 میلیلیتری از ستون جمعآوری و آزمون آنزیمی بر روی آنها انجام میشد. به منظور اطمینان نمونههای مربوط به هر پیک جمعآوری و با سیستم اولترافیلتراسیون دارای منافذ 10 کیلو دالتونی (آمیکون[18]، میلیپور[19]) تغلیظ و سپس، فعالیت آنزیمی مربوطه بررسی شد.
الکتروفورز سدیم دو دسیل سولفات- پلیاکریل آمید ژل[20]
الکتروفورز پروتئینها با روش تغییر یافتهی لاملی انجام شد. بدین شکل که از غلظت 5 درصد اکریل آمید برای ژل تودهکننده و از 5/12 درصد اکریل آمید برای ژل جداکننده استفاده شد. نمونهها با جوشانده شدن در (w/v)1 درصد SDS در حضور 2- مرکاپتواتانول آماده شدند (20).
تجزیه و تحلیل دادهها
برای مقایسه بین شرایط بهینه مختلف و نیز تعیین اختلاف معنیدار بین آنها در سطح احتمال
(P value <0.05) از تحلیل واریانس یک طرفه ANOVA[21] و آزمون چند دامنهای دانکن[22] استفاده شد. تمام تحلیلهای آماری با استفاده از نرم افزار SPSS (ویرایش 19) [23] و ترسیم نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel 2010 در محیط ویندوز انجام شد.
نتایج
رسم منحنی رشد و حذف تلوریت
شکل 1 و 2 منحنیهای رشد سویه و حذف اکسیآنیون تلوریت در طی 84 ساعت گرماگذاری را نشان میدهد. میانگین غلظتهای پروتئین و حذف اکسیآنیون بهدست آمده از سه تکرار برای هر بار سنجش نشاندهنده حذف بیشتر و رشد بالاتر میکروارگانیسم در غلظتهای پایینتر تلوریت بود. سریعترین حذف در غلظت 5/0 میلیمولار تلوریت مشاهده شد.
شکل 3 و 4 نشانگر رشد و تولید آنزیم در زمانهای مختلف است. بیشترین تولید در زمان 30 ساعت معادل U/mg 0165/0 دیده شد. نتایج حاصل بیانگر آن است که بین میزان تولید آنزیم در زمانهای 24 تا 33 ساعت تفاوت معنیداری وجود نداشت. تولید آنزیم و حذف تلوریت نیز با میزان بیوماس همخوانی دارد.
شکل1- منحنیهای رشد در حضور غلظتهای مختلف تلوریت. تلقیح در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید (اسیدیته 5/7) انجام شد. نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.
شکل2- منحنیهای حذف تلوریت در حضور غلظتهای مختلف تلوریت. تلقیح در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید (اسیدیته 5/7) انجام شد. نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.
|
a |
|
a |
|
a |
|
b |
|
b |
|
bc |
|
cd |
|
|
|
|
|
e |
|
e |
شکل3- اثر زمان بر فعالیت آنزیمو رشددر محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلیمولار تلوریت (اسیدیته 5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (Pvalue<0.05) هستند.
|
Growth Curve & Tellurite Removal |
|
Optimization |
شکل4- اثر زمان برحذف تلوریت و رشددر محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلیمولار تلوریت (اسیدیته 5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.
میزان رشد و فعالیت آنزیم و حذف تلوریت با مقادیر مایه تلقیح متفاوت درشکلهای 5 و 6 نشانداده شدهاست. بین فعالیت آنزیمی مشاهده شده در محیطهای با درصدهای متفاوت مایه تلقیح تفاوت معنیداری دیده نشد (بین 1 و 10 درصد تفاوت معنیدار بود). فعالیت آنزیمی و حذف تلوریت در این محیطها نیز با میزان بیوماس همخوانی دارد.
|
a |
|
ab |
|
ab |
|
ab |
|
ab |
|
b |
شکل5- اثر حجم مایه تلقیح بر فعالیت آنزیم و رشدسویه QW6 در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلیمولار تلوریت (اسیدیته5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (Pvalue<0.05) هستند.
شکل6- اثر حجم مایه تلقیح بر حذف تلوریت و رشدسویه QW6 در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلیمولار تلوریت (اسیدیته 5/7) نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (Pvalue<0.05) هستند.
|
a
|
|
a |
|
b |
|
c |
|
c |
شکل7- اثر غلظتهای مختلف تلوریت بر رشد و فعالیت آنزیمدر زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلیمولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته 5/7) نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (P value <0.05) هستند.
شکل8- اثر غلظتهای مختلف تلوریت بر حذف تلوریت و رشد در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v)5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 5/0 میلیمولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته 5/7) نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است.
اثر غلظتهای مختلف تلوریت بر رشد، تولید آنزیم و حذف تلوریت
نتایج رشد و فعالیت آنزیم و حذف تلوریت در حضور غلظتهای مختلف تلوریت محلول در شکلهای 7 و 8 نشان داده شدهاست. بیشترین فعالیت آنزیم U/mg 0265/0 در غلظت 1/0 میلیمولار تلوریت به دست آمد. با افزایش غلظت میزان تولید بیوماس و فعالیت آنزیم کاهش نشان میدهد. میزان فعالیت آنزیم در 1/0 میلیمولار و 25/0 تلوریت تفاوت معنیداری مشاهده نشد. حذف تلوریت نیز با میزان بیوماس همخوانی دارد.
اثر اسیدیته بر فعالیت آنزیم، رشد و حذف تلوریت
نتایج حاصل از از اثرات اسیدیته اولیه محیطکشت تولید، بر میزان رشد، حذف تلوریت و فعالیت آنزیم در شکل 9 و 10 نشان داده شده است. طبق شکل، بیشترین فعالیت ردوکتازی معادل U/mg 0303/0 در8 pH مشاهده شد. بررسی فعالیت آنزیم در اسیدیتههای مختلف گویای آن است که تفاوت معنیداری بین اسیدیتههای 5/7 تا 9 وجود نداشته و در اسیدیته 10 فاقد رشد قابل ملاحظه به منظور بررسی فعالیت آنزیم بود. همچنین، سویه در اسیدیتههای اسیدی 6 نیز رشد ضعیفی را نشان میداد ولی به این علت که تلوریت در اسیدیته کمتر از 5/7 در بافر مخلوط مورد استفاده حلالیت کمی داشت، رشد و فعالیت در اسیدیتههای اسیدی بررسی نشد. در اسیدیته 5/7 حذف تلوریت به شکل معنیدار از اسیدیتههای دیگر بالاتر بود.
|
a |
|
b |
|
bc |
|
bc |
|
bc |
|
c |
شکل9- اثر اسیدیته بر فعالیت آنزیم و میزان رشد در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلیمولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته 5/7). نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (P value <0.05) هستند.
|
c |
|
bc |
|
ab |
|
ab |
|
a |
|
ab |
شکل10- اثر اسیدیته برحذف تلوریت و میزان رشد در زمان 30 ساعت در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلیمولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته 5/7).نتایج میانگین سه تکرار جداگانه بوده و میله خطا برای آن نشان داده شده است. مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (P value <0.05) هستند.
اثرنمکهای کلرایدی
شکل11 نتایج تاثیر غلظتهای مختلف نمک جایگزین بر روی رشد و فعالیت آنزیم را نشان میدهد. بیشترین میزان تولید در غلظت 5 درصد NaCl و معادل U/mg 029/0، 5 درصدMgCl2و معادل U/mg 054/0 و در غلظت 5 درصد KCl و معادل U/mg 030/0 سنجیده شده است. میزان تولید بیوماس نیز با میزان فعالیت آنزیم همخوانی دارد.
|
a |
|
c |
|
b |
|
a |
|
a |
|
c |
|
b |
|
b |
|
b |
|
c |
|
ab |
|
a |
شکل11- اثر غلظتهای مختلف سدیم کلراید، منیزیوم کلراید، پتاسیم کلراید بر تولید آنزیم و رشد در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلیمولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته5/7). مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (P value <0.05) هستند.
مقایسه اثر سدیم کلراید، پتاسیم کلراید، منیزیوم کلراید بهینه
باکتری Salinicoccus iranensis QW6 در نبود یون سدیم نیز به خوبی قادر به رشد است. نتایج اثر غلظتهای مختلفMgCl2، NaCl وKCl روی رشد و فعالیت آنزیم در شکل 12 نشان داده شده است.
همانطور که مشاهده میشود، بیشترین میزان فعالیت آنزیمU/mg 04/0، 038/0، 039/0 به ترتیب در غلظتهای 5 درصد MgCl2، 5 درصد NaCl و 5 درصدKCl مشاهده میشود. حذف تلوریت در این نمکها به شکل 100 درصد انجام شد.
|
a |
|
a |
|
a |
شکل12- مقایسه بهینه نمکهای سدیم، منیزیوم و پتاسیم کلراید بر فعالیت آنزیم و رشد در محیط پایه حاوی (w/v) 5 درصد نمک سدیم کلراید حاوی 1/0 میلیمولار تلوریت با 2 درصد مایه تلقیح (اسیدیته 5/7). مقادیر نشانگذاری شده با حروف لاتین مختلف دارای اختلاف معنیدار (P value <0.05) هستند.
اثر نمکهای مختلف سدیم نیترات، دی سدیم سولفات و سدیم استات روی رشد و فعالیت آنزیم
باکتری Salinicoccus iranensis QW6 قادر به رشد قابل ملاحظه در نمکهای مورد آزمون نبوده ولی به ترتیب رشد دی سدیم سولفات و سدیم استات در غلظتهای 10 و 15 درصد بهتر بود. در مورد
نیترات با افزایش غلظت نمک افزایش مییافت ولی هیچ گونه فعالیت آنزیمی در این نمکها ردیابی نشد (شکل 13). در ضمن با وجود رشد روی غلظتهای مختلف نمک، حذفی به شکل مشاهده رسوب سیاه رنگ انجام نشده یا با روش مورد استفاده (DDTC) قادر به سنجش آن نبود.
شکل13- اثر نمکهای سدیمی بر رشد و فعالیت آنزیم. باکتری در محیط LB با اسیدیته5/7 تلقیح شد
خالصسازی آنزیم
رسوبدهی به روش آمونیوم سولفات روش مناسبی برای رسوب دادن آنزیم بود. در ابتدا تصمیم بر این بود تا از روش بخشبندی[25] توسط آمونیوم سولفات برای خالصسازی استفاده شود ولی به علت عدم تکرارپذیری از این روش صرف نظر و از همان ماکزیمم غلظت به منظور رسوبدهی استفاده شد. در این روش از عصاره سلولی با غلظت 11440 میلیگرم بر میلیلیتر استفاده شد. بخشهایی که دارای فعالیت آنزیمی بودند، بررسی شدند (شکل 14). با محاسبه فعالیت ویژه، میزان درصد مناسب آمونیوم سولفات به منظور رسوب پروتئین (های) مد نظر 60 درصد بهدست آمد.
از آنجا که به نظر آنزیم وابستگی به نمک از خود نشان میداد نمونهها بدون دیالیز و با دیالیز سنجش فعالیت آنزیمی شدند. عصاره دیالیز شده در صورت دیالیز علیه بافر فسفات فعالیت از خود نشان نمیداد. علاوه بر آن گرماگذاری بخش فعال در حضور سوبسترا نشان داد که با استفاده از درصد آمونیوم سولفات به دست آمده فرآیند ردوکتازی به شکل رسوب سیاه رنگ در محیط مشاهده شد.
شکل14- رسوبدهی با آمونیوم سولفات. غلظتهای مختلف آمونیوم سولفات به منظور رسوب دادن پروتئین (های) مورد نظر از 30-80 درصد به کار گرفته شد.
نتایج ستون فنیل سفارز
120 فرکشن از بارگذاری نمونه عصاره سلولی پس از رسوب با آمونیوم سولفات، روی ستون فنیل سفارز جمع آوری و برای تعیین فعالیت آنزیمی سنجش شد. کروماتوگرام حاصل از سنجش شکل 15 مشاهده میشود. فعالیت آنزیمی در بخش انتهایی ستون (95 درصد بافرB) مشاهده شد.
شکل 15- کروماتوگرام ستون فنیل سفارز. ستون باTris-HCl اسیدیته 8 به تعادل رسانده شده بود. فعالیت آنزیمی در در پیک انتهایی ستون مشاهده شد که با ستاره در بالای پیک مورد نظر نشان داده شده است. مقدار جذب (mAu) در طول موج 280 نانومتر و درصد B میزان بافر B افزوده سده به ستون به منظور شستشو است.
بررسی پروتئینها با الکتروفورز SDS-PAGE
الکتروفورز بخش فعال بهدست آمده از ستون تغلیظ یکی از باندها در محدوده جرم مولکولی 57 کیلودالتون را نشان داد (شکل 16). در این بخش علاوه بر فعالیت تلوریت ردوکتازی، فعالیت سلنیت و نیترات
ردوکتازی هم مشاهده شد. تغلیظ نمونه نیز نشان داد که در محدوده جرم مولکولی بالاتر از 116 کیلودالتون نیز یک باند تغلیظ شده حضور دارد. علاوه بر آن هم در چاهک و هم اطراف این باندها حضور پروتئین مشاهده میشد.
|
A |
|
C |
|
B |
|
0/116 2/66 0/45 0/35 0/25 4/18 4/14
|
|
0/116 2/66
0/45 0/35 0/25
4/18 4/14
|
|
KDa |
|
KDa |
بحث و نتیجهگیری
با وجود مطالعات زیاد بر روی مقاومت به تلوریت و سایر اکسیآنیونها، تا کنون در زمینه شناسایی عوامل دخیل در مسیر احیای تلوریت کوششهای اندکی انجام شده است.
این مطالعهها مربوط به میکروارگانیسمهای غیرنمکدوست بوده و با وجود مقاومت ذاتی بالای نمک دوستها به نمک بر روی آنها، پژوهشی در این زمینه انجام نشده است. علت استفاده از باکتریSalinicoccus iranensisQW6، علاوه بر هالوفیل بودن و بومی بودن سویه، مقاومت بالاتر آن به تلوریت نسبت به سایر هالوفیلهای گزارش شده بود (21-24). به منظور بررسی فعالیت مکانیسم تلوریت زدای سعی شد از تکنیکهای میکربی استفاده شود. در این روش، حذف تلوریت بالاتر به معنای فعالیت بیشتر آنزیم (ها) تعبیر میشد. با توجه به نتایج رشد همان گونه که انتظار میرفت هر چه غلظت اکسیآنیون سمی بالاتر بود، مدت زمان فاز تاخیر میکروارگانیسم هم بیشتر شد. حتی در غلظتهای کم تلوریت هم فاز تأخیر در رشد میکروارگانیسم مشاهده میشود که بیانگر سمیت بالای اکسی آنیون و آمادهسازی میکروارگانیسم برای مقابله با آن است. در مورد غلظت 1/0 میلیمولار تلوریت این موضوع کمرنگتر بود بدین علت که این غلظت با توجه بهMIC میکروارگانیسم که 12 میلیمولار گزارش شده، کم محسوب شده و میکروارگانیسم قادر است بهآسانی با آن مقابله نموده و تفاوت زیادی با شاهد و در شرایط بدون حضور اکسیآنیون سمی نداشته باشد. این موارد نیز پیشتر در نتایج کبیری و همکاران[26] و نیز صعودی و همکاران[27] گزارش شده بود (13 و 25).
در مورد حذف تلوریت نتایج جالب به نظر میرسید با افزایش غلظت تلوریت تا 5/0 میلیمولار حذف آن هم بیشتر انجام میشود. آموزگار و همکاران نیز حذف تلوریت در این غلظت را توسط میکروارگانیسم بیشتر گزارش نمودند (17). سریعترین میزان حذف در غلظت 1/0 میلیمولار تلوریت مشاهده شد. کمی بعد حذف در غلظت 25/0 میلیمولار اکسیآنیون مشاهده شد که این موضوع با اختلاف میزان بیوماس مشاهده شده مطابقت دارد. با افزایش غلظت اکسی آنیون همانطور که میزان بیوماس کاهش بیشتری مییابد، حذف اکسیآنیون هم کمتر انجام میشود. در غلظت 1 میلیمولار تلوریت حذف به اندازهای کم و نوساندار بود که از ارائه آن صرف نظر شد. نتایج پژوهشی دیگر توسط آموزگار و همکاران بر روی باکتری Thermoactinomyces sp. QS-2006 انجام شده بود، نشان داده شد که حذف تلوریت توسط سویه با افزایش غلظت اکسیآنیون تا 1 میلیمولار بیشتر انجام میشود (26). نکته مشابه این است که حتی در غلظتهای بالا نیز بین 1، 2 و 3 میلیمولار تلوریت، 1 میلیمولار حذف بالاتری را نشان داد. نوسانات مشابهی در حذف تلوریت در هر دو گزارش مشاهده میشود.
بررسی فعالیت آنزیمی در محیط بیرون سلولی (محیط کشت) منفی بود. این محیط تغلیظ شد ولی باز هم آزمون آنزیمی مربوطه به آن هیچ فعالیت آنزیمی را با این روش نشان نداد. اگرچه بررسی روی Pseudomonas stutzeri نشان داده بود که پیریدین 2 و 6 بیس تیوکربوکسیلیک اسید (PDTC) که یک سیدروفور است یا محصولات تولید شده توسط آن، هم در احیای سلنیت و هم در احیای تلوریت نقش دارند (27)، این نشان میدهد که آنزیم مؤثر در حذف تلوریت در باکتری مورد بررسی در محلی در داخل سلول باکتری واقع شده است.
به منظور انجام بررسی و خالصسازی آنزیم از غلظت 5/0 میلیمولار تلوریت استفاده شد. پس از سونیکاسیون، فعالیت آنزیم مثبت بود و کاهش جذب در طول زمان مشاهده میشد ولی این مقدار فعالیت آنزیمی اندک بود به گونهای که آغاز فرآیند خالصسازی با آن انجام پذیر نبود؛ زیرا در طی مراحل خالصسازی این مقدار فعالیت که تنها عامل شناسایی آنزیم بود، قابل ردیابی نبود. بررسی تأثیر شرایط مختلف حضور تلوریت، حضور سلنیت، حضور تلوریت و سلنیت، حضور نیترات و بدون هر گونه اکسیآنیون بر میزان فعالیت ویژهی آنزیم، عدم القایی بودن آنزیم را پیشنهاد میکرد.
بهبود فعالیت آنزیم با روش OFAT افزایش فعالیت آنزیم تلوریت زدای را به همراه داشت.
اثر غلظتهای مختلف تلوریت
افزایش فعالیت آنزیم در حضور غلظتهای مختلف تلوریت عدم القاگر بودن آن را برای آنزیم مورد نظر نشان داد؛ ولی نتایج حذف تلوریت اینگونه نشان میداد که با افزایش غلظت اکسی آنیون حذف تلوریت نسبت به فعالیت آنزیمی بالاتر است که این موضوع میتواند حضور مسیرهای مختلف حذف تلوریت در باکتری را نشان دهد. وابستگی بین بیوماس و فعالیت آنزیم، فرض القا شونده بودن آنزیمی را که با این روش به دنبال آن بودیم، رد نمود. پیشتر نیز چوانگ و همکاران[28] و نیز موسکوسو و همکاران[29] عدم وجود ارتباط بین غلظتهای مختلف تلوریت و فعالیت آنزیم را مربوط به القایی نبودن آن گزارش کردند (9 و 28).
اثر نمکهای مختلف
آموزگار و همکاران پیشتر با رشد باکتری نمکدوست Thermoactinomyces sp. QS-2006 در حضور نمکهای اخیر رشد و حذف تلوریت مناسبی را گزارش کرده بودند (26). در حالیکه رشد و حذف تلوریت در این نمکها دیده نشد. هر دو باکتری مقایسه شده از راسته باسیلالز هستند. به نظر میرسد میکروارگانیسم مربوطه وابستگی به یون سدیم نشان نمیدهد. این موضوع باز هم تأییدکننده همراهی حذف تلوریت با میزان بیوماس است. نکته جالب توجه این بود که بیشتر نمک دوستها نیازمندی به NaCl نشان میدهند؛ ولی میکروارگانیسم مورد مطالعه در حضور MgCl2 و KCl نیز رشد قابل ملاحظهای، برابر با رشد در حضور NaCl (P value < 0.05)، از خود بروز میداد. شاید این نمک دوست وابستگی به یون کلراید دارد. مقایسه هر سه نمکMgCl2، KCl و NaCl در یک آزمایش نشان داد هر سه، رشد، فعالیت آنزیم و حذف تلوریت را به خوبی پشتیبانی میکردند و تفاوت معنیداری (P value < 0.05) نشان ندادند. در هر سه نمک حذف تلوریت به شکل 100 درصد انجام شده بود. آشنگرف و همکاران[30] بین حذف تلوریت در حضور نمکهای MgCl2 و KCl را تفاوت در میزان حذف تلوریت گزارش کرده بودند، که تفاوت مشاهده شده به زمان بررسی میزان حذف در این نمکها نسبت داده شد (17).
خالصسازی آنزیم با تلفیق دو تکنیک رسوبدهی با آمونیوم سولفات و فنیل سفارز به نظر روش مناسبی برای خالصسازی آنزیم بود. کروماتوگرام ستون فنیل سفارز سه پیک نشان داد که فعالیت آنزیمی در پیک انتهایی مشاهده شد. تغلیظ نمونه نیز نشان داد که هنوز پروتئینهای دیگری هم در چاهک و هم در اطراف باند به نظر تغلیظ شده حضور دارد. به همین منظور نیاز است تا در ادامه با افزودن روشهای دیگر به آن، خالصسازی را بهبود دهیم. به منظور تأیید احیای تلوریت توسط آنزیم مربوطه، از گرماگذاری مستقیم آن با تلوریت و NADH استفاده شد که نتایج حضور آنزیمی را که در احیای این اکسیآنیون نقش دارد، تأیید کرد.
این نمونه به طور نسبی خالصسازی شده، قادر به احیای سلنیت و نیترات نیز بود. از آنجا که فعالیت تلوریت ردوکتازی نیترات ردوکتازها به عنوان قویترین فرضیه تا کنون مطرح است، این احتمال را دور از ذهن نمیکند که ما به سمت خالصسازی این آنزیم گام نهادهایم ولی اثبات آن منوط به خالصسازی کامل آنزیم است.
مطالعاتی که در زمینه خالصسازی نیترات ردوکتازها در باکتریهای نمک دوست بوده، یک مورد
و آن هم در سال 2010 توسط فیلیموننکو و همکاران[31] انجام گرفت، که در آن تنها یک زیر واحد را که همان NarG بود، گزارش نمود (29).
در مجموع نتایج این پژوهش بهینهسازی آنزیم دخیل در تبدیل زیستی تلوریت به تلوریوم و خالصسازی نسبی آن را به همراه داشت. اما باید خالصسازی به شکل کامل در ادامه کار انجام شود. همچنین، احتمال حضور مسیرهای دیگر و غیر وابسته به NADH نیز بررسی شود.
[1]- Bioaccumulation
[2]- Merck (Darmstadt, Germany(
[3]- PhenylMethylSulphonyl Fluorid
[4]- Diethyl dithiocarbamate (DDTC(
[5]- Sigma (St. Louis, MO, USA) and
[6]- Pharmacia
[7]- Mojallali
[8]- Amoozegar et al
[9]- IBRC (Irainian Biological Resources Center(
[10]- Shimadzu UV-160A
[11]- OD620 1.5
[12]- Bovine Serum Albumin (BSA(
[13]- Bradford
[14]- Mode
[15]- One Factor At a Time (OFAT(
[16]- Fractionation
[17]- Fast Protein Liquid Chromatograpy
[18]- Amicon
[19]- Millipore
[20]- SDS- PAGE
[21]- One way ANOVA
[22]- Duncan`s multiple-range test
[23]- IBM SPSS Statistics 19
[24]- Inoculum
[25]- Fractionation
[26]- Kabiri et al
[27]- Soudi et al
[28]- Chiong et al
[29]- Moscoso et al
[30]- Ashengroph et al
)