بیوکنترل عامل مولد بیماری شانکر مرکبات با استفاده از ترکیبات ضد میکروبی تولید شده توسط قارچ Aspergillus awamori K-03

مقدمه

بیماری باکتریایی‏ شانکر آسیایی مرکبات از جمله بیماری‏های باکتریایی است که بر روی درختان میوه ایجاد می‏شود. عامل این بیماری دارای دو تیپ متفاوت A و ^*A است. اگرچه سویه‏های تیپ A در بیشتر مناطق کشت و تولید مرکبات دیده می‏شود ولی سویه‏های تیپ ^*A تنها در هند، تایلند و کشورهای حوزه خلیج فارس از جمله ایران شناسایی شده‏اند و دامنه میزبانی آن‏ها تنها محدود به درخت لیموترش است. این بیماری در سال 1899 برای نخستین بار در ژاپن بر روی برگ‏های واشنگتن ناول مشاهده شد ولی نامی برای آن مشخص نشد (1). برگر و همکاران[1] شانکر را به عنوان بیماری جدید معرفی کردند (2). این بیماری نخستین بار در ایران بر روی لیموی مکزیکی از منطقه کهنوج استان کرمان به‏وسیله علیزاده و رحیمیان[2]گزارش شد (4). رحیمیان و همکاران[3] گسترش شانکر را در استان‏های جنوبی بررسی و گزارش کردند این بیماری در بیشتر باغات استان هرمزگان، کهنوج و تعدادی از باغات جیرفت و سیستان و بلوچستان وجود دارد. همچنین، درختان لیموترش به پاتوتیپ‏های موجود حساسیت بالایی داشته ولی ارقام پرتقال، نارنگی و نارنج حساسیت کمتری دارند (5 و 6).

عامل بیماری شانکر مرکبات باکتری گرم منفی Xanthomonas citri ssp. citri است که بر روی محیط‏های کشت کلونی‏های زرد رنگ ایجاد می‏کند. درجه حرارت بهینه برای رشد این باکتری 28 تا 32 درجه سانتی‏گراد‏ است. عامل بیماری در حاشیه زخم‏های ایجاد شده روی برگ، میوه و سرشاخه‏ها تا زمان ریزش آن‏ها باقی می‏ماند، در حالی که در خاک فقط چند روز می‏تواند زنده بماند (7).

علایم این بیماری شامل: زخم‏های برآمده و نکروتیک مشخص بر روی برگ‏ها، ساقه و میوه است. شدت بیماری باعث ریزش برگ‏ها، بدشکلی میوه‏ها، ریزش پیش از موقع میوه‏ها، خشکیدگی سر شاخه‏ها و ضعف عمومی درخت است. البته این بیماری سیستمیک نیست و فقط باعث زخم‏های موضعی می‏شود (3، 8 و 9). شانکر باکتریایی به کمک قطرات باران و یا آب جاری و یا دست‏زدن به گیاهان و یا از طریق ابزار آلوده و مواد آلوده گیاهی انتقال می‏یابد. کنترل بیماری شانکر، از طریق بهداشت، شیوه‏های از بین بردن و از طریق چندین بار اسپری کردن سموم مسی، محلول بوردو و یا آنتی‏بیوتیک‏ها انجام می‏شود (6 و 7).

با توجه به اهمیت استفاده از استراتژی مبارزه زیستی به‏عنوان یکی از روش‏های کنترل عوامل بیماری‏زا، در این تحقیق توانایی آنتاگونیستی عصاره خام مجموعه‏ای از جدایه‏های قارچی برای استفاده در بیوکنترل بیماری شانکر مرکبات بررسی شد.

مواد و روش‏ها

نمونه‏برداری و جداسازی قارچ از خاک

نمونه‏برداری از خاک باغات نواحی شمال کشور (استان‏های گلستان و مازندران) و جنوب کشور (استان‏های هرمزگان، فارس و کرمان) در تابستان 1390 انجام شد. از هر یک از نمونه‏های خاک، سری رقتی[4] تهیه و بر روی محیط PDA (پپتون، گلوکز و آگار) کشت و در دمای 30 درجه سلسیوس و در تاریکی به مدت یک هفته انکوبه شد. جدایه‌های به‌دست آمده از هر یک از نمونه‌های خاک به ظروف پتری حاوی محیط کشت آب آگار منتقل و با گرفتن تک اسپور از آن‏ها و انتقال به محیط PDA دیگری خالص شد.

تهیه عصاره خام[5]از هر یک از جدایه‏های قارچ

برای تهیه عصاره خام از حاشیه کشت هفت روزه هر یک از جدایه‏ها، دو قطعه از محیط کشت قارچ حاوی ژلوز محیط کشت، به ابعاد تقریبی (1 ×1 سانتی‏متر) حاوی 10⁶ × 75 سلول اسپور به‏طور تقریبی، جدا و در فلاسک ارلن مایر شامل: 100 میلی‏لیتر محیط PDB (شامل: 4 گرم پپتون، 20 گرم گلوکز) ریخته شد و به مدت 20 روز در شیکر انکوباتور با دور rpm 180 و دمای 30 درجه‏ سلسیوس نگهداری شد. محیط کشت حاوی میسلیوم‏های قارچی، با عبور از کاغذ صافی فیلتر شد. مایع عبوری از صافی با حجم برابری از اتیل استات مخلوط و به مدت یک ساعت در دمای 20 منفی درجه سلسیوس قرار داده شد و به مدت 30 دقیقه در
 g× 11627 سانتریفیوژ شد. عصاره با استفاده از تبخیر چرخشی در دستگاه SpeedVac Eppendorf/Hamburg/Germany) Concentrator) به میزان 10 برابر غلیظ شدند. تمامی عصاره‏ها در دمای 4 درجه سلسیوس نگهداری شدند (10-13).

سنجش فعالیت آنتی‏میکروبیال عصاره‏های قارچی

عصاره 20 قارچ برای سنجش فعالیت آنتی‏باکتریالی در مقابل 26 سویه از باکتری زانتوموناس و همچنین، سایر باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی دیگر، از جمله Escherichia coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescens، Salmonella typhi، Staphylococcus aureus و Erwinia amylovora بررسی شد.

مقدار 100 میکرولیتر از باکتری کشت داده شده در محیط مایع (YP عصاره مخمر و پپتون) شامل:
 cfu. ml^-110²³×4 تعداد باکتری، روی سطح پتری‏هایی که حاوی محیط کشت PDA بودند با استفاده از سوآپ استریل کشت شد. مقدار 15 میکرولیتر از هر یک از عصاره‏های قارچی روی سطح دیسک‏های اتوکلاو 5 میلی‏متری که به واسطه پانچ کاغذ صافی ایجاد شده بود، قرار گرفت و دیسک‏ها روی سطح پلیت‏های آغشته به سوسپانسیون باکتری، قرار داده شد. ظرف در دمای 30 درجه‏ سلسیوس به مدت 24 ساعت انکوبه شد. فعالیت آنتی‏باکتریالی به شکل اندازه‏گیری قطر ناحیه بازدارنده بر حسب میلی‏متر ارزیابی شد. همچنین، برای بررسی اثر ضد قارچی سکروتوم هر یک از جدایه‏های قارچی فعالیت آن‏ها بر روی دو قارچ Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani ارزیابی شد (10-12 و 14-16).

شناسایی مولکولی جدایه قارچی دارای خاصیت آنتاگونیستی

برای شناسایی مولکولی جدایه دارای خاصیت کنترل کنندگی ابتدا با استفاده از روش [6]CTAB، DNA ژنومی استخراج شد. سپس، با استفاده از پرایمرهای عمومی، توالی 18SrRNA

(F18S-5'-CCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3' و R18S-5'- GCTTGATCCTTCTGCAGGTT-3') آن تکثیر شد و پس از تعیین توالی با توالی‏های مربوط در سایت [7]NCBI مقایسه شد. از نرم افزارCLC Sequence Viewer 6 نیز برای ترسیم درخت فیلوژنتیک مربوط به این قارچ استفاده شد.

هر واکنش PCR[8] شامل: 1 میکرولیتر DNA الگو، 5/2 میکرولیتر بافر PCR ×10، 8/0 میکرولیتر MgCl₂ (50 میلی‏مولار)، 5/0 میکرولیتر dNTP (10 میلی‏مولار)، 5/0 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای رفت و برگشت با غلظت 10 پیکومول، Taq پلی‏مراز به میزان 2/0 میکرولیتر و ddH2O به میزان 19 میکرولیتر استفاده شد. تکثیر در دستگاه PCR در طی 30 سیکل انجام شد. برنامه PCR شامل: 1 دقیقه در 94 درجه سانتی‏گراد‏، 1 دقیقه در 56 درجه سانتی‏گراد‏ و 2 دقیقه در 72 درجه سانتی‏گراد‏ استفاده شد. مرحله تطویل نهایی نیز در طی 10 دقیقه در دمای 72 درجه‏ سانتی‏گراد‏ انجام گرفت (11).

تأثیر حرارت، اسیدیته‏ و مواد شیمیایی بر فعالیت عصاره قارچی

برای بررسی اثر اسیدیته‏ با استفاده از بافر سدیم فسفات، اسیدیته‏های 4 تا 9 تهیه شد و عصاره قارچی با هر یک از اسیدیته‏های ساخته شده با نسبت 1:1 به مدت 30 دقیقه مجاور شد. برای اندازه‏گیری مقاومت به گرما عصاره در حرارت 50 تا 100 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت نیم ساعت قرار گرفت (14-16). همچنین، برای بررسی اثر مواد شیمیایی، عصاره قارچی با EDTA[9] یک درصد به مدت 30 دقیقه مجاور شد و فعالیت آنتاگونیستی در تمامی موارد با استفاده از روش دیسک بررسی شد (17).

تعیین حداقل غلظت بازدارنده[10] (MIC)

تعیین حداقل غلظت بازدارنده عصاره قارچی با استفاده از روش Broth microdilution در میکروپلیت الایزا انجام شد. برای این کار غلظت‏های 4 تا 2048 میکروگرم در میلی‏لیتر از عصاره حاوی ترکیب آنتی‏میکروبیال تهیه شد و سپس، کدورت باکتری زانتوموناس (سویه 88 NIGEB) به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر در cfu. ml^-1  10⁵ ×5 تنظیم شد. در زیر هود از هر کدام از غلظت‏های ساخته شده حجم 100 میکرولیتر به چاهک‏های میکروپلیت اضافه شد. از نمونه باکتری نیز به میزان 1 میکرولیتر به دامنه غلظت‏های ترکیب ضد میکروبی اضافه شد. در نهایت، میکروپلیت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 24 ساعت قرار گرفت[11].

نتایج

پس از بررسی اثر مهاری عصاره 20 جدایه قارچی بر روی سویه مختلف باکتری زانتوموناس، عصاره‏ قارچی جدایه شماره 3 هاله عدم رشد شاخص‏تری نسبت به سایرین ایجاد کرد. پس از تکثیر ناحیه‏ی 18S rRNAمحصول PCR با کیت Roche (Penzberg/Germany) خالص و برای تعیین توالی به شرکت ژن فناوران فرستاده شد. نتیجه توالی‏یابی حاصل پس از انجام BLAST در سایت NCBI و رسم درخت فیلوژنتیک نشان داد که توالی حاصل به یکی از سویه‏های قارچ Aspergillus awamori مربوط است این قارچ با نام Aspergillus awamori K-03 و با شماره پذیرش KF922319 در سایت NCBI ثبت شد (شکل 1).

در این بررسی عصاره قارچ K-03 A. awamori علیه 26 سویه از باکتری مولد بیماری شانکر مرکبات خاصیت آنتاگونیستی نشان داد (جدول 2). نتایج بررسی‏های ما در شرایط آزمایشگاهی ثابت کرد که می‏توان از ترکیب ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ K-03 ‏A.awamoriبه عنوان عاملی برای بیوکنترل سایر باکتری‏های پاتوژن نیز استفاده کرد. ماده ضد‏میکروبی تولیدی توسط قارچ K-03 A. awamori علاوه بر سویه‏های مختلف باکتری زانتوموناس فعالیت بازدارندگی برعلیه سایر باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی دیگر از جمله E. coli، Bacillus subtilis، Pseudomonas fluorescenceو Erwinia amylovora و دو پاتوژن مهم انسانی Salmonella typhiوStaphylococcus aureus را نشان داد (شکل 2). حداقل غلظت بازدارنده برای ترکیب ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ A. awamori K-03، 128 میکروگرم بر میلی‏لیتر تعیین شد.

خاصیت مهم ترکیب ضدمیکروبی موجود در سکروتوم قارچ K-03 A. awamori پایداری در دمای 100 درجه سلسیوس به مدت 30 دقیقه بود. ضمن آنکه فعالیت خود را در اسیدیته‏های متفاوت و همچنین در حضور EDTA حفظ نمود.

سکروتوم قارچ  A. awamori K-03هیچ اثر کنترل‏کنندگی را در مقابل دو قارچ Macrophomina phaseolina و Rhizoctonia solani نشان نداد.

بحث و نتیجه‏گیری

نتایج حاصل از تاثیر عصاره‏ قارچK-03A. awamori بر سویه‏های مختلف باکتریایی بیانگر وسیع الطیف بودن این ترکیب‏ ضدمیکروبی است. این اثر بازدارندگی وسیع می‏تواند ناشی از سیستم‏های پیچیده آنتاگونیستی باشد که توسط این قارچ‏ تولید می‏شود. نتایج حاصل از بررسی‏های ژنگ و همکاران[12] مؤید همین مسئله است (16). گزارش‏های بسیاری پیرامون مقاومت ترکیبات آنتی‏میکروبیال در دماهای بالا وجود دارد که در این مطالعه این میزان به مدت 30 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‏گراد بود. ژنگ و همکاران (16) نشان دادند حساسیت ترکیبات آنتی‏میکروبیال نسبت به اسیدیته‏ بسیار متفاوت است و تعداد زیادی از آن‏ها در محدوده وسیعی از اسیدیته‏ها فعال هستند. ماده استخراجی در این مطالعه، نیز همین ویژگی را نشان داده و در تمامی اسیدیته‏های تهیه شده فعالیت خود را به خوبی حفظ کردند. مشابه نتایج مژگانی و همکاران[13] ترکیب عصاره دارای خاصیت ضد میکروبی با EDTAپس از 30 دقیقه مجاورت تغییری را در عملکرد آن‏ها ایجاد نکرد. این عدم بازدارندگی گویای این است که کاتیون‏های فلزی نقشی در فعالیت این ماده ضد میکروبی ندارند (17) (جدول 1).

شکل 1- بررسی توالی 18S rRNA ایزوله شماره 3 نشان داد این ایزوله یکی از سویه‏های قارچ Aspergillus awamori است. قرار گرفتن این سویه قارچی در یک شاخه جداگانه از درخت بیانگر این مهم است که قارچ یاد شده سویه‏ای جدید در جنس مربوط به خود است. این قارچ با نام Aspergllus awamori K-03 و با شماره پذیرش KF922319 در سایت NCBI ثبت شد.

جدول 1- تأثیر عوامل بازدارنده فیزیکی و شیمیایی بر عامل بازدارنده تولید شده توسط قارچ A. awamori K-03

شکل2- بررسی اثر آنتاگونیستی سکروتوم قارچ A. awamori K-03بر روی برخی از سویه‏های بیماری‏زای زانتوموناس