نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، هیات علمی جهاد دانشگاهی سازمان، تهران، ایران
2 کارشناس میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه شاهد، ایران
4 دکترای تخصصی ژنتیک، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
IntroductionPlant growth promoting rhizobacteria with ACC deaminase activity can be used for stimulating plant growth under tension situations. This study held to surveyed native bacteria having ACC deaminase activity.
Materials and methods: 8 (none) rhizospherial soils were cultured by preparing serial dilution in selective media. The isolates screened by semi quantity assay of determining ACC deaminase in which diagonal colony after inoculation and incubation was measured in first, second and fifth day. The ability of these strains in accdeaminase production was investigated by optical density of bacterial growth in 504nm. ACC deaminase activity was assayed by measuring the production of α-KB. The selected strains recognized by biochemical and microbiological tests and the best strain in production of ACCD was identified by PCR amplification and sequencing of 16s rRNA..
Results: 445 stains were isolated. Then, 17 stains were selected by semi quantity assay. Then, 9 strains belong to Bacillus and Pseudomonas genera and Actinomycete group, were selected based on their abilities in the enzymes production. The study of Acc deaminase activity showed Pseudomonas brassicacearum strain KOT12 belonged to the fluorescent pseudomonad group had highest activity (826/4369 nmol kb/mg pr/h).
Discussion and conclusion: Based on high production of ACCD in the selected isolate in comparison with other strains, this strain can be used for PGPR inoculums in the field by optimizing enzyme production and formulation.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
ریزوباکترهای محرک رشد گیاه بخش اصلی میکروارگانیسمهای ریزوسفر را تشکیل میدهند. از مهمترین مکانیسمهایی که باعث افزایش رشد و نمو گیاه میشوند، تولید و ترشح تنظیم کنندههای رشد گیاهی[1] است (1). امروزه پژوهشگران تنظیم باکتریایی تولید اتیلن در گیاهچههای جوان را بهترین مکانیسم ریزوباکتریهای محرک رشد گیاه در افزایش رشد گیاهان دانستهاند (2). در کشاورزی کنترل سطح اتیلن در گیاه از اهمیت زیادی برخوردار است. کنترل سطح اتیلن در گیاهان زراعی به ویژه در مواقعی که گیاه در معرض تنش قرار میگیرد میتواند از خسارت اقتصادی ناشی از افزایش غلظت اتیلن که باعث کاهش رشد و عملکرد گیاه میشود، جلوگیری کند. سازوکارهای متداول در کنترل سطح اتیلن در گیاهان شامل این موارد است: استفاده از بازدارندههای شیمیایی بیوسنتز و فعالیت اتیلن، تهیه ارقام موتانت گیاهی که به سطح بالای اتیلن حساسیت کمتری داشته باشند، تهیه گیاهان تراریختهای که در شرایط تنش، اتیلن کمتری تولید کنند و بهتازگی استفاده از برخی باکتریهای محرک رشد گیاه که قادرند سطح اتیلن درون گیاه را کاهش دهند. با وجود این، استفاده از باکتریهای محرک رشد گیاه، روشی است که بیشتر مورد پسند قرار گرفته است (3). در گیاهان عالی، پیش ماده اتیلن، ترکیب ACC[2] است. آنزیم ACCدآمیناز توسط تعداد زیادی از باکتریهای محرک رشد گیاه و برخی از مخمرها و قارچها تولید میشود (4). آنزیم (1- آمینـو سـیکلوپروپان -1- کربوکـسیلیک اسید) دآمیناز مانع تبدیل ماده ACC به اتیلن شده و از اثرات بازدارنده رشد اتیلن تنشی که در پاسخ به تـنشهـای محیطـی در گیاه تولید میشود، جلوگیری مینماید. آنزیم ACC دآمیناز به این میکروارگانیسمها امکان میدهد که از ACC به عنوان تنها منبع نیتروژن استفاده کند (4).
مواد و روشها
از نواحی ریزوسفری و غیرریزوسفری گیاهان مناطق کومله، اطاقور، پرشکوه و لیلیکوه در شمال کشور (با عرض و طول جغرافیایی به ترتیب N"88/10 '10°37 وE"62/54'10°50 -N"00/34 '6°37وE"00/51 '6°50-N"21/39'8°37 وE "90/9 '10°50 - N"30/20 '11°37وE"10/47 '8°50)، تعداد 8 نمونه خاک از عمق 20 تا 40 سانتیمتری جمعآوری شد. نمونهبرداری از ریزوسفر گیاهان شاداب و سالم و از درختانی که رشد و نمو بهتری داشتند انجام شد. کشت از نمونههای خاک به روش تهیه رقتهای متوالی و پخش بر 3 نوع محیط کشت جامد DF (5)، YM (6) وKing B (7) بهوسیله میله سرکجِ استریل انجام شد. ترکیب اجزای محیطهای کشت در جدول 1 آمده است. به سطح محیطهای کشت بلافاصله قبل از تلقیح باکتری، 150 میکرولیتر از محلول آمونیوم سولفات 3/0 مولار اضافه شد. تمامی پلیتها به مدت یک هفته در دمای28 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و روزانه رشد کلونی بر روی محیطهای کشت بررسی و در نهایت کشت خالص بهدست آمد.
آزمون نیمه کمی توان تولید آنزیم ACCدآمیناز
به منظور آزمون نیمه کمی توان تولید ACCدآمیناز در سویههای بهدست آمده، آزمون لکهگذاری در 3 حالت کنترل منفی (فاقد منبع نیتروژن)، کنترل مثبت (دارای منبع نیتروژن کلرید آمونیوم) و نمونه مورد بررسی (دارای منبع نیتروژن ACC) مشابه با روش خسروی و همکاران[3] (8) انجام گرفت. بدینمنظور، کشت تازه از سویههای مورد نظر بر روی محیطهای جامد DF، YM و King B تهیه شد و محیطهای کشت مزبور به گونهای که منابع نیتروژن در آنها حذف شده بود، نیز در 3 سری آماده شد؛ در سری اول به سطوح محیط کشت بلافاصله قبل از تلقیح باکتری، 150 میکرولیتر از محلول 15/0 مولار ACC اضافه شد (محلول ACC کمی قبل از شروع از فریزر خارج و پس از ذوب شدن با یک میله شیشهای سرکج استریل روی سطح پلیت پخش و در مدت کوتاهی خشک شد). در سری دوم به سطح محیط کشت 150 میکرولیتر کلریدآمونیوم 15/0 مولار اضافه شد (به عنوان شاهد مثبت) و در سری سوم هیچ منبع نیتروژنی به سطح محیط کشت اضافه نشد (به عنوان شاهد منفی). برای حذف منبع نیتروژن احتمالی موجود در آگار بهکار رفته در محیطهای کشت، آگار مرک[4] طبق روش ریان[5] (9) شستشو شد. از کشت تازه جدایهها سوسپانسیونی معادل یک مک فارلند در سرم فیزیولوژی برای تلقیح تهیه شد. از هر سوسپانسیون میزان 2 میکرولیتر در خانههای مربوطه لکهگذاری شد. مایعتلقیح هر 3 سری پلیت با جدایهها در یک زمان واحد انجام شد و پلیتها در دمای 28 درجه سانتیگراد برای یک هفته گرماگذاری شدند.
جدول 1- الف) ترکیب محیط کشت DF ب) محیط کشت YM ج) محیط کشت King B د) محیط کشت M9 در 1 لیتر آب مقطر
|
الف |
KH2PO4 |
4 گرم |
|
Na2HPO4 |
6 گرم |
|
|
MgSO4 _ 7H2O |
2/0 گرم |
|
|
Glucose |
2 گرم |
|
|
FeSO4 _ 7H2O |
1 میلی گرم |
|
|
H3BO3 |
10 ماکروگرم |
|
|
MnSO4 _H2O |
19/11 ماکروگرم |
|
|
ZnSO4 _ 7H2O |
6/124 ماکروگرم |
|
|
gluconic acid |
2 گرم |
|
|
citric acid |
2 گرم |
|
|
CuSO4 _ 5H2O |
22/78 ماکروگرم |
|
|
MoO3 |
10 ماکروگرم |
|
ب |
KHPO4_3H2O |
65/0 گرم |
|
NaCl |
1/0 گرم |
|
|
MgSO4 _ 7H2O |
2/0 گرم |
|
|
Yeast Extract |
5/0 گرم |
|
|
Mannitol |
10 گرم |
|
|
Congo Red 1% |
5/2 میلیلیتر |
|
ج |
Proteose Peptone |
20 گرم |
|
MgSO4 _ 7H2O |
5/1 گرم |
|
|
K2HPO4 |
5/1 گرم |
|
|
Glycerol |
10 میلیلیتر |
|
د |
KH2PO4 |
6 گرم |
|
Na2HPO4 |
3 گرم |
|
|
NaCl |
5/1 گرم |
عناصر زیر نیز به طور جداگانه استریل و به ترکیبات یاد شده محیط کشت M9 در حجم نهایی یک لیتر افزوده شدند.
|
MgSO4×7H2O |
493میلیگرم |
|
CaCl2×2H2O |
47/1میلیگرم |
|
Glucose |
2 گرم |
|
Thamine HCl |
میلیگرم 337 |
تعیین توانایی سویهها در استفاده از ACC به عنوان منبع نیتروژن
توانایی تولید آنزیم ACCدآمیناز با استفاده از روش تغییر یافته پنروز و گلیک[6] ارزیابی شد (10). برای این منظور یک لوپ از هر جدایه به 20 میلیلیتر محیط کشت نوترینت براث در لولههای 50 میلیلیتری تلقیح شد و پس از 24 ساعت از رشد باکتری در28 درجه سانتیگراد، میزان 50 میکرولیتر از سوسپانسیون هر جدایه به 30 میلیلیتر محیط نوترینت براث تازه اضافه شد و 24 ساعت در 28 درجه سانتیگراد تکان داده شد. سپس، 50 میکرولیتر از سوسپانسیون هر سویه به هر یک از لولههای 50 میلیلیتری حاوی 20 میلی لیتر از محیط حداقل M9، محیط حداقل M9 حاوی 15/0 مولار ACC و محیط حداقل M9 حاوی 2 گرم در لیتر آمونیوم کلرید تلقیح و به مدت 48 ساعت روی شیکر با دمای 28 درجه سانتیگراد و دور rpm80تکان داده شد. دانسیته نوری این محیطها در طول موج 504 نانومتر بهوسیله اسپکتروفتومتر به عنوان معیاری از رشد باکتری در آن محیط در روزهای اول، دوم و پنجم اندازهگیری شد.
سنجش آنزیم (1- آمینـو سـیکلوپروپان -1- کربوکـسیلیک اسید) دآمیناز[7] در سویههای منتخب
میزان فعالیت آنزیم ACCدآمیناز با تعیین غلظت آلفا کتوبوتیرات آزاد شده و بر طبق روش تغییر یافته پنروز (10) انجام گرفت. در این روش، از محیط کشت مایع BHI به عنوان محیط پیش کشت استفاده شد. برای این منظور، ابتدا از باکتریها، کشت تازه در محیط جامد BHI تهیه شد. سوسپانسیون سلولی از کشت جامد سویهها با غلظت معادل 1 مک فارلند آماده و به میزان 100 ماکرولیتر به 10 میلی لیتر محیط کشت مایع BHI تلقیح و در دمای 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. با بررسی میزان جذب نوری محیط کشت سویهها، زمان مناسب برای رسیدن سویهها به فاز سکون رشد ارزیابی شد. در این مقطع زمانی سلولها طی 1 مرحله سانتریفوژ در دمای4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه با دور rpm 6000 جمعآوری و محلول رویی دور ریخته شد. برای القای آنزیم، سلولهای باقیمانده پس از شستشو با محیط کشت حداقل M9، در 5/7 میلیلیتر محیط کشت مایع M9 حاوی 40 میکرولیتر از محلول 5/0 مولار معلق و برای 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد و دور rpm 120 قرار گرفت. 50 ماکرولیتر از سوپ رویی سلولهای لیز شده با تولوئن 5 درصد (حجمی/ حجمی) برداشته شد و پس از افزودن 5 ماکرولیتر ACC 5/0 مولار، ورتکس و برای 30 دقیقه در30 درجه سانتیگراد نگهداری شد. از نمونه حاوی 50 ماکرولیتر سوپ باکتریایی به همراه 5 ماکرولیتر آب مقطر و نیز نمونه حاوی 50 ماکرولیتر بافر تریس-کلریدریک اسید[8] 1/0 مولار (اسیدیته 5/8) و 5 ماکرولیتر محلول ACC 5/0 مولار به ترتیب به عنوان کنترل منفی و بلانک استفاده شد. سپس، 500 ماکرولیتر کلریدریک اسید 56/0 نرمال به هر لوله اضافه شد. پس از آن محلول نهایی درون هر لوله با استفاده از ورتکس مخلوط و برای حذف بقایای سلولی، نمونهها به مدت 5 دقیقه با دور rpm 18000 در دمای اطاق سانتریفوژ شد. سپس، 500 ماکرولیتر از محلول رویی هر لوله میکروسانتریفوژ برداشته و با 400 ماکرولیتر کلریدریک اسید 56/0 نرمال درون یک لوله آزمایش کوچک ورتکس شد. 150 ماکرولیتر از محلول 2-4 دی نیتروفنیل هیدرازین[9] (محلول 2/0 درصد در کلریدریک اسید 2 نرمال: 02/0 گرم 2-4 دی نیتروفنیل هیدرازین در 61/9 میلیلیتر استون حل و 330 ماکرولیتر کلریدریک اسید 2 نرمال به آن اضافه شد) به هر لوله افزوده و ورتکس شد. محتویات 30 دقیقه در30 درجه سانتیگراد نگهداری شد. سپس، به محلول فوق 1 میلیلیتر سدیم هیدروکسید 2 نرمال اضافه و مخلوط شد تا یکنواخت شود. مقدار جذب نور در طول موج 540 نانومتر قرائت شد. مقادیر جذب کنترل منفی و بلانک برای هر سویه از جذب نمونه، کسر شد و مقدار بهدست آمده برای سنجش فعالیت آنزیم، به کار رفت.
شناسایی سویههای منتخب
شناسایی سیستماتیک سویهها طی 2 سری از آزمایشها انجام شد. در سری نخست، آزمونهای بیوشیمیایی و میکروبیولوژیک برای شناسایی تمامی سویههای منتخب طبق روش پیشنهادی برگی[10] (6)، انجام شد. در نهایت، شناسایی سویه منتخب که دارای بیشترین میزان فعالیت آنزیم ACCدآمیناز بود، با تکثیر و تعیین توالی ژن 16S rRNAانجام گرفت. برای این منظور، استخراج DNA باکتری به کمک مواد لیز کننده سلولی انجام گرفت و در ادامه با روش فنل/ کلروفرم/ ایزوآمیل الکل خالص شد. در این تحقیق، برای تکثیر ژن 16S rRNAسویه منتخب از آغازگر رفت:
F27)P1) ´3AGAGTTTGATCCTGGCTTAG´5
و آغازگر برگشت:
P2 (R1492) ´3TAAGGAGGTGATCCAGC´5 استفاده شد و ژن 16S rRNA تکثیر یافته به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز[11] که برای تعیین توالی مناسب بود (تراکم مناسب، بدون اسمیر و باند اضافه) به شرکت ماکروژن[12] برای تعیین توالی با استفاده از دستگاه
(ABI 3730 XL DNA sequencer) ارسال شد.
نتایج
در مجموع، تعداد 445 جدایه از نمونههای خاک بهدست آمد که این فراوانی بالا را میتوان با اکوسیستم غنی و پیچیده خاک مرتبط دانست. از این تعداد 242 جدایه، در محیط کشت YM، 170 جدایه در محیط در جدایه درمحیط کشت YM، 170 جدایه در محیطکشت King B و 33 جدایه در محیط کشت DF رشد یافتند. مشاهدات حاصل از بررسی لام میکروسکوپی تمامی سویهها نشان داد که باکتریها با ریختشناسی میلهای کوتاه فراوانترین گروه را در میان اشکالِ میلهای بلند، میلهای کوتاه، کوکوباسیل و کوکوس شامل میشوند.
شکل 1- آزمون نیمه کمی توان تولید آنزیم ACC دآمیناز به روش لکهگذاری
بر اساس شکل میکروسکوپی و ظاهر کلونی باکتریایی، تعداد 159 جدایه از 3 محیط کشت (33 جدایه از محیط DF، 73 جدایه از محیط YM و 53 جدایه از محیط King B) برای آزمون نیمه کمی توان تولید آنزیم ACCدآمیناز انتخاب شدند (شکل 1).
نتایج بررسی نیمه کمی توان تولید آنزیم در سویههای مورد آزمایش نشان داد، تعداد 55 سویه رشد ناچیزی (کمتر از 2میلیمتر) در محیط کشت دارای منبع نیتروژن ACC و نیز کنترل منفی داشته و به عنوان سویههای ناتوان در تولید آنزیم در نظر گرفته شدند.
با توجه به میزان رشد باکتری و قطر کلونی حاصل در مقایسه با شاهد منفی، تعداد 17 سویه توانمند در تولید آنزیم ACCدآمیناز انتخاب شد.
در بررسی توان تولید آنزیم ACCدآمیناز، میزان رشد سویههای مورد نظر در 3 نوع محیط کشت M9 بدون هیچ منبع نیتروژن به عنوان کنترل منفی، M9 حاوی 15/0 مولار منبع نیتروژن ACC و M9 حاوی 2 گرم در لیتر منبع نیتروژن کلرید آمونیوم در روزهای اول، دوم و پنجم به شکل نانومتر 504 OD در جدول 2 آمده است.
جدول 2- بررسی توان تولید آنزیم ACC دآمیناز به شکل میزان رشد سویههای مورد نظر در 3 نوع محیط کشت در طول موج نانومتر504
|
روز
سویه |
منبع نیتروژن |
||||||||
|
NH4 |
Control Negative |
ACC |
|||||||
|
اول |
دوم |
پنجم |
اول |
دوم |
پنجم |
اول |
دوم |
پنجم |
|
|
12 Kot |
4/0 |
76/0 |
19/1 |
21/0 |
42/0 |
63/0 |
67/0 |
28/1 |
73/1 |
|
7 Ko |
4/0 |
53/0 |
6/0 |
16/0 |
23/0 |
25/0 |
17/0 |
28/0 |
36/0 |
|
DF25 |
21/0 |
72/0 |
96/0 |
41/0 |
16/0 |
18/0 |
38/0 |
98/0 |
45/1 |
|
7 Kot |
13/0 |
55/0 |
88/0 |
12/0 |
27/0 |
45/0 |
41/0 |
99/0 |
30/1 |
|
10 Yo |
2/0 |
39/0 |
6/0 |
08/0 |
26/0 |
40/0 |
04/0 |
20/0 |
28/0 |
|
28 Kp |
19/0 |
41/0 |
53/0 |
01/0 |
14/0 |
23/0 |
14/0 |
24/0 |
30/0 |
|
528 DF |
038/0 |
12/0 |
17/0 |
07/0 |
10/0 |
12/0 |
11/0 |
17/0 |
20/0 |
|
2 DF |
001/0 |
011/0 |
81/0 |
01/0 |
037/0 |
22/0 |
001/0 |
014/0 |
23/0 |
|
39 Kot |
25/0 |
25/0 |
24/0 |
8/0 |
6/0 |
9/0 |
08/0 |
07/0 |
10/0 |
|
22 Kp |
001/0 |
014/0 |
023/0 |
001/0 |
046/0 |
06/0 |
02/0 |
04/0 |
08/0 |
|
18 Yot |
001/0 |
006/0 |
23/0 |
018/0 |
015/0 |
11/0 |
011/0 |
013/0 |
08/0 |
|
10 Kot |
235/0 |
516/0 |
684/0 |
169/0 |
261/0 |
252/0 |
523/0 |
237/1 |
324/1 |
|
42 Kot |
31/0 |
45/0 |
79/0 |
12/0 |
19/0 |
35/0 |
63/0 |
31/1 |
44/1 |
|
4 Yl |
03/0 |
084/0 |
022/0 |
005/0 |
031/0 |
04/0 |
034/0 |
029/0 |
069/0 |
|
23 Yp |
03/0 |
08/0 |
3/0 |
09/0 |
12/0 |
4/0 |
01/0 |
02/0 |
09/0 |
|
17 Ypn |
1/0 |
09/0 |
2/0 |
005/0 |
02/0 |
09/0 |
004/0 |
007/0 |
17/0 |
|
7 Yp |
2/0 |
19/0 |
22/0 |
07/0 |
03/0 |
1/0 |
03/0 |
03/0 |
1/0 |
دادههای جدول 2 که حاصل میانگین سه مرتبه تکرار آزمایش است، نشان داد: سویههای 7 KOT، KOT42، 10 KOT، KOT12 و 25 DF در محیط کشت حاوی 15/0 مولار ACC، بیشتر از محیط کشت کنترل و نیز محیط حاوی 2 گرم در لیتر آمونیوم کلرید رشد داشتند. به این معنی که، این سویهها بهواسطه آنزیم ACCD از منبع نیتروژن ACC استفاده و بهتر از حالات دیگر رشد کردند. همچنین، نتایج این بررسی نشان میدهد در سویههای 528 DF، KP22 و 4 YL با وجود رشد کم در حالات مختلف، میزان رشد در محیط حاوی 15/0 مولار ACC بیشتر است. بنابراین، سویههای KOT7، KOT10، KOT12، KOT42، DF25، DF528، KP22 و 4 YLبه عنوان سویههای منتخب، شناسایی
فراتر بیوشیمیایی شدند. سویههای اکتینومیستی 17 YPN و 7YP به دلیل دیر رشد بودن در مقایسه با دیگر سویههای باکتریایی، نتایج مشخصی نداشتند. بنابراین، سویه اکتینومیستی 17 YPN به عنوان شاخص از میان 2 سویه منتخب اکتینومیستی بر مبنای رشد بهتر در پلیت حاوی ACC و توانمند در تولید آنزیم ACCدآمیناز انتخاب شد تا برای سنجش فعالیت آنزیم در مراحل بعدی استفاده شود.
سنجش کمی آنزیم ACCدآمیناز در 9 سویه منتخب به روش تغییر یافته پنروز با تعیین غلظت آلفا کتوبوتیرات آزاد شده و در مقایسه با منحنی استاندارد غلظتهای 1/0 -2/0 تا 1 میکرو مول آلفاکتوبوتیرات انجام گرفت. یک واحد فعالیت آنزیم به شکل مقدار نانومول آلفاکتوبوتیرات آزاد شده به ازای 1 میلیگرم پروتئین (آنزیم) در 60 دقیقه تعریف شد. برای ارزیابی مقدار پروتئین سلولی از جذب نوری غلظتهای مختلف (1/0-4/1 میلیگرم در میلیلیتر) آلبومین سرمی گاو در 595 نانومتر به عنوان استاندارد استفاده شد. نتایج این بررسی نشان داد که در میان سویههای مورد آزمایش، سویه KOT12 دارای بیشترین میزان فعالیت آنزیم (4369/826 نانومول آلفا کتو بوتیرات/میلیگرم پروتئین/ ساعت) و سویه KOT42 دارای کمترین میزان فعالیت (519668/8 نانومول آلفا کتو بوتیرات/میلیگرم پروتئین/ ساعت) است (جدول 3).
جدول 3- میزان فعالیت آنزیم ACCD در سویههای منتخب
|
نام سویه |
مقدارجذب آلفاکتوبوتیرات (540 نانومتر OD) |
مقدار جذب پروتئین (595 نانومتر OD) |
فعالیت آنزیم (نانومول آلفا کتو بوتیرات/میلیگرم پروتئین/ ساعت) |
|
Kot 10 |
028/0 |
835/0 |
9037/320 |
|
12 Kot |
039/0 |
793/0 |
4369/826 |
|
Df528 |
031/0 |
85/0 |
2439/378 |
|
4 Yl |
025/0 |
82/0 |
6202/253 |
|
7 Kot |
018/0 |
825/0 |
812/30 |
|
42 Kot |
0178/0 |
162/1 |
519668/8 |
|
22 Kp |
0175/0 |
83/0 |
98507/14 |
|
25 Df |
0195/0 |
79/0 |
8835/95 |
|
17 Ypn |
0174/0 |
84/0 |
36691/11 |
از آنجا که پنروز و گلیک (10) فعالیت آنزیمی کمتر از 20 نانومول را به عنوان فعالیت کم آنزیم ACCدآمیناز یاد کرده اند، بر اساس نتایج، سویههای مورد بررسی از نظر میزان فعالیت آنزیم در 3 گروه با فعالیت زیاد، متوسط و کم به طور نسبی طبقهبندی شدند (جدول 4).
جدول 3- طبقه بندی نسبی سویههای منتخب بر اساس میزان فعالیت آنزیم ACCD
|
گروه |
میزان فعالیت (نانومول آلفا کتو بوتیرات/میلیگرم پروتئین/ ساعت) |
درجه نسبی فعالیت آنزیمی |
سویه |
|
1 |
100< |
زیاد |
Yl4/ Df528/ Kot 10/ Kot 12 |
|
2 |
100-20 |
متوسط |
Df25/ Kot7 |
|
3 |
20> |
کم |
Ypn17/ Kp22/ Kot 42 |
آزمایشهای اولیه شناسایی سویههای منتخب نشان داد که باکتریهای بهدست آمده به جنسهای
سودوموناس(KOT7،KOT10، KOT12،42KOT، DF25)، باسیلوس(DF528، KP22،4YL)و گروهActinomycetes(YPN17) متعلق اند.
|
1500bp
|
از میان سویههای منتخب، سویه 12 KOT که بیشترین میزان فعالیت آنزیم را در مقایسه با دیگر سویههای مورد آزمایش نشان داد، شناسایی مولکولی شد. شکل 2 تصویر ژل تکثیر ژن 16S rRNA (طول حدود1500 جفت باز) در سویه Pseudomonas KOT12 را نشان میدهد. نتایج به دست آمده از تعیین توالی سویه منتخب با استفاده از نرم افزار Chromas، DNA baser و Bioedit ویراش شد.
با مقایسه ژن 16S rRNAبهدست آمده از سویه منتخب با توالیهای موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI و بر اساس میزان شباهت 99 درصد، این سویه به جنس Pseudomonas متعلق بوده و به گونه Pseudomonas brassicacearumنزدیک است.
|
1500bp
|
شکل 2- سمت چپ مارکر وزن مولکولی 1kb ladder DNA و سمت راست محصول تکثیر ژن 16S rRNAدر سویه منتخب
بحث و نتیجهگیری
با توجه به عدم تهیه آسان ACC و همچنین، هزینه زیاد برای خریداری این ماده، آزمون نیمه کمی توان تولید آنزیم ACCدآمیناز با روش یاد شده (محاسبه قطر کلونی) دارای توجیه اقتصادی است. با وجود اینکه روش محاسبه قطر کلونی دقت کمتری در تفکیک سویهها از نظر فعالیت آنزیم ACCدآمیناز دارد، در مواقعی که تعداد سویههای باکتری زیاد است (همانند پژوهش حاضر) این روش میتواند برای غربالگری اولیه استفاده شود. در تایید این موضوع پنروز و گلیک (10) محیط کشت حاوی ACC را روش مناسبی برای غربالگری تعداد زیادی از سویههای باکتری گزارش دادند. در این پژوهش، پلیت فاقد هر گونه منبع نیتروژنی نیز به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد که اختلاف آن با محیط حاوی ACC دقت کار را بیشتر کرد. شایان ذکر است، در روش پنروز و گلیک به استفاده از کنترل منفی اشارهای نشده است. همچنین، پنروز و گلیک (2) اشاره داشتهاند که تقریبا غیرممکن است که بر روی پلیتهای کشت شده، باکتری فاقد رشدی را پیدا کرد و معمولا هر سویه حداقل رشد بسیار ضعیفی را نشان خواهد داد. این نکتهای است که در پژوهش حاضر نیز مشاهده شد. در رابطه با این موضوع که چرا سویهها در محیط کشت میتوانند رشد حداقلی داشته باشند ولی فاقد توان سنتز ACC باشند، اشاره شده است که این مسأله میتواند هنگام تلقیح سویهها همراه سوسپانسیون باکتری، مقدار ناچیزی محیط کشت قبلی به محیط جدید منتقل شود. از دیگر دلایل احتمالی این موضوع میتوان به کاتابولیسم برخی از متابولیتهای سلولی توسط سویهها اشاره کرد و شاید بتوان اصطلاح جاروبگرهای نیتروژن[xiii] را برای این باکتریها به کار برد. این باکتریها از برخی مواد و ترکیبات دارای نیتروژن که سایر باکتریها قادر به رشد در آنها نیستند به عنوان منبع نیتروژن استفاده میکنند. در مواردی اشاره شده که برخی از باکتریها قادرند حتی از آمونیاک موجود در اتمسفر نیز استفاده کنند.
گلیک و همکارانش[xiv] با تقسیمبندی میکروارگانیسمهای خاکزی دارای فعالیت آنزیمیACC دآمینازی به باکتریهای با سطح فعالیت بالا و پایئن، بیان داشتند که معمولا میکروارگانیسمهایی که فعالیت آنزیمی بالایی دارند بهطور غیر اختصاصی به سطوح بسیاری از گیاهان متصل شده که بیشتر میکروارگانیسمهای ریزوسفری به شمار میآیند (11).
از سوی دیگر بنیزری و همکارانش[xv] دریافتند که سویههای Pseudomonas fluorescens بخش مهمی از باکتریهای ریزوسفری را تشکیل داده و پتانسیل بالایی در کلنیزه کردن ریشه گیاهان دارند (12). بنابراین، مطابق با این یافتهها، سویه برتر در این مطالعه، که دارای فعالیت آنزیمی بالایی است، در گروه fluorescentPseudomonas قرار گرفته است.
در خصوص توانایی سویههای Pseudomonas fluorescensدر استفاده از ACC به عنوان منبع نیتروژن و به عبارت دیگر تولید آنزیم ACCدآمیناز و تحریک رشد گیاه، گزارشهای متعددی ارائه شده است که از آن میان میتوان به مطالعه خاوازی و همکارانش[xvi] در سال 2009 اشاره کرد که نشان دادند میزان جوانهزنی بذرهای آغشته شده به مایه تلقیح گونههای فلورسنت Pseudomonasدارای فعالیت ACCD در گیاه کلزا، تحت شرایط تنش شوری بسیار افزایش یافته است (13).
همچنین، نوید و همکارانش[xvii] در سال 2008 نشان دادند میزان رشد و محصول ذرت در حضور کودهای آلی دارای گونههای فلورسنت Pseudomonas، به میزان در خور توجهی افزایش یافت (14). در مطالعهای دیگر، ساراواناکومار و همکارانش[xviii] در سال 2006 دریافتند که تیمار گیاه بادام زمینی با باکتریPseudomonas fluorescensسویه TDK1 با میزان فعالیت آنزیم ACCD 342 نانومول آلفاکتوبوتیرات آزاد شده در واحد میلیگرم پروتئین در ساعت، در مقایسه با گیاهی که فاقد این تیمار بود، سبب افزایش مقاومت گیاه به شوری و در نهایت تولید محصول شد (15).
در نهایت، با توجه به میزان فعالیت بالای آنزیم ACCدآمیناز در سویه Pseudomonasمنتخب و نقش مثبتی که این سویه میتواند در افزایش رشد گیاه داشته باشد، ادامه تحقیقات در این زمینه با توجه به لزوم استفاده از راهکارهای زیستی به منظور جلوگیری از کاربرد بیرویه کودهای شیمیایی ضروری به نظر میرسد.
[1]- Plant Growth Regulators (PGPRs)
[2]- 1-آمینو سیکلوپروپان-1- کربوکـسیلیک اسید
[3]- Khosravi H. et al.
[4]- Merck
[5]- Ryan
[6]- Penrose DM, Glick BR
[7]- ACC Deaminase
[8]- Tris-HCl
[9]- DPH
[10]- Bergey
[11]- PCR
[12]- Macrogen
[xiii]- Nitrogen Scavenger
[xiv]- Glick et al
[xv]- Benizri et al
[xvi]- Khavazi et al
[xvii]- Naveed et al
[xviii]- Saravanakumar et al
)